Summary
Cette méthode décrit une préparation chronique qui permet un accès optique à l'hippocampe de souris vivantes. Cette préparation peut être utilisée pour effectuer l'imagerie optique longitudinale de la plasticité structurale neuronale et de la plasticité cellulaire suscitée par l'activité sur une période de plusieurs semaines.
Abstract
La microscopie à deux photons est un outil fondamental pour les neurosciences car elle permet d'enquêter sur le cerveau d'animaux vivants à des échelles spatiales allant des niveaux subcellulaires aux niveaux de réseau et à des échelles temporelles de millisecondes à semaines. En outre, l'imagerie à deux photons peut être combinée avec une variété de tâches comportementales pour explorer les relations causales entre la fonction cérébrale et le comportement. Cependant, chez les mammifères, la pénétration limitée et la diffusion de la lumière ont limité l'imagerie intravitale à deux photons principalement aux régions superficielles du cerveau, empêchant ainsi l'investigation longitudinale des zones du cerveau profond comme l'hippocampe. L'hippocampe est impliqué dans la navigation spatiale et la mémoire épisodique et est un modèle de longue date utilisé pour étudier les processus cellulaires ainsi que cognitifs importants pour l'apprentissage et le rappel, à la fois dans la santé et la maladie. Ici, une préparation qui permet un accès optique chronique à l'hippocampe dorsal chez les souris vivantes est détaillée. Cette préparation peut être combinée avec l'imagerie optique à deux photons à la résolution cellulaire et subcellulaire dans la tête fixe, souris vivantes anesthésiées sur plusieurs semaines. Ces techniques permettent l'imagerie répétée de la structure neuronale ou de la plasticité suscitée par l'activité dans des dizaines à des centaines de neurones dans le CA1 hippocampal dorsal. En outre, cette préparation chronique peut être utilisée en combinaison avec d'autres techniques telles que la micro-endoscopie, la microscopie à champ large monté sur la tête ou la microscopie à trois photons, élargissant ainsi considérablement la boîte à outils pour étudier les processus cellulaires et réseau impliqués. dans l'apprentissage et la mémoire.
Introduction
Chez les mammifères, l'hippocampe est une région clé du cerveau pour l'encodage et le rappel des souvenirs épisodiques ainsi que pour la navigation spatiale1,2,3,4. Pour cette raison, l'hippocampe a été - et est toujours - un modèle très important pour étudier les mécanismes de base qui permettent au cerveau d'encoder et de rappeler des souvenirs5,6,7 ou de naviguer dans un environnement8 ,9 collecter des récompenses et éviter les dangers. En outre, la formation hippocampique est l'une des régions du cerveau où de nouveaux neurones sont générés tout au long de la vie des rongeurs10,11 et, éventuellement, des humains12,13. Enfin, la dégénérescence ou l'affaiblissement de la formation hippocampique sont associés à des troubles neurologiques et psychiatriques, y compris la maladie d'Alzheimer14.
Chez la souris, l'hippocampe est situé à environ 1 mm sous la surface du cerveau15. Sa position a empêché l'accès optique dans le cerveau intact et par conséquent, les études longitudinales de la dynamique hippocampal se sont appuyées principalement sur l'imagerie de résonance magnétique (MR), l'électrophysiologie, et les analyses ex vivo d'imagerie. Les méthodes d'imagerie par M. permettent de suivre les processus biologiques (p. ex., l'expression génique changede 16) chez le même animal sur plusieurs jours, mais n'ont pas la résolution spatiale pour discriminer les neurones uniques. Les techniques électrophysiologiques in vivo classiques offrent une résolution temporelle très élevée et une sensibilité exquise aux changements du potentiel membranaire. Cependant, ils ont une résolution spatiale limitée et ils n'ont pas la capacité de suivre de façon fiable les mêmes cellules sur de plus longues périodes de temps. L'imagerie optique permet d'étudier des processus plus diversifiés en raison de ses résolutions temporelles et spatiales élevées. Cependant, l'imagerie ex vivo ne fournit que des instantanés des processus en cours, et donc elle n'est pas adaptée aux études longitudinales au cours desquelles les animaux apprennent et rappellent l'information.
L'imagerie optique in vivo combine certains avantages de l'imagerie par résonance magnétique et de l'électrophysiologie avec ceux de l'imagerie optique. Par conséquent, il est très bien adapté pour les analyses longitudinales et corrélatives de la dynamique et du comportement du cerveau de la souris. Ceci est pertinent dans les études des processus biologiques avec des échelles de temps très rapides (millisecondes à secondes) ou très lentes (de jours à semaines). Les exemples de tels processus qui sont pertinents pour les neurosciences sont la dynamique de tension membranaire, les transitoires Ca2, la plasticité cellulaire et les changements structurels, qui sont tous considérés comme très importants pour la formation et le rappel de la mémoire. Différentes méthodes ont étendu l'imagerie in vivo à l'hippocampe dorsal18,19,20,21,22. Les préparations aigues ont permis le suivi de l'activité des neurones pyramidaux (PN) ainsi que de leurs dendrites et épines dendritiques pendant plusieurs heures20,22. Ce calendrier temporel, cependant, ne permet pas d'étudier les changements structurels à long terme, qui pourraient sous-tendre l'apprentissage progressif. Les préparations chroniques - en combinaison avec des micro-endoscopes23,24 ou avec des objectifs de microscope standard à longue distance de travail (WD)21 - ont permis l'imagerie répétée de l'hippocampe dorsal sur plusieurs Semaines.
Ici, nous décrivons une préparation chronique qui fournit l'accès optique récurrent au sous-champ CA1 de l'hippocampe dorsal des souris vivantes utilisant une canule d'imagerie insérée de façon permanente. Cette préparation permet un accès répété au CA1 sans perturbation fonctionnelle et convient à l'imagerie intravitale à deux photons (2P) ou à l'épifluorescence à champ large. Deux exemples de l'imagerie chronique profonde de cerveau 2P dans le CA1 dorsal des souris vivantes sont détaillés : imagerie longitudinale de la structure dendritique et de la dynamique de la colonne vertébrale dendritique et imagerie longitudinale de la plasticité suscitée par l'activité. Les avantages saillants et les limites de la technique sont discutés.
Protocol
Toutes les méthodes décrites ont été approuvées par le gouvernement de Haute-Bavière (licence 2016-ROB-55.2Vet-2532.Vet-02-16-48) et par le Stanford and Max Planck Florida Institute for Neuroscience Administrative Panels on Laboratory Animal Care.
1. Préparation de la canule d'imagerie
- Tenez une perceuse de précision sur un support de forage fourni avec une table de règle mobile.
- Pincez un tube en acier inoxydable de 3,0 mm de diamètre sur la table de règle mobile.
- Couper le tube sur un anneau métallique de 1,6 mm de long. Si les bords de l'anneau ne sont pas émoussés après la coupe, décez les irrégularités.
- Rincer l'anneau métallique et un bordereau circulaire en verre de 4 mm de diamètre dans 100 % d'acétone et laisser sécher pendant 5 min.
- Placez l'anneau métallique et la couverture en verre sur un lieu de travail lisse, uniforme et propre, sous un stéréoscope.
- Déposer une goutte d'adhésif optique de traitement UV sur une surface lisse, comme un plat Petri. Utilisez une aiguille ou une spatule pour étaler l'adhésif pour former une mince couche (0,5 mm).
- Utilisez des forceps pour tremper un côté de l'anneau métallique dans l'adhésif. Portez une attention particulière à ne pas sceller l'intérieur de l'anneau. Si cela se produit, utilisez une aiguille pour briser l'adhésif optique dans l'anneau.
- À l'aide du stéréoscope, placez l'anneau métallique au centre de la glissière de verre avec le côté de l'anneau recouvert d'adhésif touchant la glissière. Un mince anneau d'adhésif devrait se former à l'interface entre l'anneau métallique et le bordereau. Évitez toute propagation adhésive au centre de la couverture.
- Allumez l'unité de conducteur LED de traitement UV et allumez la lumière (365 nm) pendant 1 min.
CAUTION: La lumière UV provoque des brûlures de la peau et est un agent mutagène. Portez des lunettes anti-UV et couvrez les mains et les bras avec des gants et une blouse de laboratoire pour éviter l'exposition de la peau. - Pour guérir l'adhésif uniformément, assurez-vous que tous les côtés de l'anneau sont également éclairés en changeant la direction de la source lumineuse.
- Laisser l'adhésif durcir pendant au moins 2 h, de préférence, pendant la nuit.
- Tenez fermement la canule de l'extrémité ouverte de l'anneau métallique au moyen d'un hemostat. À l'aide d'une perceuse dentaire munie d'un fichier rotatif et de travail sous le stéréoscope, déposer l'excédent de la glissière de verre jusqu'à ce qu'il soit rincé avec les côtés de l'anneau (figure 1A).
2. Implantation de la canule d'imagerie au-dessus de l'hippocampe dorsal
- Préparation de l'équipement et mise en place
- Assurez-vous que tous les instruments chirurgicaux sont propres et stériles. Si vous utilisez un stérilisateur de perles de verre pour la stérilisation, nettoyez les instruments et placez-les dans le stérilisateur (réglé à 250 oC) pendant 10 min, avant de l'utiliser. Alternativement, autoclave les instruments avant utilisation.
- Préparer tous les matériaux nécessaires à la chirurgie, ainsi que les instruments chirurgicaux, afin qu'ils puissent être atteints facilement.
- Assurez-vous qu'il y a suffisamment de médicaments fraîchement préparés comme des analgésiques ou des anti-inflammatoires.
- Assurez-vous qu'il y a assez d'isoflurane pour toute la durée de la chirurgie (environ 1 h par chirurgie).
- Allumez le tapis chauffant et fixez-le à 37 oC pour maintenir la température des animaux stable sous anesthésie.
- Assurez-vous que le système de récupération de l'isoflurane fonctionne.
- Ouvrez la valve du flux d'oxygène.
- Induction d'anesthésie, et fixation animale
- Placez la souris dans la chambre d'induction d'anesthésie à 3% isoflurane en 1 L/min O2 et attendez qu'elle perde conscience. Évaluer l'anesthésie à l'aide du test réflexe de pincement des orteils.
- Pesez l'animal.
- Appliquer des médicaments anti-inflammatoires (Meloxicam, 1mg/Kg) et analgésiques (Vetalgin, 200 mg/kg) sous-cutané.
- Placez la souris sur le tapis chauffant. Assurez-vous que l'animal n'est pas en contact direct avec le tapis chauffant pour éviter les brûlures thermiques.
- Fixez la tête à l'appareil stéréotaxique et placez le cône de nez pour couvrir le museau. Pour maintenir l'anesthésie, diminuer l'isoflurane à 1,5-2%. Tout au long de la chirurgie, surveiller l'état de la souris en surveillant visuellement la respiration et en testant le réflexe de pincement des orteils. Réglementer le pourcentage d'isoflurane si nécessaire.
- Appliquer de l'onde ophtalmique sur les yeux pour prévenir la déshydratation et la cécité potentielle.
REMARQUE : Pour l'anesthésie et les médicaments pour animaux, des méthodes et des médicaments alternatifs sont possibles. S'il vous plaît, se référer à votre permis d'animal et la littérature relative.
- Implantation de canule optique
- Allumez la source de lumière de fibre optique.
- Enlever les cheveux et désinfecter la peau sur la tête de la souris.
- À l'aide de ciseaux et de forceps, retirez le cuir chevelu de la souris. Commencez par faire une petite coupure dans le cuir chevelu dans une position proche de lambda. Continuer en ouvrant le cuir chevelu sur les deux côtés. D'abord se déplacer latéralement dans la direction des oreilles, puis rostalement, dans la direction des orbites oculaires, pour former un triangle sur l'axe sagittal, environ 4 mm rostral à bregma. Faites attention à ne pas couper trop près des oreilles et des yeux, mais exposer bregma et lambda, ainsi que les os pariétals et la moitié postérieure des os frontaux.
- Appliquer une goutte (10 mg) de lidocaïne (28,9 % v/v en alcool) sur le crâne.
- Effacer le périoste et sécher le crâne à l'aide d'un coton-tige.
- Placez les barres d'oreille, pour fixer la tête de la souris.
- Faire une petite craniotomie, à l'aide d'une micro-perceuse avec une bavure de 0,5 mm de largeur. Placez le trou dans l'os frontal opposé à l'hippocampe image, à environ 1,5 mm de la suture sagittale et à 2 mm de la suture coronale.
- Visser une vis en acier inoxydable de 0,86 mm de largeur dans le trou du crâne.
- Si nécessaire, nettoyez les débris et séchez le crâne.
- Préparation d'un mélange de ciment adhésif rapide
- À l'aide d'une petite cuillère (4,5 mm de diamètre), dispenser 1 à 1,5 boules de lune dans un puits de mélange.
- Distribuez 3-4 gouttes de base rapide dans le puits.
- Dispense 1 goutte de catalyseur universel dans le puits.
- Remuer le mélange pendant 5-10 s à l'aide d'un applicateur de précision.
REMARQUE : Des ciments alternatifs sont disponibles. Veuillez consulter les instructions de leur fabricant.
- Utilisez des applicateurs de précision pour appliquer du ciment adhésif rapide sur le crâne, la vis et la peau environnante. Laisser sécher de 30 s à 1 min.
- Utilisez une perceuse de tréphine de 3,0 mm de diamètre pour faire une craniotomie dans l'os pariétal. Placez le trou à environ 1,5 mm de la suture sagittale et à 2 mm de la suture lambdoid.
- Retirez soigneusement le rabat osseux.
- Vérifiez la taille de la craniotomie à l'aide de la canule pour s'assurer qu'elle s'adapte. Utilisez un micro-perceur de 0,5 mm ou 0,9 mm de largeur pour agrandir la craniotomie si nécessaire.
- Retirez les méninges à l'aide de forceps Dumont.
- Amile la matière corticale, pour atteindre la capsule externe. Utilisez une aiguille émoussée de 0,9 mm de diamètre (19 jauge) reliée à une pompe à vide. Irriguer avec saline pour éviter la déshydratation des tissus exposés et pour laver le sang résiduel après le saignement est résolu. Suck tissu cortical lentement, 50-100 m à la fois, jusqu'à ce que le cortex se détache de la capsule, exposant les fibres du cingulum ou le callosum corpus. Changez l'aiguille fréquemment, pour éviter l'engorgement.
- Les fibres s'étendent principalement dans trois directions (Figure 1B). Épluchez soigneusement les fibres dorsales jusqu'à ce que les fibres les plus profondes(alvée de l'hippocampe) soient exposées.
- Rincer le tissu avec de la saline. Utilisez des forceps minces pour tremper la canule inférieure dans saline et placez-le au-dessus du trou du crâne. La canule et les tissus doivent être scellés par solution saline pour éviter de piéger les bulles d'air entre la canule et le tissu.
- Poussez la canule dans le crâne (Figure 1C) jusqu'à ce que le bordereau en verre soit en contact avec les fibres.
- Séchez bien le crâne à l'aide de triangles d'absorption, d'écouvillons de coton et/ou de la pompe à vide.
- Préparation d'un mélange de ciment adhésif rapide (se référer à l'étape 2.3.10).
- Utilisez des applicateurs de précision pour appliquer du ciment adhésif rapide sur le crâne. Appliquer l'adhésif également sur le bord de la canule. Veillez à ne pas laisser l'adhésif courir dans la canule. Laisser sécher de 30 s à 1 min.
- Utilisez un bras stéréotaxique pour positionner une plaque de porte-tête au-dessus de la canule, en contact avec le crâne.
- Préparation d'un mélange d'acrylique dentaire
- À l'aide d'une cuillère (9 mm de diamètre), dispenser 1 cuillère de niveau (1 partie) de poudre dans un puits de mélange.
- Distribuer 2-3 parties de liquide dans le même puits. Couvrir toute la poudre avec le liquide.
- Remuer pendant 1 min à l'aide d'une spatule.
REMARQUE : Des acryliques alternatifs sont disponibles. Veuillez consulter les instructions de leur fabricant.
- Utilisez une spatule ou un applicateur de précision pour appliquer de l'acrylique sur le crâne. Couvrez tout le crâne exposé, la vis et la peau ouverte avec de l'acrylique dentaire. Cela rend la préparation stable. Ne laissez pas l'acrylique couler le cou, les oreilles et les yeux.
- Laisser sécher l'acrylique et durcir environ 15 min.
- Appliquer un film adhésif amovible sur la plaque du support de la tête, afin d'empêcher les débris d'entrer dans la canule. Il est recommandé que la taille du film corresponde à celle de la plaque.
- Éteignez le flux d'isoflurane, retirez l'animal de l'appareil stéréotaxique et placez-le sur une plaque chauffante pour maintenir la température physiologique du corps pendant qu'il se réveille de l'anesthésie.
- Surveillez l'animal jusqu'à ce qu'il ait retrouvé une conscience suffisante pour maintenir la tension.
- Rendre l'animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux seulement lorsqu'il est complètement récupéré.
3. Soins postopératoires
- Vérifiez l'état de la souris pendant 2 jours après la chirurgie, en surveillant le poids et le comportement général.
- Appliquer des médicaments anti-inflammatoires (Meloxicam, 1mg/Kg) et analgésiques (Vetalgin, 200 mg/kg) sous-cutané pendant 2 jours après la chirurgie
REMARQUE : D'autres procédures de surveillance, des médicaments et des doses sont possibles pour les soins postopératoires. S'il vous plaît, se référer à votre permis d'animal et la littérature relative.
4. Préparation de la séance d'imagerie
- Allumez la configuration d'imagerie à l'avance et laissez le laser se réchauffer et stabiliser, si nécessaire.
- Anesthésiez la souris (voir l'étape 2.2.1).
- Utilisez des forceps pour retirer soigneusement le film adhésif de la plaque du support de la tête. Tenez la souris dans une main et la plaque du porte-tête avec les doigts. Retirer le film doucement, pour éviter d'endommager la préparation.
- Placez la souris sous le microscope, au-dessus du tapis chauffant et fixez la plaque de tête au support (Figure 1D).
- Placez le cône de nez pour couvrir le museau et diminuer isoflurane à 1.5-2%.
- Appliquer un onduleur ophtalmique sur les yeux de souris.
- Nettoyez la canule d'imagerie en rinçant à l'eau déionisée. Utilisez une seringue et une fine aiguille pour déposer de l'eau dans la canule et une pompe à vide pour l'enlever.
5. Séance d'imagerie
- Utilisez un grossissement faible, des objectifs de longue distance de travail pour vérifier visuellement la canule pour l'eau résiduelle, la saleté, l'intégrité et la présence de fluorescence.
- Alignez la canule sur l'axe optique en ajustant les angles des bras du porte-tête.
- Passez aux objectifs d'immersion de l'eau 25X 1.0 NA, 4 mm WD ou 40X 0.8 NA, 3 mm WD. Ajouter suffisamment d'eau déionisée pour remplir la canule et maintenir l'excès d'eau sur le dessus de la canule. Évitez la formation de bulles d'air.
- Utilisez l'excitation 2P et les signaux fluorescents d'image.
REMARQUE : Le protocole d'imagerie dépend fortement du temps et des échelles spatiales à imager. Veuillez consulter les résultats représentatifs des sections et discuter pour plus de détails sur les paramètres d'imagerie que nous avons utilisés pour produire les images montrées dans cet article.
Representative Results
Puisque la canule est placée juste dorsal à CA1, l'aspect dorsal du CA1 est plus proximal au microscope si comparé à celui ventral. L'alveus est la structure la plus proximale suivie dans l'ordre par les stratum oriens (SO), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) et stratum lacunosum moleculare (SLM), la couche la plus distale (Figures 1B , C). La formation image 2P longitudinale de la structure neuronale avec la résolution subcellulaire et de la plasticité activité-évoquée avec la résolution cellulaire sont présentées comme résultats représentatifs. Pour exciter la protéine fluorescente verte fluorophores (GFP), d2Venus et TurboFP635, un laser ti:Sapphire pulsé de femtoseconde accordé à 920 nm est utilisé et la puissance laser moyenne est ajustée à 5-25 mW à l'échantillon. Les différentes longueurs d'onde d'émission sont séparées à l'aide de filtres d'émission et de différents tubes photomultiplicateurs.
Imagerie longitudinale de la structure dendritique et de la dynamique des épines dendritiques.
Pour étiqueter à peine les PN hippocampes et visualiser leur structure, une ligne de souris transgénique Thy1-GFP (ligne M) est utilisée. Les souris Thy1-GFP expriment le GFP amélioré cytoplasmique sous le contrôle du promoteur Thy1 dans une population clairsemée et aléatoire de PNs25. En général, l'axe principal des PN CA1 est à peu près perpendiculaire au plan d'imagerie XY (Figures1B, Figure 2A et Film supplémentaire 1). Les dendrites basiques s'étendent dans l'SO, du soma vers la canule, tandis que les dendrites apatiques et apicales s'étendent distally à la canule, dans la direction opposée (Film supplémentaire 1). Puisque la préparation laisse intactes les fibres les plus profondes de l'alveus, quelques fibres fluorescentes traversant le champ de vision, juste sous la canule, devraient être visibles (Figure 2A et Film 1). La préparation permet l'imagerie des dendrites PN avec résolution de la colonne vertébrale (Figure 2 A-C). Pour l'image dendrites et épines dendritiques, un 25X 1.0 NA, 4 mm WD, l'immersion en eau objectif commercial objectif objectif objectif objectif objectif est utilisé.
Pour le suivi longitudinal, plusieurs régions du cerveau dans le champ de vision de la canule sont définies au cours de la première séance d'imagerie. Chaque région correspond à une superficie d'environ 240 x 240 m et contient entre 1 et 7 segments dendritiques (figure 2B). Ces régions sont cartographiées manuellement à une pile tridimensionnelle de grossissement faible montrant le modèle d'expression GFP dans le volume au-dessous de la canule d'imagerie (Figure 2A). Ensuite, des piles d'images de 1 m z-step de dendrites basiques CA1 PN sont acquises à des intervalles de temps différents (de 24 h à 3 jours) pendant environ 14 jours (figure2C). Des durées et des intervalles d'imagerie plus longs sont possibles26. Chaque séance d'imagerie dure environ 60 à 90 min. Bien que la plupart des images sont d'épines dendritiques dans le SO, il est également possible d'imageépines dendritiques dans les dendrites obliques de SR (Figures 2D-F). En plus de la densité de la colonne vertébrale, cette méthode permet d'étudier la dynamique de la colonne vertébrale en quantifiant leurs taux de survie, de gain et de perte26,27,28,29,30, 31 Ans, états-unis ( , 32. Pour marquer et suivre les épines dendritiques au fil du temps (Figure 2C), une interface MATLAB personnalisée est utilisée. Cela permet l'alignement des piles d'images acquises à différents moments et prend en charge l'étiquetage manuel des dendrites et des épines tout en suivant les longueurs dendritiques et les positions de la colonne vertébrale au fil du temps26. Fait important, cette méthode peut être utilisée pour distinguer (par chaque point de temps, à l'exclusion du premier) entre les épines dendritiques préexistantes et les épines dendritiques nouveau-nées. Ceci est important car les différentes classes d'épines dendritiques sont pensés pour avoir des rôles différents dans l'acquisition de mémoire et la rétention33.
Imagerie longitudinale de la plasticité suscitée par l'activité.
Pour imager la plasticité évoquée par l'activité dans les PN CA1, la zone hippocampal CA1 dorsal est injectée avec un vecteur viral exprimant le vert fluorescent déstabilisé d2Venus par l'intermédiaire d'une forme améliorée de l'élément synaptique d'activité-réactive (E-SARE) dans l'Arc enhancer/promoteur et rouge fluorescent TurboFP635 via le promoteur ePGK 34. Cela permet d'imagerie des niveaux de plasticité d'activité de centaines de PC CA1 chez chaque animal35. Compte tenu de l'étiquetage très dense des PN, il n'est généralement pas possible de résoudre les dendrites de CA1 PNs (Film supplémentaire 2).
Pour imager les somata des NA CA1, une lentille objective d'immersion de 40x 0,8, 3 mm WD, on utilise une lentille objective d'immersion en eau. Pour le suivi longitudinal, 1 à 9 régions du cerveau sont définies par souris au cours de la première séance d'imagerie. Chaque région correspond à une superficie d'environ 300 x 300 m et contient entre 50 et 150 cellules (figure 3A). Ces régions sont cartographiées manuellement à des repères de tissus locaux visibles à un grossissement inférieur. Ensuite, 3 piles d'images à étape z-m sont acquises, qui englobent le SP des PN CA1 (Figure3A et Film Supplémentaire 2) à intervalles de temps différents (de 24 h à 6 jours) pour un temps pouvant aller jusqu'à environ 30 jours. Chaque séance d'imagerie dure environ 60 à 90 min. L'activation E-SARE culmine de 6 à 8 h après une exposition à un environnement nouveau ou enrichi (EE, Figure 3B)et se désintègre au cours de quelques jours. Ainsi, nous images généralement 6 à 8 h après l'expérience et de permettre 5 jours entre les séances d'imagerie35.
Pour quantifier les valeurs de fluorescence d2Venus et TurboFP635, une région circulaire d'intérêt de 4,64 m de diamètre est dessinée, qui est plus petite qu'un corps de cellules neurales, centrée sur le soma cellulaire. Nous progressons ensuite vers le point suivant, notons le soma de la même cellule de la même manière, et itérer cette procédure pour tous les points de temps et toutes les cellules visibles dans le jeu de données longitudinale. La valeur moyenne de l'émission d2Venus de chaque neurone (dépendante de l'activité) est normalisée par son émission moyenne (indépendante de l'activité) TurboFP635. Cette méthode permet d'enquêter sur la dynamique à long terme de la plasticité d'ensemble des NC CA135 (Figure 3C).
Figure 1 : Préparation à l'imagerie optique cérébrale profonde in vivo. (A. Top (gauche) et côté (droite) vues d'exemple d'imagerie cannuals. Les canules d'imagerie ont un fond de verre transparent pour permettre un accès optique à l'hippocampe. (B. Description schématique de la préparation mettant en évidence la position relative de la canule d'imagerie, d'un PN CA1 et des trois couches de fibres du dorsal au ventral. (C, D). Description schématique de la configuration d'imagerie (C) et de la fixation animale (D) pendant une session d'imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Imagerie longitudinale de la structure dendritique et de la dynamique des épines dendritiques. (Piled'images 2P (Maximum Intensity Projection (MIP) de 59 plans d'image, 2 z-espacements) de neurones et dendrites étiquetés par GFP dans une souris Thy1-GFP en direct. (B). Grossissement plus élevé (MIP de 53 plans d'image, 1 z-espacement) détaillant les dendrites basales situées dans SO. (C. Séquence d'image time-lapse d'un segment dendritique photographié sur 14 jours. Les pointes de flèche indiquent des épines dendritiques suivies sur 14 jours. (D, E). Pile d'images 2P de neurones et de ndrites étiquetés par GFP dans une souris Thy1-GFP en direct; (D) projection ZY (31 plans d'images, 3 z-spacing) et (E) XY projections (17 plans d'image, 3 z-espacement). (F. Un grossissement plus élevé (plan d'image unique) détaillant les dendrites apicales et les épines dendritiques situées dans SR. Arrowheads indiquent des épines dendritiques. Excitation: 920 nm; pic d'émission : 510 nm. Barres d'échelle : A, 50 m; B, 10 m; C, 2 m; D et E, 15 m; F, 4 m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Imagerie longitudinale de plasticité activité-évoquée. (A. 2P images (plans d'image unique) à partir d'une souris en direct, montrant les mêmes cellules le jour de base 0 et après EE le jour 1. (B. 2P piles d'images (MIP de 4-6 plans d'image, 3 z-espacement) montrant les modèles d'activation E-SARE spécifiques pour l'environnement A (Jours 1, 19 et 25) et l'environnement B (Jours 7 et 13). Vert: fluorescence d2Venus. Rouge: Fluorescence TurboFP635. Excitation: 920 nm; d2Venus pic d'émission: 530 nm; TurboFP635 pic d'émission: 635nm. Barres d'échelle : A, 20 m; B, 10 m. Ce chiffre a été modifié à partir d'Attardo et coll., 201835. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Imagerie de la structure neuronale dans le DG hippocampal utilisant la microscopie de trois-photon (3P). (A-H). Images 3P (plans d'images uniques) de neurones et dendrites étiquetés par GFP dans une souris Thy1-GFP en direct détaillant (A-E) PN sachez les cellules granules CA1 et (F-H) de la DG. Excitation: 1400 nm; pic d'émission : 510 nm. Barre d'échelle : 40 m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film supplémentaire 1 : Champ de vision d'imagerie dans une souris Thy1-GFP en direct. Pile d'images 2P (83 plans d'images, 7 z-espacement) de neurones et dendrites étiquetés par GFP (blanc) dans une souris Thy1-GFP en direct s'étendant du fond de la canule à SLM. Pour tenir compte de la décomposition du signal de fluorescence avec une profondeur croissante, nous avons utilisé un gradient non linéaire du gain des tubes photomultiplicateurs. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Film supplémentaire 2 : Imagerie de la plasticité suscitée par l'activité. Pile d'images 2P (28 plans d'images, 3 z-spacing) de neurones exprimant E-SARE reporter de l'expression IEG dans une souris en direct englobant SP. Green: fluorescence d2Venus. Rouge: Fluorescence TurboFP635. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Ici, une procédure pour la formation image 2P répétée du CA1 dorsal chez les souris vivantes est décrite. Après la chirurgie, la souris récupère habituellement dans les 2 jours. La procédure induit un minimum d'astrogliose26,43. L'hémorragie et l'odema qui pourraient suivre la chirurgie sont habituellement ré-adsorbés dans un délai de 10 à 14 jours. En général, à partir de 14 jours après l'implantation, la préparation est suffisamment claire pour effectuer une imagerie intravitale. Le succès de la chirurgie ne dépend pas de travailler dans un environnement stérile. Cependant, il est crucial de maintenir un niveau élevé d'hygiène, pour éviter les complications dues aux infections associées à la chirurgie. Ceci est obtenu en nettoyant méticuleusement les instruments chirurgicaux avant et après la chirurgie et en les stérilisant à la chaleur immédiatement avant chaque utilisation (étape 2.1.1). La canule optique est conservée dans un récipient propre et stérilisé et rincée avec de la saline stérile juste avant l'implantation. L'exécution des pratiques chirurgicales communes de désinfection des mains et le nettoyage de la station chirurgicale est également très important. La préparation reste stable et permet l'imagerie par résolution cellulaire et subcellulaire pendant plusieurs semaines26,35.
Étapes critiques, modifications et dépannage.
Il est important de peler la capsule externe jusqu'à ce que les fibres les plus profondes soient exposées. Le défaut d'exposer l'alvée pourrait entraîner l'incapacité de se concentrer sur le soma des PN, ou dans des épines dendritiques d'imagerie à résolution réduite, lors de l'utilisation d'objectifs commerciaux avec DEO de 3 ou 4 mm. À cet effet, il est utile d'aérer le néocortex très lentement à l'aide d'une aiguille de 0,9 mm de diamètre, puis de passer à une aiguille de 0,3 à 0,5 mm de diamètre (24-29 jauge) pour un contrôle plus fin de l'aspiration lors de l'enlèvement des fibres les plus dorsales. Alternativement, les forceps fins peuvent être employés pour enlever le cortex restant après exposition de fibre36.
Saignement pendant la chirurgie peut être problématique, comme le sang obstrue la vue. Il est recommandé d'attendre que le caillot se forme, puis de rincer à la saline pour laver le sang résiduel. Répétez au besoin.
Un ajustement serré entre la canule et la craniotomie aide à augmenter la stabilité de la préparation en maintenant la canule en place avant l'application du ciment, surtout si le bord externe de la canule est rincer avec le crâne. Étant donné que les tailles de la perceuse de tréphine et de la canule sont assorties, un ajustement lâche peut surgir en raison d'irrégularités sur le côté de la canule - qui nécessitent des craniotomies légèrement plus grandes pour s'adapter (voir l'étape 2.3.14) - ou d'une craniotomie irrégulière. Toute irrégularité de canule doit être déposée (étapes 1.3 et 1.12) et la tréphine doit être maintenue perpendiculaire au crâne jusqu'à ce que la craniotomie soit terminée (étape 2.3.12). L'enlèvement de la tréphine du crâne avant que la craniotomie soit terminée peut entraîner des craniotomies irrégulières.
Limitations- Invasivité et stabilité de la préparation.
Il est difficile d'évaluer l'effet de l'ablation corticale car il est difficile de définir avec précision les zones touchées directement et indirectement. En général, la chirurgie enlève une partie du cortex pariétal et une partie du cortex sensoriel visuel et postérieur21. Le cortex ablated ne projette pas directement à l'hippocampe et le tissu hippocampal n'est ni touché ni blessé. Fait important, il a été démontré que l'implantation d'une canule d'imagerie ne modifie pas grossièrement la fonction hippocampique et plus particulièrement l'apprentissage hippocampique-dépendant21,36,37,38, 39. Pourtant, il serait important de quantifier dans quelle mesure la canule et la partie externe de l'implant (plaque de porte-tête et capuchon acrylique dentaire) sont des facteurs de stress chroniques en évaluant les taux sanguins de corticostérone et le poids des glandes surrénales par rapport à souris non implantées.
La préparation reste généralement stable de semaines à26mois. À long terme, la croissance de la peau et des os tend à déplacer le capuchon acrylique et à augmenter l'instabilité de la préparation de la formation image.
Limites optiques.
La microscopie 2P conventionnelle permet l'imagerie jusqu'à environ 1 mm de profondeur dans le tissu néocortical40,41. Conformément à cela, il est possible d'image dendrites et d'épines dendritiques situées dans le SR (Figure 2D-F) ou SLM36. Cependant, l'imagerie par une canule pose des limites à l'AnA efficace. Pour atteindre la résolution maximale, le diamètre et la profondeur des canules d'imagerie doivent être appariés à l'imagerie NA, car de plus petits diamètres et des profondeurs plus longues couperont la lumière des objectifs élevés de NA. Par exemple, lors de l'imagerie avec un objectif d'immersion de 1,0 NA à travers une canule de 1,6 mm de long, un diamètre intérieur de 3,65 mm est nécessaire pour garder la NA complète. Cependant, l'utilisation d'une canule de ce diamètre augmentera la compression sur l'hippocampe et pourrait affecter la santé du tissu, pour cette raison, nous utilisons une canule avec un diamètre plus petit. Lors de l'imagerie avec un objectif d'immersion de l'eau de 0,8 NA à travers une canule de 1,6 mm de long, un diamètre intérieur de 2,5 mm serait suffisant pour garder la NA complète. Cependant, 0,8 NA objectifs d'immersion de l'eau ont un DEO plus court (3 mm dans notre cas), qui peut empêcher de se concentrer à la SP.
Ces calculs s'appliquent au centre du champ de vision au bas de la canule. Cependant, déplacer le champ d'imagerie de la vue latéralement - plus près des bords de la canule - ou se concentrer plus profondément dans le tissu - plus loin de la surface de verre de la canule - diminue encore l'Accès NA efficace au plan focal et réduit ainsi la résolution. Cela conduira à une résolution non homogène à travers les différents volumes de tissus imaged et peut être un sujet de préoccupation pour l'imagerie quantitative à la résolution subcellulaire, en particulier lors de l'utilisation de techniques de super-résolution telles que la microscopie 2P-STED42. Ces questions sont moins importantes lors de l'imagerie à la résolution cellulaire.
Mouvement des tissus.
Le mouvement à l'intérieur du tissu - provenant de la respiration et du rythme cardiaque chez les animaux anesthésiés - tend à devenir plus grave avec une distance accrue de la canule d'imagerie. C'est peut-être parce que la canule d'imagerie applique une pression mécanique sur le cerveau contrecarrant ainsi une partie du mouvement à proximité de la canule (de la même façon que les préparations néocorticales). Ainsi, bien que l'imagerie des épines dendritiques soit possible dans SR et SLM, dans nos mains, il est le plus robuste dorsale à l'SO jusqu'à 200 'm de la surface de la canule. Pour compenser le mouvement, nous utilisons des scanners résonnants et une moyenne hors ligne. Plusieurs images (4 à 6 répétitions) sont acquises par plan d'image d'une z-pile à la vitesse maximale disponible (30 images/s). Toutes les répétitions pour chaque z-plan sont ensuite décongestionnées (à l'aide du logiciel commercial, AutoQuant), enregistrées (à l'aide d'ImageJ) et moyennes en une seule image26. Pour l'imagerie de somata, le mouvement est souvent négligeable sur l'anesthésie35 et deux moyennes sont souvent suffisantes pour compenser les artefacts de mouvement.
Applications ou orientations futures de la méthode .
La préparation peut être combinée avec des micro-endoscopes26,43. Les micro-endoscopes sont des sondes optiques rigides qui utilisent des microlenses d'indice de réfraction de gradient (GRIN) pour guider la lumière vers et depuis les tissus profonds18. L'utilisation de micro-endoscopes permet des canules de plus petits diamètres ou même pas de canules du tout. Cependant, les micro-endoscopes commerciaux sont moins bien corrigés pour les aberrations optiques et ont nA inférieur aux objectifs commerciaux. Les sondes actuelles atteignent des résolutions latérales et axiales de 0,6 à 1 m, 10-12 m, respectivement17,18,44. L'utilisation de micro-endoscopes permet également la combinaison de cette préparation avec des microscopes à large champ intégrés montés sur la tête45,46,47.
La méthode se prête également à l'utilisation chez les souris non anesthésiées, et il a été utilisé pour étudier l'activité cellulaire à l'aide de capteurs Ca2 chez les souris éveillées fixées à la tête21,37,48,49. Dans ces cas, en raison des délais rapides des changements de fluorescence, il est conseillé de mettre en œuvre l'enregistrement de ligne50. Il est également possible d'adapter la préparation à l'imagerie d'autres sous-régions hippocampiques telles que le gyrus denté (DG)39,51,52. Combinant cette préparation avec 3P excitation53,54 avec 1 MHz fréquence pulsée laser accordé à 1400 nm, nous avons pu imager plus profondément dans la formation hippocampal atteignant la couche moléculaire, la couche de cellules granules et le hilus du DG (Figure 4) sans enlever la superposition CA1.
En conclusion, nous présentons une méthode qui fournit un accès optique à l'hippocampe dorsal et permet des études longitudinales et corrélatives de la dynamique de la structure et de l'activité hippocampales. Cette technique élargit les possibilités d'analyse de la fonction hippocampique dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
U. A. F. est soutenu par la fondation Schram; C.-W. T. P. et W. G. sont soutenus par la Max Planck Society; L.Y. et R.Y. sont soutenus par la Max Planck Society et le National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. est soutenu par une subvention du 7e PC du Conseil européen de la recherche, des programmes ERANET et I-CORE, du Bureau des scientifiques en chef du Ministère israélien de la Santé, du Ministère fédéral de l'éducation et de la recherche, Roberto et Renata Ruhman, Bruno et Simone Lich, Nella and Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, the Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging and Genomics, The Israel Science Foundation the Perlman Family, Adelis, Marc Besen, Pratt and Irving I. Moskowitz foundations; A. A. est soutenu par la Société Max Planck, la fondation Schram et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Les images 3P ont été acquises au cours advanced course on Neuroimaging Techniques au Max Planck Florida Institute for Neuroscience. Le cours avancé sur les techniques de neuroimagerie est soutenu par la Max Planck Society, le Florida State Max Planck Scientific Fellowship program et par le max Planck Florida Institute Corporation Partnership program. Nous tenons à remercier Thorlabs, Coherent et SpectraPhysics d'avoir fourni un soutien et de l'équipement pour le système d'imagerie 2P /3P pendant le cours. Nous sommes également reconnaissants à Henry Haeberle et Melissa Eberle pour leur aide au système pendant le cours.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
| MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
| MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
| Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
| Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
| Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
| Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
| Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
| UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
| UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
| Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
| Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
| Graefe Forceps - Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
| MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
| Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill - 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
| Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
| 3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
| Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
| Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
| Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
| Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
| Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
| Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
| CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
| Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
| KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
| Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
| Absorption Triangles - Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
| Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
| Blunt needles 0.9x23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.5x42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.3x23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
| Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
| Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
| Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
| Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
| Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
| Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
| Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
| 7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
| Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
| RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
| S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
| Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
| X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
| Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
| Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
| Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
| XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |
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