Summary
इस विधि एक पुरानी तैयारी है कि रहने वाले चूहों के हिप्पोकैम्पस के लिए ऑप्टिकल का उपयोग की अनुमति देता है का वर्णन करता है. इस तैयारी के लिए न्यूरोनल संरचनात्मक प्लास्टिक और गतिविधि के अनुदैर्घ्य ऑप्टिकल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कई हफ्तों की अवधि में सेलुलर plasticity evoked.
Abstract
दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी तंत्रिका विज्ञान के लिए एक मौलिक उपकरण है क्योंकि यह स्थानिक तराजू पर जीवित जानवरों के मस्तिष्क की जांच की अनुमति देता है जिसमें उपकोशिक से लेकर नेटवर्क स्तर तक और मिलीसेकंड से सप्ताह तक अस्थायी तराजू शामिल हैं। इसके अलावा, दो फोटो न इमेजिंग मस्तिष्क समारोह और व्यवहार के बीच कारण संबंधों का पता लगाने के लिए व्यवहार कार्यों की एक किस्म के साथ जोड़ा जा सकता है. हालांकि, स्तनधारियों में, प्रकाश के सीमित प्रवेश और प्रकीर्णन ने ज्यादातर सतही मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए दो-फोटोन इंट्राविटल इमेजिंग सीमित कर दी है, इस प्रकार हिप्पोकैम्पस जैसे गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों की अनुदैर्घ्य जांच को रोक दिया है। हिप्पोकैम्पस स्थानिक नेविगेशन और प्रासंगिक स्मृति में शामिल है और एक लंबे समय से चली आ रही मॉडल सेलुलर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सीखने और याद करने के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया है, दोनों स्वास्थ्य और रोग में. यहाँ, एक तैयारी है कि जीवित चूहों में पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के लिए पुरानी ऑप्टिकल पहुँच सक्षम बनाता है विस्तृत है. इस तैयारी के साथ जोड़ा जा सकता है दो-photon ऑप्टिकल इमेजिंग सेलुलर और सिर में subcellular संकल्प तय, कई हफ्तों से अधिक anesthetized रहते चूहों. इन तकनीकों न्यूरॉन संरचना या गतिविधि की बार-बार इमेजिंग सक्षम करने के लिए दसियों में पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस CA1 में न्यूरॉन्स के सैकड़ों करने के लिए प्लास्टिक की. इसके अलावा, इस पुरानी तैयारी माइक्रो एंडोस्कोपी, सिर पर चढ़कर व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी या तीन-फोटोन माइक्रोस्कोपी जैसे अन्य तकनीकों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रकार बहुत शामिल सेलुलर और नेटवर्क प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपकरण बॉक्स का विस्तार सीखने और स्मृति में.
Introduction
स्तनधारियों में, हिप्पोकैम्पस, एन्कोडिंग के लिए एक प्रमुख मस्तिष्क क्षेत्र है और प्रासंगिक यादों को याद करने के साथ-साथ स्थानिक नेविगेशन1,2,3,4के लिए भी एक महत्वपूर्ण मस्तिष्क क्षेत्र है । इस कारण से, हिप्पोकैम्पस गया है - और अभी भी है - एक बहुत ही महत्वपूर्ण मॉडल बुनियादी तंत्र है कि मस्तिष्क सांकेत: बदलना और यादों को याद करने की अनुमति का अध्ययन करने के लिए5,6,7 या एक वातावरण में नेविगेट करने के लिए8 ,9 पुरस्कार इकट्ठा करने और खतरों से बचने। इसके अतिरिक्त, हिप्पोकैम्पस गठन मस्तिष्क क्षेत्रों में से एक है जहां कृन्तकों के जीवन भर नए न्यूरॉन्स उत्पन्न होते हैं10,11 और संभवतः , मनुष्यों के12,13. अंत में, अध: पतन या हिप्पोकैम्पस गठन की हानि मस्तिष्क संबंधी और मनोरोग विकारों के साथ जुड़े रहे हैं, अल्जाइमर रोग सहित14.
चूहों में, हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क की सतह15के नीचे लगभग 1 मिमी स्थित है। इसकी स्थिति बरकरार मस्तिष्क में ऑप्टिक का उपयोग रोका गया है और इसके परिणामस्वरूप, हिप्पोकैम्पस गतिशीलता के अनुदैर्घ्य अध्ययन ज्यादातर चुंबकीय अनुनाद (एमआर) इमेजिंग, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, और पूर्व विवो इमेजिंग विश्लेषण पर भरोसा किया है। एमआर इमेजिंग तरीकों जैविक प्रक्रियाओं पर नज़र रखने की अनुमति (जैसे, जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन16) एक ही जानवर में कई दिनों से अधिक है, लेकिन स्थानिक संकल्प की कमी एकल न्यूरॉन्स भेदभाव करने के लिए. विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीकों में क्लासिक बहुत उच्च लौकिक संकल्प और झिल्ली क्षमता में परिवर्तन करने के लिए अति सुंदर संवेदनशीलता प्रदान करते हैं। हालांकि, वे एक सीमित स्थानिक संकल्प है और वे मज़बूती से लंबे समय अवधि में एक ही कोशिकाओं को ट्रैक करने की क्षमता की कमी है. ऑप्टिकल इमेजिंग अधिक विविध प्रक्रियाओं अपने उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के आधार पर अध्ययन किया जा करने के लिए अनुमति देता है। हालांकि, पूर्व विवो इमेजिंग केवल चल रही प्रक्रियाओं के स्नैपशॉट प्रदान करता है, और इस प्रकार यह अनुदैर्घ्य अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है जिसके दौरान जानवर सीखने और जानकारी याद करते हैं।
विवो ऑप्टिकल इमेजिंग में ऑप्टिकल इमेजिंग के उन लोगों के साथ एमआर इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के कुछ फायदे को जोड़ती है। इसलिए, यह बहुत अच्छी तरह से माउस मस्तिष्क गतिशीलता और व्यवहार के अनुदैर्घ्य और सहसंबंधी विश्लेषण के लिए अनुकूल है. यह बहुत तेजी से (मिलीसेकंड सेकंड के लिए) या बहुत धीमी गति से (सप्ताह के लिए दिन) समय तराजू के साथ जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन में प्रासंगिक है। ऐसी प्रक्रियाओं है कि तंत्रिका विज्ञान के लिए प्रासंगिक हैं के लिए उदाहरण झिल्ली वोल्टेज गतिशीलता, Ca2 + यात्रियों, सेलुलर plasticity और संरचनात्मक परिवर्तन, जो सभी स्मृति गठन और याद करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण माना जाता है. विवो इमेजिंग में विभिन्न तरीकों ने पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस18,19,20,21,22तक बढा दिया है . तीव्र तैयारी ने पिरामिडीय न्यूरॉन (पीएन ) की गतिविधि के साथ-साथ कई घंटोंकेलिए उनके डेन्ड्रेट और डेन्ड्रिटिक रीढ़ की ट्रैकिंग की अनुमति दी है . तथापि, यह अस्थायी समय-सीमा दीर्घकालिक संरचनात्मक परिवर्तनों की अनुमति नहीं देती है, जो वृद्धिशील अधिगम को कम कर सकती है, जिसका अध्ययन किया जा सकता है। पुरानी तैयारी - माइक्रो एंडोस्कोप के साथ संयोजन में23,24 या लंबे समय तक काम कर दूरी (WD) मानक माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के साथ21 - कई पर पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस की बार-बार इमेजिंग सक्षम है सप्ताह.
यहाँ, हम एक पुरानी तैयारी है कि एक स्थायी रूप से डाला इमेजिंग cannula का उपयोग कर रहने वाले चूहों के पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के CA1 उप क्षेत्र के लिए आवर्तक ऑप्टिक पहुँच प्रदान करता है का वर्णन. इस तैयारी कार्यात्मक अशांति के बिना CA1 के लिए दोहराया उपयोग की अनुमति देता है और intravital दो-फोटोन (2P) या व्यापक क्षेत्र epifluorscence इमेजिंग के लिए उपयुक्त है. लाइव चूहों के पृष्ठीय CA1 में 2P गहरी मस्तिष्क पुरानी इमेजिंग के दो उदाहरण विस्तृत हैं: डेन्ड्रिटिक संरचना और डेन्ड्रिटिक रीढ़ की गतिशीलता के अनुदैर्घ्य इमेजिंग और गतिविधि के अनुदैर्घ्य इमेजिंग-उत्तेजित प्लास्टिकता. तकनीक के मुख्य लाभ और सीमाओं पर चर्चा की जाती है।
Protocol
वर्णित तरीकों के सभी ऊपरी बवेरिया की सरकार द्वारा अनुमोदित किया गया है (लाइसेंस 2016-आरओबी-55.2Vet-2532.Vet$02-16-48) और स्टैनफोर्ड और मैक्स प्लैंक फ्लोरिडा इंस्टीट्यूट द्वारा प्रयोगशाला पशु देखभाल पर तंत्रिका विज्ञान प्रशासनिक पैनलों के लिए.
1. इमेजिंग कैनुला की तैयारी
- चल मापनी तालिका के साथ प्रदान किए गए ड्रिल स्टैंड पर सटीक ड्रिल रखें.
- चल शासक मेज पर एक 3.0 मिमी व्यास स्टेनलेस स्टील ट्यूब दबाना।
- एक 1.6 मिमी लंबी धातु की अंगूठी के लिए ट्यूब कट. यदि काटने के बाद अंगूठी के किनारों कुंद नहीं कर रहे हैं, अनियमितताओं बाहर फ़ाइल.
- धातु की अंगूठी और एक परिपत्र 4 मिमी व्यास गिलास 100% एसीटोन में कवरस्लिप कुल्ला और $ 5 मिनट के लिए सूखी छोड़ दें।
- एक स्टीरियोस्कोप के तहत, एक चिकनी, यहां तक कि और साफ काम जगह पर धातु की अंगूठी और कांच coverslip रखें।
- एक चिकनी सतह पर यूवी-curing ऑप्टिकल चिपकने वाला की एक बूंद रखें, इस तरह के एक पेट्री डिश के रूप में. एक पतली (lt;0.5 मिमी) परत बनाने के लिए चिपकने वाला बाहर फैलाने के लिए एक सुई या एक स्पैचुला का उपयोग करें।
- चिपकने वाला में धातु की अंगूठी के एक तरफ डुबकी के लिए forceps का प्रयोग करें. अंगूठी के अंदर सील करने के लिए नहीं विशेष ध्यान देना। यदि ऐसा होता है, तो रिंग में ऑप्टिकल चिपकने वाला तोड़ने के लिए सुई का उपयोग करें।
- स्टीरियोस्कोप का उपयोग करना, कांच के केंद्र में धातु की अंगूठी की स्थिति कवर पर्ची को छूने चिपकने वाला द्वारा कवर अंगूठी के पक्ष के साथ। चिपकने की एक पतली अंगूठी धातु की अंगूठी और कवरस्लिप के बीच इंटरफेस पर फार्म चाहिए। कवरस्लिप के केंद्र में किसी भी चिपकने वाले प्रसार से बचें।
- यूवी-curing एलईडी चालक इकाई को चालू करें और 1 मिनट के लिए प्रकाश (365 एनएम) चमक।
चेतावनी: यूवी प्रकाश त्वचा जलने को उत्तेजित करता है और एक म्यूटाजेनिक एजेंट है। यूवी की रक्षा चश्मा पहनें और दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट के साथ हाथ और हथियारों को कवर करने के लिए त्वचा जोखिम से बचने के. - चिपकने वाला समान रूप से इलाज करने के लिए, सुनिश्चित करें कि अंगूठी के सभी पक्षों को समान रूप से प्रकाश स्रोत की दिशा बदलकर प्रकाशित कर रहे हैं.
- चिपकने वाला कम से कम 2 एच के लिए कठोर चलो, अधिमानतः, रात भर.
- एक हेमोस्ट के माध्यम से धातु की अंगूठी के खुले सिरे से कैनुला को दृढ़ता से पकड़ लें। एक घूर्णन फ़ाइल के साथ लगे एक दंत ड्रिल का उपयोग करना और स्टीरियोस्कोप के तहत काम कर रहा है, अतिरिक्त ग्लास कवरस्लिप को तब तक फ़ाइल करें जब तक कि रिंग के किनारों के साथ फ्लश न हो जाए (चित्र 1A)।
2. पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस पर इमेजिंग कैनुला का प्रत्यारोपण
- उपकरण और सेटअप की तैयारी
- सुनिश्चित करें कि सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों को साफ और बाँझ कर रहे हैं. नसबंदी के लिए एक गिलास मनका स्टरलाइज़र का उपयोग करते हैं, तो उपकरणों को साफ और उपयोग करने से पहले, 10 मिनट के लिए स्टरलाइज़र (सेट 250 डिग्री सेल्सियस) में उन्हें जगह। वैकल्पिक रूप से, उपयोग करने से पहले उपकरणों को ऑटोक्लेव करें।
- सर्जरी के लिए आवश्यक सभी सामग्री तैयार करें, साथ ही शल्य चिकित्सा उपकरणों, ताकि वे आसानी से पहुँचा जा सकता है।
- सुनिश्चित करें कि दर्द हत्यारों या विरोधी भड़काऊ दवाओं के रूप में पर्याप्त ताजा तैयार दवाएं हैं।
- सुनिश्चित करें कि सर्जरी की पूरी अवधि के लिए पर्याप्त isoflurane है (लगभग 1 एच सर्जरी प्रति).
- हीटिंग कालीन चालू करें और संज्ञाहरण के तहत जबकि पशु तापमान स्थिर रखने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट।
- सुनिश्चित करें कि आईसोलुरेन के लिए अपमार्जन प्रणाली कार्य कर रही है।
- ऑक्सीजन प्रवाह के वाल्व खोलें.
- संज्ञाहरण प्रेरण, और पशु निर्धारण
- 1 L/min O2 में 3% isoflurane पर संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में माउस प्लेस और जब तक यह चेतना खो देता है प्रतीक्षा करें. टो प्रतिवर्त परीक्षण का उपयोग संज्ञाहरण का आकलन करें।
- जानवर का वजन करें।
- विरोधी भड़काऊ (मेलोक्सीकैम, 1mg/Kg) और दर्द हत्यारा (Vetalgin, 200mg/kg) दवाओं subcutaneously लागू करें.
- हीटिंग कालीन पर माउस स्थिति. सुनिश्चित करें कि जानवर थर्मल जलने से बचने के लिए हीटिंग कालीन के साथ सीधे संपर्क में नहीं है।
- स्टीरियोटेक्टिक उपकरण के लिए सिर को सुरक्षित करें और नाक शंकु को स्नाउट को कवर करने के लिए स्थिति दें। संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए, कमी isoflurane करने के लिए 1.5-2%. सर्जरी के दौरान, नेत्रहीन साँस लेने की निगरानी और टो चुटकी पलटा परीक्षण द्वारा माउस राज्य की निगरानी. यदि आवश्यक हो तो isoflurane प्रतिशत विनियमित.
- निर्जलीकरण और संभावित अंधापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मलम लागू करें।
नोट: संज्ञाहरण और पशु दवा के लिए, वैकल्पिक तरीकों और दवाओं संभव हो रहे हैं. कृपया, अपने पशु लाइसेंस और रिश्तेदार साहित्य को देखें.
- ऑप्टिक कैनुला आरोपण
- फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोत चालू करें.
- बालों को निकालें और माउस सिर पर त्वचा कीटाणुरहित.
- कैंची और संदंश का उपयोग करना, माउस खोपड़ी को हटा दें. लैम्ब्डा के पास की स्थिति में खोपड़ी में एक छोटा सा कट बनाकर शुरू करें। दोनों पक्षों पर खोपड़ी खोलने के द्वारा जारी रखें. पहले कान की दिशा में बाद में कदम, फिर rostrally, नेत्र कक्षाओं की दिशा में, sagital अक्ष पर एक त्रिकोण बनाने के लिए, लगभग 4 मिमी रोस्ट्रल करने के लिए bregma. कान और आंखों के बहुत करीब कटौती करने के लिए ध्यान देना नहीं है, लेकिन bregma और Lambda, साथ ही पार्श्विक हड्डियों और ललाट हड्डियों के पीछे आधा बेनकाब.
- खोपड़ी के लिए लिडोनी (28.9% v/v शराब में) की एक बूंद ($10 मिलीग्राम) लागू करें।
- पेरिओस्टेम को साफ़ करें और कपास के झाड़ू का उपयोग करके खोपड़ी को सुखा लें।
- कान सलाखों की स्थिति, माउस सिर को ठीक करने के लिए.
- एक छोटे से craniotomy बनाओ, एक 0.5 मिमी चौड़ाई बर्र के साथ एक माइक्रो-ड्रिल का उपयोग कर. छविवाले हिप्पोकैम्पस के विपरीत ललाट हड्डी में छेद की स्थिति, सैगिटल सीवन से लगभग 1.5 मिमी और कोरोनल सीवन से 2 मिमी दूर।
- खोपड़ी छेद में एक 0.86 मिमी चौड़ाई स्टेनलेस स्टील की हड्डी पेंच पेंच।
- यदि आवश्यक हो, तो मलबे को साफ करें और खोपड़ी को सुखाएं।
- त्वरित चिपकने वाला सीमेंट के मिश्रण की तैयारी
- एक छोटी चम्मच ($ 4.5 मिमी व्यास) का उपयोग करते हुए, एक मिश्रण अच्छी तरह से एल-पाउडर के 1-1.5 स्तर स्कूप वितरित करें।
- कुएं में त्वरित बेस की 3-4 बूंदें वितरित करें।
- अच्छी तरह से में यूनिवर्सल उत्प्रेरक की 1 बूंद दवाना.
- एक सटीक applicator का उपयोग कर 5-10 s के लिए मिश्रण हिलाओ.
नोट: वैकल्पिक सीमेंट उपलब्ध हैं. कृपया अपने निर्माता के निर्देशों को देखें.
- खोपड़ी, पेंच और आसपास की त्वचा पर त्वरित चिपकने वाला सीमेंट लागू करने के लिए सटीक applicators का प्रयोग करें। इसे 30 से 1 मिनट के लिए सूखने दें।
- पार्श्विक हड्डी में एक craniotomy बनाने के लिए एक 3.0 मिमी व्यास ट्रेफिन ड्रिल का प्रयोग करें। छेद को लगभग 1.5 मिमी दूर धनु सीवन से और 2 मिमी लैम्बडोइड सीवन से दूर की स्थिति।
- ध्यान से हड्डी फ्लैप हटा दें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह फिट बैठता है cannula का उपयोग कर craniotomy के आकार की जाँच करें। यदि आवश्यक हो तो craniotomy विस्तार करने के लिए एक 0.5 मिमी या 0.9 मिमी चौड़ाई माइक्रो-ड्रिल का उपयोग करें।
- डुमोंट संदंश का उपयोग करके मेनिंग्स निकालें।
- Ablate cortical बात, बाहरी कैप्सूल तक पहुँचने के लिए. एक वैक्यूम पंप से जुड़े एक 0.9 मिमी व्यास (19 गेज) कुंद सुई का प्रयोग करें। उजागर ऊतक के निर्जलीकरण से बचने के लिए और रक्तस्राव के हल होने के बाद अवशिष्ट रक्त को धोने के लिए नमकीन के साथ सिंचाई करें। धीरे-धीरे, एक समय में $50-100 $m चूसना, जब तक कॉर्टेक्स कैप्सूल से detaches, cingulum या कॉर्पस callosumके फाइबर को उजागर . clogging को रोकने के लिए, सुई बार-बार बदलें।
- फाइबर मुख्य रूप से तीन दिशाओं में विस्तार करते हैं (चित्र 1ख)। ध्यान से पृष्ठीय फाइबर छील जब तक गहरे फाइबर (हिप्पोकैम्पस केalveus) उजागर कर रहे हैं.
- लवण के साथ ऊतक कुल्ला. नीचे कैनुला को लवण में डुबकी और खोपड़ी छेद पर रखने के लिए पतली संदंश का उपयोग करें। कैनुला और ऊतक को कैनुला और ऊतक के बीच हवा के बुलबुले को फँसाने से बचने के लिए लवण द्वारा सील किया जाना चाहिए।
- कैनुला को खोपड़ी में धकेलें (चित्र 1C) जब तक कि कांच की कवरस्लिप फाइबर के संपर्क में न हो।
- अवशोषण त्रिकोण, कपास swabs और / या वैक्यूम पंप का उपयोग कर खोपड़ी अच्छी तरह से सूखी.
- त्वरित चिपकने वाला सीमेंट के मिश्रण की तैयारी (चरण 2.3.10) को देखें।
- खोपड़ी पर त्वरित चिपकने वाला सीमेंट लागू करने के लिए सटीक applicators का प्रयोग करें। कैनुला के रिम पर चिपकने वाला भी लागू करें। चिपकने वाला cannula में चलाने के लिए नहीं जाने के लिए सावधान रहें। इसे 30 से 1 मिनट के लिए सूखने दें।
- खोपड़ी के संपर्क में, कैनुला पर एक सिर धारक प्लेट की स्थिति के लिए एक स्टीरियोटैक्सिक हाथ का उपयोग करें।
- दंत एक्रिलिक के मिश्रण की तैयारी
- एक चम्मच (9 मिमी व्यास का उपयोग करना), एक मिश्रण अच्छी तरह से पाउडर के 1 स्तर स्कूप (1 भाग) वितरित.
- एक ही कुएं में तरल के 2-3 भागों का वितरण करें। पूरे पाउडर को तरल के साथ कवर करें।
- एक spatula का उपयोग कर $ 1 मिनट के लिए हिलाओ.
नोट: वैकल्पिक एक्रिलिक्स उपलब्ध हैं। कृपया अपने निर्माता के निर्देशों को देखें.
- कपाल भर में एक्रिलिक लागू करने के लिए एक spatula या एक सटीक applicator का प्रयोग करें. दंत एक्रिलिक के साथ पूरे उजागर खोपड़ी, पेंच और खुली त्वचा को कवर करें। यह तैयारी को स्थिर बनाता है। एक्रिलिक गर्दन, कान और आंखों के नीचे चलाने मत देना।
- एक्रिलिक सूखी और के बारे में 15 मिनट के लिए कठोर चलो.
- कानवाला में प्रवेश करने से मलबे को रोकने के लिए, सिर धारक प्लेट पर एक हटाने योग्य चिपकने वाला फिल्म लागू करें। यह अनुशंसा की जाती है कि फिल्म का आकार प्लेट से मेल खाता है।
- आइसोफ्लुरेन प्रवाह को बंद करें, स्टीरियोटेक्टिक उपकरण से जानवर को हटा दें और शारीरिक शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए इसे एक हीटिंग प्लेट पर रखें, जबकि यह संज्ञाहरण से उठता है।
- जानवर की निगरानी करें जब तक कि यह कठोर पुनर्वक्तता बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
- उस जानवर को लौटाएं जो पूरी तरह से ठीक होने पर ही अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी से गुजरा है।
3. पोस्टऑपरेटिव देखभाल
- वजन और सामान्य व्यवहार की निगरानी के द्वारा सर्जरी के बाद 2 दिनों के लिए माउस की स्थिति की जाँच करें.
- विरोधी भड़काऊ लागू करें (Meloxicam, 1mg/Kg) और दर्द हत्यारा (Vetalgin, 200mg/kg) दवाओं सर्जरी के बाद 2 दिनों के लिए subcutaneously
नोट: वैकल्पिक निगरानी प्रक्रियाओं, दवाओं और खुराकों पश्चात देखभाल के लिए संभव हैं. कृपया, अपने पशु लाइसेंस और रिश्तेदार साहित्य को देखें.
4. इमेजिंग सत्र की तैयारी
- अग्रिम में इमेजिंग सेटअप चालू करें और लेजर को गर्म और स्थिर करने के लिए करते हैं, यदि आवश्यक हो तो।
- माउस Anesthetize (चरण 2.2.1 को देखें).
- हेड होल्डर प्लेट से चिपकने वाली फिल्म को सावधानी से हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें। माउस को हाथ में और सिर धारक प्लेट को उंगलियों से पकड़ो। फिल्म धीरे निकालें, तैयारी को नुकसान पहुँचाने से बचने के लिए.
- माउस को सूक्ष्मदर्शी के नीचे, हीटिंग कार्पेट के ऊपर रखिए तथा सिर की प्लेट को धारक को सुरक्षित रखें (चित्र 1D)।
- नाक शंकु स्थिति snout को कवर करने के लिए और कमी isoflurane करने के लिए 1.5-2%.
- माउस आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू करें।
- deionized पानी के साथ rinsing द्वारा इमेजिंग कैनुला साफ करें। कैनुला और इसे हटाने के लिए एक वैक्यूम पंप में पानी छोड़ने के लिए एक सिरिंज और एक पतली सुई का उपयोग करें।
5. इमेजिंग सत्र
- नेत्रहीन अवशिष्ट पानी, गंदगी, अखंडता और फ्लोरोसेंट की उपस्थिति के लिए cannula की जांच करने के लिए कम आवर्धन, लंबे समय से काम कर दूरी के उद्देश्यों का प्रयोग करें।
- सिर धारक हथियारों के कोण का समायोजन करके कैनुला को ऑप्टिक अक्ष पर संरेखित करें।
- 25X 1.0 एनए, 4 मिमी WD या 40X 0.8 एनए, 3 मिमी WD, पानी विसर्जन उद्देश्यों के लिए स्विच करें. कैनुला को भरने और कैनुला के शीर्ष पर अतिरिक्त पानी बनाए रखने के लिए पर्याप्त deionized पानी जोड़ें। हवा के बुलबुले के गठन से बचें।
- 2P उत्तेजना और छवि फ्लोरोसेंट संकेतों का प्रयोग करें.
नोट: इमेजिंग प्रोटोकॉल अत्यधिक समय और स्थानिक तराजू पर निर्भर है छवि हो. कृपया इमेजिंग सेटिंग्स हम इस लेख में दिखाया छवियों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया है के बारे में विवरण के लिए वर्गों प्रतिनिधि परिणाम और चर्चा को देखें.
Representative Results
चूंकि cannula सिर्फ CA1 के लिए पृष्ठीय रखा गया है, CA1 के पृष्ठीय पहलू अधिक सूक्ष्मदर्शी के लिए proximal है अगर अधर एक की तुलना में. एल्वियस सबसे समसमी संरचना है जिसके बाद स्ट्रैटम ओरियन्स (एसओ), स्ट्रेटम पिरामिडेल (एसपी), स्तर रेडिएटम (एसआर) और स्ट्रेटम लैकुनोसम आण्विक (एसएलएम), सबसे दूरस्थ परत (चित्र 1 बी) द्वारा पीछा किया जाता है। , सी) उपकोशिकीय संकल्प और सेलुलर संकल्प के साथ गतिविधि-evoked plasticity के साथ न्यूरोनल संरचना के Longitudinal 2P इमेजिंग प्रतिनिधि परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. फ्लोरोफोर्स हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन उत्तेजित करने के लिए (GFP), d2Venus और TurboFP635, एक femtosecond स्पंदित ती: Sapphire लेजर 920 एनएम के लिए देखते प्रयोग किया जाता है और औसत लेजर शक्ति के लिए समायोजित किया जाता है 5-25 mW नमूना पर. विभिन्न उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य उत्सर्जन फिल्टर और विभिन्न photopliplier ट्यूबों का उपयोग कर अलग कर रहे हैं.
डेन्ड्रिटिक संरचना और डेन्ड्रिटिक रीढ़ की दीर्घकालिक इमेजिंग गतिशीलता।
दरदरे लेबल हिप्पोकैम्पस PNs और उनकी संरचना कल्पना करने के लिए, एक Thy1-GFP ट्रांसजेनिक माउस लाइन (एम लाइन) का उपयोग किया जाता है. Thy1-GFP चूहों एक्सप्रेस साइटोप्लाज्मिक बढ़ाया GFP PNs25की एक विरल, यादृच्छिक आबादी में Thy1 प्रमोटर के नियंत्रण में | सामान्यतया, CA1 PNs का मुख्य अक्ष XY-इमेजिंग तल के लम्बवत मोटे तौर पर होता है (चित्र1B, चित्र 2A और अनुपूरक मूवी 1)। बेसल डेंड्राइट SO में विस्तार, सोमा से कैनुला की ओर, जबकि शीर्ष और शीर्ष टफ्ट dendrites विपरीत दिशा में cannula के लिए distally का विस्तार (पूरकमूवी 1)। के बाद से तैयारी alveus बरकरार की गहरी फाइबर छोड़ देता है, कुछ फ्लोरोसेंट फाइबर देखने के क्षेत्र traversing, बस cannula के नीचे, दिखाई देना चाहिए (चित्र 2A और मूवी 1). तैयारी रीढ़ संकल्प के साथ पीएन dendrites के इमेजिंग की अनुमति देता है (चित्र 2 ए सी). छवि dendrites और डेन्ड्रिटिक रीढ़ की हड्डी के लिए, एक 25X 1.0 एनए, 4 मिमी WD, पानी विसर्जन वाणिज्यिक उद्देश्य लेंस प्रयोग किया जाता है.
अनुदैर्घ्य ट्रैकिंग के लिए, कैनुला के दृश्य के क्षेत्र के भीतर कई मस्तिष्क क्षेत्रों को पहले इमेजिंग सत्र के दौरान परिभाषित किया जाता है। प्रत्येक क्षेत्र लगभग 240 x 240 उ के क्षेत्र से मेल खाता है और इसमें 1 और 7 डेन्ड्रिटिक खंडों के बीच होता है (चित्र 2ख) । इन क्षेत्रों को मैन्युअल रूप से एक निम्न आवर्धन त्रि-आयामी स्टैक में मैप किया जाता है जो इमेजिंग कैनुला के नीचे दी गई मात्रा में GFP व्यंजक का प्रतिरूप दर्शाता है (चित्र 2क)। फिर, CA1 PN बेसल dendrites के 1 $m z-कदम छवि ढेर के बारे में 14 दिनों के लिए अलग अलग समय अंतराल पर प्राप्त कर रहे हैं (24 h से 3 दिन) के बारे में 14 दिनों के लिए (चित्र 2C). लंबी इमेजिंग अवधि और अंतरालसंभव 26हैं . प्रत्येक इमेजिंग सत्र लगभग 60 से 90 मिनट तक रहता है। हालांकि अधिकांश छवियों एसओ में डेन्ड्रिटिक रीढ़ की हड्डी के हैं, यह भी एसआर के तिरछी dendrites में डेन्ड्रिटिक रीढ़ की छवि के लिए संभव है (चित्र 2 डी-एफ).। रीढ़ की हड्डी घनत्व के अलावा, इस विधि उनके अस्तित्व, लाभ और हानि दर26,27,28,29,30, मात्रा निर्धारित करके रीढ़ की गतिशीलता के अध्ययन में सक्षम बनाता है 31 , 32. समय के साथ डेन्ड्रिटिक रीढ़ की हड्डी को स्कोर करने और ट्रैक करने के लिए (चित्र 2C) एक कस्टम MATLAB इंटरफ़ेस का उपयोग किया जाता है। यह विभिन्न समय बिंदुओं पर प्राप्त छवि ढेर के संरेखण को सक्षम बनाता है औरसमय 26के साथ डेन्ड्रिटिक लंबाई और रीढ़ की स्थिति पर नज़र रखने के दौरान डेन्ड्रिट और रीढ़ की हड्डी की मैन्युअल लेबलिंग का समर्थन करता है . महत्वपूर्ण बात, इस विधि (प्रत्येक समय बिंदुके अनुसार, पहले एक को छोड़कर) पूर्व मौजूदा और नवजात डेन्ड्रिटिक रीढ़ के बीच भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि डेन्ड्रिटिक रीढ़ के विभिन्न वर्गों को स्मृति अर्जन और प्रतिधारण33में अलग - अलग भूमिकामाना जाता है .
क्रियाकीय-वृद् धप्लास्टिकता का देशांतरीय इमेजिंग।
CA1 PNs में छवि गतिविधि-evoked plasticity करने के लिए, पृष्ठीय CA1 हिप्पोकैम्पस क्षेत्र एक वायरल वेक्टर के साथ इंजेक्शन है एक हरे फ्लोरोसेंट अस्थिर d2Venus synaptic गतिविधि-प्रतिक्रियाशील तत्व का एक बढ़ाया रूप के माध्यम से व्यक्त (ई-SARE) आर्क के भीतर ePGK प्रमोटर34के माध्यम से enhancer/promoter और लाल फ्लोरोसेंट टर्बोFP635 | यह गतिविधि के इमेजिंग स्तर के लिए अनुमति देता है प्रत्येक जानवर35में CA1 PNs के सैकड़ों की प्लास्टिक की. PNs की बहुत सघन लेबलिंग को देखते हुए, आम तौर पर CA1 PNs (पूरकमूवी 2) के डेन्ड्राइट को हल करना संभव नहीं है।
CA1 PNs के somata छवि के लिए, एक 40X 0.8 एनए, 3 मिमी WD, पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस प्रयोग किया जाता है. अनुदैर्घ्य ट्रैकिंग के लिए, 1 से 9 मस्तिष्क क्षेत्रों पहले इमेजिंग सत्र के दौरान माउस प्रति परिभाषित कर रहे हैं. प्रत्येक क्षेत्र लगभग 300 x 300 उ के क्षेत्रसे मेल खाता है और इसमें 50 और 150 कोशिकाओं के बीच होता है (चित्र 3क) इन क्षेत्रों को मैन्युअल रूप से एक कम आवर्धन पर दिखाई स्थानीय ऊतक स्थलों के लिए मैप कर रहे हैं. फिर, 3 m z-चरण छवि स्टैक प्राप्त किए जाते हैं, जो लगभग 30 दिनों तक के लिए अलग-अलग समय अंतरालों (24 h से 6 दिनों तक) पर CA1 PNs (चित्र 3A और पूरक मूवी 2) के SP को शामिल करते हैं. प्रत्येक इमेजिंग सत्र लगभग 60 से 90 मिनट ई-सरे सक्रियण चोटियों 6 से 8 एच एक नया या समृद्ध वातावरण (ईई, चित्रा 3 बी) के लिए एक जोखिम के बाद रहता है और कुछ दिनों के पाठ्यक्रम पर decays. इस प्रकार, हम आम तौर पर 6 से 8 एच अनुभव के बाद छवि और इमेजिंग सत्र35के बीच 5 दिनों के लिए अनुमति देते हैं.
d2Venus और TurboFP635 फ्लोरोसेंट मानों की मात्रा निर्धारित करने के लिए, एक परिपत्र क्षेत्र के ब्याज 4.64 मीटर व्यास में तैयार की है, जो एक तंत्रिका कोशिका शरीर से छोटा है, सेल सोमा के लिए केंद्रित. फिर हम अगली बार बिंदु पर प्रगति करते हैं, उसी प्रकार एक ही सेल का सोमा स्कोर करते हैं, और सभी समय बिंदुओं और अनुदैर्घ्य डेटासेट में सभी दृश्यमान कोशिकाओं के लिए इस प्रक्रिया को फिर से निर्धारित करते हैं। प्रत्येक न्यूरॉन का औसत मूल्य (सक्रियता पर निर्भर) d2Venus उत्सर्जन अपने मतलब (सक्रियता-स्वतंत्र) TurboFP635 उत्सर्जन द्वारा सामान्यीकृत है. इस विधि CA1 PNs35 के पहनावा प्लास्टिक की दीर्घकालिक गतिशीलता की जांच सक्षम बनाता है (चित्र 3C) .
चित्रा 1: विवो गहरे मस्तिष्क ऑप्टिकल इमेजिंग में के लिए तैयारी। (A) ऊपर (बाएं) और पक्ष (दाएं) उदाहरण इमेजिंग cannuals के विचार. इमेजिंग कैनुला के पास हिप्पोकैम्पस तक ऑप्टिकल एक्सेस की अनुमति देने के लिए एक पारदर्शी कांच का नीचे होता है। (बी) इमेजिंग कैनुला, एक CA1 पीएन और पृष्ठीय से अधर तक फाइबर की तीन परतों के सापेक्ष स्थिति पर प्रकाश डाला तैयारी का योजनाबद्ध विवरण. (सी, डी)। इमेजिंग सेटअप (सी) और एक इमेजिंग सत्र के दौरान पशु निर्धारण (डी) का योजनाबद्ध विवरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: डेन्ड्रिटिक संरचना और डेन्ड्रिटिक रीढ़ की दीर्घकालिक इमेजिंग गतिशीलता। (ए) 2P छवि स्टैक (अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन (एमआईपी) 59 छवि विमानों की, न्यूरॉन्स और एक जीवित Thy1-GFP माउस में GFP द्वारा लेबल dendrites के 2 m z-spacing.. (ब) उच्च आवर्धन (53 छवि विमानों के MIP, 1 $m z-spacing) SO में स्थित बेसल dendrites विवरण. (सी) एक डेन्ड्रिटिक खंड के समय चूक छवि अनुक्रम 14 दिनों से अधिक छवि. एरोहेड्स 14 दिनों में ट्रैक किए गए डेन्ड्रिटिक रीढ़ का संकेत देते हैं। (डी, ई)। न्यूरॉन्स और एक जीवित Thy1-GFP माउस में GFP द्वारा लेबल dendrites की 2P छवि ढेर; (घ) $Y प्रक्षेपण (31 प्रतिबिंब विमान, 3 उ z-स्पेसिंग) तथा (म्) XY अनुमानों (17 प्रतिबिंब विमानों, 3 उ z-रिक्ति)। (च) उच्च आवर्धन (एकल छवि विमान) शीर्ष डेन्ड्रोइट्स और डेन्ड्रिटिक रीढ़ का विवरण एसआर एरोहेड्स में स्थित डेन्ड्रिटिक रीढ़ का संकेत देते हैं। उत्तेजना: 920 एनएम; उत्सर्जन शिखर: 510 एनएम. स्केल बार: A, 50 डिग्री; बी, 10 डिग्री मी; सी, 2 डिग्री मी; डी और ई, 15 डिग्री मी; एफ, 4 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: गतिविधि की देशांतर्गत इमेजिंग-उत्तेजित प्लास्टिकता. (एक) 2P छवियों (एकल छवि विमानों) एक जीवित माउस से, बेसलाइन दिवस 0 पर और दिन 1 पर ईई के बाद एक ही कोशिकाओं को दिखा. (बी) 2P छवि ढेर (4-6 छवि विमानों के MIPs, 3 $m z-pacing) पर्यावरण A (दिन 1, 19 और 25) और पर्यावरण बी (दिन 7 और 13) के लिए विशिष्ट ई-सेरे सक्रियण पैटर्न दिखा. ग्रीन: d2Venus फ्लोरोसेंट. लाल: TurboFP635 फ्लोरोसेंट. उत्तेजना: 920 एनएम; d2Venus उत्सर्जन शिखर: 530 एनएम; टर्बोएफपी635 उत्सर्जन शिखर: 635nm. स्केल बार: A, 20 डिग्री; बी, 10 डिग्री मी. यह आंकड़ा Attardo एट अल से संशोधित किया गया है, 201835. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: तीन-फोटोन (3 पी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हिप्पोकैम्पस डीजी में न्यूरोनल संरचना की इमेजिंग। (ए-एच)। 3P छवियों (एकल छवि विमानों) न्यूरॉन्स और dendrites के एक जीवित Thy1-GFP माउस विवरण में GFP द्वारा लेबल (ए-ई) सीए 1 में पी एन और (एफ-एच) डीजी में ग्रेन्युल कोशिकाओं. उत्तेजना: 1400 एनएम; उत्सर्जन शिखर: 510 एनएम. स्केल बार: 40 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक मूवी 1: एक जीवित Thy1-GFP माउस में देखने की इमेजिंग क्षेत्र. 2P छवि ढेर (83 छवि विमानों, 7 m z-spacing) न्यूरॉन्स और dendrites GFP द्वारा लेबल (सफेद) एक जीवित Thy1-GFP माउस में cannula के नीचे से SLM के लिए विस्तार. बढ़ती गहराई के साथ फ्लोरोसेंट संकेत के क्षय के लिए खाते में, हम photopliplier ट्यूबों के लाभ के एक गैर रेखीय ढाल का इस्तेमाल किया. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक मूवी 2: गतिविधि की इमेजिंग-उत्तेजित प्लास्टिकता. 2P छवि स्टैक (28 छवि विमानों, 3 m z-spacing) न्यूरॉन्स के एक जीवित माउस में IEG अभिव्यक्ति के ई-सरे रिपोर्टर व्यक्त SP. ग्रीन: d2Venus फ्लोरोसेंट. लाल: TurboFP635 फ्लोरोसेंट. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
Discussion
यहाँ, लाइव चूहों में पृष्ठीय CA1 के दोहराया 2P इमेजिंग के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है. सर्जरी के बाद, माउस आमतौर पर 2 दिनों के भीतर ठीक हो जाता है। इस प्रक्रिया से कम से कम एस्ट्रोग्लियोसिस26,43पैदा होती है . रक्तस्राव और एडीमा जो सर्जरी का पालन कर सकते हैं आमतौर पर 10 से 14 दिनों के भीतर फिर से adsorbed हैं। आम तौर पर, 14 दिनों के बाद प्रत्यारोपण के बाद से तैयारी इंट्राविटल इमेजिंग करने के लिए पर्याप्त रूप से स्पष्ट है। सर्जरी की सफलता एक बाँझ वातावरण में काम करने पर निर्भर नहीं करता है। हालांकि, सर्जरी से जुड़े संक्रमण के कारण जटिलताओं से बचने के लिए, स्वच्छता के उच्च स्तर को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। यह सावधानी से सर्जरी से पहले और बाद में शल्य चिकित्सा उपकरणों की सफाई और गर्मी से उन्हें तुरंत प्रत्येक उपयोग से पहले स्टरलाइज़ करके प्राप्त की है (चरण 2.1.1). ऑप्टिक कैनुला को एक साफ, बाँझ कंटेनर में रखा जाता है और प्रत्यारोपण से ठीक पहले बाँझ नमकीन के साथ कुल्ला किया जाता है। हाथ कीटाणुशोधन और सर्जिकल स्टेशन की सफाई के आम शल्य चिकित्सा प्रथाओं का प्रदर्शन भी बहुत महत्वपूर्ण है। तैयारी स्थिर बनी हुई है और कई सप्ताह26,35के लिए सेलुलर और उपकोशिकीय संकल्प इमेजिंग की अनुमति देता है .
महत्वपूर्ण कदम, संशोधन और समस्या निवारण.
यह गहरे फाइबर उजागर कर रहे हैं जब तक बाहरी कैप्सूल छील करने के लिए महत्वपूर्ण है. Alveus का पर्दाफाश करने में विफलता PNs की सोमा पर ध्यान केंद्रित करने में असमर्थता में परिणाम हो सकता है, या कम संकल्प इमेजिंग डेन्ड्रिटिक रीढ़ में, जब 3 या 4-मिमी WD के साथ वाणिज्यिक उद्देश्यों का उपयोग कर. इस उद्देश्य के लिए, यह बहुत धीरे धीरे एक 0.9 मिमी व्यास सुई का उपयोग कर neocortex ablate करने के लिए उपयोगी है और फिर सबसे पृष्ठीय फाइबर को हटाने जब चूषण की एक बेहतर नियंत्रण के लिए एक 0.3-0.5 मिमी व्यास (24-29 गेज) सुई के लिए स्विच. वैकल्पिक रूप से, ठीक forceps फाइबर जोखिम36के बाद शेष प्रांतस्था को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
सर्जरी के दौरान रक्त स्राव समस्याग्रस्त हो सकता है, क्योंकि रक्त दृश्य में बाधा डालता है। थक्का बनाने के लिए प्रतीक्षा कर रहा है और फिर अवशिष्ट रक्त को धोने के लिए नमकीन के साथ rinsing की सिफारिश की जाती है। आवश्यकतानुसार दोहराएँ.
कैनुला और क्रैनियोटोमी के बीच एक सुखद फिट सीमेंट के आवेदन से पहले कैनुला को जगह में रखकर तैयारी की स्थिरता को बढ़ाने में मदद करता है, खासकर अगर कैनुला का बाहरी रिम खोपड़ी के साथ फ्लश होता है। के बाद से trephine ड्रिल और cannula के आकार मिलान कर रहे हैं, एक ढीला फिट कैनुला के पक्ष में अनियमितताओं की वजह से पैदा कर सकते हैं - जो थोड़ा बड़ा craniotomies फिट करने की आवश्यकता होती है (चरण 2.3.14 देखें) - या एक अनियमित craniotomy से. किसी भी cannula अनियमितताओं से दायर किया जाना चाहिए (चरण 1.3 और 1.12) और ट्रेफिन खोपड़ी के सीधा आयोजित किया जाना चाहिए जब तक craniotomy पूरा हो गया है (चरण 2.3.12). कपाल रचना पूरी होने से पहले खोपड़ी से ट्रेफिन निकालना अनियमित क्रैनिओटॉमी हो सकता है।
सीमाएं- आक्रामकता और तैयारी की स्थिरता.
यह cortical ablation के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल है के रूप में यह ठीक से प्रत्यक्ष और परोक्ष रूप से प्रभावित क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए कठिन है. सामान्य तौर पर, सर्जरी पार्श्विक प्रांतस्था के हिस्से और दृश्य और हिंदलिम संवेदी प्रांतस्था21के हिस्से को हटा देती है। ablated प्रांतस्था सीधे हिप्पोकैम्पस और हिप्पोकैम्पस ऊतक के लिए परियोजना नहीं है न तो छुआ है और न ही घायल. महत्वपूर्ण बात यह है कि यह दिखाया गया है कि एक इमेजिंग कैनुला का प्रत्यारोपण हिप्पोकैम्पस समारोह और विशेष रूप से हिप्पोकैम्पस-निर्भर सीखने21,36,37,38, 39. फिर भी, यह क्या हद तक दोनों cannula और प्रत्यारोपण के बाहरी भाग (सिर धारक प्लेट और दंत एक्रिलिक टोपी) corticosterone रक्त के स्तर और अधिवृक्क ग्रंथि वजन की तुलना में आकलन करके पुरानी तनाव हैं मात्रा निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा प्रत्यारोपित चूहों.
तैयारी आम तौर पर सप्ताह से26महीने तक स्थिर रहती है . लंबे समय में, त्वचा और हड्डी के विकास के लिए एक्रिलिक टोपी विस्थापित करते हैं और इमेजिंग तैयारी की अस्थिरता में वृद्धि.
ऑप्टिकल सीमाओं.
पारंपरिक 2P माइक्रोस्कोपी के बारे में 1 मिमी तक इमेजिंग की अनुमति देता है neocortical ऊतक40,41में गहरी . इस के अनुरूप, यह एसआर में स्थित डेन्ड्रिट और डेन्ड्रिटिक रीढ़ की छवि के लिए संभव है (चित्र 2 डी-एफ) या SLM36. हालांकि, एक cannula के माध्यम से इमेजिंग प्रभावी एनए के लिए सीमाओं बन गया है. अधिकतम संकल्प को प्राप्त करने के लिए, व्यास और इमेजिंग cannulas की गहराई इमेजिंग एनए के लिए मिलान किया जाना चाहिए, के रूप में छोटे व्यास और अब गहराई उच्च NA उद्देश्यों के प्रकाश क्लिप जाएगा. उदाहरण के लिए, जब एक 1.6 मिमी लंबे cannula के माध्यम से एक 1.0 एनए पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ इमेजिंग, एक 3.65 मिमी आंतरिक व्यास पूर्ण एनए रखने की जरूरत है. हालांकि, इस व्यास के एक cannula का उपयोग हिप्पोकैम्पस पर संपीड़न में वृद्धि होगी और ऊतक के स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकता है, इस कारण के लिए, हम एक छोटे व्यास के साथ एक cannula का उपयोग करें. जब एक 1.6 मिमी लंबे cannula के माध्यम से एक 0.8 एनए पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ इमेजिंग, 2.5 मिमी के एक आंतरिक व्यास पूर्ण एनए रखने के लिए पर्याप्त होगा. हालांकि, 0.8 एनए पानी विसर्जन उद्देश्यों एक छोटे WD है (3 मिमी हमारे मामले में), जो सपा पर ध्यान केंद्रित करने से रोका जा सकता है.
ये परिकलन कैनुला के निचले भाग में दृश्य के क्षेत्र के केंद्र पर लागू होते हैं. हालांकि, दृश्य के इमेजिंग क्षेत्र को पक्षवार ले जाना - कैनुला के किनारों के करीब - या ऊतक में गहरा ध्यान केंद्रित करना - कैनुला के कांच की सतह से आगे - फोकल प्लेन पर प्रभावी एनए को और कम कर देता है और इस प्रकार संकल्प को कम कर देता है। यह छवि वाले ऊतक के विभिन्न संस्करणों में गैर समजात संकल्प करने के लिए नेतृत्व करेंगे और subcellular संकल्प पर मात्रात्मक इमेजिंग के लिए एक चिंता का विषय हो सकता है, खासकर जब इस तरह के 2P-STED माइक्रोस्कोपी42के रूप में सुपर संकल्प तकनीक का उपयोग कर . इन मुद्दों को कम महत्वपूर्ण हैं जब सेलुलर संकल्प पर इमेजिंग.
ऊतक गति.
ऊतक के भीतर गति - एनेस्थेटाइज़्ड जानवरों में सांस लेने और दिल की धड़कन से निकलने वाली गति - इमेजिंग कैनुला से बढ़ी हुई दूरी के साथ अधिक गंभीर हो जाती है। यह संभवतः इसलिए है क्योंकि इमेजिंग कैनुला मस्तिष्क पर यांत्रिक दबाव लागू करता है इस प्रकार कैनुला के आसपास के क्षेत्र में गति के कुछ प्रतिक्रिया (नियोकोर्टिक तैयारी के समान)। इस प्रकार, हालांकि डेन्ड्रिटिक रीढ़ की इमेजिंग एसआर और एसएलएम में संभव है, हमारे हाथों में, यह कैनुला की सतह से $200 डिग्री तक SO के लिए सबसे मजबूत पृष्ठीय है। गति के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, हम गुंजयमान स्कैनर और ऑफ़लाइन औसत का उपयोग करें। कई छवियों (4 से 6 repetitions) अधिकतम उपलब्ध गति (30 फ्रेम / प्रत्येक z-plane के लिए सभी repetitions तो deconvolved हैं (वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, AutoQuant), पंजीकृत (ImageJ का उपयोग कर) और एक ही छवि में औसत26. सोमाटा की इमेजिंग के लिए, गति अक्सर संज्ञाहरण35 पर नगण्य है और दो औसत अक्सर गति कलाकृतियों के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए पर्याप्त हैं।
भविष्य के आवेदन या विधि के निर्देश .
तैयारी माइक्रो एंडोस्कोप के साथ जोड़ा जा सकता है26,43. माइक्रो-एंडोस्कोप कठोर ऑप्टिक जांच होते हैं जो गहरे ऊतक18के लिए प्रकाश का मार्गदर्शन करने के लिए ढाली अपवर्तक सूचकांक (जीआरआईआर) माइक्रोलेन्स का उपयोग करते हैं। माइक्रो एंडोस्कोप का उपयोग छोटे व्यास या यहां तक कि कोई cannulas के cannulas की अनुमति देता है. हालांकि, वाणिज्यिक माइक्रो एंडोस्कोप कम अच्छी तरह से ऑप्टिकल विपथन के लिए सही कर रहे हैं और वाणिज्यिक उद्देश्यों की तुलना में कम एनए है. वर्तमान अन्वेषण ों की ताक्षर एवं अक्षीय रिज़ॉल्यूशन ों तक पहुँच जाते हैं, जो क्रमशः17,18,44हैं। माइक्रो-एंडोस्कोप ्सके यूज होने से इस तैयारी का संयोजन सिर पर चढ़कर एकीकृत वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप45,46,47के साथ भी मिल सकता है.
विधि भी गैर-एनेस्थेटाइज्ड चूहों में उपयोग करने के लिए उधार देता है, और यह जाग सिर में सी2 + सेंसर का उपयोग सेलुलर गतिविधि की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है21,37,48,49. इन मामलों में, फ्लोरोसेंट परिवर्तन के तेजी से समय तराजू के कारण, लाइन पंजीकरण50को लागू करने की सलाह दी जाती है। अन्य हिप्पोकैम्पस उप-क्षेत्रों जैसे दंतेले जाइरस (डीजी)39,51,52के इमेजिंग के लिए तैयारी को भी अनुकूलित करना संभव है . 3P उत्तेजना53के साथ इस तैयारी के संयोजन,54 के साथ 1 मेगाहर्ट्ज आवृत्ति स्पंदित लेजर 1400 एनएम करने के लिए देखते हैं, हम हिप्पोकैम्पस गठन आणविक परत तक पहुँचने में गहरी छवि करने में सक्षम थे, ग्रेन्युल सेल परत और डीजी की हिलाहट (चित्र 4) ओवरलेइंग सीए 1 को हटाए बिना।
अंत में, हम एक विधि है कि पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के लिए ऑप्टिकल पहुँच प्रदान करता है और हिप्पोकैम्पस संरचना और गतिविधि की गतिशीलता के अनुदैर्घ्य और सहसंबंधी अध्ययन की अनुमति देता है प्रस्तुत करते हैं. इस तकनीक शारीरिक और रोग की स्थिति के तहत हिप्पोकैम्पस समारोह के विश्लेषण की संभावनाओं का विस्तार.
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यू. ए. एफ. Schram नींव द्वारा समर्थित है; C.-W. T. P. और W. G. Max प्लैंक सोसायटी द्वारा समर्थित हैं; एल.वाई. और आर.वाई. मैक्स प्लैंक सोसायटी और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01MH080047, 1DP1NS096787) द्वारा समर्थित हैं; ए सी यूरोपीय अनुसंधान परिषद से एक FP7 अनुदान द्वारा समर्थित है, ERANET और मैं कोर कार्यक्रमों, इजरायल के स्वास्थ्य मंत्रालय के मुख्य वैज्ञानिक कार्यालय, संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय, रॉबर्टो और Renata Ruhman, ब्रूनो और सिमोन लीच, नेला और लियोन बेनोजीयो सेंटर फॉर न्यूरोलॉजिकल डिजामेंट्स, हेनरी चानोच क्रेन्ट इंस्टीट्यूट फॉर बायोमेडिकल इमेजिंग एंड जीनोमिक्स, द इज़राइल साइंस फाउंडेशन द पर्लमैन परिवार, एडेलिस, मार्क बेसन, प्रैट और इरविंग I. Moskowitz फाउंडेशन; ए. ए मैक्स प्लैंक सोसायटी, श्राम फाउंडेशन और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा समर्थित है। 3P छवियों को न्यूरोइमेजिंग तकनीक पर उन्नत पाठ्यक्रम के दौरान मैक्स प्लैंक फ्लोरिडा इंस्टीट्यूट फॉर न्यूरोसाइंस में अधिग्रहण किया गया था। Neuroimaging तकनीक पर उन्नत पाठ्यक्रम मैक्स प्लैंक सोसायटी, फ्लोरिडा राज्य मैक्स प्लैंक वैज्ञानिक फैलोशिप कार्यक्रम और मैक्स प्लैंक फ्लोरिडा संस्थान निगम भागीदारी कार्यक्रम द्वारा समर्थित है. हम पाठ्यक्रम के दौरान 2P / 3P इमेजिंग प्रणाली के लिए समर्थन और उपकरण प्रदान करने के लिए Thorlabs, सुसंगत और SpectraPhysics धन्यवाद देना चाहते हैं. हम भी पाठ्यक्रम के दौरान प्रणाली के साथ सहायता के लिए हेनरी Haeberle और Melissa Eberle के आभारी हैं.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
Graefe Forceps - Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill - 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles - Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9x23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5x42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3x23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
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Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
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Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |
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