Summary
Denna metod beskriver en kronisk beredning som tillåter optisk tillgång till Hippocampus levande möss. Denna beredning kan användas för att utföra longitudinell optisk avbildning av neuronala strukturella plasticitet och aktivitet-framkallat cellulär plasticitet under en period av flera veckor.
Abstract
Två-Photon mikroskopi är ett grundläggande verktyg för neurovetenskap eftersom det tillåter undersökning av hjärnan hos levande djur på rumsliga skalor allt från subcellulära till nätverksnivåer och vid tidsmässiga skalor från millisekunder till veckor. Dessutom kan två-Photon Imaging kombineras med en mängd olika beteendemässiga uppgifter för att utforska orsakssambanden mellan hjärnans funktion och beteende. Men hos däggdjur, begränsad penetration och spridning av ljus har begränsad två-Photon intravital avbildning mestadels till ytliga hjärnregioner, vilket utesluter longitudinell undersökning av djupa hjärnområden såsom hippocampus. Hippocampus är involverad i spatial navigering och episodiskt minne och är en långvarig modell som används för att studera cellulära samt kognitiva processer viktiga för inlärning och återkallande, både i hälsa och sjukdom. Här, en beredning som möjliggör kronisk optisk tillgång till dorsala Hippocampus i levande möss är detaljerad. Denna beredning kan kombineras med två-Photon optisk avbildning på cellulära och subcellulära upplösning i huvudet fast, sövda levande möss under flera veckor. Dessa tekniker möjliggör upprepad avbildning av neuronala struktur eller aktivitet-framkallat plasticitet i tiotals till hundratals nervceller i dorsala Hippocampus CA1. Dessutom kan detta kroniska preparat användas i kombination med andra tekniker såsom mikro-endoskopi, Head-monterad wide fält mikroskopi eller tre-Photon mikroskopi, vilket kraftigt expanderande verktygslådan för att studera cellulära och nätverk processer inblandade i inlärning och minne.
Introduction
Hos däggdjur, Hippocampus är en viktig hjärnregion för kodning och återkallande av episodiska minnen samt för rumslig navigering1,2,3,4. Av denna anledning har Hippocampus varit-och fortfarande är-en mycket viktig modell för att studera de grundläggande mekanismer som gör det möjligt för hjärnan att koda och återkalla minnen5,6,7 eller att navigera i en miljö8 ,9 samla belöningar och undvika faror. Dessutom är den Hippocampus formation en av de hjärnregioner där nya nervceller genereras under hela livet av gnagare10,11 och, möjligen, av människor12,13. Slutligen, degeneration eller försämring av hippocampus bildandet är förknippade med neurologiska och psykiska störningar, inklusive Alzheimers sjukdom14.
I möss, Hippocampus ligger cirka 1 mm under hjärn ytan15. Dess position har förhindrat optisk åtkomst i intakt hjärna och följaktligen, longitudinella studier av hippocampus dynamik har åberopats främst på magnetisk resonans (MR) Imaging, elektrofysiologi, och ex vivo Imaging analyser. MR Imaging metoder tillåter spårning av biologiska processer (t. ex., genuttryck förändringar16) i samma djur under flera dagar, men saknar den rumsliga upplösningen att diskriminera enstaka nervceller. Klassisk in vivo elektrofysiologiska tekniker erbjuder mycket hög temporala upplösning och utsökt känslighet för förändringar i membranet potential. De har dock en begränsad rumslig upplösning och de saknar förmågan att på ett tillförlitligt sätt spåra samma celler över längre tidsperioder. Optisk avbildning gör att mer varierande processer kan studeras på grund av dess höga temporala och rumsliga upplösningar. Ex vivo Imaging ger dock endast ögonblicksbilder av pågående processer, och därför är det inte lämpligt för longitudinella studier under vilka djuren lär sig och minns information.
In vivo optisk avbildning kombinerar vissa fördelar med MR Imaging och elektrofysiologi med de av optisk avbildning. Därför är det mycket väl lämpad för longitudinella och korrelativa analyser av mus hjärnans dynamik och beteende. Detta är relevant i studier av biologiska processer med mycket snabb (millisekunder till sekunder) eller mycket långsamma (dagar till veckor) tidsskalor. Exempel på sådana processer som är relevanta för neurovetenskap är membranspänningsdynamik, ca2 + transienter, cellulär plasticitet och strukturella förändringar, som alla tros vara mycket viktiga för minnesbildning och återkallande. Olika metoder har förlängt in vivo avbildning till dorsala Hippocampus18,19,20,21,22. Akuta preparat har gjort det möjligt att spåra pyramidala neuron (PN) aktivitet samt deras dendriter och dendritiska Taggar i flera timmar20,22. Denna tidsmässiga tidsram medger dock inte långsiktiga strukturella förändringar, som kan ligga till grund för stegvis inlärning, som skall studeras. Kroniska preparat-i kombination med mikro-endoskop23,24 eller med långa arbetsavstånd (WD) standard Mikroskop mål21 -har möjliggjort upprepad avbildning av dorsala Hippocampus över flera Veckor.
Här beskriver vi en kronisk beredning som ger återkommande optisk tillgång till CA1 sub-området i dorsala Hippocampus levande möss med en permanent insatt Imaging kanyl. Denna beredning möjliggör upprepad tillgång till CA1 utan funktionella störningar och är lämplig för intravital två-Photon (2P) eller wide-fält epifluorescens Imaging. Två exempel på 2P djupa hjärnan kronisk avbildning i dorsala CA1 av levande möss är detaljerade: longitudinell avbildning av dendritiska struktur och dendritiska ryggraden dynamik och longitudinell avbildning av aktivitet-framkallat plasticitet. Den salient fördelar och begränsningar av tekniken diskuteras.
Protocol
Alla beskrivna metoder har godkänts av regeringen i Oberbayern (licens 2016_ROB-55,2 vet-2532. Vet_02-16-48) och av Stanford och Max Planck-institutet för neurovetenskap administrativa paneler på laboratoriedjur omsorg.
1. beredning av bild kanyl
- Håll en precisions borr på ett borrstativ som levereras med ett rörligt linjalbord.
- Spänn fast en 3,0 mm diameter av rostfritt stålrör på det rörliga linjalbordet.
- Skär röret till en 1,6 mm lång metallring. Om kanterna på ringen inte är trubbiga efter styckning, fil ut oegentligheterna.
- Skölj metallringen och en cirkulär 4 mm diameter glastäckslip i 100% aceton och låt torka för ≈ 5 min.
- Placera metallringen och glas täckglasets på en slät, jämn och ren arbetsplats, under ett stereoskop.
- Placera en droppe UV-härdande optisk lim på en slät yta, till exempel en petriskål. Använd en nål eller en spatel för att sprida ut limmet för att bilda ett tunt (< 0,5 mm) skikt.
- Använd tång för att doppa ena sidan av metallringen i limmet. Ägna särskild uppmärksamhet inte för att täta insidan av ringen. Om detta händer, Använd en nål för att bryta det optiska limmet i ringen.
- Med hjälp av stereoskop, placera metallringen i mitten av glaset täckglas med sidan av ringen täcks av lim vidrör täckglasets. En tunn ring av lim bör bildas vid gränssnittet mellan metallringen och täckslip. Undvik att lim sprids till mitten av täckslip.
- Slå på den UV-härdande LED-drivrutinsenheten och glans ljus (365 nm) i 1 min.
Varning: UV-ljus framkallar brännskador på huden och är en mutagen agent. Använd UV-skyddande glasögon och täck händer och armar med handskar och en Lab-Coat för att undvika hudexponering. - För att bota limmet jämnt, se till att alla sidor av ringen är lika belysta genom att ändra riktningen på ljuskällan.
- Låt limmet hårdna i minst 2 timmar, företrädesvis, över natten.
- Stadigt hålla kanyl från den öppna änden av metallringen med hjälp av en hemostat. Med hjälp av en tand borr försedd med en roterande fil och arbetar under stereoskop, fil bort överflödigt glas täckglasburk tills spola med sidorna av ringen (figur 1a).
2. implantation av Imaging kanyl över dorsala Hippocampus
- Beredning av utrustning och installation
- Se till att alla kirurgiska instrument är rena och sterila. Om du använder en glaspärla autoklav för sterilisering, rengör instrumenten och placera dem i autoklaven (inställd på 250 ° c) för 10 min, före användning. Alternativt autoklav instrumenten före användning.
- Förbered allt material som krävs för operationen, samt kirurgiska instrument, så att de kan nås lätt.
- Se till att det finns tillräckligt med nyberedda mediciner som smärtstillande eller antiinflammatoriska läkemedel.
- Se till att det finns tillräckligt med isofluran under hela operationen (cirka 1 h per operation).
- Slå på Värmemattan och Ställ in den på 37 ° c för att hålla djur temperaturen stabil under anestesi.
- Kontrollera att rensnings systemet för isofluran fungerar.
- Öppna ventilen av syre flöde.
- Anestesi induktion och djurfixering
- Placera musen i anestesi induktions kammaren på 3% isofluran i 1 L/min O2 och vänta tills den förlorar medvetandet. Utvärdera anestesi med tå nypa reflex test.
- Väg djuret.
- Applicera Anti-inflammatorisk (meloxikam, 1mg/kg) och smärtstillande medel (Vetalgin, 200mg/kg) läkemedel subkutant.
- Placera musen på Värmemattan. Se till att djuret inte är i direkt kontakt med Värmemattan för att undvika termisk brännskador.
- Säkra huvudet till stereotaktisk apparat och placera näsan konen för att täcka nos. För att bibehålla anestesi, minska isofluran till 1.5-2%. Under hela operationen, övervaka mus tillstånd genom att visuellt övervaka andning och genom att testa tå nypa reflex. Reglera isofluran procentsats vid behov.
- Applicera oftalmisk salva på ögonen för att förhindra uttorkning och potentiell blindhet.
Anmärkning: för anestesi och djur medicinering, alternativa metoder och läkemedel är möjliga. Vänligen hänvisa till din djur licens och den relativa litteraturen.
- Optisk kanylimplantation
- Slå på fiberoptisk ljuskälla.
- Ta bort håret och desinficera huden över mus huvudet.
- Med hjälp av sax och pinpett, ta bort musens hårbotten. Börja med att göra ett litet snitt i hårbotten i en position nära lambda. Fortsätt genom att öppna hårbotten på de två sidorna. Först rör sig i sidled i riktning mot öronen, sedan rostrally, i riktning mot ögat omloppsbanor, för att bilda en triangel på sagittal axeln, cirka 4 mm rostralt till bregma. Var uppmärksam på att inte klippa för nära öron och ögon, men exponera bregma och lambda, liksom parietala ben och den bakre halvan av frontal ben.
- Applicera en droppe (≈ 10 mg) lidokain (28,9% v/v i alkohol) till skallen.
- Rensa periostet och torka skallen med hjälp av en bomullspinne.
- Placera öron listerna för att fixera mus huvudet.
- Gör en liten kraniotomi, med hjälp av en mikro-borr med en 0,5 mm bredd Burr. Placera hålet i det främre benet mittemot den avbildade Hippocampus, cirka 1,5 mm från sagittal suturen och 2 mm långt från den koronala suturen.
- Skruva en 0,86 mm bredd rostfrittstål ben skruv i skalle hålet.
- Rengör vid behov skräpet och torka skallen.
- Beredning av en blandning av snabb självhäftande cement
- Med en liten sked (≈ 4,5 mm diameter), fördela 1-1.5 nivå skopor av L-pulver i en blandning väl.
- Fördela 3-4 droppar snabb bas i brunnen.
- Fördela 1 droppe universell katalysator i brunnen.
- Rör om blandningen för 5-10 s med hjälp av en precisionsapplikator.
Obs: alternativa cement finns tillgängliga. Se tillverkarens instruktioner.
- Använd precisionsapplikatorer för att applicera snabb limcement över skallen, skruva och omgivande hud. Låt den torka i 30 s till 1 min.
- Använd en trefin borr på 3,0 mm diameter för att göra en kraniotomi i parietalbenet. Placera hålet ca 1,5 mm långt från sagittal suturen och 2 mm långt från lambdoid suturen.
- Ta försiktigt bort ben luckan.
- Kontrollera storleken på kraniotomi med kanyl att se till att det passar. Använd en Micro-Drill 0,5 mm eller 0,9 mm bredd för att förstora kraniotomi vid behov.
- Ta bort hjärnhinnorna med Dumont pinps.
- Kortikal materia, för att nå den externa kapseln. Använd en 0,9 mm diameter (19 gauge) trubbig nål ansluten till en vakuumpump. Vattna med saltlösning för att undvika uttorkning av den exponerade vävnaden och för att tvätta bort restblod efter blödning är löst. Suck kortikala vävnad långsamt, ≈ 50-100 μm i taget, tills cortex lossnar från kapseln, utsätta fibrerna i påbörjad eller corpus callosum. Byt nål ofta för att förhindra igensättning.
- Fibrer sträcker sig huvudsakligen i tre riktningar (figur 1b). Skala försiktigt dorsala fibrer tills de djupaste fibrerna (alveus i hippocampus) exponeras.
- Skölj vävnaden med saltlösning. Använd tunna tång för att doppa botten kanyl i saltlösning och placera den över skallhålet. Kanyl och vävnad måste förseglas med saltlösning för att undvika att fånga luftbubblor mellan kanyl och vävnad.
- Skjut in kanylen i skallen (figur 1c) tills glas täckglaset är i kontakt med fibrerna.
- Torka skallen väl med hjälp av absorptionstrianglar, bomullsvabb och/eller vakuumpumpen.
- Beredning av en blandning av snabb självhäftande cement (se steg 2.3.10).
- Använd precisionsapplikatorer för att applicera snabb limcement över skallen. Applicera lim även på kanten av kanyl. Var noga med att inte låta limmet springa in i kanyl. Låt den torka i 30 s till 1 min.
- Använd en stereotaxic arm för att placera en huvud hållaren plattan över kanyl, i kontakt med skallen.
- Beredning av en blandning av Dental akryl
- Med en sked (≈ 9 mm diameter), fördela 1 nivå skopa (1 del) av pulvret i en blandningbrunn.
- Fördela 2-3 delar av vätskan i samma brunn. Täck hela pulvret med vätskan.
- Rör om ≈ 1 min med en spatel.
Anmärkning: alternativa akryl typer finns tillgängliga. Se tillverkarens instruktioner.
- Använd en spatel eller en precisionsapplikator för att applicera akryl över kraniet. Täck hela den exponerade skallen, skruven och den öppna huden med Dental akryl. Detta gör förberedelserna stabila. Låt inte akryl springa nerför halsen, öronen och ögonen.
- Låt akryl torka och härda i ca 15 min.
- Applicera en avtagbar självhäftande film på huvud hållaren plattan, för att förhindra att skräp kommer in i kanyl. Det rekommenderas att filmens storlek matchar den på plattan.
- Stäng av isofluran Flow, ta bort djuret från stereotaktisk apparat och placera det på en värmeplatta för att bibehålla den fysiologiska kroppstemperaturen medan den vaknar upp från anestesi.
- Övervaka djuret tills det har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternala recumbency.
- Returnera djuret som har genomgått kirurgi till företaget av andra djur endast när det är helt återhämtat.
3. postoperativ vård
- Kontrollera status för musen för 2 dagar efter operationen, genom att övervaka vikten och allmänna beteende.
- Applicera Anti-inflammatorisk (meloxikam, 1mg/kg) och smärtstillande medel (Vetalgin, 200mg/kg) läkemedel subkutant i 2 dagar efter operationen
Anmärkning: alternativa övervaknings procedurer, läkemedel och doser är möjliga för postoperativ vård. Vänligen hänvisa till din djur licens och den relativa litteraturen.
4. förberedelse av bildsessionen
- Slå på bild installationen i förväg och låt lasern värma upp och stabilisera vid behov.
- Anesthetize musen (se steg 2.2.1).
- Använd tång för att försiktigt ta bort den självhäftande filmen från huvud hållaren plattan. Håll musen i en hand och huvud hållaren plattan med fingrarna. Ta försiktigt bort filmen för att undvika att preparatet skadas.
- Placera musen under mikroskopet, över Värmemattan och fäst huvud plattan på hållaren (figur 1d).
- Placera näsan konen för att täcka nos och minska isofluran till 1.5-2%.
- Applicera oftalmisk salva på mus ögonen.
- Rengör bild kanyl genom att skölja med avjoniserat vatten. Använd en spruta och en tunn nål för att släppa vatten i kanyl och en vakuumpump för att ta bort den.
5. bildsession
- Använd låg förstoring, långa arbetsavstånd mål att visuellt kontrollera kanyl för restvatten, smuts, integritet och förekomst av fluorescens.
- Rikta in kanyeln mot den optiska axeln genom att justera vinkeln på huvud hållarens armar.
- Byt till 25X 1,0 NA, 4 mm WD eller 40X 0,8 NA, 3 mm WD, vatten bads målen. Tillsätt tillräckligt avjoniserat vatten för att fylla kanyla och bibehålla överflödigt vatten ovanpå kanyl. Undvik bildandet av luftbubblor.
- Använd 2P excitation och bild fluorescerande signaler.
Anmärkning: Imaging-protokollet är mycket beroende av tid och rumsliga skalor som ska avbildas. Se avsnitten representativa resultat och diskussion för mer information om de bildinställningar som vi har använt för att producera bilderna som visas i den här artikeln.
Representative Results
Eftersom kanyl är placerad bara dorsala till CA1, den dorsala aspekten av CA1 är mer proximalt till mikroskopet om jämfört med den ventrala en. Alveus är den mest proximala strukturen som följs i ordning av stratum Oriens (so), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) och stratum lacunosum moleculare (SLM), det mest distala skiktet (figurerna 1b , C). Längsgående 2P avbildning av neuronala struktur med subcellulära upplösning och av aktivitet-framkallat plasticitet med cellulära upplösning presenteras som representativa resultat. För att excitera fluoroforer grönt fluorescerande protein (GFP), d2Venus och TurboFP635, en femtosecondlaser pulsad TI: Sapphire laser trimmad till 920 nm används och den genomsnittliga lasereffekten justeras till 5-25 mW vid provet. De olika emissions våglängderna separeras med hjälp av emissions filter och olika Fotomultiplikator-rör.
Longitudinell avbildning av dendritiska strukturen och dendritiska Taggar dynamik.
Till glest etikett Hippocampus PNS och visualisera deras struktur, en Thy1-GFP transgena mus linjen (M linje) används. Thy1-GFP möss Express cytoplasmiska förstärkt GFP under kontroll av Thy1 promotorn i en gles, slumpmässig population av PNS25. Generellt är den stora axeln av CA1 PNs ungefär vinkelrät mot XY-avbildning planet (figurerna 1b, figur 2A och kompletterande film 1). Basal dendriter sträcker sig i så, från Soma mot kanyl, medan apikala och apikala tofs dendriter förlänga distalt till kanyl, i motsatt riktning (kompletterande film 1). Eftersom preparatet lämnar de djupaste fibrerna i alveus intakt, ska några fluorescerande fibrer som korsar synfältet, precis under kanyren, synas (figur 2A och film 1). Preparatet tillåter avbildning av PN dendriter med ryggrads upplösning (figur 2 A-C). Till bilden dendriter och dendritiska taggar, en 25X 1,0 NA, 4 mm WD, vatten nedsänkning kommersiell objektiv används.
För longitudinell spårning definieras flera hjärnregioner inom synfältet av kanyl under den första bildsessionen. Varje region motsvarar en yta på cirka 240 x 240 μm och innehåller mellan 1 och 7 dendritiska segment (figur 2b). Dessa regioner mappas manuellt till en tredimensionell stapel med låg förstoring som visar mönstret för GFP-uttryck i volymen under Imaging-kanyl (figur 2A). Sedan, 1 μm z-steg bild stackar av CA1 PN basal dendriter förvärvas vid olika tidsintervall (från 24 h till 3 dagar) för upp till ca 14 dagar (figur 2C). Längre bild längder och intervall är möjliga26. Varje bildsession varar ca 60 till 90 min. Även om de flesta bilder är av dendritiska Taggar i den så, är det också möjligt att bilden dendritiska Taggar i den sneda dendriter av SR (figurerna 2D-F). Förutom ryggraden densitet, denna metod möjliggör studiet av ryggrads dynamik genom att kvantifiera deras överlevnad, vinst och förlust priser26,27,28,29,30, 31 , 32. för att göra mål och spåra dendritiska Taggar över tid (figur 2C), används ett anpassat MATLAB-gränssnitt. Detta gör att anpassningen av bild stackar förvärvas vid olika tidpunkter och stöder manuell märkning av dendriter och taggar medan spårning dendritiska längder och ryggrad positioner över tiden26. Viktigt, denna metod kan användas för att skilja (per varje gång punkt, exklusive den första) mellan befintliga och nyfödda dendritiska taggar. Detta är viktigt eftersom de olika klasserna av dendritiska Taggar tros ha olika roller i minne förvärv och retention33.
Longitudinell avbildning av aktivitet-framkallat plasticitet.
Till bild aktivitet-framkallat plasticitet i CA1 PNS, den dorsala CA1 Hippocampus området injiceras med en viral vektor uttrycker grön fluorescerande destabiliserat d2Venus via en förbättrad form av Synaptic aktivitet-lyhörd element (E-SARE) inom Arc förstärkare/promotor och röd fluorescerande TurboFP635 via Epgk promotorn34. Detta möjliggör avbildning nivåer av aktivitet-framkallat plasticitet av hundratals CA1 PNs i varje djur35. Med tanke på den mycket täta märkning av PNs, är det i allmänhet inte möjligt att lösa dendriter av CA1 PNs (kompletterande film 2).
Till bild Somata av CA1 PNs, en 40X 0,8 NA, 3 mm WD, vatten nedsänkning objektiv objektiv används. För longitudinell spårning definieras 1 till 9 hjärnregioner per mus under den första bildsessionen. Varje region motsvarar en yta på cirka 300 x 300 μm och innehåller mellan 50 och 150 celler (figur 3a). Dessa regioner mappas manuellt till lokala vävnads landmärken som visas vid en lägre förstoring. Sedan, 3 μm z-steg bild stackar förvärvas, som omfattar SP av CA1 PNs (figur 3a och kompletterande film 2) vid olika tidsintervall (från 24 h till 6 dagar) för upp till ca 30 dagar. Varje avbildning session varar cirka 60 till 90 min. E-SARE aktiverings toppar 6 till 8 h efter en exponering för en ny eller anrikad miljö (EE, figur 3b) och sönderfaller under loppet av några dagar. Således, vi i allmänhet bild 6 till 8 h efter erfarenhet och möjliggöra 5 dagar mellan Imaging sessions35.
För att kvantifiera d2Venus och TurboFP635 fluorescensvärden, en cirkulär region-av-intresse 4,64 μm i diameter dras, vilket är mindre än en neurala cellkroppen, centrerad till cellen Soma. Vi går sedan vidare till nästa tidpunkt, Poäng Soma av samma cell på samma sätt, och iterera den här proceduren för alla tidspunkter och alla synliga celler i den longitudinella datauppsättningen. Medelvärdet av varje neuron (aktivitetsberoende) d2Venus emission normaliseras genom dess medelvärde (aktivitets oberoende) TurboFP635 emission. Denna metod möjliggör utredning av långsiktig dynamik av Ensemble plasticitet av CA1 PNs35 (figur 3c).
Figur 1: förberedelse för in vivo djup hjärn optisk avbildning. (A). övre (vänster) och sida (höger) vyer av exempel Imaging cannuals. Imaging kanyler har en transparent glasbotten för att tillåta optisk åtkomst till hippocampus. (B). Schematisk beskrivning av preparatet som belyser den relativa positionen av Imaging Cannula, en CA1 PN och de tre lagren av fibrer från dorsala till ventral. (C, D). Schematisk beskrivning av avbildnings inställningen (C) och av djurens fixering (D) under en bildsession. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Longitudinell avbildning av dendritiska strukturen och dendritiska Taggar dynamik. (A). 2p bildstapel (maximal intensitet projektion (MIP) av 59 bild plan, 2 μm z-avstånd) av nervceller och dendriter märkta med GFP i en levande THY1-GFP mus. (B). högre förstoring (MIP av 53 bild plan, 1 μm z-avstånd) med uppgifter om basal dendriter ligger i så. (C) tidsförlopp bildsekvens av ett dendritiska segment avbildas under 14 dagar. Pilspetsar indikerar dendritiska Taggar spåras över 14 dagar. (D, E). 2P bild stack av nervceller och dendriter märkta med GFP i en levande Thy1-GFP mus; D) ZY projektion (31 bild plan, 3 μm z-mellanrum) och (E) XY-projektioner (17 bild plan, 3 μm z-avstånd). (F). högre förstoring (enbildsplan) med detaljerade apikala dendriter och dendritiska taggar som finns i SR. pilspetsar indikerar dendritiska taggar. Excitation: 920 nm; högsta utsläpp: 510 nm. Skalstreck: A, 50 μm; B, 10 μm; C, 2 μm; D och E, 15 μm; F, 4 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Longitudinell avbildning av aktivitet-framkallat plasticitet. (A). 2p bilder (Single bild Planes) från en levande mus, visar samma celler på baseline dag 0 och efter ee på dag 1. (B). 2p bild stackar (MIPs av 4-6 bild plan, 3 μm z-avstånd) som visar E-SARE aktiveringsmönster som är specifika för miljö a (dag 1, 19 och 25) och miljö B (dag 7 och 13). Grön: d2Venus Fluorescence. Röd: TurboFP635 fluorescens. Excitation: 920 nm; d2Venus utsläpp topp: 530 nm; TurboFP635 utsläpp topp: 635nm. Skalstreck: A, 20 μm; B, 10 μm. Denna siffra har modifierats från Attardo et al., 201835. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Avbildning av neuronala struktur i HIPPOCAMPUS DG med hjälp av tre-Photon (3P) mikroskopi. (a-H). 3P bilder (Single bild Planes) av nervceller och dendriter märkta med GFP i en levande Thy1-GFP mus Detailing (A-E) PNs i CA1 och (F-H) granule celler i DG. Excitation: 1400 nm; högsta utsläpp: 510 nm. Skalstapel: 40 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande film 1: Imaging synfält i en Live Thy1-GFP mus. 2P bildstapel (83 bild plan, 7 μm z-avstånd) av nervceller och dendriter märkta med GFP (vit) i en levande Thy1-GFP mus sträcker sig från botten av kanyl till SLM. För att redogöra för sönderfall av fluorescens signal med ökande djup, använde vi en icke-linjär gradient av Fotomultiplikatorrör förstärkning. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande film 2: avbildning av aktivitet-framkallat plasticitet. 2P bildstapel (28 bild plan, 3 μm z-avstånd) av nervceller som uttrycker E-SARE reporter på IEG uttryck i en levande mus som omfattar SP. grön: d2Venus Fluorescence. Röd: TurboFP635 fluorescens. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Här beskrivs ett förfarande för upprepad 2P avbildning av dorsala CA1 i levande möss. Efter operationen, musen återhämtar sig vanligtvis inom 2 dagar. Förfarandet inducerar minimal astrogliosis26,43. Blödning och ödem som kan följa operationen är oftast omadsorberas inom 10 till 14 dagar. Generellt, från 14 dagar efter implantationen och framåt är preparatet tillräckligt klart för att utföra intravital avbildning. Framgången för operationen är inte beroende av att arbeta i en steril miljö. Emellertid, det är viktigt att upprätthålla en hög nivå av hygien, för att undvika komplikationer på grund av kirurgi-associerade infektioner. Detta erhålls genom minutiöst rengöring av kirurgiska instrument före och efter operationen och genom att värma sterilisera dem omedelbart före varje användning (steg 2.1.1). Den optiska kanyl hålls i en ren, steriliserad behållare och sköljas med steril saltlösning strax före implantation. Att utföra vanliga kirurgiska ingrepp i händer desinfektion och rengöring av Operations stationen är också mycket viktigt. Preparatet förblir stabilt och tillåter cellulära och subcellulära upplösning Imaging för flera veckor26,35.
Kritiska steg, modifieringar och felsökning.
Det är viktigt att skala den externa kapseln tills de djupaste fibrerna exponeras. Underlåtenhet att exponera alveus kan resultera i oförmåga att fokusera på Soma av PNS, eller i minskad upplösning Imaging dendritiska taggar, när du använder kommersiella mål med 3-eller 4-mm WD. För detta ändamål är det lämpligt att ablera neocortex mycket långsamt med en 0,9 mm diameter nål och sedan byta till en 0,3-0,5 mm diameter (24-29 gauge) nål för en finare kontroll av sug när du tar bort de mest rygg fibrer. Alternativt kan fina pinps användas för att ta bort kvarvarande cortex efter fiber exponering36.
Blödning under operationen kan vara problematiskt, som blod blockerar vyn. Väntar på koagel att bilda och sedan skölja med saltlösning för att tvätta bort restblod rekommenderas. Upprepa vid behov.
En Snug passar mellan kanyl och kraniotomi hjälper till att öka stabiliteten i preparatet genom att hålla kanyl på plats innan applicering av cement, särskilt om den yttre kanten av kanyl är i jämnhöjd med skallen. Eftersom storleken på trefin borr och kanyl matchas, kan en lös passform uppstå på grund av oegentligheter på sidan av kanyl-som kräver något större kraniotomier att passa (se steg 2.3.14)-eller från en oregelbunden kraniotomi. Eventuella avvikelser från kanyl måste lämnas in (steg 1,3 och 1,12) och trefin måste hållas vinkelrät mot skallen tills kraniotomi har slutförts (steg 2.3.12). Ta bort trefin från skallen innan kraniotomi är klar kan resultera i oregelbundna kraniotomier.
Begränsningar- Av preparatets invasivitet och stabilitet.
Det är svårt att utvärdera effekten av kortikal ablation eftersom det är mödosamt att exakt definiera de områden som påverkas direkt och indirekt. I allmänhet tar operationen bort en del av parietala cortex och en del av den visuella och bakbenet sensoriska cortex21. Den avlägsnas cortex inte direkt projekt till hippocampus och Hippocampus vävnad är varken rörd eller skadad. Viktigt, det har visats att implantation av en avbildning kanyl inte grovt Alter Hippocampus funktion och specifikt Hippocampus-beroende inlärning21,36,37,38, 39. Ändå skulle det vara viktigt att kvantifiera i vilken utsträckning både kanyl och den externa delen av implantatet (huvud hållare plattan och Dental akryl mössa) är kroniska stressorer genom att bedöma kortikosteron blodnivåer och binjurar vikt i jämförelse med unimplanterade möss.
Preparatet är i allmänhet stabilt från veckor till månader26. På lång sikt, hud och bentillväxt tenderar att tränga undan akryl locket och att öka instabiliteten i Imaging preparatet.
Optiska begränsningar.
Konventionell 2p-mikroskopi möjliggör avbildning upp till ca 1 mm djupt in i neokortikala vävnaden40,41. I överensstämmelse med detta är det möjligt att avbilda dendriter och dendritiska taggar som finns i SR (figur 2D-F) eller SLM36. Imaging genom en kanyl innebär dock begränsningar för den effektiva NA. För att uppnå maximal upplösning, bör diametern och djupet av Imaging kanyler matchas mot Imaging na, eftersom mindre diametrar och längre djup kommer att klämma ljus av höga na-mål. Till exempel, när avbildning med en 1,0 NA vatten nedsänkning mål genom en 1,6 mm lång kanyl, en 3,65 mm innerdiameter behövs för att hålla hela NA. Men med hjälp av en kanyl av denna diameter kommer att öka kompressionen på Hippocampus och kan påverka hälsan hos vävnaden, av denna anledning använder vi en kanyl med en mindre diameter. Vid avbildning med en 0,8 NA vatten nedsänkning mål genom en 1,6 mm lång kanyl, en innerdiameter på 2,5 mm skulle räcka för att hålla hela NA. Men, 0,8 NA vatten nedsänkning mål har en kortare WD (3 mm i vårt fall), som kan hindra från att fokusera på SP.
Dessa beräkningar gäller centrum av synfältet längst ner på kanylen. Men flytta Imaging synfält sidewise-närmare kanterna på kanyl-eller fokusera djupare in i vävnaden-längre från glasytan av kanyl-ytterligare minskar den effektiva NA vid fokalplanet och därmed minskar upplösningen. Detta kommer att leda till icke-homogen upplösning över de olika volymerna av avbildade vävnad och kan vara ett bekymmer för kvantitativ avbildning vid subcellulära upplösning, särskilt när man använder super-resolution tekniker som 2p-sted mikroskopi42. Dessa problem är mindre viktiga vid avbildning vid mobil upplösning.
Vävnad rörelse.
Rörelse inom vävnaden-kommer från andning och hjärtslag i sövda djur-tenderar att bli mer allvarliga med ökat avstånd från Imaging kanyl. Detta är möjligen på grund av att Imaging kanyl applicerar mekaniskt tryck till hjärnan vilket motverkar en del av rörelsen i närheten av kanyl (på samma sätt som neokortikala preparat). Således, även om avbildning av dendritiska taggar är möjligt i SR och SLM, i våra händer, är det mest robust rygg till så upp till ≈ 200 μm från ytan av kanyl. För att kompensera för rörelse, använder vi resonant skannrar och offline averaging. Flera bilder (4 till 6 repetitioner) förvärvas per bild plan av en z-stack vid maximal tillgänglig hastighet (30 bildrutor/s). Alla repetitioner för varje z-Plane är sedan deconvolved (med hjälp av kommersiell programvara, AutoQuant), registrerade (med ImageJ) och i genomsnitt i en enda bild26. För avbildning av Somata, är rörelse ofta försumbar vid anestesi35 och två medelvärden är ofta tillräckliga för att kompensera för rörelse artefakter.
Framtida applikationer eller riktningar av metoden .
Preparatet kan kombineras med mikroendoskop26,43. Micro-endoskop är stela optiska sonder som använder gradient brytningsindex (grin) mikrolinser för att vägleda ljus till och från djup vävnad18. Användningen av mikro-endoskop tillåter kanyl av mindre diametrar eller till och med ingen kanyl alls. Kommersiella mikroendoskop korrigeras dock mindre väl för optiska avvikelser och har lägre NA än kommersiella mål. Aktuella sonder når laterala och axiella upplösningar på ≈ 0,6-1 μm, ≈ 10-12 μm, respektive17,18,44. Användningen av mikroendoskop möjliggör också kombinationen av denna beredning med huvudmonterade integrerade widefield Mikroskop45,46,47.
Metoden lämpar sig också att använda i icke-sövda möss, och det har använts för att undersöka cellulära aktivitet med ca2 + sensorer i vaken Head-fast möss21,37,48,49. I dessa fall, på grund av de snabba tidsskalor av fluorescens förändringar, är det tillrådligt att genomföra linje registrering50. Det är också möjligt att anpassa förberedelserna för avbildning av andra underregioner i hippocampus, såsom dentate gyrus (DG)39,51,52. Kombinera denna beredning med 3P excitation53,54 med 1 MHz frekvens pulsad laser trimmad till 1400 nm, vi kunde bilden djupare in i hippocampus bildandet når molekyl skiktet, granule cellskikt och hilus av DG (figur 4) utan att ta bort överliggande CA1.
Sammanfattningsvis presenterar vi en metod som ger optisk tillgång till dorsala hippocampus och möjliggör longitudinella och korrelala studier av dynamiken i hippocampus struktur och aktivitet. Denna teknik utökar möjligheterna till analys av hippocampus funktion under fysiologiska och patologiska tillstånd.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
U. A. F. stöds av Schram Foundation; C.-W. T. P. och W. G. stöds av Max Planck Society; L.Y. och liitto stöds av Max Planck Society och National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. stöds av ett FP7 bidrag från Europeiska forskningsrådet, ERANET och I-CORE program, Chief Scientist Office av det israeliska hälsoministeriet, det federala ministeriet för utbildning och forskning, Roberto och Renata Ruhman, Bruno och Simone Lich, The Nella och Leon Benoziyo centrum för neurologiska sjukdomar, Henry Chanoch Krenter Institutet för biomedicinsk avbildning och genomik, Israel Science Foundation den Perlman familjen, Adelis, Marc Besen, Pratt och Irving I. Moskowitz stiftelser; A. A. stöds av Max Planck Society, Schram Foundation och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). 3P-bilderna förvärvades under den avancerade kursen om neuroimaging tekniker vid Max Planck-institutet för neurovetenskap. Den avancerade kursen om neuroimaging tekniker stöds av Max Planck Society, Florida State Max Planck Scientific Fellowship program och av Max Planck-institutet Corporation partnerskapsprogram. Vi vill tacka Thorlabs, sammanhängande och SpectraPhysics för att ge stöd och utrustning för 2P/3P Imaging system under kursen. Vi är också tacksamma mot Henry Haeberle och Melissa Eberle för hjälp med systemet under kursens gång.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
| MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
| MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
| Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
| Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
| Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
| Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
| Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
| UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
| UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
| Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
| Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
| Graefe Forceps - Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
| MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
| Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill - 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
| Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
| 3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
| Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
| Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
| Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
| Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
| Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
| Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
| CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
| Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
| KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
| Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
| Absorption Triangles - Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
| Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
| Blunt needles 0.9x23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.5x42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.3x23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
| Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
| Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
| Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
| Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
| Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
| Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
| Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
| 7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
| Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
| RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
| S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
| Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
| X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
| Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
| Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
| Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
| XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |
References
- O’Keefe, J., Nadel, L. The hippocampus as a cognitive map. , Clarendon Press; Oxford University Press. (1978).
- Zola-Morgan, S., Squire, L. R. Memory Impairment in Monkeys Following Lesions Limited to the Hippocampus. Behavioral Neuroscience. 100 (2), 155-160 (1986).
- Squire, L., Zola-Morgan, S. The medial temporal lobe memory system. Science. 253 (5026), 1380-1386 (1991).
- Leutgeb, S., Leutgeb, J. K., Barnes, C. A., Moser, E. I., McNaughton, B. L., Moser, M. B. Independent codes for spatial and episodic memory in hippocampal neuronal ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
- Silva, A. J., Zhou, Y., Rogerson, T., Shobe, J., Balaji, J. Molecular and cellular approaches to memory allocation in neural circuits. Science. 326 (5951), 391-395 (2009).
- Tonegawa, S., Pignatelli, M., Roy, D. S., Ryan, T. J. Memory engram storage and retrieval. Current Opinion in Neurobiology. 35, 101-109 (2015).
- Poo, M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, (2016).
- O’Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Research. 34 (1), 171-175 (1971).
- Moser, M. B., Moser, E. I. Functional differentiation in the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 608-619 (1998).
- Altman, J. Autoradiographic investigation of cell proliferation in the brains of rats and cats. Anatomical Record. 145, 573-591 (1963).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Sorrells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Boldrini, M., et al. Human hippocampal neurogenesis persists throughout aging. Cell Stem Cell. 22 (4), 589-599 (2018).
- Polanco, J. C., et al. Amyloid-β and tau complexity — towards improved biomarkers and targeted therapies. Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2017).
- Rosene, D. L., Van Hoesen, G. W., et al. The hippocampal formation of the primate brain. in Cerebral Cortex. Jones, E. G., et al. Chapter 9, Plenum Press. New York. 345-456 (1987).
- Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist. 17 (5), 539-559 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Reviewof Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Jung, J. C., Schnitzer, M. J. Multiphoton endoscopy. Optics Letters. 28 (11), 902 (2003).
- Levene, M. J., Dombeck, D. A., Kasischke, K. A., Molloy, R. P., Webb, W. W. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. Journal of Neurophysiology. 91 (4), 1908-1912 (2004).
- Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. High-Resolution in vivo imaging of hippocampal dendrites and spines. The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147-3151 (2004).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Busche, M. A., et al. Critical role of soluble amyloid- for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Science. 109 (22), 8740-8745 (2012).
- Jung, J. C., Mehta, A. D., Aksay, E., Stepnoski, R., Schnitzer, M. J. In vivo mammalian brain imaging using one- and two-photon fluorescence microendoscopy. Journal of Neurophysiology. 92 (5), 3121-3133 (2004).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Zuo, Y., Yang, G., Kwon, E., Gan, W. B. Long-term sensory deprivation prevents dendritic spine loss in primary somatosensory cortex. Nature. 436 (7048), 261-265 (2005).
- Holtmaat, A. J. G. D., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Gu, L., et al. Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity. The Journal of Neuroscience. 34, 13948-13953 (2014).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (42), 177-187 (2011).
- Kawashima, T., et al. Functional labeling of neurons and their projections using the synthetic activity-dependent promoter E-SARE. Nature Methods. 10 (9), 889-895 (2013).
- Attardo, A., et al. Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
- Schmid, L. C., et al. Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer’s disease model. Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).
- Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
- Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
- Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
- Beaurepaire, E., Oheim, M., Mertz, J. Ultra-deep two-photon fluorescence excitation in turbid media. Optics Communications. 188, 25-29 (2001).
- Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 mm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
- Pfeiffer, T., et al. Chronic 2P-STED imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. eLife. 7, e34700 (2018).
- Barretto, R. P. J., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature Medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
- Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), aaa5694 (2016).
- Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. SIMA: Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, (2014).
- Gonçalves, J. T., et al. In vivo imaging of dendritic pruning in dentate granule cells. Nature Neuroscience. 19 (6), 788-791 (2016).
- Danielson, N. B., et al. Distinct contribution of adult-born hippocampal granule cells to context encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
- Hell, S. W., et al. Three-photon excitation in fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 1 (1), 71 (1996).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
