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Biochemistry

Expression et purification de nuclease-Free Oxygen Sccatechuate 3,4-Dioxygenase

Published: November 8, 2019 doi: 10.3791/59599
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cancer Biology and Genetics, College of Medicine, The Ohio State University

Summary

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) peut enzymatiquement enlever l'oxygène diatomique libre d'un système aqueux utilisant son acide protocatechuic de substrat (PCA). Ce protocole décrit l'expression, la purification, et l'analyse d'activité de cette enzyme de récupération d'oxygène.

Abstract

La microscopie à molécule unique (SM) est utilisée dans l'étude des interactions moléculaires dynamiques des biomolécules étiquetées fluorophore en temps réel. Cependant, les fluorophores sont sujets à la perte de signal par photoblanchiment par l'oxygène dissous (O2). Pour prévenir le photoblanchiment et prolonger la durée de vie du fluorophore, des systèmes de récupération d'oxygène (OSS) sont utilisés pour réduire L'O2. Les OSS disponibles dans le commerce peuvent être contaminés par des nucléases qui endommagent ou dégradent les acides nucléiques, ce qui confond l'interprétation des résultats expérimentaux. Ici nous détaillons un protocole pour l'expression et la purification du protocatechuate fortement actif de Pseudomonas de Pseudomonas-3,4-dioxygenase (PCD) sans contamination détectable de nucléane. Le PCD peut éliminer efficacement les espèces réactives O2 en reconversion de l'acide protocatechuic substrat (PCA) en acide 3-carboxy-cis,cis-muconic. Cette méthode peut être utilisée dans n'importe quel système aqueux où O2 joue un rôle préjudiciable dans l'acquisition de données. Cette méthode est efficace dans la production de PCD très actif et sans nucléane par rapport au PCD disponible dans le commerce.

Introduction

La biophysique à molécule unique (SM) est un domaine en croissance rapide qui change notre façon de voir les phénomènes biologiques. Ce domaine a la capacité unique de lier les lois fondamentales de la physique et de la chimie à la biologie. La microscopie de fluorescence est une méthode biophysique qui peut atteindre la sensibilité SM. La fluorescence est utilisée pour détecter les biomolécules en les reliant à de petits fluorophores organiques ou à des points quantiques1. Ces molécules peuvent émettre des photons lorsqu'elles sont excitées par des lasers avant de photobleaching irréversiblement2. Photobleaching se produit lorsque les étiquettes fluorescentes subissent des dommages chimiques qui détruit leur capacité à exciter à la longueur d'onde désirée2,3. La présence d'espèces réactives d'oxygène (ROS) dans le tampon aqueux sont une cause primaire de photoblanchiment2,4. En outre, ROS peut endommager les biomolécules et conduire à des observations erronées dans les expériences SM5,6. Pour prévenir les dommages oxydatifs, les systèmes de récupération d'oxygène (OSS) peuvent être utilisés3,7,8. Le système d'oxydase/catalase de glucose (GODCAT) est efficace pour enlever l'oxygène8,mais il produit des peroxydes potentiellement dommageables comme intermédiaires. Ceux-ci peuvent être préjudiciables aux biomolécules d'intérêt dans les études de SM.

Alternativement, protocatechuate 3,4 dioxygenase (PCD) éliminera efficacement O2 d'une solution aqueuse utilisant son acide protocatechuic de substrat (PCA)7,9. PCD est un métalloenzyme qui utilise le fer nonheme pour coordonner PCA et catalyser la réaction d'ouverture de l'anneau catéchol en utilisant dissous O210. Cette réaction d'une étape s'est avérée être un OSS globalement meilleur pour améliorer la stabilité du fluorophore dans les expériences SM7. Malheureusement, de nombreuses enzymes OSS disponibles dans le commerce, y compris le PCD, contiennent des nucléases contaminantes11. Ces contaminants peuvent endommager les substrats à base d'acide nucléique utilisés dans les expériences SM. Ces travaux permettront d'élucider un protocole de purification à base de chromatographie pour l'utilisation de PCD recombinant dans les systèmes SM. Le PCD peut être largement appliqué à toute expérience où les ROS sont des substrats dommageables nécessaires à l'acquisition de données.

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Protocol

1. Induire l'expression PCD dans E. coli

  1. Combinez 1 plasmide d'expression PCD de l'AL pVP91A-pcaHG (20 ng/L, Figure 1A) et 20 'L d'E. coli BL21 (20 cellules disponibles commercialement, 'gt; 2 x 106 cfu/g plasmid) dans un tube. Feuilleter le tube pour mélanger. Placer le tube sur la glace 5 min.
  2. Placer la transformation à 42 oC pour 30 s. Puis glace 2 min.
  3. Ajouter 80 'L soC media (super optimal broth with catabolite repression: 2.5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% tryptone, 0.5% extract de levure, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose). Secouer à 225 tours par min (rpm) 37 oC pour 1 h.
  4. Plaquer la réaction de transformation sur LB Amp Agar (1L Luria Broth agar: 10 g NaCl, 10 g bacto-tryptone, 5 g extrait de levure, 15 g d'agar, 50 g/mL d'ampicilline; 25 mL par plat de pétri de 10 cm de diamètre).
  5. Incuber la plaque, couvercle vers le bas, à 37 oC pendant 16-18 h.
  6. Inoculer 50 mL LB Amp (1L LB: 10 g bacto-tryptone, 10 g NaCl, 5 g d'extrait de levure, 50 'g/mL d'ampicilline) dans un flacon Erlenmeyer de 250 mL avec une colonie. Incuber à 37 oC pendant 16-18 h en secouant à 225 tr/min.
  7. Transférer la culture de 20 ml dans un flacon de 4 L avec 1 Lb Am. Secouer à 225 tr/min à 37 oC.
  8. Chaque h mesure la culture OD600 (densité optique à 600 nm). Comme la culture OD600 se rapproche de 0,5, augmenter la fréquence des mesures à toutes les 15 minutes. La densité désirée de la culture est de 0,5 OD600.
  9. Transférer le flacon de 4 L dans un bac de glace. Faites tourbillonner le flacon dans le bain de glace pour réduire la température de la culture.
    Note: Le temps sur la glace doit être réduit au minimum afin que les cellules restent métaboliquement actives. Idéalement, les cellules seront sur la glace à moins de 10 min.
  10. L'induction réussie de PCD peut être observée en dénaturant l'électrophores de gel de sulfate de dodecyl de sodium polyacrylamide (SDS-PAGE). Récolte 1 ml de la culture non induite dans un tube. Faire tourner l'échantillon 1 min à 14 000 x g dans un microfuge à température ambiante. Decant le supernatant.
    1. Solubilize les cellules granulées dans 150 L PBS (phosphate tamponné saline).
    2. Ajouter un volume égal de colorant de chargement 2X (1,2 % DeSD, 30 % de glycérol, 150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,0018 % bleu bromophénol, 15 % de mercaptoéthanol). Vortex l'échantillon à bien mélanger.
    3. Faire bouillir l'échantillon pendant 3 min et le transférer sur la glace. L'échantillon peut être conservé dans un congélateur de -20 oC pour une analyse future.
      Note: PBS est disponible dans le commerce avec ou sans CaCl2 et MgCl2. De nombreux laboratoires auront PBS sans CaCl2 et MgCl2 pour les méthodes de culture cellulaire. Nous n'avons trouvé aucune différence avec PBS avec ou sans CaCl2 et MgCl2.
  11. Transférer le flacon de 4 L dans un incubateur à 17 oC avec 180 tr/min. Continuer à surveiller l'OD600 toutes les 20 min.
  12. À 0,7 OD600 ajouter isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à 0,5 mM concentration finale (0,25 M solution de stock) et 10 mg/L de fer ammonium (II) sulfate hexahydrate (Fe(NH4)2(SO4)2, 10 mg/mL solution de stock). Les gènes PCD pcaH et pcaG sont induits par le promoteur T5 par l'ajout de l'IPTG (Figure 1A). Le sulfate de fer est lié par PCD et nécessaire pour l'activité catalytique en coordonnant l'oxygène pendant l'ouverture de catéchol.
  13. Secouez la culture à 180 tr/min à 17 oC pendant 18 h.
  14. Placez le flacon de culture dans la glace comme dans 1.2. Récolte1 ml des cellules induites pour SDS-PAGE comme dans 1.3.
  15. Verser la culture bactérienne dans les bouteilles appropriées pour la centrifugation. Une culture de 1 L peut être centrifiée dans 4 bouteilles coniques de fond conique. Pelleter la culture à 4 oC pendant 20 min à 3000 x g. Décant les supernatants. Éliminer les déchets liquides bactériens de façon appropriée.
  16. Pipet pour resuspendre les granulés dans 25 ml de PBS froid (CaCl2 et MgCl2 sont facultatifs) par culture de 1 L.
  17. Transférer la suspension dans des tubes coniques de 50 ml (1 tube de 50 ml par culture de 1 L). Pelleter les cellules à 3000 x g pendant 20 min à 4 oC. Décantez le supernatant et disposez de manière appropriée.
  18. Resuspendre les cellules dans 10 ml de tampon de lyse (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM d'imidazole, 10 % de glycérol, 800 ng/mL de Pepstatine, 1 g/mL de leupeptin, et 87,1 g/mL de phénylmethylsulfonyl fluorure (PMSF)) par tuyauterie. Congeler la suspension avec de l'azote liquide dans un flacon Dewar. Conserver les tubes d'échantillon dans un congélateur de -80 oC. Nous avons purifié le PCD à partir de granulés stockés à -80 oC pendant un an sans perte apparente d'activité.
  19. Comparez les cellules non induites et induites par SDS-PAGE.
    Note: Nous n'avons eu aucune difficulté avec l'induction de l'hétérodime de PCD. Cependant, nous recommandons de tester l'induction avant de continuer avec la purification dans le cas où tout réactif a expiré de façon inattendue.
    1. Assembler des plaques pour SDS-PAGE (dimensions : 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm d'épaisseur). Le gel d'empilage est de 1,5 mL 6% de polyacrylamide (6% d'acrylamide, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate, 0,001% TEMED). Le gel résolvant est 3,5 mL 12% de polyacrylamide (12% d'acrylamide, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate, 0,001% TEMED). Insérez un peigne de 10 puits à la couche d'empilage.
    2. Chargez 10 L d'échantillons bactériens non induits et induits. Chargez 4 L de marqueurs de poids moléculaires présagés pour les protéines (Figure 1B).
    3. Électrophorese le gel à 16,5 V/cm environ 1 h. Le bleu bromophénol devrait atteindre le fond du gel.
    4. Placez le gel dans la tache bleue de Coomassie (10% d'acide acétique, 40% de méthanol, 0.1% de colorant bleu de Coomassie) dans une baignoire en plastique. La tache doit immerger complètement le gel. Tache à température ambiante pendant 20 min. La rotation douce pendant la coloration est facultative.
    5. Remplacer la solution par delatache (10% d'acide acétique, 40% de méthanol). Incuber à température ambiante avec une rotation douce en option jusqu'à ce que les bandes protéiques soient facilement visibles.
    6. Remplacer la tache par de l'eau déionisée. Parmi les protéines bactériennes, les sous-unités induites de PCD devraient être visibles dans les cellules induites. Hexahistidine marqué PCD sous-unité pcaH a un poids moléculaire de 28,3 kDa et la sous-unité pcaG est de 22,4 kDa. Si les sous-unités PCD ne sont pas apparentes, une nouvelle induction dérivée d'une nouvelle colonie doit être effectuée.

2. Purification de chromatographie d'affinité de nickel du PCD

  1. Décongeler sur la glace un tube de 50 ml de cellules induites. Il peut prendre 2-3 h pour décongeler complètement l'échantillon.
  2. Garder le tube sur la glace, sonicate l'échantillon à 30% d'amplitude pendant 1 min, vélo 1 s sur et en dehors. Utilisez un sonicateur conique (diamètre 0,125 pouces). La puissance maximale est de 400 W et la fréquence est de 20 kHz et par 1 L de granule de culture.
  3. Après la sonication, ajouter le lysozyme à une concentration finale de 0,2 mg/mL (10 mg/ml de solution de bouillon) et conserver sur la glace pendant 30 min à 4 oC.
  4. Verser le lysate bactérien dans une bouteille de polycarbonate préréfrigérée (dimensions : 25 mm x 89 mm). La bouteille doit être compatible avec un rotor d'ultracentrifuge à angle fixe. D'autres tubes et/ou rotors peuvent être remplacés, mais la force de gravitation finale doit être maintenue.
  5. Centrifugeuse de 60 min à 120 000 x g à 4 oC. Les débris cellulaires formeront une pastille. Le supernatant peut apparaître jaune.
    1. Le granule peut être inclus dans l'analyse ultérieure SDS-PAGE pour déterminer la solubilité du PCD (figure 1B). Solubiliser la pastille en vortexant dans 10 mL de PBS. Transférer 150 l dans un tube de 1,5 ml. Préparer l'échantillon pour SDS-PAGE comme dans 1.3.
  6. Verser le supernatant dans un tube conique froid de 50 ml. Notez le volume. La contamination du supernatant avec de l'ADN bactérien peut donner un échantillon visqueux. L'ADN génomique bactérien pourrait bloquer le flux de la colonne. L'étape d'ultracentrifugation 2.2 doit être répétée pour granuler l'ADN bactérien. Une pastille de cette deuxième rotation peut ne pas être facilement visible ou transparente.
  7. Faire 500 mL Ni Buffer A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, et 10% glycérol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 g/mL Leupeptin, et 87,1 g/mL PMSF) et 500 mL Ni Buffer B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glycérol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 'g/mL Leupeptin, et 87.1 'g/mL PMSF, 250 mM imidazole, pH 8.0). Passer les deux tampons Ni à travers les filtres de 0,2 m pore.
  8. L'échantillon, les tampons et le système FPLC (chromatographie liquide à protéines rapides) sont dans une pièce réfrigérée à 4 oC. Laver la pompe A avec Ni Buffer A et la pompe B avec Ni Buffer B. Laver le système avec 20 mM d'imidazole (8 % Ni Buffer B, 92 % Ni Buffer A) jusqu'à ce que les UV et la conductivité se stabilisent. Nous écoulons régulièrement des tampons à 5 ml/min avec une limite de pression de 1,0 MPa. La limite de débit et de pression doit être déterminée par les spécifications de l'instrument FPLC utilisé.
  9. Préparer une colonne avec 1,5 ml de résine chargée de nickel (dimensions : 110 mm de long x 5 mm). La capacité de liaison de résine est de 50 mg/mL et peut tolérer une pression de 1 MPa. Une colonne peut être versée et stockée à 4 oC avant la purification.
    Note: La taille de la colonne peut être proportionnellement augmentée pour accueillir plus d'un tube de 50 ml de cellules induites si plus de protéines est nécessaire. Nous préférons une colonne fraîche pour chaque préparation pour nous assurer qu'aucune protéine résiduelle ne contamine notre protéine désirée. Toutefois, les résines de nickel peuvent être recyclées selon les instructions du fabricant.
  10. Fixez la colonne de résine chargée de nickel au FPLC. Exécuter 20 ml de 92% Ni Buffer A et 8% Ni Buffer B (20 mM imidazole) à 0,5 ml/min avec une limite de pression de 0,5 MPa à travers la colonne pour l'équilibre. En temps réel, le FPLC devrait mesurer a280 (280 nm d'absorption UV) ainsi que la conductivité. Si ces valeurs ne se sont pas stabilisées après que le volume de 20 ml a traversé la colonne, les tampons coulent jusqu'à ce qu'ils se soient stabilisés.
  11. Chargez l'échantillon à la colonne (10 ml) à 0,15 ml/min. Fixez la limite de pression à 0,5 MPa. Recueillir le flux à travers.
  12. Laver la colonne avec 20 mL Ni Buffer à 20 mM imidazole (92% Ni Buffer A et 8% Ni Buffer B). Conserver le lavage dans un tube de 50 ml pour analyse. Laver la colonne avec 15 ml de 50% Ni Buffer A et 50% Ni Buffer B (125 mM imidazole). Recueillir l'élution en 19 fractions de volume de 0,8 ml. Laver la colonne avec 15 mL 100% Ni Buffer B. Recueillir 75 fractions supplémentaires de 0,2 ml. Certains heterodimer PCD s'éliront dans le 50% Ni Tampon B lavage, mais la majorité de l'hétérodiste s'élit dans le 100% Ni Tampon B lavage.
  13. Analyser les fractions recueillies sur les gels SDS-PAGE de 12 % pour confirmer la présence de PCD. Ajoutez des volumes égaux de colorant de chargement 2X au débit, au lavage et au pic A280 fractions. Faire bouillir pendant 3 min. Transférer sur la glace. Verser deux gels SDS-PAGE de 12 % (comme à l'étape 1.7). Répétez la méthode du gel telle que décrite dans 1.7.

3. L'activité nucléase

  1. Sur la base de l'analyse SDS-PAGE, identifier les fractions d'affinité nickel qui contiennent des PCD presque pures. Combiner 5 fractions de chromatographie Ll et 500 ng 3 kb de plasmide pXbaMD dans un tampon de réaction (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT) avec un volume final de 50 l.
    1. Incuber à 37 oC pendant 1 h.
    2. Inclure un contrôle négatif (pas de protéines ajoutées) et un contrôle positif (PCD disponible dans le commerce). Arrêtez la réaction avec une solution d'arrêt de 10 l (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% de glycérol, 0,15% Orange G).
    3. Les échantillons peuvent être conservés dans un congélateur de -20 oC pour être analysés plus tard. N'importe quel plasmide supercoiled peut être employé dans un analyse de nucléase aussi longtemps que les produits supercoiled et détendus de réaction de cercle peuvent être résolus par l'électrophoresis de gel d'agarose.
  2. Verser un gel d'agarose de 120 ml 1 % dans un tampon d'éthidium 1X TAE (40 mM Tris-acétate, 1 mM EDTA, 0,5 g/mL de bromure d'étoduyium) dans un gel moulé (dimensions : 15 x 10 cm). Utilisez un peigne de 15 puits (dimensions de puits : 5 mm x 1,5 mm). Lorsque le gel a pris, plongez-le dans un tampon d'éthidium 1X TAE.
  3. Analyser 30 L des réactions par gel d'agarose. Électrophorese à 10 V/cm à température ambiante pendant environ 1 h. L'avant de teinture Orange G doit être à la fin du gel.
  4. Utilisez un scanner à fluorescence pour imager immédiatement le signal de bromure d'éthidium du gel. Si un plasmide de 3 kb a été utilisé, la bande la plus lente sera des cercles détendus à 3,5 kb, l'ADN linéaire fonctionnera à 3 kb, et le plasmide supercoiled aura la mobilité la plus rapide à 2 kb.
    1. Calculez le volume total de pixels de chaque voie avec un logiciel d'analyse d'images.
    2. Déterminez le volume de pixels des différentes espèces d'ADN, telles que les cercles supercoiled, linéaires et entaillés. Utilisez ces valeurs pour déterminer le pourcentage de chaque espèce d'ADN. Par exemple, une présence accrue de cercles entaillés associés à une fraction par rapport au contrôle négatif indique la présence de nucléase. Le volume de pixels des cercles entaillés dans une voie est divisé par la valeur pixel de l'ADN total. Déterminez un pourcentage en multipliant ce nombre par 100.
  5. Combinez les fractions du deuxième pic d'élution qui contiennent de l'hétérodiste PCD presque pur basé sur l'analyse SDS-PAGE et ont une activité nucléase minimale à indétectable. Notre volume commun typique est de 2 ml.
  6. Chargez l'échantillon à une unité de filtre centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de 10 kDa. Centrifugeuse dans une centrifugeuse à seau oscillant à 4000 x g pendant 40 min à 4 oC. Alternativement, un rotor à angle fixe de 35 degrés peut être utilisé à 7500 x g pendant 20 min à 4 oC.
    1. Répétez la centrifugation jusqu'à ce que le volume final de la retentignite soit de 100-200 l.
    2. Inverser l'unité de filtre et récupérer le retentate par centrifugation à 1000 x g pendant 2 min à 4 oC.

4. Purification de chromatographie d'exclusion de taille de PCD

  1. Faire 250 mL de chromatographie d'exclusion de taille (SEC) en cours d'exécution (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glycérol, 0,1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 g/mL Leupeptin, et 87,1 g/mL PMSF). Passer le tampon à travers un filtre à pores de 0,2 m et le stocker à 4 oC.
    Note: Effectuer toutes les étapes dans une pièce réfrigérée à 4 oC. La purification SEC est facultative, mais la protéine doit être stockée dans le tampon de fonctionnement SEC. Si la purification SEC est omise, la retentate recueillie en 3.6.2. doit être dialysé contre 1 L de tampon SEC dans 10 kDa MWCO (poids moléculaire coupé) tube de dialyse à 4 oC pendant la nuit.
  2. Équilibrez une colonne d'agarose croisée SEC (chromatographie d'exclusion de taille) (dimesions : 10 mm x 300 mm ; volume de lit de 24 mL ; volume d'échantillon de 25 - 500 L ; limite de pression de 1,5 MPa ; limite d'exclusion de 2 x 106 limite d'exclusion de Da ; 1 à 300 kDa séparation) avec sec Buffer courant à 0.5 mL/min.
    Note: Si les colonnes SEC de taille alternative souhaitées peuvent être utilisées.
  3. Chargez les fractions concentrées sur une boucle d'injection de volume de 200 ll. Chargez l'échantillon à 0,5 ml/min à la colonne. La résolution SEC augmente avec un volume de charge plus faible. Elute avec 23 mL SEC en cours d'exécution tampon et de recueillir 94 fractions de 250 L. Le chromatogramme SEC devrait résoudre un seul A280 pic qui est l'hétérodiste PCD. Nous constatons que PCD élute 8,9 mL. Le calendrier de l'élution changera avec d'autres colonnes SEC.

5. L'oxydation de PCA et les essais d'activité de nucléane

  1. Les réactions à l'assiduation de PCA et d'activité nucléane sont exécutées dans une plaque à fond plat de 96 puits. Assembler les réactions dans une plaque de puits 96 sur la glace dans une chambre froide à 4 oC pour prévenir une catalyse prématurée. Combiner dans un volume final de 50 OL : 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT, 5 mM PCA, 10 ng/mL plasmide pXbaMD et 10 euros de fractions individuelles PCD SEC SEC.
    Note: Les fractions DEC SEC doivent être ajoutées en dernier et immédiatement avant l'analyse car la protéine commencera la catalyse au moment de l'ajout.
  2. L'oxydation du PCD de PCA se traduit par une absorption réduite de PCA à 290 nm (A290). Transférer la plaque de puits 96 sur le support de plaque d'un lecteur de plaque réglé à une température interne de 37 oC. Retirez le porte-plaque dans l'instrument et mesurez A290 à 20 s intervalles pendant 1 h. Demandez à l'instrument de secouer la plaque 5 s avant chaque lecture.
  3. Après 1 h, terminez les réactions en ajoutant une solution d'arrêt de 10 l (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% de glycérol, 0,15% d'Orange G).
  4. Préparer, charger et exécuter un gel d'agarose comme à l'étape 3.2.
  5. Image et analyse du gel agarose comme à l'étape 3.3.
  6. Sélectionnez les fractions ayant l'activité d'oxydation la plus importante de l'APC et aucune contamination à nucléane observée pour un stockage à long terme à -80 oC. Mesurer l'A280.
  7. Calculer la concentration totale de PCD à l'aide de l'A280 et du coefficient d'extinction(280) de 734 700 M-1cm-1.
  8. Congeler les fractions individuelles dans l'azote liquide. Conserver dans un congélateur à -80 oC. Vous pouvez également combiner des fractions actives sans nucléarité, aliquot, et congeler de la même manière. Notre rendement typique est de 1-2 mg PCD par culture L. L'utilisation typique dans une expérience SM est de 3 g PCD. Nous avons utilisé le PCD stocké à -80 oC jusqu'à 1 an sans diminution de l'activité.

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Representative Results

Le PCD de récupération d'oxygène disponible dans le commerce est fréquemment contaminé par une nucléase d'ADN. La contamination de l'activité nucléase pourrait mener à de faux résultats dans des études fluorescentes, en particulier des études qui analysent l'ADN ou l'ADN interagissant protéines. Nous avons constaté que le PCD recombinant, un hétérodiste d'hexahistidine marqué pcaH et pcaG, peut être exprimé dans E. coli (Figure 1). L'hétérodiste est d'abord purifié par la chromatographie d'affinité nickel (figure 2). Le PCD est élugé en 2 étapes des concentrations d'imidazole. Les fractions de chromatographie sont analysées par SDS-PAGE. Les fractions de PCD presque pure sont concentrées et purifiées par la SEC (figure 3). Les fractions SEC sont analysées individuellement pour l'activité d'oxydation pcA et l'activité nucléase (figure 4). Les fractions qui présentaient une activité d'oxydation élevée et aucune activité apparente de nucléane sont indiquées pour la concentration en protéines et conservées dans un congélateur de -80 oC pour une utilisation expérimentale.

Figure 1
Figure 1 : Induction de PCD dans E. coli. (A) pVP91A-pcaHG est montré avec les sous-unités PCD pcaG (A) et hexahistidine-tagged pcaH ( ' ) PCD. (B) Gel SDS-PAGE représentatif de l'induction PCD. Les poids moléculaires sont indiqués sur la gauche. Les mobilités de 28,3 kDa hexahistidine-marqué pcaH et 22,4 kDa pcaG sont sur la droite. E. coli (Un), E. coli induit (In), le granule suivant la lyse et l'ultracentrifugation (P), le supernatant suivant l'ultracentrifugation à charger à une colonne de nickel (S), fraction représentative suivant la chromatographie de nickel (Ni), et fraction représentative suivant SEC (SE). Ce chiffre a été modifié par rapport à une publication précédente12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Purification de la chromatographie d'affinité de nickel du PCD. (A) Chromatogram de chromatographie d'affinité de nickel de PCD. L'A280 est représenté en bleu et la concentration en pourcentage de Ni Buffer B est indiquée en rouge. L'échantillon a été chargé dans une faible concentration d'imidazole de 20 mM. Le débit (Flw Thr) montre les protéines bactériennes solubles qui ne se lient pas à la résine de nickel. La colonne a été lavée avec 20 ml de 20 mM tampon imidazole. Un deuxième lavage de 15 ml a été effectué avec 125 mM d'imidazole. L'élution de PCD a été exécutée avec l'imidazole de 250 mM. Certains PCD élucidé en présence de 125 mM d'imidazole, mais la majorité de la protéine éludé eluted dans 250 mM imidazole. (B) Analyse SDS-PAGE représentative des fractions d'affinité nickel. La charge, le débit (Flw Thr), et le premier lavage ont montré l'induction réussie du PCD, les protéines bactériennes solubles qui n'ont pas lier la résine de nickel, et les protéines minimales observées pendant le premier lavage, respectivement. Plusieurs fractions tout au long de la deuxième étape de lavage et d'élution sont affichées. Les fractions du deuxième lavage comprenaient des protéines PCD, mais montraient également des contaminants de poids moléculaire plus élevés détectables. Les fractions de l'étape d'élution semblaient exemptes de contaminants. Les poids moléculaires sont indiqués sur la gauche. Les mobilités de pcaH et de pcaG sont affichées sur la droite. (C) Gel Agarose d'assay nucléane. La charge de colonne d'affinité de nickel, le débit, le lavage, et les fractions multiples ont été examinés pour l'activité de nucléase. Un contrôle négatif (contrôle) est le plasmide sans protéine ajoutée. Un contrôle positif (PCDa) est un PCD disponible dans le commerce connu pour être contaminé par une nucléase d'ADN. Les espèces d'ADN sont indiquées sur la droite comme petits fragments (SF), supercoiled (SC), linéaire (LN), cercle entaillé (NC), et dimer entaillé (ND). (D) Quantitation des différentes espèces d'ADN observées dans l'analyse de nucléase de gel d'agarose. Le volume total de pixels de chaque voie a été mesuré. Le volume de pixels de chaque espèce d'ADN a été déterminé et exprimé en pourcentage du volume total de pixels dans la voie. Le contrôle négatif était de 81,7% supercoiled avec 14,4% de cercles entaillés. Le contrôle positif a montré une augmentation significative de 46,0% des cercles entaillés. La charge et le débit contenaient des nucléases bactériennes qui ont converti le plasmide et contaminant l'ADN des bactéries en petits fragments. Le premier lavage à 20 mM d'imidazole semblait également contenir une activité nucléase importante, ce qui a donné lieu à des cercles linéaires et entaillés. Les fractions 4-7 du deuxième lavage à 125 mM d'imidazole présentaient également une activité nucléase significative (en particulier les fractions 4 et 5 qui ont généré le plasmide linéaire observé). Fractions 29-38 de l'étape d'élution semblait plus similaire à la commande négative. Dans cet exemple, les fractions 29-38 ont été choisies pour être combinées, concentrées et plus poussées par la SEC. Ce chiffre a été modifié par rapport à une publication précédente12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Purification du PCD par la SEC. (A) Chromatogram de SEC des fractions de PCD suivant la chromatographie d'affinité de nickel. L'A280 est indiqué en bleu et les fractions d'élution sont indiquées. PCD éludé de la SEC comme un seul pic apparent. (B) Analyse SDS-PAGE représentative des fractions 33-48 de la SEC. La charge est le PCD concentré suivant la purification d'affinité de nickel. Fractions 33-48 couvrent le pic apparent SEC. Aucun contaminant détectable n'a été observé. (C) Gel Agarose d'assay nucléane. La charge SEC et plusieurs fractions ont été testées pour l'activité nucléase. Un contrôle négatif (contrôle) est le plasmide sans protéine ajoutée. Un contrôle positif (PCDa) est un PCD disponible dans le commerce connu pour être contaminé par une nucléase d'ADN. Les espèces d'ADN sont indiquées sur la gauche comme supercoiled (SC), cercle entaillé (NC), et dimer entaillé (ND). (D) Quantitation des différentes espèces d'ADN observées dans l'analyse de nucléase de gel d'agarose. Le volume total de pixels de chaque voie a été mesuré. Le volume de pixels de chaque espèce d'ADN a été déterminé et exprimé en pourcentage du volume total de pixels dans la voie. Le contrôle négatif était de 82,1% supercoiled avec seulement 13,7% de cercles entaillés. Le contrôle positif a montré une augmentation significative de 64,8% des cercles entaillés. La charge SEC n'a montré aucune activité apparente de nucléase due au choix judicieux des fractions de la purification d'affinité de nickel. De même, les fractions 33-48 semblaient similaires au contrôle négatif. Par exemple, la fraction 36 était 82,5% supercoiled et 13.2% entaillé le cercle. Dans cet exemple, les fractions 36 et 37 ont été choisies pour être quantifiées, congelées et conservées dans un congélateur de -80 oC pour une utilisation expérimentale future. Ce chiffre a été modifié par rapport à une publication précédente12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Oxydation PCA et activité de nucléane des fractions DE PCD SEC. L'oxydation de PCA a été mesurée par A290. Comme PCD oxydé la molécule de PCA, l'A290 a diminué. L'oxydation de PCA a été mesurée tous les 20 s pour 1 h. Un contrôle négatif sans fraction supplémentaire de PCD (ligne bleue) n'a montré aucun changement dans A290, indiquant que la molécule de PCA était stable. Les données de trois fractions représentatives sec (36 en rouge, 33 en orange, 39 en jaune) montrent que pcD purifié réduit l'A290, indiquant l'oxydation de PCA. Ce chiffre a été modifié par rapport à une publication précédente12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Les systèmes de récupération d'oxygène sont généralement inclus dans la microscopie à fluorescence à molécule unique pour réduire le photoblanchiment3,7,8. Ces techniques de microscopie sont souvent utilisées pour observer les acides nucléiques ou les interactions protéiques avec les acides nucléiques1,13,14. La contamination des OSS par des nucléases peut entraîner de faux résultats.

Il a été démontré que les SSO disponibles dans le commerce, y compris GODCAT et PCD, comprennent une contamination importante par nucléase11. Il est possible d'acheter PCD et d'employer SEC pour enlever le contaminant nucléal11. Cependant, le prix de la PCD disponible dans le commerce d'un fournisseur a été multiplié par 5 après la publication de cette méthode. Cette méthode génère un hétérodème PCD très actif et sans nucléane et peut être réalisée dans un délai de 1 semaine. D'après notre expérience, la quantité de PCD générée par une culture de 1 L (1-2 mg) est suffisante pour une année d'expériences (3 g/expérience) dans un laboratoire productif avec 2 systèmes d'imagerie fluorescente.

L'efficacité d'induction est la clé du succès de cette méthode. Si l'hétérodiste PCD n'est pas efficacement induit et apparent par SDS-PAGE, la purification sera infructueuse. Deux stratégies alternatives peuvent être essayées. Tout d'abord, essayez l'induction d'une colonie différente sur la plaque de transformation e. coli. Deuxièmement, nous avons déjà eu du succès avec BL21, mais une autre souche E. coli pour l'expression, comme BL21 pLysS, peut être essayée. Le succès de l'axédation pcA repose sur une exposition minimale du substrat au PCD avant de commencer l'effort. Il est fortement recommandé d'assembler les 96 réactions de plaque de puits sur la glace dans une chambre froide et d'ajouter l'échantillon de protéines immédiatement avant de charger la plaque au lecteur.

La chromatographie d'affinité de nickel peut être suffisante pour identifier des fractions de PCD pur sans l'activité contaminante de nucléase. Dans ce cas, il est possible d'éliminer la purification SEC. Cependant, les fractions de chromatographie de nickel devraient être combinées et dialysées pendant la nuit à 4 oC dans le tampon de fonctionnement de SEC. Le glycérol présent dans le tampon de fonctionnement sec est important pour le stockage à -80 oC.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par NIH GM121284 et AI126742 à KEY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

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References

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  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
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  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).

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Biochimie Numéro 153 chromatographie protocatechuate-3,4-dioxygénase (PCD) contamination par nucléane acide protocatéhuique (PcA) espèces réactives d'oxygène systèmes de récupération d'oxygène (OSS)
Expression et purification de nuclease-Free Oxygen Sccatechuate 3,4-Dioxygenase
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Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

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