Summary
プロトカテクテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ(PCD)は、その基質プロトカテク酸(PCA)を使用して水系から遊離した二原子酸素を酵素的に除去することができる。このプロトコルは、この酸素清掃酵素の発現、精製、および活性分析について説明する。
Abstract
単一分子(SM)顕微鏡は、蛍光体標識生体分子の動的分子相互作用の研究にリアルタイムで使用されます。しかし、蛍光管は溶存酸素による光脱白による信号の損失を起こしやすい(O2)。光白化を防止し、蛍光を通す寿命を延ばすために、酸素清掃システム(OSS)がO2を低減するために採用されている。市販のOSSは、核酸を損傷または分解するヌクレアーゼによって汚染され、実験結果の解釈を混同し得る。ここでは、検出可能なヌクレアーゼ汚染のない高活性シュードモナスプチダプロトカテクテネート-3,4-ジオキシゲナーゼ(PCD)の発現および精製のためのプロトコルを詳述する。PCDは、基質プロトカテク酸(PCA)を3-カルボキシシス、シスムコン酸に変換することにより反応性O2種を効率的に除去することができる。この方法は、O2がデータ取得に有害な役割を果たす任意の水性システムで使用できます。この方法は、市販のPCDと比較して、非常に活性の高いヌクレアーゼフリーPCDを製造する上で有効である。
Introduction
単一分子(SM)生物物理学は、生物現象の見方を変える急速に成長する分野です。この分野は、物理学と化学の基礎法則を生物学に結びつけるユニークな能力を持っています。蛍光顕微鏡は、SM感度を達成できる生物物理学的方法の1つです。蛍光は、生体分子を小さな有機蛍光体または量子ドット1に連結することによって検出するために使用される。これらの分子は、不可逆的に光脱白する前にレーザーで励起されると光子を放出することができる2.光脱色は、蛍光標識が所望の波長2、3で励起する能力を破壊する化学的損傷を受けたときに起こる。水性緩衝液中に活性酸素種(ROS)が存在することは、光脱色の主な原因である2、4である。さらに、ROSは生体分子に損傷を与え、SM実験5、6の誤った観察につながる可能性があります。酸化的損傷を防ぐために、酸素清掃システム(OSS)を3、7、8として用いることができる。グルコースオキシダーゼ/カタレーゼ(GODCAT)システムは酸素8を除去する上で効率的であるが、中間体として潜在的に有害な過酸化物を生成する。これらは、SM研究に関心のある生体分子に損害を与える可能性があります。
あるいは、プロトカテクテクテク酸3,4ジオキシゲナーゼ(PCD)は、その基質プロトカテク酸(PCA)7、9を用いて水溶液からO2を効率的に除去する。PCDは、非ヘム鉄を用いてPCAを配合し、溶解したO210を用いてカテコールリング開口反応を触媒する金属酵素である。この一歩反応は、SM実験7における蛍光性安定性を向上させるための全体的に優れたOSSであることが示されている。残念ながら、PCDを含む多くの市販のOSS酵素は、ヌクレアーゼ11を汚染して含有する。これらの汚染物質は、SM実験で使用される核酸系基質の損傷につながる可能性があります。この研究は、SMシステムにおける組換えPCDの使用のためのクロマトグラフィーベースの精製プロトコルを解明する。PCDは、ROSがデータ取得に必要な基板にダメージを与えているあらゆる実験に広く適用できます。
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Protocol
1.大腸菌におけるPCD発現誘導
- 1 μL pVP91A-pcaHG PCD 発現プラスミド(20 ng/μL、図1A)と20μLの大腸菌BL21(市販の20μL細胞、>2 x 106 cfu/μgプラスミド)をチューブに組み合わせます。ミックスするチューブをフリックします。氷の上にチューブを置きます 5 分.
- 30 s の場合は 42 °C に変換を配置します。その後、氷2分。
- 80 μL SOCメディア(カタボライト抑制付き超最適なスープ:2.5 mM KCl、10 mM NaCl、2%トリプトン、0.5%酵母エキス、10 mMMgSO 4、10 mM MgCl2、20mMグルコース)を追加します。1時間あたり225回転(rpm)37°Cで1時間振ります。
- LBアンプ寒天(1Lルリアブロス寒天:10 g NaCl、10 gバクトトリプトン、5g酵母エキス、15g寒天、50 μg/mLアンピシリン;直径10cmのペトリ皿あたり25 mL)に変換反応をプレートします。
- プレートをインキュベートし、蓋を下に向けて、37°Cで16-18時間。
- 250 mLエルレンマイヤーフラスコに50mL LBアンペア(1L LB:1L LB:10 gバクトトリプトン、10g NaCl、5g酵母エキス、50μg/mLアンピシリン)を1つのコロニーで接種します。225 rpmで16-18時間振とうに37°Cでインキュベートする。
- 1 L LBアンペアで4 Lフラスコに20 mL培養物を移します。37°で225 rpmで振る。
- 毎に培養OD600(600nmにおける光学密度)を測定する。培養OD600が0.5に近づくにつれて、測定頻度を15分ごとに増やす。培養物の所望の密度は0.5 OD600である。
- 4Lフラスコを氷のビンに移します。氷浴でフラスコを旋回して培養温度を下げます。
注:細胞が代謝的に活動的なままになるように、氷上の時間を最小限に抑える必要があります。理想的には、細胞は10分未満の氷の上になります。 - PCDの誘導の成功は、変性ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)分析によって観察することができる。チューブ内の未誘導培養物の収穫1mL。周囲温度のマイクロファジで14,000 x gでサンプルを1分回転させます。上清をデカントする。
- ペレット化細胞を150μL PBS(リン酸緩衝生理食塩糸)で溶入する。
- 2Xローディング染料(1.2%SDS、30%グリセロール、150 mMトリスHCl、pH 6.8、0.0018%ブロモフェノールブルー、15%β-メルカプトエタノール)の等量を追加します。徹底的に混合するサンプルをボルテックス。
- サンプルを3分間沸騰させ、氷に移す。サンプルは将来の分析のために-20 °Cの冷凍庫に貯えることができる。
注:PBS は、CaCl2および MgCl2の有無にかかわらず市販されています。多くの実験室は、細胞培養方法のためのCaCl2およびMgCl2なしでPBSを有するであろう。我々は、CaCl2とMgCl2の有無にかかわらずPBSとの違いを見つけていない。
- 4 Lフラスコを17°Cのインキュベーターに180rpmの振り回しで移します。OD600を20分ごとに監視し続けます。
- 0.7 OD600でイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を0.5mM最終濃度(0.25M原液)および10mg/Lアンモニウム鉄(II)硫酸六水和物(Fe(NH4)2(SO4)2、10mg/mL原液を添加する。PCD遺伝子pcaHおよびpcaGは、IPTGの添加によってT5プロモーターから誘導される(図1A)。硫酸鉄はPCDによって結合され、カテコール開口部の間に酸素を調整することによって触媒活性のために必要とされる。
- 18時間17°Cで180rpmで培養を振る。
- 1.2のように培養フラスコを氷に入れなさい。1.3のようにSDS-PAGE用の誘導細胞の1mLを収穫する。
- 遠心分離に適したボトルに細菌培養物を注ぎます。1 L培養物は、4つの250mL円錐底ボトルで遠心分離され得る。3000 x g. 上清をデカントして20分間4°Cで培養をペレット。細菌性液体廃棄物を適宜処分する。
- ピペットは、1L培養につき25mLの冷たいPBS(CaCl2およびMgCl2は任意である)でペレットを再サスペンドする。
- 50 mL 円錐管(1 L 培養あたり 1 50 mL チューブ)に懸濁液を移します。細胞を3000 x gで4°Cで20分間ペレットします。上清をデカントし、適切に処分します。
- 10 mL のリシス バッファー (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl、pH 7.5、20 mM イミダゾール、10%グリセロール、800 ng/mL ペプタチン、1 μg/mL ルペプチン、および 87.1 μg/mL フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF))デュワーフラスコの液体窒素でリサスペンションを凍結します。サンプルチューブは-80°Cの冷凍庫に保管してください。私たちは、活性の明らかな損失なしで1年間-80°Cで保存されたペレットからPCDを精製しました。
- SDS-PAGEで誘導細胞と誘導細胞を比較します。
注:私たちはPCDヘテロダイマーの誘導に苦労していません。ただし、試薬の有効期限が突然切れた場合に精製を続行する前に、誘導をテストすることをお勧めします。- SDS-PAGE用のプレートを組み立てます(寸法:7.3 cm x 8.3 cm x 0.75 mmの厚さ)。スタッキングゲルは1.5 mL 6%ポリアクリルアミド(6%アクリルアミド、125 mMトリスHCl、pH 6.8、0.1%SDS、0.1%過硫酸アンモニウム、0.001%TEMED)です。解決ゲルは3.5 mL 12%ポリアクリルアミド(12%アクリルアミド、375 mM Tris-HCl、pH 8.8、0.1%SDS、0.1%過硫酸アンモニウム、0.001%TEMED)です。10 ウェルコームをスタッキング レイヤーに挿入します。
- 未誘導および誘導細菌サンプルの10°Lをロードします。タンパク質に対する前染色分子量マーカーの4μLをロードする(図1B)。
- 16.5 V/cmでゲルを約1時間でエレクトロフォレーゼ。ブロモフェノールブルーは、ゲルの底に到達する必要があります。
- プラスチック製の浴槽にクマシーブルーステイン(酢酸10%、メタノール40%、クマシーブルー染料0.1%)にゲルを入れします。汚れは完全にゲルを浸す必要があります。周囲温度で20分間の汚れは、染色中の穏やかな回転は任意である。
- 溶液をデステイン(酢酸10%、メタノール40%)に置き換えます。タンパク質バンドが容易に見えるまで、オプションの穏やかな回転で周囲温度でインキュベートします。
- 脱剤を脱イオン水に置き換えます。細菌タンパク質の中で、誘導されたPCDサブユニットは、誘導された細胞で見えるべきである。ヘキサヒスチジンタグ付きPCDサブユニットpcaHは分子量28.3kDaで、pcaGサブユニットは22.4kDaです。PCDサブユニットが明らかでない場合は、新規コロニー由来の新しい誘導を行う必要があります。
2. PCDのニッケルアフィニティークロマトグラフィー精製
- 人工細胞の氷の上で1 50 mLチューブを解凍します。サンプルを完全に解凍するのに2〜3時間かかる場合があります。
- チューブを氷の上に置き、サンプルを30%の振幅で1分間超音波処理し、1 sのオンとオフをサイクリングします。テーパーマイクロチップ(直径0.125インチ)超音波処理器を使用してください。最大電力は400 Wで、周波数は20 kHz、1 L培養ペレットあたりです。
- 超音波処理の後、0.2 mg/mL最終濃度(10 mg/mlのストック溶液)にリソザイムを加え、4°Cで30分間氷の上に保ちます。
- あらかじめ冷やしたポリカーボネートボトル(寸法:25mm x 89mm)に細菌のリサートを注ぎます。ボトルは、固定角度超遠心分離ローターと互換性がある必要があります。他のチューブやローターは置き換えることができますが、最終的な重力を維持する必要があります。
- 遠心分離機は4°Cで120,000 x gで60分間。細胞の破片はペレットを形成します。上清が黄色く見えることがあります。
- ペレットは、PCDの溶解度を決定するために、後続のSDS-PAGE分析に含まれ得る(図1B)。10 mL PBSでボルテックスしてペレットを溶入する。150°Lを1.5mLのチューブに移します。1.3 のように SDS-PAGE のサンプルを準備します。
- 冷たい50mL円錐管に上清を注ぎます。音量をメモします。細菌DNAによる上清の汚染は、粘性試料を生じ得る。細菌ゲノムDNAはカラムの流れを遮断する可能性があります。超遠心分離工程2.2は、細菌DNAをペレット化するために繰り返されるべきである。この第2のスピンからのペレットは容易に見えないか、透明であるかもしれない。
- 500 mL Ni バッファ A (300 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、および 10% グリセロール、800 ng/mL ペプタチン、1 μg/mL ロイペプチン、 および 87.1 μg/mL PMSF)および 500 mL Ni バッファ B (300 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、10% グリセロール、800 ng/mL ペプスタチン、1 μg/mL ルペプチン、および 87.1 μg/mL PMSF、250 mmmmmmmm)両方のNiバッファを0.2μmの細孔フィルタに渡します。
- 試料、緩衝液、およびFPLC(高速タンパク質液体クロマトグラフィー)システムは、4°Cの冷蔵室内にあります。Ni Buffer AでポンプAを洗浄し、NiバッファBでポンプBを洗浄し、UVと導電率が安定するまで20 mMイミダゾール(8%Ni緩衝B、92%NiバッファA)でシステムを洗浄します。私たちは、1.0 MPa圧力制限で5 mL/分でバッファを定期的に流します。流量と圧力制限は、使用するFPLC機器の仕様によって決定されるべきです。
- 1.5 mLニッケル帯電樹脂(寸法:長さ110mm×5mm)で柱を用意します。樹脂結合容量は50 mg/mLであり、1 MPa圧力を許容できる。カラムを注ぎ、精製前に4°Cで保存してもよい。
注:カラムのサイズは、より多くのタンパク質が必要な場合に、誘導細胞の複数の50 mLチューブを収容するために比例的に増加することができる。私たちは、残留タンパク質が私たちの所望のタンパク質を汚染しないように、各調製のための新鮮なカラムを好みます。ただし、ニッケル樹脂はメーカーの指示に従ってリサイクルされる場合があります。 - ニッケル帯電樹脂のカラムをFPLCに取り付けます。92%NiバッファAの20 mLと8%NiバッファB(20 mMイミダゾール)を0.5 mL/minで実行し、カラムを通して0.5 MPa圧力制限を平衡化します。リアルタイムでFPLCは、A280(280 nmの紫外線吸光度)と導電率を測定する必要があります。20 mL のボリュームが列を通過してもこれらの値が安定しない場合は、バッファーが安定するまでバッファーをフローします。
- サンプルを 0.15 mL/min のカラム (~10 mL) にロードします。流れを集めます。
- 20 mM イミダゾール (92% Ni バッファー A および 8% Ni バッファー B) で 20 mL Ni バッファーでカラムを洗浄します。分析のために50 mLの管で洗浄を保持する。50%NiバッファーAと50%NiバッファーB(125 mMイミダゾール)の15 mLでカラムを洗浄します。0.8 mL容積の19の分率で溶出を集める。15 mL 100% Ni バッファー B. 0.2 mL のさらに 75 個の分数を収集して、カラムを洗浄します。一部のPCDヘテロダイマーは50%Ni緩衝液B洗浄で溶出しますが、ヘテロ二量体の大部分は100%Ni Buffer B洗浄で溶出します。
- 12% SDS-PAGE ゲル上の収集された分数を分析して、PCD の存在を確認します。流れに2Xローディング染料の等量を加え、280分の流れ、洗浄、ピークAを流します。3分間沸騰し、氷に移す。2つの12%SDS-PAGEゲルを注ぎます(ステップ1.7のように)。1.7の説明に従ってゲル法を繰り返します。
3. ヌクレアーゼ活性アッセイ
- SDS-PAGE 分析に基づいて、ほぼ純粋な PCD を含むニッケルアフィニティー分数を特定します。反応バッファー(50 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 mM NaCl、5 mM MgCl 2、0.1 mM DTT)に500ng3 kbのスーパーコイルドプラスミドpXba+を50μLの最終体積で組み合わせます。
- 37°Cで1時間インキュベートする。
- 陰性対照(タンパク質を添加しない)および陽性対照(市販のPCD)を含む。10 μL 停止溶液 (150 mM EDTA、pH 8.0、0.6% SDS、18% グリセロール、0.15% オレンジ G) で反応を停止します。
- サンプルは-20°冷凍庫に保管して、後で分析することができます。任意のスーパーコイルドプラスミドは、スーパーコイルおよびリラックスした円反応生成物がアガロースゲル電気泳動によって解決され得る限り、ヌクレアーゼアッセイに使用され得る。
- 120 mL 1% アガロースゲルを1X TAEエチジウム緩衝液(40mMトリス酢酸、1mM EDTA、0.5μg/mL臭化エチジウム)にゲルキャスト(寸法:15 x 10cm)で注ぎます。15ウェルコーム(井戸寸法:5mm x 1.5 mm)を使用してください。ゲルがセットされたら、1X TAEエチジウム緩衝液に浸漬する。
- アガロースゲルによる反応の30°Lを分析します。周囲温度で約1時間の周囲温度で10V/cmのエレクトロフォレーゼ。オレンジG染料前面は、ゲルの端にある必要があります。
- 蛍光スキャナーを使用して、ゲルの臭化エチジウムシグナルを即座に画像化します。3 kb のプラスミドを使用した場合、最も遅いバンドは~3.5 kb で円を緩和し、線形 DNA は 3 kb で実行され、スーパーコイルド プラスミドは最大の移動度を ~2 kb で持つことになります。
- 画像解析ソフトウェアを使用して、各レーンの合計ピクセル量を計算します。
- スーパーコイル、リニア、ニック円など、さまざまな DNA 種のピクセル体積を決定します。これらの値を使用して、各DNA種のパーセンテージを決定します。例えば、負の対照と比較した分数に関連するニック円の存在の増加は、ヌクレアーゼの存在を示す。レーン内のニックされた円のピクセルボリュームは、DNA全体のピクセル値で除算されます。この数値に 100 を掛けてパーセンテージを決定します。
- SDS-PAGE分析に基づいてほぼ純粋なPCDヘテロ二量体を含み、検出不能なヌクレアーゼ活性を最小限に抑える第2の溶出ピークからの分数を組み合わせます。私たちの典型的なプールボリュームは約2mLです。
- 10 kDa分子量カットオフで遠心フィルターユニットにサンプルをロードします。4000 x gのスイングバケット遠心分離機で40分間、40分間遠心分離機。あるいは、35°固定角度ロータは、4°Cで20分間7500 x gで使用することができる。
- 最終的なリテント体積が100~200°Lになるまで遠心分離を繰り返します。
- フィルターユニットを反転し、1000 x gで4°Cで2分間遠心分離してリテントを回収します。
4. PCDのサイズ排除クロマトグラフィー精製
- 250 mL サイズの除外クロマトグラフィー (SEC) ランニング バッファー (100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、10% グリセロール、0.1 mM EDTA、800 ng/mL ペプスタチン、1 μg/mL ルペプチン、および 87.1 μg/mL PMSF)を作成します。バッファを0.2μmの細孔フィルターに通し、4°Cで保管してください。
注:4°Cの冷蔵室ですべてのステップを実行します。SEC精製は任意ですが、タンパク質はSEC実行バッファに保存する必要があります。SEC精製を省略した場合、リテントは3.6.2で回収する。10 kDa MWCO(分子量カットオフ)透析チューブでSEC緩衝液1Lに対して一晩4°Cで透析を行う必要があります。 - 架橋アガロースSEC(サイズ排除クロマトグラフィー)カラム(ダイム:10 mm x 300 mm;24 mLベッド容積;25~500 μLサンプルボリューム;1.5 MPa圧力制限;2 x 106 Da 除外制限;1~300 kDa分離)をSECランニングバッファで0.5mL/分で平衡化します。
注:必要に応じて、SEC列を代替サイズとして使用できます。 - 濃縮画分を200μLのボリュームインジェクションループにロードします。サンプルを 0.5 mL/min で列にロードします。SEC 解像度は、負荷量が少なくなるにつれて増加します。23 mL SECランニングバッファを使用して溶出し、250°Lの94画分を収集します。SECクロマトグラムは、PCDヘテロダイマーである単一のA280ピークを解決する必要があります。PCD は 8.9 mL を溶出することがわかります。溶出タイミングは、代替 SEC 列によって変化します。
5. PCA酸化およびヌクレアーゼ活性アッセイ
- PCAの酸化とヌクレアーゼ活性の両方のアッセイに対する反応は、96ウェルフラットボトムプレートで行われる。早期触媒を防ぐために、4°Cの冷たい部屋で氷の上の96ウェルプレートで反応を組み立てます。50 μLの最終容積で組み合わせる:130 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、5 mM MgCl 2、0.1 mM DTT、5 mM PCA、10 ng/mLスーパーコイルドプラスミドpXba+、および個々のPCD SEC画分の10°L。
注:PCD SEC画分は、タンパク質が添加時に触媒を開始するので、分析の直前に最後に追加する必要があります。 - PCAのPCD酸化は、290nm(A290)でのPCAの吸光度の低下をもたらす。96ウェルプレートをプレートリーダーセットのプレートホルダーに37°Cの内部温度に移します。プレートホルダーを器具に引き込み、20s間隔でA290を1時間測定します。各読み取り前に、計器でプレート5sを振ってください。
- 1時間後、10μL停止溶液(150 mM EDTA、pH 8.0、0.6%SDS、18%グリセロール、0.15%オレンジG)を加えて反応を終了します。
- ステップ3.2のようにアガロースゲルを準備、ロード、実行します。
- ステップ3.3のようにアガロースゲルを画像化し、分析する。
- -80°Cでの長期保存のための最も多くのPCA酸化活性および観察されたヌクレアーゼ汚染を有する分画を選択する。A280を測定します。
- A280と 734,700 M -1 cm-1の消滅係数 (ε280)を使用して PCD 濃度の合計を計算します。
- 液体窒素中の個々の画分をスナップ凍結します。-80°Cの冷凍庫で保存してください。あるいは、活性、ヌクレアーゼフリー画分、アリコートを組み合わせ、同じ方法で凍結する。私たちの典型的な収率は、L培養あたり1-2 mgのPCDです。SM実験での典型的な使用は3μg PCDである。-80°Cで保存したPCDを最大1年間使用し、活動性を低下さなくしました。
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Representative Results
市販の酸素捕捉剤PCDは、DNAヌクレアーゼで頻繁に汚染される。ヌクレアーゼ活性を汚染すると、蛍光研究、特にDNAまたはDNA相互作用タンパク質を分析する研究において、スプリアスの結果につながる可能性があります。組換えPCDは、ヘキサヒスチジンタグ付きpcaHおよびpcaGのヘテロ二量体であり、大腸菌で発現され得る(図1)。ヘテロ二量体は、まずニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製される(図2)。PCDは、イミダゾール濃度の2ステップで溶出される。クロマトグラフィー分画はSDS-PAGEによって分析される。ほぼ純粋なPCDの端数は、SECによって濃縮され、さらに精製される(図3)。SEC画分は、PCA酸化活性とヌクレアーゼ活性の両方について個別に分析される(図4)。高い酸化活性を示し、明らかなヌクレアーゼ活性を示さない画分は、タンパク質濃度に対してアッセイされ、実験的な使用のために-80°冷凍庫に保管されます。
図1:大腸菌におけるPCDの誘導 .(A)pVP91A-pcaHGは、pcaG(α)およびヘキサヒスチジンタグ付きpcaH(β)PCDサブユニットと共に示されている。(B) PCD誘導の代表的なSDS-PAGEゲル。分子量は左側に示されています。28.3 kDa ヘキサヒスチジンタグ付き pcaH および 22.4 kDa pcaG のモビリティは右側にあります。未誘導大腸菌(Un)、誘導大腸菌(In)、大腸菌リジおよび超遠心分離に続くペレット(P)、ニッケルカラム(S)に装填される超遠心分離に続く上清、ニッケルクロマトグラフィー(Ni)に続く代表的画分、およびSEC(SE)に続く代表的な画分。この図は、以前の文書12から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PCDのニッケルアフィニティークロマトグラフィー精製(A) PCDのニッケルアフィニティークロマトグラフィーのクロマトグラム。A280は青色で示され、Ni緩衝液Bの濃度のパーセントは赤色で示されています。試料を低い20mMイミダゾール濃度で装填した。フロースルー(Flw Thr)は、ニッケル樹脂に結合しなかった可溶性細菌タンパク質を示す。カラムを20mMイミダゾール緩衝液の20mLで洗浄した。2回目の15mL洗浄を125mMイミダゾールで行った。PCDの溶出は250mMイミダゾールで行った。一部のPCDは125mMイミダゾールの存在下で溶出したが、タンパク質の大部分は250mMイミダゾールで溶出した。(B)ニッケル親和性画分の代表的なSDS-PAGE分析負荷は、フロースルー(Flw Thr)、および最初の洗浄がPCDの誘導に成功したことを示し、ニッケル樹脂を結合しなかった可溶性細菌タンパク質、および最初の洗浄時に観察された最小限のタンパク質をそれぞれ示した。第2の洗浄および溶出工程を通していくつかの画分が示される。第2の洗浄からの画分にはPCDタンパク質が含まれていたが、検出可能な高分子量汚染物質も表示された。溶出工程からの画分には汚染物質が含まないように見えた。分子量は左側に示されています。pcaH と pcaG のモビリティが右側に表示されます。(C)ヌクレアーゼアッセイのアガロースゲル。ニッケル親和性カラム負荷、フロースルー、洗浄、および複数の画分をヌクレアーゼ活性について試験した。陰性対照(対照)は、タンパク質を添加しないプラスミドである。陽性対照(PCDa)は、DNAヌクレアーゼで汚染することが知られている市販のPCDである。DNA種は、小さな断片(SF)、スーパーコイル(SC)、線形(LN)、ニック付き円(NC)、およびニックダイマー(ND)として右側に示されます。(D)アガロースゲルヌクレアーゼアッセイで観察される各種DNA種の定量。各レーンの合計画素量を測定した。各DNA種の画素体積を決定し、レーン内の全画素量に対するパーセンテージで表した。ネガティブコントロールは81.7%で、14.4%のニック円でスーパーコイルされました。正のコントロールは、46.0%のニック円の大幅な増加を示しました。負荷と流れは、プラスミドと汚染細菌DNAを小さな断片に変換する細菌ヌクレアーゼを含んでいました。20 mM イミダゾールでの最初の洗浄も有意なヌクレアーゼ活性を含んでいるように見え、線形およびニック円をもたらした。125mMイミダゾールでの第2の洗浄からの画分4〜7はまた、有意なヌクレアーゼ活性を示した(特に、報告された線形化プラスミドを生成した画分4および5)。溶出工程からの画分29〜38は、負対照に近いように見えた。この例では、分数29〜38を組み合わせ、濃縮し、SECによってさらに精製するように選択された。この図は、以前の文書12から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:PCDのSEC精製(A)ニッケルアフィニティークロマトグラフィーに続くPCD画分のSECのクロマトグラム。A280は青色で示され、溶出分率が示される。PCDは単一の見かけ上のピークとしてSECから溶出した。(B) SEC分数の代表的なSDS-PAGE分析 33-48.負荷は、ニッケル親和性精製に続く濃縮PCDである。分数33-48は、見かけのSECピークにまたがっています。検出可能な汚染物質は認められなかった。(C)ヌクレアーゼアッセイのアガロースゲル。SEC負荷および複数の画分をヌクレアーゼ活性について試験した。陰性対照(対照)は、タンパク質を添加しないプラスミドである。陽性対照(PCDa)は、DNAヌクレアーゼで汚染することが知られている市販のPCDである。DNA種は、左にスーパーコイル(SC)、ニックサークル(NC)、およびニックダイマー(ND)として示される。(D)アガロースゲルヌクレアーゼアッセイで観察される各種DNA種の定量。各レーンの合計画素量を測定した。各DNA種の画素体積を決定し、レーン内の全画素量に対するパーセンテージで表した。ネガティブコントロールは82.1%で、わずか13.7%のニック円でスーパーコイルされました。正のコントロールは、64.8%のニック円の大幅な増加を示しました。SEC負荷は、ニッケル親和性精製からの画分の慎重な選択による明らかなヌクレアーゼ活性を示さなかった。同様に、分数33〜48は負対照に類似して現れた。例えば、分数36は82.5%のスーパーコイル、13.2%のニック円であった。この例では、分画36および37を定量化し、凍結し、将来の実験用に-80°Cの冷凍庫に保管することを選択した。この図は、以前の文書12から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:PCD SEC画分のPCA酸化およびヌクレアーゼ活性。PCA酸化はA290で測定した。PCDがPCA分子を酸化するにつれて、A290は減少した。PCA酸化は20s毎に1時間測定した。PCD画分を加えない負の対照(青線)はA290に変化を示さず、PCA分子が安定したことを示す。3つの代表的なSEC画分(赤色36、オレンジ33、黄色39)からのデータは、精製されたPCDがA290を減少させ、PCAの酸化を示すことを示す。この図は、以前の文書12から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
酸素清掃システムは、光漂白を低減するために一般的に単一分子蛍光顕微鏡に含まれています。これらの顕微鏡法は、核酸1、13、14との核酸またはタンパク質相互作用を観察するためにしばしば使用される。ヌクレアーゼを含むOSSの汚染は、スプリアスの結果につながる可能性があります。
GODCATおよびPCDを含む市販のOSSは、有意なヌクレアーゼ汚染11を含むことが示されている。PCDを購入し、ヌクレアーゼ汚染物質11を除去するためにSECを採用することが可能です。しかし、あるベンダーから市販のPCDの価格は、その方法の公表に続いて5倍に増加しました。この方法は、非常に活性なヌクレアーゼ遊離PCDヘテロダイマーを生成し、1週間以内に行うことができると考えられる。私たちの経験では、1L培養(1〜2mg)によって生成されるPCDの量は、2つの蛍光イメージングシステムを備えた生産的な実験室での1年間の実験(3μg/実験)に十分です。
誘導効率は、この方法の成功の鍵です。PCDヘテロ二量体がSDS-PAGEによって効率的に誘導され、明らかでない場合、精製は失敗します。2つの代替戦略が試みられるかもしれません。まず、大腸菌変換板上の別のコロニーからの誘導を試みる。第二に、BL21で以前に成功を収めましたが、BL21 pLysSのような発現のための代替大腸菌株が試みられるかもしれません。PCA酸化アッセイの成功は、アッセイを開始する前に、PCDへの基板の最小限の露出に依存する。コールドルームで氷上で96ウェルプレート反応を組み立て、プレートをリーダーにロードする直前にタンパク質サンプルを追加することを強くお勧めします。
ニッケルアフィニティークロマトグラフィーは、ヌクレアーゼ活性を汚染しない純粋なPCDの画分を同定するのに十分であり得る。この場合、SEC精製を排除することができる。しかし、ニッケルクロマトグラフィー画分は、SECランニングバッファで4°Cで一晩組み合わせて透析する必要があります。SECランニングバッファに存在するグリセロールは、-80°Cでの保存に重要です。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この作品は、NIH GM121284およびAI126742からKEYにサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
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