Summary
Den tåre kirtel (LG) har to celletyper, der udtrykker α-glat muskel aktin (αsma): myoepithelial celler (mecs) og pericytter. Mecs er af ektodermal oprindelse, findes i mange kirtel væv, mens pericytter er vaskulære glatte muskelceller af endodermale oprindelse. Denne protokol isolerer Mec'er og pericytter fra murine LGs.
Abstract
Den tåre kirtel (LG) er en eksokrin tubuloacinar kirtel, der udskiller et vandigt lag af tåre film. LG epitelial træet består af acinar, duktalt epitelial og myoepitel celler (mecs). Mecs Express Alpha glatte muskel aktin (αsma) og har en kontraktile funktion. De findes i flere kirtel organer og er af ektodermal oprindelse. Desuden, LG indeholder SMA + vaskulære glatte muskelceller af endodermale oprindelse kaldet pericytter: kontraktile celler, der omsluttes overfladen af vaskulære rør. En ny protokol giver os mulighed for at isolere både MECs og pericytter fra voksne murine LGs og submandibulære kirtler (SMGs). Protokollen er baseret på den genetiske mærkning af MECs og pericytter ved hjælp af SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl musestamme, efterfulgt af forberedelsen af LG enkelt cellesuspension til fluorescens aktiveret celle sortering (FACS ). Protokollen giver mulighed for adskillelse af disse to cellepopulationer af forskellig oprindelse baseret på ekspression af EpCAM-cellens adhæsions molekyle, mens pericytterne ikke udtrykker EpCAM. Isolerede celler kan anvendes til celle dyrkning eller analyse af genekspression.
Introduction
Myoepithelial celler (MECs) er til stede i mange eksokrine kirtler herunder lacrimal, spyt, harderian, sved, prostata, og mammary. MECs er en unik celletype, der kombinerer en epitelial og en glat muskel fænotype. Mecs Express α-glatte muskel actin (SMA) og har en kontraktile funktion1,2. Ud over mecs, den tåre kirtel (LG) og submandibulær kirtel (SMG) indeholder SMA + vaskulære celler kaldet pericytter, som er celler af endodermale oprindelse, der indhyller overfladen af vaskulære rør3. Selv om mecs og pericytter udtrykke mange markører, SMA er den eneste markør, der ikke udtrykkes i andre LG og SMG celler1,3.
Inden for de sidste 40 år rapporterede flere laboratorier analyser for afkobling af forskellige eksokrine kirtel væv, hvor ikke-enzymatiske og enzymatiske tilgange blev anvendt. I en af de første rapporter, der blev offentliggjort i 1980, beskrev Fritz og medforfattere en protokol til isolering af felin parotideale acini ved hjælp af sekventiel fordøjelse i en kollagenase/trypsin opløsning4. I 1989 justerede Hann og coforfattere denne protokol for acini isolation fra rotte LGs ved hjælp af en blanding af collagenase, hyaluronidase og DNase5. I 1990 offentliggjorde Cripps og kolleger metoden med ikke-enzymatisk afkobling af tåre kirtel acini6. Senere, i 1998, vendte Zoukhri og medforfattere tilbage til en enzymatisk dissociations protokol for at følge op på ca2 +-Imaging på LG og SMG isoleret acini7. Inden for det sidste årti, har forskerne vendt deres fokus på isolering af stamceller/progenitorcellerne fra eksokrine kirtler. Pringle og medforfattere beskrev en protokol i 2011 til isolering af SMG-muse stamceller8. Denne metode var baseret på isolering af stamcelle-holdige salisfærer, som blev opretholdt i kulturen. Forfatterne hævdede, at prolifererende celler, der udtrykte stamcelle-associerede markører kunne isoleres fra disse salikugler8. Shatos og medforfattere offentliggjorde protokollen for progenitorcelle isolation fra uskadede voksne rotte LGs ved hjælp af enzymatisk fordøjelse og indsamling af "befriet" celler9. Senere, i 2015, justerede Ackermann og coforfattere denne procedure for at isolere formodede "murine tåre kirtelceller" ("mlgscs"), som kunne blive formeret som en mono-lags kultur over flere passager10. Ingen af de før nævnte procedurer tillod imidlertid at skelne mellem cellulære undertyper og individuelle populationer af isolerede epitelceller. I 2016 offentliggjorde Gromova og medforfattere en procedure for isolering af LG Stam-/progenitorceller fra voksne murine LGs ved hjælp af FACS11. Denne protokol havde imidlertid ikke til formål at isolere MECs.
For nylig har vi vist, at vi er i stand til at isolere SMA + celler fra 3 uger gamle SMA-GFP mus12. Men på dette tidspunkt har vi ikke adskilt forskellige populationer af SMA + celler. Her etablerede vi en ny procedure for direkte isolation af differentierede Mec'er og pericytter fra voksne LGs og SMGs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al animalsk arbejde var gennemført i overensstemmelse med den National Institute i helbred (NIH) retningslinjer og var godkendt af institutionel animalsk omhu og hjælp udvalg i den Scripps forskningsinstitut. Alle bestræbelser blev gjort for at minimere antallet af mus og deres lidelser. Alle forsøgsdyr fik en standard diæt med fri adgang til ledningsvand.
Bemærk: De vigtigste trin for MEC og pericyt isolation er skitseret skematisk i figur 1a-F. Alle reagenser og udstyr, der anvendes til denne procedure, er beskrevet i tabel 1.
1. mus og mærkning af SMA-cellerne
- Brug voksne (2-4 måneder gammel) Tamoxifen-inducerbar, αSMA driven reporter mus SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl.
Bemærk: Den SMACreErt2 stamme var venligt leveret af Dr. Ivo kalajzic13. Rosa26-Tdtomatfl/fl (B6. CG-gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze/j, også kendt som Ai9) stamme (# 007909) blev købt fra Jackson Laboratory (Sacramento, ca). SMA + celler blev mærket af intraperitoneal Tamoxifen (TM) administration. -
Fremstilling af Tamoxifen opløsning
- Forbered filtreret majsolie. Brug 0,22 μm vakuum filter, da majsolie er viskøs.
- Overfør 1 g TM-pulver fra flasken til et 50 mL rør. Tilsæt 1 mL ethanol til flasken, hætten og ryst den til skylning og tilsæt derefter til et 50 mL rør. Gentag igen med yderligere 1 mL ethanol.
- Tilsæt filtreret majsolie for at lave 50 mL af en 20 mg/mL TM opløsning. Vortex røret, wrap det i folie, og sætte det i et ryste vand bad eller ryste inkubator ved 45 °C.
- Det kan tage ca. 12-24 h at opløse TM. Fra tid til anden, fjerne røret og kontrollere for eventuelle resterende krystaller. Når TM er helt opløst, alikvot og opbevares ved-80 °c. En optøet alikvot kan genbruges.
-
For at mærke SMA + celler, injicere mus intraperitonealt (IP) med TM på to sekventielle dage.
- Injicer 3-4 uger gamle SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f alle kønsmus med TM ved 100 μl/20 g (eller 2 mg/20 g) legemsvægt (figur 1a). Mus er klar til at blive brugt til celle isolation i 2-3 dage efter den sidste TM injektion. Hvis det er nødvendigt, kan injicerede mus ofres i længere tid efter TM injektion.
Bemærk: Som kontrol for korrekt kompensation under FACS, en Wild type (C57Bl/6) mus og en SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl mus ikke injiceres med TM (med "ufarvede" mecs) af samme alder ville være påkrævet. Brug de samme beregninger for 2 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl - mus. Ikke indsprøjtet SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl vil tillade evaluering af dsred baggrund. Den C57Bl/6 mus vil tjene som en negativ kontrol af ufarvede celler.
- Injicer 3-4 uger gamle SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f alle kønsmus med TM ved 100 μl/20 g (eller 2 mg/20 g) legemsvægt (figur 1a). Mus er klar til at blive brugt til celle isolation i 2-3 dage efter den sidste TM injektion. Hvis det er nødvendigt, kan injicerede mus ofres i længere tid efter TM injektion.
2. løsninger og buffere
Bemærk: LG er en epitel oprindelse kirtel, der indeholder en ekstracellulær matrix, der gør afkobling af celler vanskeligt. Derfor anbefales ved hjælp af en særlig kombination af enzymer og en multi trins fordøjelsesproces beskrevet nedenfor.
-
Dispase type II stamopløsning (25x)
- Der opløses 120 mg dispase type II pulver i 2 mL 50 mM HEPES/150 mM NaCl for at tilberede en 25x stamopløsning (den endelige koncentration af dispase skal være 30 enheder/mL). Enheder pr. milligram kan variere afhængigt af antallet af mus og koncentrationen af dispase bør justeres i overensstemmelse hermed.
- Tilbered 200 μL aliquoter, og opbevar dem ved-70 °C i op til 6 måneder eller 4 °C i flere dage. Du må ikke nedfryse/tø alikvoterne mere end én gang for at forhindre enzym nedbrydning.
-
DNase type I stamopløsning
- 5 mg DNase type I-pulver opløses i en 5 mL opløsning af 50% glycerol, 20 mM Tris-buffer (pH 7,5) og 1 mM MgCl2 (Stam koncentrationen bør være ca. 2000 enheder/ml). Enheder pr. milligram kan variere afhængigt af antallet af mus og dermed koncentrationen af DNase bør justeres i overensstemmelse hermed.
- Filtrer stamopløsningen ved hjælp af et 0,22 μm-filter og en 10 mL sprøjte.
- Tilbered 200 μL aliquoter, og opbevar dem ved-70 °C i op til 6 måneder eller 4 °C i flere dage. Må ikke nedfryses/tø mere end én gang for at forhindre enzym nedbrydning.
-
Fordøjelses medium
- Til 10 mL DMEM lavt glucose uden glutamin tilsættes 100 μL cellekultur tillæg (f. eks. Glutamax, se tabel over materialer) for en fortynding på 1:100.
- Til 2 mL DMEM lavt glucose med cellekultur supplement tilsættes 6 mg collagenase type I og blandes grundigt ved pipettering (enzym på våd is), 160 μL dispase stamopløsning (2,4 U/mL slutkoncentration), 16 μL DNase type I stamopløsning (8 e/mL slutkoncentration) og 12 μL 1 M CaCl2 (slutkoncentration på 6 mm).
Bemærk: Calcium er påkrævet for at øge enzymatisk aktivitet14,15. Alle beregninger er fastsat for isolering af celler fra fire tåre kirtler fra to voksne mus. Mængden af fordøjelses medium kan variere afhængigt af mængden af væv og antallet af replikater. Brug ikke mere end 4 tåre kirtler fra 2-4 måneder gamle mus pr. 2 ml medium.
-
Blokerende medium I
- Til 25 mL DMEM/F-12 tilsættes FBS (15% slutkoncentration), 250 μL cellekultur tillæg (Se tabel over materialer) til en fortynding på 1:100 og 50 ΜL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm slutkoncentration).
Bemærk: Af de forskellige typer af medium, der blev sammenlignet for denne protokol, gav DMEM/F-12 de bedste resultater. Dette medium er også blevet brugt af andre forskere til at isolere/kultur epitelial celler16,17.
- Til 25 mL DMEM/F-12 tilsættes FBS (15% slutkoncentration), 250 μL cellekultur tillæg (Se tabel over materialer) til en fortynding på 1:100 og 50 ΜL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm slutkoncentration).
-
Blokerende medium II
- Til 25 mL PBS tilsættes 50 μL 0,5 M EDTA pH 8,0 (slutkoncentration på 1 mM).
-
Genoprettelses medium
- Til 2 mL HBSS suppleret med 5 mM MgCl2tilsættes 100 ΜL DNase type I-stamopløsning til 100 U pr. 2 ml slutkoncentration. Relativt høje koncentrationer af DNase-type I er påkrævet for at reducere aggregering af epitelceller.
-
Fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) buffer
- Til 486,5 mL PBS tilsættes 12,5 mL serum (2,5% slutkoncentration) og 1 mL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM slutkoncentration).
Bemærk: Bufferen kan opbevares ved 4 °C i højst 6 uger.
- Til 486,5 mL PBS tilsættes 12,5 mL serum (2,5% slutkoncentration) og 1 mL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM slutkoncentration).
3. voksen mus lacrimal kirtel høst og Microdissection
- Anæstetize musen ved isofluran indånding (justere isofluran strømningshastighed eller koncentration til 5% eller højere) og ofre ved cervikal dislokation. Udføre anæstesi og eutanasi i henhold til institutionelle IACUCs anbefalinger.
- Ved hjælp af fine pincetter og sakse fjernes huden mellem øjet og øret (figur 2a).
- At dissekere en LG, forsigtigt trække LG ved hjælp af pincet og på samme tid ridse bindevæv omkring LG ved hjælp af den skarpe spids af lille saks til at frigøre det (figur 2b).
- Undgå at skære med en saks, som LG og parotideale spytkirtler er placeret meget tæt på hinanden og skal adskilles før dissektion. Når LG og parotideale kirtler er adskilt, klippe LG ud ved hjælp af en saks. Der anbringes kirtler i en 35 mm skål med 2 mL kold PBS (opbevares på is) (figur 1b).
-
Da LG er dækket af en bindevævs kapsel/konvolut, skal du trimme eventuelle omgivende fedtstoffer og bindevæv under et dissekerende mikroskop og fjerne LG-kapslen med to pincet.
- Gentag dette trin for alle kirtler.
- Kontroller et lille stykke væv under fluorescerende mikroskop for at sikre celle mærkning (figur 1c).
4. klargøring af LG enkelt celle suspension
- Alle lg'er overføres til en 35 mm skål med 0,5 ml stuetemperatur (RT) fordøjelses medie og hakkekød LGS med små sakse i meget små stykker (ca. 0,2-1 μm2). Normalt tager det ca. 3 min til hakkekød 4 LGS (figur 2c).
- Det hakkede væv overføres til et 2 mL rundt bund rør ved hjælp af en bred pipette filter spids. Brug en pipettespids med normal størrelse med spidsen afskåret (figur 2D).
- Tilsæt op til 2 mL fordøjelses medium og bland ved at invertere røret.
- Anbring røret i en ryste inkubator (eller omrystvands bad) ved 37 °C, 100-120 rpm i 90 min.
- Hver 30 min langsomt pipette kirtel stykker 20-30 gange ved hjælp af en 1.000 μL filter spids med den faldende bore størrelse (figur 2D). Efter inkubation/trituration tages en 10 μL alikvot, og der inspiceres under et mikroskop for klynger. Hvis klynger fortsætter, fortsætte fordøjelsen.
- Efter 90 min., passerer prøven 2-3 gange gennem en insulin sprøjte kanyle (31G) for at frigive cellerne yderligere til suspension.
Bemærk: Ingen synlige lakrimal kirtel bør forblive i opløsningen, når fordøjelsen er afsluttet (figur 1d). - Overfør cellesuspension til et 15 mL rør og tilsæt blokerende medietype I til i alt 5 mL. Vend røret 2-3 gange for at blande.
- Gennemløb cellesuspensionen gennem en 70 μm celle filter placeret på et 50 mL rør. Vask sien med 1 mL blokerende medietype I. Gentag trin 4,8 igen.
- Centrifuge prøverne ved 0,4 x g i 5 minutter ved rt.
- Aspirer supernatanten. Cellerne resuspenderes i 2 mL blokerende medium type II ved hjælp af en 1 mL pipettespids, og cellesuspensionen overføres til et 2 mL mikrocentrifuge glas.
- Cellerne centrifugeres ved 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml rotor; Se tabel over materialer) i 3 minutter ved rt.
- Aspirate supernatanten og re-suspendere celler i 1 mL celle løsrivelse løsning (Se tabel over materialer).
Bemærk: Her er løsningen til celle løsrivelse Accutase, et Marine oprindelses enzym med proteolytisk og collagenolytisk aktivitet, der løsgør/dissocierer celler til analyse af celleoverflade markører. - Cellerne inkuleeres ved 37 °C ved 100-120 rpm i 2-3 min. over fordøjelsen med opløsning af celle løsning kan beskadige cellulære membraner.
- Overfør cellesuspension til et 50 mL rør og tilsæt 10 mL blokerende medium type I. centrifuge røret ved 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml rotor; Se tabel over materialer) i 5 min.
- Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 6 mL genvindings medie, og cellerne inkurueres i 30 minutter ved RT.
- Kontrollér 10 μl cellesuspension under mikroskopet for at sikre fuldstændig celle afkobling (figur 3).
- Tæl celler ved hjælp af en celle tæller og Trypan blå. Normalt forventer vi 4 x 105-6 x 106 celler fra fire LGS (en prøve).
- Centrifuge cellerne ved 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml rotor; Se tabel over materialer) i 3 min ved RT og Fortsæt til antistof farvning.
5. antistof farvning
- Der tilsættes op til 5 x105 celler til et 2 ml rør indeholdende 400 ΜL FACS buffer. Der tilsættes 5 μL strålende violet 421 anti-Mouse CD326 (EpCAM) og 0,5 μL Ghost Red 780 (levedygtig Dye).
- Forbered samtidig kontrol for at justere FACS-kompensationen:
Negativ kontrol-1 (celler fra vildtype-mus)
Baggrundskontrol ufarvede celler fra SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl
Cy7-780 farvede celler (celler fra den vilde type mus farves med Ghost Red 780 levedygtig Dye)
EpCAM-Brilliant violet 421 (celler fra vildtype mus plettet med EpCAM-Brilliant violet 421 antistof).
Bemærk: For hver kontrolprøve skal der bruges mindst 1 x 105 celler pr. 400 ΜL FACS-buffer. - Efter tilsætning af hver reagens blande celler grundigt ved pipettering.
- Wrap tube (r) med folie og Rotér rør til 45 min ved 4 °C.
- Centrifuge prøverne ved 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml rotor; Se tabel over materialer) i 3 min ved 4 °c.
- Resuspender cellerne i 1 mL FACS-buffer. Det er vigtigt at vaske celler for at formindske baggrunden underkompensation.
6. fluorescens aktiveret celle sortering
- Overfør celle affjedring til 5 mL FACS-rør, og Fortsæt med FACS-analyse. Hold cellerne på is.
- Juster kompensation ved hjælp af enkelt farve kontrolelementer.
- Sorter celler ved 20 psi gennem en 100 μm dyse ved hjælp af passende flow flowcytometer (jf. tabel over materialer). Gating strategy18 er vist i figur 1E og figur 4.
- Saml sorterede celler i medium, RNA-senere, FACS eller lysis buffere afhængigt af downstream procedurer (figur 1E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musemodel til at isolere SMA + MECs og pericytter
Den etablerede protokol giver mulighed for isolering af to rene populationer: Mec'er og pericytter fra LGs og Smg'er (Se tabel 1). Disse to typer celler har forskellig størrelse og udseende. Mikrovaskulære pericytter, udvikle sig omkring væggene i kapillærer (figur 5a) og har en kvadreret form (figur 5b), mens mecs omgiver LG sekretoriske acini, har lange processer og optager et relativt stort område (figur 5a, B ). Den beskrevne procedure er baseret på genetiske celle mærkning af SMA + i TM-inducible SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl mus stamme. Additonally, EpCAM antistoffer gør det muligt for forskerne at skelne epitelial SMA+: epcam+ celler af Ektodermal oprindelse (MECS) og SMA+epcam- celler af endodermale oprindelse (pericytter).
Klargøring af enkelt cellesuspension
LG indeholder en filamentøs ekstracellulær matrix, der skal fordøjes grundigt. Den leverede protokol gør det muligt at forberede en enkelt celle løsning til FACS analyse og yderligere applikationer. Eksemplet med dissocierede celler er vist i figur 3.
MEC og pericyt isolation af FACS
For at skelne MECs fra pericytter blev enkeltceller plettet med antistof til EpCAM, som kun detekterer epitelial celler. Den vigtigste population af celler blev bestemt af fremad-og side scatter-område gating (figur 4a). Doublets blev ekskluderet ved at afbilde det forreste scatter område versus bredden og med side scatter området versus bredden (figur 4b). Død celle udelukkelse blev udført via Ghost Red 780 (levedygtig Dye) (figur 4c). En ikke-mærket kontrol (figur 4E), baggrundskontrol og antistof kontrolmærket med et enkelt primært antistof blev anvendt til at bestemme baggrunds støjen (ikke-specifik antistof binding) og til at etablere passende kompensation for optimal adskillelse mellem signalerne (figur 4d). Data analyser blev udført ved hjælp af FlowJo software.
MECs og pericytter blev gated af DsRed mærkning. DsRed+ Dim (ikke vist) og dsred+ lyse celler inden for både MEC og pericyt cellepopulationer blev påvist (figur 4d). Lysstyrken af mærkede celler kan afhænge af niveauet af SMA udtryk eller grad af reporter aktivering ved TM injektion19. Kun DS Red+ Bright cellepopulation blev indsamlet, da kun fuldt differentierede celler var påkrævet. DS Red+ Dim cellepopulationer kræver yderligere undersøgelse.
Downstream-anvendelser
Det er velkendt, at mecs spiller en vigtig kontraktile funktion i eksokrine kirtler. Desuden er de meget plastik celler og har træk af stamceller. Derfor kan isolerede Mec'er bruges i flere programmer. For eksempel kan celler dyrkes, bruges til RNA isolation eller transplantation (figur 1f)12,20,21,22.
| Parameter | Lacrimal kirtel | Submandibulær kirtel |
| Antal mus pr. prøve | 2 | 1 |
| Antal kirtler pr. prøve | 4 | 2 |
| Dissektions kirtler | Adskilt fra parotideale kirtel | Adskilt fra sublinguale kirtel |
| Koncentration af kollagenase pr. prøve | 6 mg/2 mL | 9 mg/2 mL |
| Omtrentligt celle nummer efter enzymatisk afkobling | 4x105-6x105 | 9x105-1.5 x106 |
| Gendannelses trin (Se afsnittet "Adult Mouse lacrimal kirtel-encelledissociation", punkt 15) | Gensuspension af celler i 6 ml gendannelsesmedie | Gensuspension af celler i 12 mL genoprettelsesmedie |
| Volumen af FACS buffer under antistof farvning | 400 μL | 2 rør med 400 μL; Det er bedre at opdele cellerne i to eller tre rør, at hvert rør ikke har mere end 6x105 |
Tabel 1: ændringer af protokollen til isolering af celler fra submandibulær kirtel (SMG). Tabellen beskriver større ændringer, der kræves for at isolere MECs og pericytter fra murine SMG i forhold til proceduren for murine LG.
Figur 1: en skematisk fremstilling af eksperimentet. (A) IP-injektioner af SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl-mus med TM. B) isolation og HAKNING af LG eller SMG. (C) analyse af celle mærkning ved hjælp af fluorescens mikroskop. (D) flertrins enzymatisk fordøjelse for at forberede en enkelt celle opløsning. Det er vigtigt at kontrollere fordøjelsestrin under et let mikroskop for at sikre, at cellerne frigives fra klynger. (E) eksempel på gating, der viser SMA + Bright DS Red +/epcam + (mecs) og DS Red + Bright/epcam-(pericytter). F) indsamlede mec'er og pericytter kan underkastes forskellige downstream-procedurer, herunder celle dyrkning, RNA-isolation og analyse af genekspression og celletransplantation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: kritiske trin af LG isolation/mincing. (A) fjernelse af huden mellem øjet og øret for at DISSEKERE LG. stiplet gul cirkel indikerer LG placering. (B) LG Dissection. Gul pilespids peger ud område mellem tåre og parotideale kirtler. (C) LG hakning i fordøjelses mediet ved hjælp af en saks med buede, stumpe ender. D) overdragelse af hakket væv til 2 ml rør. Gul pilespids skildrer bred bore størrelse 1 ml spids kræves for at overføre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Confocal og differentiale interferens kontrast (dic) billeder, der illustrerer dissocierede enkeltceller fra murine LG. (A-C) enkeltceller isoleret fra to lg'er på en 4 måneder gammel SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl -mus. Kerner er farvet med DAPI (blå). Hvide pilespidser betegner SMA + (DS Red) celler: MECs eller pericytter. Skala stang = 15 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: identifikation af murine LG MECs og pericytter ved hjælp af FACS. (A) bestemmelse af hoved populationen af LG-celler ved frem-og side scatter område gating. (B) udelukkelse af dobbelt penetration via fremad scatter område kontra bredde. (C) udelukkelse af døde celler via Ghost Red 780 (levedygtig Dye). (D) MEC (SMA+ Bright/epcam+) og pericyte (SMA+ Bright/epcam-) populationer skelnes baseret på farvning med epcam antistof. (E) kontrol uden etiket (celler fra vildtype-mus). På hvert plot er% af gated cells tilvejebragt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Konfokale billeder, der viser forskel i fordeling og form mellem Mec'er og pericytter isoleret fra murine LG. (A) hele Mount forberedelse af LG med mærkede celler viser forskel i fordelingen mellem MEC og pericytter. B) formen af MEC og pericyt er anderledes. Pericyt er relativt lille og har squired form, mens MEC er stor og har uregelmæssige form og flere lange processer. Arrowheads = MECs og pericytter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript beskrev en protokol af MEC og pericyt isolation fra LG og SMG. Denne procedure var baseret på genetiske mærkning af SMA, den eneste pålidelige biomarkør af MECs og pericytter.
Det haster med at udvikle denne protokol var motiveret af den næsten totale fravær af litteratur, der fremhæver isoleringen af MECs fra murine LGs og SMGs. Selv om genetiske mærkning tidligere blev brugt, ved hjælp af SMA-GFP mus til at isolere SMA + celler fra unge tre-ugers gamle LGs12, det tillod ikke brugen af disse ældre mus til celle isolation på grund af delvis tab af signal i voksne mus. Desuden giver GFP-mærkede celler en relativ høj baggrund i FACS-applikationer23 og kræver yderligere kompensationer. I modsætning hertil, den SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl muse linje viser ingen eller en lav baggrund og høje niveauer af SMA mærkning aktivering gennem hele musen postnatale udvikling, voksenalderen og aldring. Brug af SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl mus er især vigtigt for undersøgelser fokuseret på sygdomsprogression eller aldring, da SMA + celler i disse mus kunne mærkes før sygdomsudvikling og studerede senere, når sygdom/aldring skrider frem. Et andet kritisk skridt i protokollen er grundig LG hakning og følgende fordøjelse. Dette trin kan reducere det celle nummer, der er opnået under FACS-analysen. Samlet set er isolation og umiddelbar analyse af primære celler også vigtig på grund af betydelige ændringer i de transkriptionelle profiler af celler, der vedligeholdes i kultur24.
Derudover muliggør den beskrevne protokol for MEC og pericyt isolation fra murine LGs forskellige downstream procedurer. Protein, RNA og DNA ekstraktioner er mulige fra både enkelt cellepopulationer, selv om flere mus/prøver skal behandles parallelt eller sekventielt for at øge antallet af celler. Taget sammen, viser de opnåede resultater en effektiv og relativt ligetil måde for MEC og pericyt isolation fra forskellige murine kirtel væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser og ingen konflikter af nogen andre interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Ivo kalajzic for at give os med SMACreErt2 mus stamme, Takeshi umazume for mus hale og genotyping, Mark Shelley for at erhverve professionelle billeder til figur 2. Vi takker også Scripps Rådet for videnskabelige redaktører og Mark Shelley for videnskabelig engelsk redigering. Vi er taknemmelige for den Scripps Research Institute flow cytometry kerne for hjælp med celle sortering og til Dr. Robin Willenbring for flere diskussioner/rådgivning om FACS dataanalyse.
Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed, National Eye Institute tilskud 5 R01 EY026202 og 1 R01 EY028983 til H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren's syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren's syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. ndrewW., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
