Summary
Die Tränendrüse (LG) hat zwei Zelltypen, die α-glatte Muskelaktin (αSMA) ausdrücken: Myoepithelialzellen (MECs) und Pericytes. MECs sind ektodermaler Herkunft, der in vielen Drüsengeweben zu finden ist, während die Periicyten vaskuläre glatte Muskelzellen endodermalen Ursprungs sind. Dieses Protokoll isoliert MECs und Periicytes von murinen LGs.
Abstract
Die Tränendrüse (LG) ist eine exokrine Tubuloacinardrüse, die eine wässrige Schicht Tränenfilm abscheidet. Der LG-Epithelbaum besteht aus Akinar-, duktalen Epithel-und Myoepithelzellen (MECs). MECs drücken alpha glatte Muskelaktin (αSMA) aus und haben eine kontraktile Funktion. Sie sind in mehreren Drüsenorganen zu finden und sind ektodermalen Ursprungs. Darüber hinaus enthält das LG SMA + Gefäßglatte Muskelzellen endodermalen Ursprungs, die als Periicytes bezeichnet werden: Kontraktile Zellen, die die Oberfläche von Gefäßröhren umhüllen. Ein neues Protokoll ermöglicht es uns, sowohl MECs als auch Periicyte aus erwachsenen Murin-LGs und submandibulären Drüsen (SMGs) zu isolieren. Das Protokoll basiert auf der genetischen Kennzeichnung von MECs und Periicytes mit dem SMA CreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/. ). Das Protokoll erlaubt die Trennung dieser beiden Zellpopulationen unterschiedlicher Herkunft auf der Grundlage des Ausdrucks des epithelialen Zellhaftmoleküls (EpCAM) durch MECs, während Pericytes EpCAM nicht ausdrücken. Isolierte Zellen könnten für die Zellkultivierung oder Genexpressionsanalyse verwendet werden.
Introduction
Myoepitheliale Zellen (MECs) sind in vielen exokrinen Drüsen vorhanden, darunter Tränendrüsen, Speichel, Harderian, Schweiß, Prostata und Säugetiere. MECs sind ein einzigartiger Zelltyp, der einen Epithel-und einen glatten Muskelphenotyp kombiniert. MECs drücken α-smooth Muskelaktin (SMA) aus und haben eine kontraktile Funktion1,2. Die Tränendrüse (LG) und die submandibuläre Drüse (SMG) enthalten neben MECs auch SMA + Gefäßzellen, die Periicytes genannt werden, also Zellen endodermalen Ursprungs, die die Oberfläche von Gefäßrohren 3 umhüllen. Obwohl MECs und Periicytes viele Marker ausdrücken, ist SMA der einzige Marker, der nicht in anderen LG und SMG-Zellen1,3 ausgedrückt wird.
In den letzten 40 Jahren berichteten mehrere Labore von Untersuchungen zur Dissoziation verschiedener exokriner Drüsengewebe, in denen nicht-enzymatische und enzymatische Ansätze angewandt wurden. In einem der ersten Berichte, die 1980 veröffentlicht wurden, beschrieben Fritz und Co-Autoren ein Protokoll zur Isolierung von Katzenparotid acini mit sequenzieller Verdauung in einer Collagenase/Trypsin Lösung4. Im Jahr 1989 haben Hann und Coauthors dieses Protokoll für die Isolierung von Rat LGs mit einer Mischung aus Collagenase, Hyaluronidase und DNase5angepasst. 1990 veröffentlichten Cripps und Kollegen die Methode der nicht-enzymatischen Dissoziation der Tränendrüseacini 6. Später, im Jahr 1998, kehrten Zoukhri und Coautoren zu einem enzymatischen Dissoziationsprotokoll zurück, weil sie Ca2 +-Bildgebung auf LGundSMG isolierten acini 7 nachstellten. In den letzten zehn Jahren haben die Forscher ihren Fokus auf die Isolierung von Stamm/-Vorläuferzellen aus exokrinen Drüsen gerichtet. Pringle und Coauthors beschrieben 2011 ein Protokoll zur Isolierung von Mäuse-SMG-Stammzellen8. Diese Methode basierte auf der Isolierung von stammzellhaltigen Salisphären, die in der Kultur beibehalten wurden. Die Autoren behaupteten, dass sich vermehrende Zellen, die Stammzellmarker ausdrücken, von diesen Salisphären8isolieren könnten. Shatos und Coautoren veröffentlichten das Protokoll zur Vorläuferzellenisolierung von ungeschädigten erwachsenen Ratten-LGs mit enzymatischer Verdauung und dem Sammelnvon"befreiten" Zellen 9. Später, im Jahr 2015, passten Ackermann und Mitautoren dieses Verfahren an, um mutmaßliche "Murine-Tränendrein-Stammzellen" ("mLGSCs") zu isolieren, die sich als Einschichtkultur über mehrerePassagen 10 verbreiten ließen. Allerdings ist keines der oben genannten Verfahren erlaubt, um zelluläre Subtypen und einzelne Populationen isolierter Epithelzellen zu unterscheiden. Im Jahr 2016 veröffentlichten Gromova und Coautoren ein Verfahren zur Isolierung von LG-Stem/Vorläuferzellen von erwachsenen Murin-LGs mit FACS11. Dieses Protokoll war jedoch nicht dazu gedacht, MECs zu isolieren.
Vor kurzem haben wir gezeigt, dass wir in der Lage sind, SMA +-Zellen von 3 Wochen alten SMA-GFP-Mäuse 12 zu isolieren. Zum jetzigen Zeitpunkt haben wir jedoch keine verschiedenen Populationen von SMA +-Zellen getrennt. Hier haben wir ein neues Verfahren zur direkten Isolierung von differenzierten MECs und Pericytes von erwachsenen LGs und SMGs eingeführt.
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Protocol
Alle Tierarbeiten wurden nach den Richtlinien des Nationalen Instituts für Gesundheit (NIH) durchgeführt und vom Institutionellen Ausschuss für Tierhaltung und-nutzung des Forschungsinstituts Scripps genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der Mäuse und ihr Leid zu minimieren. Alle Versuchstiere erhielten eine Standarddiät mit freiem Zugang zu Leitungswasser.
NOTE: Die wichtigsten Schritte für die MEC-und Perizdämmung sind schematisch in Abbildung 1A-Fdargestellt. Alle Reagenzien und Geräte, die für dieses Verfahren verwendet werden, sind in Tabelle 1beschrieben.
1. Mäuse und Beschriftung der SMA-Zellen
- Verwenden Sie erwachsene (2-4 Monate alt) Tamoxifen-induzierbaren, αSMA-getriebenen Reporter Mäusen SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl.
NOTE: Die SMACreErt2 -Sorte wurde freundlicherweise von Dr. Ivo Kalajzic13zur Verfügung gestellt. Rosa26-TdTomatofl/fl (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm9-CAG-tdTomato) Hze/J, auch bekannt als Ai9) Sorte (# 007909) wurden von Jackson Laboratory (Sacramento, CA) gekauft. SMA +-Zellen wurden durch die intraperitoneale Tamoxifen (TM)-Administration gekennzeichnet. -
Vorbereitung der Tamoxifen-Lösung
- Bereiten Sie gefiltertes Maisöl vor. Verwenden Sie 0,22 μm Vakuumfilter, da Maisöl viskose ist.
- 1 g TM-Pulver von der Flasche in ein 50 ml Rohr. 1 ml Ethanol in die Flasche geben, mit einer Kappe befüllen und abschütteln, um sie zu spülen und dann zu einem 50 mL Rohr hinzufügen. Wiederholen Sie noch einmal mit einem weiteren 1 ml Ethanol.
- Fügen Sie gefiltertes Maisöl hinzu, um 50 ml einer 20 mg/mL TM-Lösung zu machen. Das Rohr anziehen, in Folie wickeln und in ein Schüttelwasserbad oder ein Schüttelinkubator bei 45 ° C geben.
- Es kann etwa 12-24 Stunden dauern, um die TM aufzulösen. Entfernen Sie von Zeit zu Zeit die Röhre und überprüfen Sie die verbleibenden Kristalle. Sobald die TM vollständig aufgelöst ist, aliquot und bei-80 ° C lagern. Ein aufgetauter Aliquot kann wiederverwendet werden.
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Um SMA +-Zellen zu kennzeichnen, injizieren Sie Mäuse intraperitoneal (IP) mit TM an zwei sequenziellen Tagen.
- 3-4 Wochen altes SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/f alle Gender-Mäuse mit TM bei 100 μL/20 g (oder 2 mg/20 g) Körpergewicht (Abbildung 1A). Mäuse sind bereit, in 2-3 Tagen nach der letzten TM-Injektion zur Zellisolierung eingesetzt zu werden. Bei Bedarf können injizierte Mäuse nach der TM-Injektion in längeren Zeiträumen geopfert werden.
NOTE: Als Bedienelemente für die richtige Kompensation während der FACS, eine wilde Art (C57Bl/6) Maus und eine SMA CreErt2/+:Rosa26 -TdTomato fl/maus nicht mit TM (mit "ungefärbten" MECs) des gleichen Alters injiziert werden, wäre erforderlich. Verwenden Sie die gleichen Berechnungen für 2 SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl Mäuse. Nicht injiziert SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl wird die Auswertung der DSRed-Background ermöglichen. Die C57Bl/6-Maus dient als negative Kontrolle von unbefleckten Zellen.
- 3-4 Wochen altes SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/f alle Gender-Mäuse mit TM bei 100 μL/20 g (oder 2 mg/20 g) Körpergewicht (Abbildung 1A). Mäuse sind bereit, in 2-3 Tagen nach der letzten TM-Injektion zur Zellisolierung eingesetzt zu werden. Bei Bedarf können injizierte Mäuse nach der TM-Injektion in längeren Zeiträumen geopfert werden.
2. Lösungen und Puffer
NOTE: Die LG ist eine epitheliale Ursprungsdrüse, die eine extrazelluläre Matrix enthält, die die Trennung von Zellen erschwert. Daher wird empfohlen, eine spezielle Enzymkombination und einen mehrstufigen Verdauungsprozess zu verwenden, der unten beschrieben wird.
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Dispase-Typ II Lagerlösung (25x)
- Lösen Sie 120 mg Dispas-Pulver Typ II in 2 mL von 50 mM HEPES/150 mM NaCl auf, um eine 25x Lagerlösung vorzubereiten (die endgültige Konzentration des Disdispases sollte 30 Units/mL betragen). Einheiten pro Milligramm können je nach Anzahl der Mäuse variieren und die Konzentration des Dispases sollte entsprechend angepasst werden.
- 200 μL Aliquots vorbereiten und bei-70 ° C für bis zu 6 Monate oder 4 ° C für mehrere Tage lagern. Nicht gefrieze/Tauwetter die Aliquot der Dispute mehr als einmal, um Enzymabbau zu verhindern.
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DNase-Typ I Bestandslösung
- Lösen Sie 5 mg DNase-Pulver in einer 5-mL-Lösung von 50% Glycerin, 20 mM-Tris-Puffer (pH 7,5) und 1 mM MgCl2 (Lagerkonzentration sollte etwa 2000 Units/mL). Einheiten pro Milligramm können je nach Anzahl der Mäuse variieren und daher sollte die DNasenkonzentration entsprechend angepasst werden.
- Filtern Sie die Lagerlösung mit einem 0,22 μm Filter und einer 10 mL-Spritze.
- 200 μL Aliquots vorbereiten und bei-70 ° C für bis zu 6 Monate oder 4 ° C für mehrere Tage lagern. Nicht mehr als einmal gefrieze/Tauwetter, um Enzymabbau zu verhindern.
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Verdauungsmittel
- Zu 10 ml DMEM-niedriger Glukose ohne Glutamin, 100 μL Zellkultur-Ergänzung (z. B. Glutamax, siehe Materialtabelle) für eine Verdünnung von 1:100 hinzufügen.
- Bis zu 2 mL DMEM niedrige Glukose mit Zellkultur-Ergänzung, Fügen Sie 6 mg Collagenase Typ I hinzu und mischen Sie gründlich durch Pipettieren (Enzym auf nassen Eis), 160 μL Dispase-Bestandslösung (2,4 U/mL Endkonzentration), 16 μL DNase-Typ I Bestandslösung (8 U/mL Endkonzentration) , und 12 μL von 1 M CaCl2 (6 mM Endkonzentration).
NOTE: Kalzium wird benötigt,umdie enzymatische Aktivität14,15zuerhöhen. Alle Berechnungen sind für die Isolierung von Zellen von vier Tränendrüsen von zwei erwachsenen Mäusen vorgesehen. Das Volumen des Verdauungsmediums kann je nach Gewebemenge und Anzahl der Replikate variieren. Verwenden Sie nicht mehr als 4 Tränendrüsen von 2-4 Monate alten Mäusen pro 2 ml Medium.
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Sperrmittel I
- Auf 25 ml DMEM/F-12, FBS (15% Endkonzentration), 250 μL Zellkultur-Ergänzung (siehe Materialtabelle) für eine Verdünnung von 1:100, und 50 μL von 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM-Endkonzentration).
NOTE: Von den verschiedenen Arten von Medium, die für dieses Protokoll verglichen wurden, lieferte DMEM/F-12 die besten Ergebnisse. Dieses Medium wurde auch von anderen Forschern verwendet, um isolate/Kultur Epithelzellen16,17.
- Auf 25 ml DMEM/F-12, FBS (15% Endkonzentration), 250 μL Zellkultur-Ergänzung (siehe Materialtabelle) für eine Verdünnung von 1:100, und 50 μL von 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM-Endkonzentration).
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Sperrmittel II
- Auf 25 mL PBS 50 μL von 0,5 M EDTA pH 8.0 (1 mM Endkonzentration).
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Rückeroberungsmedium
- Zu 2 mL HBSS, ergänzt durch 5 mM MgCl2, 100 μL DNase-Typ I stock-Lösung auf 100 U pro 2 mL Endkonzentration. Relativ hohe Konzentrationen des DNase-Typs I sind erforderlich, um die Aggregation der Epithelzellen zu reduzieren.
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Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Puffer
- Auf 486,5 mL PBS, 12,5 mL Serum (2,5% Endkonzentration) und 1 mL von 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM Endkonzentration).
NOTE: Der Puffer kann bei 4 ° C für maximal 6 Wochen gelagert werden.
- Auf 486,5 mL PBS, 12,5 mL Serum (2,5% Endkonzentration) und 1 mL von 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM Endkonzentration).
3. Adult Maus Lacrimal Gland Ernte und Mikrodissection
- Die Maus durch die Inhalation von Isoflurane anästhetisieren (die isoflurane Strömungsgeschwindigkeit oder-konzentration auf 5% oder mehr anpassen) und durch Gebärmutterhalskrebs opfern. Führen Sie Anästhesie und Sterbehilfe nach institutionellen Empfehlungen der IACUCs aus.
- Mit feinen Zangen und Scheren die Haut zwischen Auge und Ohr entfernen (Abbildung 2A).
- Um ein LG zu zerlegen, ziehen Sie LG mit Pinzette sanft und zerkratzen gleichzeitig das Bindegewebe um das LG mit der scharfen Spitze der kleinen Schere, um es zu befreien (Abbildung 2B).
- Vermeiden Sie das Schneiden mit einer Schere, da die LG und Parotid Salivariendrüsen sehr nah beieinander liegen und vor der Trennung getrennt werden müssen. Wenn LG und Parotiddrüsen getrennt sind, schneiden Sie das LG mit einer Schere aus. Die Drüsen in eine 35-mm-Schale mit 2 ml kaltem PBS (auf Eis halten) (Abbildung 1B).
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Da das LG mit einer Bindegewebskapelle bedeckt ist, schneiden Sie jedes umgebende Fett und Bindegewebe unter einem Trennmikroskop und entfernen Sie die LG-Kapsel mit zwei Zangen.
- Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Drüsen.
- Überprüfen Sie ein kleines Stück Gewebe unter fluoreszierendem Mikroskop, um die Zellbeschriftung zu gewährleisten (Abbildung 1C).
4. Vorbereitung der LG Single-Zell-Sparte
- Übertragen Sie alle LGs in eine 35-mm-Schüssel mit 0,5 ml Raumtemperatur (RT) Verdauungsmedien und Hackfleisch LGs mit kleinen Scheren in sehr kleine Stücke (ca. 0,2-1 μm 2). Normalerweise dauert es etwa 3 Minuten bis zu minus 4 LGs (Abbildung 2C).
- Mit einer Breitbader Pipette filtern Sie Hackgewebe in ein 2 mL rundes Unterrohr. Verwenden Sie eine normal große Pipette-Spitze mit der abgeschnittenen Spitze (Abbildung 2D).
- Bis zu 2 mL Verdauungsmittel dazugeben und durch Umkehrung des Rohres vermischen.
- Legen Sie die Röhre in einen Schüttelinkubator (oder Schüttelwasserbad), bei 37 ° C, 100-120 U/min für 90 min.
- Alle 30 Minuten langsam pipette Drüsenstücke 20-30 mal mit einer 1.000 μL-Filterspitze mit der abnehmenden Bohrgröße(Abbildung 2D). Nach der Inkubation/Trituration, nehmen Sie einen 10 μL Aliquot und inspizieren Sie unter einem Mikroskop für Cluster. Wenn Cluster fortbestehen, fahren Sie weiter mit der Verdauung.
- Nach 90 Minuten die Probe 2-3 mal durch eine Insulinspurnadel (31G) passieren, um die Zellen weiter in die Aufhängung zu entlassen.
NOTE: Nach der Verdauung sollten keine sichtbaren Tränendrüsenstücke in der Lösung verbleiben (Abbildung 1D). - Übertragen Sie die Zellaufhängung auf ein 15 mL-Rohr und fügen Sie die Blockierung des Medientyps I auf insgesamt 5 mL. Die Röhre 2-3 mal umkehren, um sie zu mischen.
- Die Zellaufhängung durch einen 70 μm Zellglane auf einem 50 mL-Rohr passieren. Waschen Sie den Sieb mit 1 ml blockierender Medientyp I. Wiederholen Sie Schritt 4.8.
- Zentrifugenproben mit 0,4 x g für 5 min bei RT.
- Die Supernatante aufschwingen. Die Zellen in 2 mL blockiertem Medium Typ II mit einer 1 mL-Pipette-Spitze neu aussetzen und die Zellaufhängung in ein 2-mL-Mikrozentrifugenrohr übertragen.
- Zentrifugen Sie die Zellen auf 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 mL Rotor ; siehe Materialtabelle) für 3 min bei RT.
- Aspirate supernatant und wieder aussetzen Zellen in 1 ml Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle).
NOTE: Hier ist die Zellablösungslösung Accutase, ein Meeresher-Enzym mit proteolytischer und kollagenolytischer Aktivität, das Zellen zur Analyse von Zelloberflächenmarkern detailliert/. - Inkubate Zellen bei 37 ° C, bei 100-120 U/min für 2-3 min. Überverdauung mit Zellablösungslösung kann die Zellmembranen schädigen.
- Die Zellaufhängung in ein 50 mL-Rohr übertragen und bis zu 10 mL Blockiermedium vom Typ I addieren . Zentrifugenrohr bei 0,4 x g (24 x 1,5 /2,0 mL Rotor; siehe Materialtabelle) für 5 min.
- Discard supernatant und wieder Suspendierung von Zellen in 6 ml von Rückgewinnungsmedien und Inkubatzellen für 30 Minuten bei RT.
- Überprüfen Sie 10 μL Zellaufhängung unter dem Mikroskop, um eine vollständige Zelldissoziation zu gewährleisten (Abbildung 3).
- Zählen Sie Zellen mit einem Zellzähler und Trypan blau. Normalerweise erwarten wir 4 x 105-6 x 10 6 Zellen von vier LGs (eine Probe).
- Zentrifugenzellen mit 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 mL Rotor; siehe Materialtabelle) für 3 min bei RT und gehen zur Antikörper-Färbung über.
5. Antibody Staining
- Fügen Sie bis zu 5 x10 5 Zellen zu einem 2 ml-Röhre mit 400 μL FACS-Puffer hinzu. Fügen Sie 5 μL von Brilliant Violet 421 Anti-Mause-CD326 (EpCAM) und 0,5 μL von Ghost Red 780 (Viability Dye) hinzu.
- Parallel dazu werden die Kontrollen vorbereitet, um die FACS-Vergütung anzupassen:
Negative Kontrolle-1 (Zellen von wilder Maus)
Hintergrundkontrolle ungefärbter Zellen von SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl
Cy7-780 gefärbte Zellen (Zellen aus dem wilden Typ Maus mit dem Ghost Red 780 Viability Dye gefärbt)
EpCAM-Brilliant Violet 421 (Zellen aus wilder Maus mit dem EpCAM-Brilliant Violet 421 Antikörper).
NOTE: Für jede Kontrollprobe mindestens 1 x 105 Zellen pro 400 μL FACS-Puffer verwenden. - Nach dem Hinzufügen jeder Reagenzmischung Zellen gründlich durch Pipettieren.
- Wickelschlauch (n) mit Folie und rotierende Rohre für 45 min bei 4 ° C.
- Zentrifugenproben mit 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 mL Rotor; siehe Materialtabelle) für 3 min auf 4°C.
- Die Zellen in 1 mL FACS-Puffer neu aussetzen. Es ist wichtig, Zellen zu waschen, um den Hintergrund während der Kompensation zu verringern.
6. Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung
- Übertragen Sie die Zellaufhängung in 5 mL FACS-Rohre und gehen Sie mit der FACS-Analyse fort. Halten Sie die Zellen auf Eis.
- Passen Sie die Kompensation mit einzelnen Farbkontrollen an.
- Sortieren Sie Zellen mit einem geeigneten Strömungszytometer mit 20 psi durch eine 100 μm Düse (siehe Materialtabelle). Die Gating-Strategie 18 ist in Abbildung 1E und Abbildung 4zu sehen.
- Sammeln Sie sortierte Zellen in Medium, RNA-later, FACS oder Lysis-Puffer, abhängig von nachgelagerten Verfahren (Abbildung 1E,F).
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Representative Results
Mausmodell zur Isolierung von SMA + MECs und-pericytes
Das etablierte Protokoll ermöglicht die Isolierung von zwei reinen Populationen: MECs und Periicytes von LGs und SMGs (siehe Tabelle1). Diese beiden Zelltypen haben eine unterschiedliche Größe und ein anderes Aussehen. Mikrovaskuläre Periicyten, die sich um die Wände der Kapillaren entwickeln (Abbildung 5A) und eine quadratische Form haben (Abbildung 5B), während MECs das LG-Sekret acini umgeben, lange Prozesse haben und eine relativ große Fläche einnehmen (Abbildung 5A, B ). Das beschriebene Verfahren basiert auf der genetischen Zellkennzeichnung von SMA + in der TM-induzible SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl Maus-Stamm. Zusätzlich ermöglichen EpCAM-Antikörper den Forschern, epitheliale SMA+: EpCAM+ Zellen ektodermalen Ursprungs (MECs) und SMA+EpCAM-Zellen endodermalen Ursprungs (Periicyte)- zu unterscheiden.
Vorbereitung der Einzeller-Aufhängung
Das LG enthält eine filamentöse extrazelluläre Matrix, die gründlich verdaut werden muss. Das mitgelieferte Protokoll ermöglicht die Erstellung einer Einzelzellösung für die FACS-Analyse und weitere Anwendungen. Das Beispiel der dissoziierten Zellen wird in Abbildung3 gezeigt.
MEC und Perizyten-Isolierung durch FACS
Um MECs von den Perizyten zu unterscheiden, wurden einzelne Zellen mit Antikörper gegen EpCAM befleckt, das nur Epithelzellen erkennt. Die Hauptpopulation der Zellen wurde durch die Vorwärts-und Seitenstreuung bestimmt (Abbildung 4A). Die Doppel wurden durch die Planung des vorderen Streubereichs gegen die Breite und mit dem seitlichen Streubereich versus Breite (Abbildung4B) ausgeschlossen. Der Tot-Zell-Ausschluss erfolgte über Ghost Red 780 (Viability Dye) (Abbildung 4C). Eine nicht beschriftete Steuerung(Abbildung 4E), Hintergrundkontrolle und Antikörper-Kontrolle mit einem einzigen primären Antikörper wurden verwendet, um das Hintergrundgeräusch (unspezifische Antikörper-Bindung) zu bestimmen und eine angemessene Kompensation für eine optimale Trennung zu schaffen. Zwischen denSignalen (Abbildung 4D). Datenanalysen wurden mit Hilfe der FlowJo Software durchgeführt.
MECs und Pericytes wurden mit DsRed-Kennzeichnung versehen. Es wurden DsRed+ dim (nicht abgebildet) und DsRed+ helle Zellen innerhalb der MEC-und Perizytzellen-Populationen festgestellt (Abbildung 4D). Die Helligkeit der beschrifteten Zellen kann vom Grad der SMA-Expression oder dem Grad der Reporteraktivierungbeider TM-Injektion 19 abhängen. Es wurden nur DSRed + helle Zellpopulare gesammelt, da nur vollständig differenzierte Zellen benötigt wurden. Die DSRed + Dim-Zellpopulationen müssen weiter untersucht werden.
Abgeschaltete Anwendungen
Es ist bekannt, dass MECs eine wichtige Kontrahenzfunktion in exokrinen Drüsen spielen. Außerdem handelt es sich dabei um sehr plastische Zellen, die Merkmale von Stammzellen aufweisen. Daher könnten isolierte MECs in mehreren Anwendungen eingesetzt werden. Zum Beispiel können Zellen kultiviert werden, die zur RNA-Isolierung oder Transplantation verwendetwerden (Abbildung 1F)12,20, 21,22.
| Parameter | Lacrimal Drüse | Submandibuläre Drüse |
| Anzahl der Mäuse pro Probe | 2 | 1 |
| Anzahl der Drüsen pro Probe | 4 | 2 |
| Trengrückungen | Getrennt von Parotiddrüse | Getrennt von sublingualer Drüse |
| Konzentration der Kollagenase pro Probe | 6 mg/2 mL | 9 mg/2 mL |
| Ungefähre Zellzahl nach enzymatischer Dissoziation | 4x105-6x105 | 9x105-1.5x106 |
| Erholungsschritt (siehe Abschnitt "Adult Maus Lacrimal Gland Single-Zell-Dissoziation", Punkt 15) | Zellen in 6 ml Rückgewinnungsmedien neu aussetzen | Ersetzung von Zellen in 12 ml von Recovery Medien |
| Volumen des FACS-Puffers während der Antikörper-Färbung | 400 μL | 2 Röhren von 400 μL; Es ist besser, die Zellen in zwei oder drei Röhren aufzuteilen, dass jedes Rohr nicht mehr als 6x105 hat . |
Tabelle 1: Änderungen des Protokolls zur Isolierung von Zellen aus der submandibulären Drüse (SMG). Die Tabelle beschreibt wesentliche Änderungen, die erforderlich sind, um MECs und Periicyte von Murine SMG im Vergleich zum Verfahren für Murine LG zu isolieren.
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung des Experiments. (A) IP-Injektionen der SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/. (B) Isolierung und Schminken des LG oder SMG. C) Analyse der Zellkennzeichnung mit Fluoreszenzmikroskop. D) Multi-Pitzerenzymatische Verdauung zur Vorbereitung einer Einzellösung. Es ist wichtig, die Verdauungsschritte unter einem Lichtmikroskop zu überprüfen, um sicherzustellen, dass Zellen aus Clustern freigesetzt werden. (E) Beispiel für Gating, das SMA + bright DS Red +/EpCAM + (MECs) und DS Red + bright/EpCAM-(Periicytes) zeigt. F) Gesammelte MECs und Periicyten könnten verschiedenen nachgelagerten Verfahren unterzogen werden, darunter Zellkultivierung, RNA-Isolation und Genexpressionsanalyse und Zelltransplantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Kritische Schritte von LG isolation/mincing. (A) Entfernung der Haut zwischen Auge und Ohr, um LG zu zerlegen. (B) LG Dissection. Gelbe Pfeilspitzen weisen den Bereich zwischen Tränen-und Parotiddrüsen auf. (C) LG Hackermittel im Verdauungsmittel mit einer Schere mit geschwungenen, stumpfen Enden. D) Überführung von gehacktem Gewebe in 2 mL Schlauch. Das gelbe Pfeildrad zeigt eine breite Bohrung von 1 ml Spitze, die für die Übertragung benötigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 3: Kontrafokal und Differentieller Interferenzkontrast (DIC) Bilder, die dissoziierte einzelne Zellen von murine LG illustrieren. (A-C) Einzelzellen isoliert von zwei LGs einer 4 Monate alten SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl Maus. Die Nuklei sind mit DAPI (blau) befleckt. Weiße Pfeilspitzen bezeichnen SMA + (DS Red) Zellen: MECs oder Pericytes. Skalierbalken = 15 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Identifizierung von Murine LG MECs und Periicytes mit FACS. (A) Bestimmung der Hauptpopulation der LG-Zellen durch Vorwärts-und Seitenstreuungsbereich. (B) Ausschluss von Doppelzimmern über vordere Streufläche versus Breite. (C) Tot-Zell-Ausschluss über Ghost Red 780 (Viability Dye). (D) MEC (SMA+ bright/EpCAM+) und pericyte (SMA+ bright/EpCAM-) Populationen, die sich aufgrund der Färbung mit EpCAM-Antikörper auszeichnen. (E) Unbeschriftete Kontrolle (Zellen von wilder Maus). Auf jedem Grundstück werden die% der gated cells bereitgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Kontrafokalbilder, die unterschiedliche Verteilung und Form zwischen MECs und Pericytes zeigen, die von murine LG isoliert sind. (A) Vollmontagevorbereitung von LG mit beschrifteten Zellen, die einen Unterschied in der Verteilung zwischen MEC und Periicytes anzeigen. (B) Die Form von MEC und Pericyte ist anders. Pericyte ist relativ klein und hat eine gewünschte Form, während MEC groß ist und unregelmäßige Form und mehrere lange Prozesse hat. Arrowheads = MECs und Pericytes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Manuskript beschrieb ein Protokoll von MEC und Perizyten-Isolierung von LG und SMG. Dieses Verfahren basierte auf der genetischen Kennzeichnung von SMA, dem einzigen zuverlässigen Biomarker von MECs und Periicytes.
Die Dringlichkeit, dieses Protokoll zu entwickeln, wurde durch das fast völlige Fehlen von Literatur motiviert, die die Isolierung von MECs von Murine LGs und SMGs hervorhob. Obwohl früher eine genetische Kennzeichnung verwendet wurde, die SMA-GFP-Mäuse zur Isolierung von SMA +-Zellen aus jungen, dreiwöchigen LGs12nutzte, erlaubte sie nicht, diese älteren Mäuse wegen eines teilweisen Signalverlustes bei erwachsenen Mäusen für die Zellisolierung zu verwenden. Darüber hinaus geben GFP-beschriftete Zellen einen relativ hohen Hintergrund in FACS-Anwendungen23 und erfordern zusätzliche Kompensationen. Im Gegensatz dazu zeigt die SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofll Mauline keine oder einen niedrigen Hintergrund und einen hohen Grad an SMA-Kennzeichnung Aktivierung während der Entwicklung der Maus postnatal, Erwachsenenalter und Alterung. Verwendung der SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/maus ist besonders wichtig für Studien, die sich auf das Fortschreiten von Krankheiten oder Alterung konzentrieren, da SMA + Zellen in diesen Mäusen vor der Krankheitsentwicklung gekennzeichnet und später untersucht werden können, wenn Die Krankheit/die Alterung schreitet voran. Ein weiterer kritischer Schritt des Protokolls ist die gründliche LG-Minenräumung und die anschließende Verdauung. Dieser Schritt kann die Zellzahl verringern, die während der FACS-Analyse gewonnen wurde. Insgesamt ist die Isolierung und sofortige Analyse der Primärzellen auch wichtig, da sich die Transkriptionsprofile der in der Kultur gehaltenen Zellen erheblich verändern.
Darüber hinaus ermöglicht das beschriebene Protokoll für MEC und die Isolierung von Murinen verschiedene nachgelagerte Verfahren. Protein-, RNA-und DNA-Extraktionen sind aus beiden Einzellen-Populationen möglich, obwohl mehrere Mikro-/Proben parallel oder sequenziell verarbeitet werden müssen, um die Anzahl der Zellen zu erhöhen. Insgesamt zeigen die erzielten Ergebnisse einen effektiven und relativ unkomplizierten Weg für MEC und die Perizdämmung von verschiedenen Murindrüsengewebe.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen und keine Konflikte anderer Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Ivo Kalajzic für die Bereitstellung der SMA CreErt2-Maus-Stamm, Takeshi Umazume für das Mäuseschießen und Genotyping, Mark Shelley für den Erwerb von professionellen Bildern für Abbildung 2. Wir danken auch dem Scripps Council of Scientific Editors und Mark Shelley für die redaktionelle Bearbeitung von Scientific English. Wir danken dem Scripps Research Institute Flow Cytometry Core für die Unterstützung bei der Zellsortierung und Dr. Robin Willenbring für mehrere Diskussionen/Beratung zur FACS-Datenanalyse.
Diese Arbeit wurde unterstützt von den National Institutes of Health, National Eye Institute Grants 5 R01 EY026202 und 1 R01 EY028983 bis H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
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