Summary
We beschrijven protocollen voor het bereiden van oöcysten en zuiveren sporozoieten voor het bestuderen van infectie van menselijke intestinale en luchtweg organoïden door Cryptosporidium parvum. We demonstreren de procedures voor micro injectie van parasieten in het intestinale organoïde lumen en immunokleuring van organoïden. Tot slot beschrijven we de isolatie van gegenereerde oöcysten uit de organoïden.
Abstract
Cryptosporidium parvum is een van de belangrijkste oorzaken van de ziekte van de mens diarree. Om de pathologie van de parasiet te begrijpen en efficiënte geneesmiddelen te ontwikkelen, is een in vitro cultuur systeem dat de omstandigheden in de gastheer recapitates nodig. Organoïden, die sterk lijken op de weefsels van hun oorsprong, zijn ideaal voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en parasiet. Organoïden zijn driedimensionale (3D) weefselstructuren die zijn afgeleid van adulte stamcellen en die gedurende langere tijd in cultuur groeien zonder genetische afwijkingen of transformatie te ondergaan. Ze hebben een goed gedefinieerde polariteit met zowel apicale als basolaterale oppervlakken. Organoïden hebben verschillende toepassingen in drug testing, bio Banking, en ziekte modellering en host-microbe interactiestudies. Hier presenteren we een stap-voor-stap Protocol van hoe de oöcysten en sporozoïeten van Cryptosporidium voor het infecteren van de menselijke intestinale en luchtweg organoïden voor te bereiden. Vervolgens laten we zien hoe micro-injectie kan worden gebruikt om de microben in de organoïde lumen te injecteren. Er zijn drie belangrijke methoden waarmee organoïden kunnen worden gebruikt voor host-microbe interactiestudies — micro Injection, mechanisch scheren en beplating, en door het maken van monolayers. Micro Injection maakt onderhoud van de 3D-structuur mogelijk en zorgt voor nauwkeurige controle van de parasiet volumes en direct apicaal zijcontact voor de microben. We bieden Details voor een optimale groei van organoïden voor Imaging of oocyste productie. Ten slotte tonen we ook aan hoe de nieuw gegenereerde oöcysten kunnen worden geïsoleerd van de organoïde voor verdere downstream verwerking en analyse.
Introduction
Ontwikkeling van geneesmiddelen of vaccins voor de behandeling en preventie van Cryptosporidium infectie is belemmerd door het ontbreken van in-vitro systemen die de in vivo situatie bij de mens nauwkeurig nabootsen1,2. Veel van de momenteel beschikbare systemen alleen toestaan korte termijn infectie (< 5 dagen) of bieden geen ondersteuning voor de volledige levenscyclus van de parasiet3,4. Andere systemen die de volledige ontwikkeling van de parasiet mogelijk maken, zijn gebaseerd op vereeuwigd cellijnen of cellijnen van kanker die de fysiologische situatie bij de mens niet getrouw recapituleren5,6,7 . Organoïden of ' mini-orgels ' zijn 3D-weefsel afgeleide structuren die worden gekweekt in een extracellulaire matrix aangevuld met verschillende weefsel specifieke groeifactoren. Organoïden zijn ontwikkeld uit verschillende organen en weefsels. Ze zijn genetisch stabiel en recapituleren de meeste functies van de organen van hun oorsprong en kunnen gedurende langere tijd in cultuur worden gehouden. We hebben een methode ontwikkeld voor het infecteren van humane intestinale en Long organoïden met Cryptosporidium dat een nauwkeurig in vitro model biedt voor de studie van gastheer-parasiet interacties die relevant zijn voor intestinale en respiratoire Cryptosporidiose8 ,9,10,11,12,13. In tegenstelling tot andere gepubliceerde cultuur modellen, het organoïde systeem is representatief voor Real-Life host parasiet interacties, maakt het mogelijk voor de voltooiing van de levenscyclus, zodat alle stadia van de parasiet levenscyclus kan worden bestudeerd, en onderhoudt parasiet propagatie tot 28 dagen10.
Cryptosporidium parvum is een apicomplexaanse parasiet die het epitheel van de Ademhalings-en darm tracten infecteert, waardoor een langdurige diarree ziekte ontstaat. De resistente milieu fase is de oocyste, gevonden in verontreinigd voedsel en water14. Eenmaal geconsumeerd of geïnhaleerd, de oocyste excysts en releases vier sporozoieten die hechten aan epitheliale cellen. Sporozoites glijden op hosts cellen en Engage host cel receptoren, maar de parasiet niet volledig de cel binnenvallen, en lijkt te induceren van de host cel om het te verzwelgen15. De parasiet, die binnen een intracellulair maar extracytoplasmisch compartiment geïnternationaliseerd is, blijft op het apicale oppervlak van de cel, repliceert binnen een parasitophoreuze vacuole. Het ondergaat twee ronden ongeslachtelijke voortplanting — een proces dat merogony wordt genoemd. Tijdens merogony ontwikkelen type I meronts die acht merozoïeten bevatten die vrijkomen om nieuwe cellen binnen te dringen. Deze merozoïeten binnenvallen nieuwe cellen te ontwikkelen tot type II meronts met vier merozoïeten. Deze merozoites, wanneer vrijgegeven, infecteren cellen en ontwikkelen tot macrogamonts en microgamonts. Microgameten worden vrijgegeven en bevruchten de macrogameten die zygoten produceren, die volwassen worden tot oöcysten. Volwassen oöcysten worden vervolgens in het lumen vrijgegeven. Oöcysten zijn ofwel dun-ommuurd die onmiddellijk excyst om het epitheel te reinfecteren, of dikke ommuurde die vrijkomen in het milieu om de volgende gastheer14infecteren. Alle stadia van de levenscyclus van Cryptosporidium zijn geïdentificeerd in het organoïde cultuur systeem dat eerder werd ontwikkeld door onze groep10.
Omdat menselijke organoïden getrouw de menselijke weefsels9,11,13nabootsen en alle replicatieve stadia van Cryptosporidium10ondersteunen, zijn ze het ideale weefselkweek systeem om te bestuderen Cryptosporidium biologie en gastheer-parasiet interacties. Hier beschrijven we de procedures voor het infecteren van organoïden met zowel Cryptosporidium oöcysten en excysted sporozoites, en het isoleren van de nieuwe oöcysten geproduceerd in dit weefselcultuur systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle weefselhandling en resectie werden uitgevoerd onder de door de institutionele Review Board (IRB) goedgekeurde protocollen met toestemming van de patiënt.
1. bereiding van C. parvum oöcysten voor injectie
Opmerking: Cryptosporidium oöcysten werden gekocht van een commerciële bron (Zie de tabel met materialen). Deze oöcysten worden geproduceerd in kalveren en worden opgeslagen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met antibiotica. Ze kunnen ongeveer 3 maanden worden bewaard bij 4 °C en mogen nooit worden bevroren. Normaalgesproken gebruiken we oöcysten binnen een maand. Organoïden kunnen worden geïnfecteerd met ofwel intact oöcysten, of sporozoïeten kunnen worden geïsoleerd van excysted oöcysten en gebruikt om organoïden te infecteren als het belangrijk is om geen oöcysten te hebben van het oorspronkelijke entmateriaal.
-
Prepareren Cryptosporidium oöcysten voor het infecteren van cellen (Figuur 1a).
- Houd oöcysten op ijs tijdens alle manipulaties totdat ze worden toegevoegd aan de organoïden.
- Bereken het aantal oöcysten dat nodig is voor een volledige zes-well plaat van organoïden (meestal ongeveer 5 x 105– 2,5 x 105 voor de plaat). Tel het aantal oöcysten in een hemocytometer om de hoeveelheid te controleren en over te brengen naar een centrifugebuis.
Opmerking: Om te helpen in de visualisatie, oöcysten kunnen worden gemengd 1:1 met een oocyste-specifieke fluorescentie antilichaam (Zie de tabel van de materialen) voordat het wordt geladen op de hemocytometer. De fluorophore-gelabelde oöcysten kunnen dan gemakkelijk worden gevisualiseerd en geïnventariseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Wij stellen voor het injecteren van ongeveer 100 – 1000 oöcysten/organoid. In het algemeen, 1000 – 2000 organoïden kunnen worden geteeld in een zes-goed plaat. - Breng het volume van de suspensie voor oöcysten tot 900 μL met PBS. Voeg 100 μL natriumhypochloriet (bijv. Clorox) bleekmiddel (bij 4 °C) toe. Inbroed 10 min. op ijs.
- Centrifugeer gedurende 3 minuten in een micro centrifuge bij 8.000 x g bij 4 °c. Oriënteer de buizen in de centrifuge met de opening van de dop naar binnen gericht. De pellet kan moeilijk te zien zijn, dus wetende waar de parasieten in de buis zijn omhuld is essentieel.
- Verwijder de supernatant met een pipet die voorzichtig is om de pellet te vermijden. Voeg 1 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) en Vortex toe om te mengen.
- Centrifugeer gedurende 3 minuten in een micro centrifuge bij 8.000 x g bij 4 °c.
- Herhaal spoelingen nog twee keer met DMEM.
- Bereid expansievat (OME) of differentiatie organoïde medium (OMD) waaraan taurocholaat is toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5% (w/v) (Zie tabel met materialen). Taurocholate moet altijd worden bereid en vers toegevoegd.
Opmerking: We hebben met succes 0,5% taurocholate gebruikt in onze infectie testen waar het entmateriaal intact oöcysten is, en zagen verbeterde tarieven van infectie zonder schadelijke effecten op de gastheer cellen. Echter, taurocholate wellicht onverwachte effecten op cellen, en lagere concentraties zijn met succes gebruikt in infectie testen16. - Respendeer oöcysten in 100 μL organoïde kweekmedium aangevuld met 0,5% (w/v) natrium taurocholaat. Tel oöcysten opnieuw zoals beschreven in stap 1.1.2.
- Voeg snel groene kleurstof toe aan de suspensie om de injectie te visualiseren.
- Vul micro-loader tips (Zie de tabel met materialen) met de oocyste suspensie en gebruik deze om getrokken haarvaten te vullen.
Let op: De hele procedure moet worden uitgevoerd in een weefsel cultuurkap met veiligheidsprotocollen van niveau 2. Gebruik van maskers wordt aanbevolen als Cryptosporidium oocysten kunnen ook besmettelijk zijn in de lucht.
2. in vitro zuivering van sporozoïeten uit C. parvum oöcysten
-
Purify sporozoieten van C. Parvum oöcysten na het bleken en wassen van de bleekmiddel zoals hierboven beschreven.
- Breng de oöcysten over naar een buis van 15 mL. Respendeer oöcysten op kamertemperatuur excystation medium (0,75% w/v natrium taurocholaat in DMEM) te verkrijgen 1 x 107 oöcysten/ml. De toevoeging van taurocholaat verbetert de excystation snelheid van de oöcysten, verbetering van de sporozoite opbrengst.
- Incuberen oocyste suspensie bij 37 °C gedurende 1 – 1,5 uur.
- Controleer het monster microscopisch voor omvang van de excystation; 60 – 80% excystation is redelijk voor goed herstel van sporozoites. Als het niveau van de excystation laag is, inincuberen langer (nog eens 30 min tot 1 h).
- Bepaal het percentage excystation ten opzichte van het aantal startende oöcysten. Excystation wordt als volgt berekend:
% excystation = [1 – (aantal intacte oöcysten/aantal oöcysten bij start)] x 100 - Was cellen om excystation reagentia te verwijderen door 14 mL PBS of medium toe te voegen, te mengen en cellen te herstellen (intact oöcysten, oöcyste schelpen en sporozoïeten) door centrifugeren bij 3.400 x g gedurende 20 minuten om sporozoïeten te herstellen. Aspireren zorgvuldig om te voorkomen dat cellen verliezen.
- Respendeer de sporozooriet pellet in 1 – 2 mL DMEM om 3 x 107 oöcysten/ml te verkrijgen (gebaseerd op het aantal beginnende oöcysten).
- Om overgebleven oöcysten en schelpen te verwijderen, filtert u de suspensie door een 3 μm filter (Figuur 1b). Gebruik een 47 mm filterhouder apparaat uitgerust met polycarbonaat filter (poriegrootte 3 μm) bevestigd aan een 10 mL spuit vat. Plaats het apparaat van de filterhouder bovenop een buis van 15 mL. Plaats de montage in een ijsemmer of in een koude ruimte.
- Voeg 7,5 mL van de sporozoite suspensie toe aan de filter assemblage en laat ze door de zwaartekracht filteren. Doorspoelen met een andere 7,5 mL DMEM.
Opmerking: Om succes in sporozoite isolatie te garanderen, zijn verse oöcysten en een goed excystation van cruciaal belang. Als er te veel onexcysted oöcysten zijn, zal de suspensie niet door de zwaartekracht stromen. Druk op de spuit toepassen kan geforceerd oöcysten door. Micro injectie van sporozoïeten is uitdagender dan die van oöcysten omdat sporozoïeten kunnen klonteren en het capillair blokkeren. Om dit te voorkomen, raden wij het maken van een bredere capillaire Tip bij het injecteren van organoïden met sporozoites. Om voldoende infectie niveaus te bereiken, moeten 2 – 4 keer het aantal sporozoïeten in elke organoïde worden geïnjecteerd in vergelijking met organoïden die zijn geïnfecteerd met oöcysten. - Centrifugeer de gefilterde sporozoïet suspensie op 3.400 x g met behulp van een draaiende emmer rotor voor 20 minuten tot pellet sporozoites.
- Respenderen in 50 – 100 μL OME of OMD organoïde kweekmedium (Zie de tabel met materialen) aangevuld met 0,05% (w/v) snelle groene kleurstof en L-glutathion, betaïne, l-cysteïne, linolzuur en taurine-bevattende Reduceer buffer5 (Zie de Tabel met materialen).
Opmerking: Te lang incuberen van oöcysten kan resulteren in de lysis van sporozoieten en slecht herstel en moet daarom worden vermeden.
3. in vitro cultuur van humane intestinale en Long Organoïden voor micro injectie
- Cultuur intestinale organoïden onder expansie en differentiatie media omstandigheden.
Opmerking:De details van de intestinale en Long organoïde vermeerdering zijn eerder beschreven in andere artikelen8,13(ZieTabel met materialenvoor media recepten). Hier beschrijven we kort de organoïde cultuur methode met specifieke verwijzing naar optimalisatie voorCryptosporidiuminjectie en groei. We hebben geconstateerd dat voor de beeldvorming van parasieten in organoïden de organoïden die in het expansie medium worden geteeld, beter zijn dan die in gekweekte media, omdat er minder vuilophoping is dan in organoïden die in differentiatie medium zijn geteeld. Echter, als het doel is om oöcysten te isoleren, produceren organoïden geteeld in differentiatie media veel hogere aantallen oöcysten.- Handhaaf organoïden in 3D-culturen in extracellulaire matrix (Zie de tabel met materialen) bij 37 °c. Voeg OME (Expansion media) bovenaan toe en vernieuw elke dag.
Opmerking: Voor Long organoïden hebben we geen aparte expansie-en differentiatie media. - Om organoïden te splitsen en te platen voor micro injectie, verwijder de media uit de 6-well plaat met menselijke organoïden en voeg F12 + + + toe (Zie de tabel met materialen) naar de put en Splits de matrix op door pipetteren met een 1 ml pipetpunt meerdere malen. Verzamel cellen in een buis van 15 mL (2 mL F12 + + + per buis is genoeg voor verdere procedures).
- Voeg 10 – 12 mL F12 + + + toe aan een andere buis van 15 mL en plaats een pipet met vuur gepolijst glas in het medium, Pipetteer 3 keer op en neer om de menselijke intestinale en Long organoïden op te breken.
Opmerking: Gebruik een lange glazen pipet (20 – 30 cm) en vuur-Poets het kort. Maak de opening (diameter van 1 mm) niet erg klein omdat organoïden beschadigd kunnen raken. Maak de punt van het pipet glad door het kort te polijsten. Breek organoïden in kleinere stukjes van ~ 50 μm. Long organoïden hebben een dikker buitenste membraan en vereisen daarom een sterkere afschuiving met de glazen pipet in vergelijking met de intestinale organoïden. Bovendien hebben ze een tragere groeisnelheid dan intestinale organoïden (tot 14 dagen tussen elke passage). - Voeg F12 + + + toe tot 5 – 7 mL en centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min.
Opmerking: De centrifugeersnelheid in deze stap is hoger dan normaal om een goede celpellet te maken die goed gescheiden is van de extracellulaire matrix (Zie de tabel met materialen). We hebben gezien dat in vergelijking met muis dunne darm organoïden, menselijke dunne darm organoïden moeilijker te verstoren. - Verwijder zo veel mogelijk medium zonder de cellen te storen, en breng vervolgens de pellet met matrix op 4 °C aan; 200 – 300 μL matrix per put van een zes-put-plaat is vereist. Organoïden moeten één op de drie gesplitst worden om een vrij hoge celdichtheid te behouden.
- Plaat de organoïden in matrix druppeltjes van ongeveer 5 – 10 μL, elk in de put van een 6-well plaat. Inbroed 20 – 30 minuten bij 37 °C en voeg vervolgens het expansie medium (OME) bovenop.
- Verander het medium elke 2 – 3 dagen.
Opmerking: In ongeveer 5 – 7 dagen bereiken organoïden die in EM groeien een grootte van 100 – 200 μm en zijn ze klaar voor injectie. - Om de organoïden te differentiëren, na 5 – 6 dagen in EM, verander de media in differentiatie media (DM) voorwaarden en houd voor 5 – 6 extra dagen voor het injecteren van de parasieten.
Opmerking: Voor de uitbreiding van organoïden wordt aanbevolen om de organoïden dicht te maken. Voor micro injectie wordt het gebruik van een 6-put plaat aanbevolen met organoïden verguld met een mindere dichtheid. Bijvoorbeeld, plaat organoïden uit drie putjes van een zesboorput in een volle zes-Wells plaat voor micro injecties. De matrix moet bij-20 °C worden gehouden voor lange termijn opslag en ontdooid bij 4 °C of op ijs vóór gebruik. Uitbreiding van de Long organoïden gebeurt op een vergelijkbare manier, maar met behulp van Long organoïde specifieke mediacomponenten (tabel 1)8 .
- Handhaaf organoïden in 3D-culturen in extracellulaire matrix (Zie de tabel met materialen) bij 37 °c. Voeg OME (Expansion media) bovenaan toe en vernieuw elke dag.
4. micro injectie van oöcysten/sporozoïeten in het Organoid lumen
-
Microinjecteer parasieten in de apicale kant van de 3D organoïde (Figuur 2).
- Maak glazen capillairen van 1 mm diameter met behulp van een micro pipet trekker.
Opmerking: De instellingen die worden gebruikt op de pipet-trekker (Zie tabel met materialen) zijn: Heat = 663, pull = 100, Velocity = 200, time = 40 MS. instellingen moeten worden aangepast volgens de instructies van de gebruiker voor een bepaalde machine. - Snijd de punt van het capillair met de Tang. De grootte/diameter van het capillaire uiteinde meet ongeveer 9 – 12 μm; Dit zorgt voor een gemakkelijke stroom van oöcysten (4 – 5 μm grootte).
- Vul de capillairen met oocyste of sporozoite suspensie met behulp van micro-loader tips.
- Laad het met oocyste gevulde capillair op een micro injector.
- Microinjecteer 100 – 200 nl suspensie in elke organoïde onder een omgekeerde Microscoop bij 5x vergroting, waarbij de druk constant blijft. Na de micro injectie vernieuwt u de media met OME of OMD elke dag en houdt u de plaat bij 37 °C.
Opmerking: We gebruiken geen micro Manipulator voor micro injectie. Het gebruik van dezelfde capillaire wordt aanbevolen voor het hele experiment om te zorgen voor gelijke injectie in elk monster.
- Maak glazen capillairen van 1 mm diameter met behulp van een micro pipet trekker.
5. immunofluorescentie kleuring van Organoïden
- Verzamel organoïden (1 – 2 x 24 putjes) met een P1000 pipet in een buis van 15 mL met een koude F12 + + +.
- Pellet organoïden bij 300 x g gedurende 2 minuten, verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren en Pipet de pellet voorzichtig los in het resterende volume.
- Voeg 5 mL 2% Paraformaldehyde toe in PBS. Om te voorkomen dat de organoïden aan de muur kleven, moet u de buis niet omkeren. Laat de organoïden zich op de bodem van de buis vestigen en fixeren bij 4 °C 's nachts of 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder het fixeermiddel en voeg 10 mL permeabilization buffer (0,2% Triton in PBS) toe.
- Draai de buis op kamertemperatuur gedurende 20 minuten (dit zorgt ervoor dat alle organoïden in suspensie blijven).
- Pellet de organoïden op 300 x g gedurende 2 minuten en gooi het supernatant dan weg.
- Regeer de organoïden zachtjes in 500 μL blokkerende oplossing (Zie de tabel met materialen) en breng over naar een micro centrifugebuis van 2 ml.
- Inincuberen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur op een shaker. Laat organoïden door de zwaartekracht op de bodem van de buis vestigen. Vervang de blokkerende oplossing door primaire antilichaam oplossing (Zie tabel van de materialen) en inincuberen voor 1 – 2 h bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °c.
- Was 3x met PBS met 0,1% tween. Laat de organoïden elke keer schikken en verwijder het supernatant.
- Voeg secundaire antilichaam oplossing toe (Zie de tabel met materialen) en inincuberen voor 2 uur bij kamertemperatuur.
- Was 3x met PBS met 0,1% tween. Laat 50 μL PBS na de derde wasbeurt.
- Monteer op de glijbaan door het pipetteren van de organoïden opgehangen in 50 μL PBS op de dia. Verwijder overtollige PBS, voeg een druppel montage middel toe (Zie de tabel met materialen) en voeg de Afdeklijst bovenaan toe. Sluit de zijkanten af met nagellak en laat het drogen.
6. isolatie van oöcysten uit Organoïden
- Isoleren van nieuw gevormde oöcysten uit de organoïde lumen.
Opmerking:Oöcysten zijn geïsoleerd van de organoïden door immunomagnetische scheiding met behulp van een oocyste isolatie kit (Zie deTabel met materialen) met de hieronder beschreven wijzigingen. De geïsoleerde oöcysten kunnen vervolgens worden geanalyseerd door immunofluorescentie en elektronenmicroscopie.- Begin met gedifferentieerde organoïden die gedurende 5 – 7 dagen in OMD zijn bewaard en die niet geïnfecteerd zijn, gedurende 1 dag geïnfecteerd zijn en gedurende 5 dagen geïnfecteerd zijn. Gebruik de eerste twee als negatieve besturingselementen.
Opmerking: We hebben geconstateerd dat gedifferentieerde organoïden meer oöcysten produceren dan Long of het uitbreiden van intestinale organoïden10. - Verzamel organoïden in 15 mL centrifugebuizen. Centrifugeer de organoïden gedurende 20 minuten bij 3.000 x g en 10 °c.
Opmerking: Deze hoge snelheid is nodig om ervoor te zorgen dat er geen oöcysten verloren gaan van alle organoïden die kunnen worden gebroken. - Verwijder de organoïde media en vervang deze door 5 ml water.
- Verstoren de organoïden door herhaalde krachtige pipetteren met een vuurgepolijste glazen Pasteur-pipet.
- Als er klontjes zichtbaar zijn, breng de organoïde suspensie over naar een glas dounce homogenisator en homogeniseren tot organoïden goed verstoord zijn. De dounce homogenisator zal geen invloed hebben op de oöcysten.
- Zodra er geen zichtbare klonters zijn, voeg 5 mL buffer A toe van de oocyste isolatie kit. Meng en voeg vervolgens 120 μL van de magnetische kralen toe bedekt met anti-oocyste IgM.
- Inincuberen van de celsuspensie en magnetische kralen voor 2 uur bij kamertemperatuur met continue menging op een rocker platform.
- Leg aan het einde van de incubatie de buisjes met cellen en parels op een magnetisch scheidings rek dat is ontworpen voor buizen van 15 mL.
- Draai de buisjes in magnetisch scheidings rek handmatig gedurende 3 min. De parels zullen zich aan de zijkant van de buis naast de magneet houden.
- Voorzichtig, met een 10 mL Pipet, verwijder de supernatant van de kralen. Regeer de parels in 450 μL buffer B en breng over naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
Opmerking: Houd de supernatant totdat de isolatie van de oöcysten wordt bevestigd. - Om overgebleven kralen en oöcysten te verzamelen, was de 15 mL tube met 450 μL buffer B en voeg deze Wash toe aan de magnetische kralen in de microcentrifuge buis.
- Herhaal stap 6.1.11 nog een keer. Alle kralen en gevangen oöcysten moeten nu worden overgebracht naar de microcentrifuge buis.
- Plaats de microcentrifuge buis op een magnetisch scheidings rek dat is ontworpen voor het vasthouden van microcentrifuge buizen.
- Draai de buis in de magnetische scheidingswand met de hand gedurende 3 min.
- Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet in een nieuwe buis.
Opmerking: Houd de supernatant totdat de isolatie van de oöcysten wordt bevestigd. - Verwijder de microcentrifuge buis met magnetische kralen en oöcysten uit het magnetische scheidings rek.
- Voeg 100 μL van 0,1 N HCl toe aan magnetische kralen om de oöcysten van de kralen te elzen. Vortex voor 30 s.
Opmerking: Vortexer moet worden ingesteld op iets minder dan de maximumsnelheid. - Inbroed de kralen in 0,1 N HCl gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Vortex weer. Plaats de buis vervolgens terug op het magnetische scheidings rek. Wacht tot de kralen zich aan de zijkant van de buis hechten en breng de supernatant over naar een nieuwe microcentrifuge buis.
- Herhaal stap 6.1.17 tot en met 6.1.19 en combineer het tweede eluaat met de eerste elutie.
- Neutraliseer het eluaat met 20 μL van 1 N NaOH, of een andere neutraliserende buffer zoals 1 M Tris, pH 8.
- Om oöcysten te tellen, neem 10 μL van het eluaat, Combineer het met 10 μL oocyste-specifiek antilichaam (Zie tabel met materialen) en Tel fluorescerende oöcysten op een hemocytometer.
Opmerking: Geïsoleerde oöcysten kunnen worden bewaard bij 4 °C of onmiddellijk worden gebruikt voor immunofluorescentie of elektronenmicroscopie beeldvorming.
- Begin met gedifferentieerde organoïden die gedurende 5 – 7 dagen in OMD zijn bewaard en die niet geïnfecteerd zijn, gedurende 1 dag geïnfecteerd zijn en gedurende 5 dagen geïnfecteerd zijn. Gebruik de eerste twee als negatieve besturingselementen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier gepresenteerde protocollen resulteren in de efficiënte zuivering van oöcysten en sporozoïeten (Figuur 1a) klaar voor Microinjection. Het excystation protocol resulteert in de vrijlating van sporozoieten van ongeveer 70 – 80% van de oöcysten, daarom is het essentieel om de resterende oöcysten en schelpen te filteren door middel van een 3 μm filter. Filtratie resulteert in bijna 100% sporozoietzuivering (Figuur 1b). Bovendien zorgt de toevoeging van een groene kleurstof voor de injectie van alle organoïden en maakt het mogelijk de ingespoten organoïden gedurende ten minste 24 uur na de injectie te visualiseren (Figuur 2b).
Deze protocollen voor de bereiding van oöcysten en sporozoïeten zijn eenvoudig en zijn gebruikt voor vele jaren, dus er wordt verwacht dat de behandelde oöcysten en gezuiverde sporozoïeten levensvatbaar en infectieus zullen zijn. In onze studies gebruikten we echter het scannen van elektronenmicroscopie om ervoor te zorgen dat het excystation-proces de sporozoïeten of oöcysten niet beschadigt (Figuur 2a)10. Injectie van gelijke hoeveelheden oöcysten in de organoïde lumen kan visueel worden bevestigd door eenvoudige microscopische beeldvorming (figuur 2c). Er moet een deel van de geïnfecteerde organoïden worden ingesteld om de voortplanting van parasieten door kwantitatieve PCR te verifiëren, zoals we10hebben beschreven.
De voortgang door de parasiet levenscyclus kan worden gevisualiseerd door het verzamelen van geïnfecteerde organoïden op verschillende tijdstippen na infectie en analyse door transmissie elektronenmicroscopie of door immunofluorescentie gecombineerd met 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole ( DAPI) kleuring van parasiet kernen10. Bijvoorbeeld, antilichamen tegen merozooniet oppervlakte antigenen, zoals gp40 en GP1517 kunnen worden gebruikt om meront stadia te identificeren; type I meronts zal hebben 8 kernen en type II meronts, 4 kernen10. Onlangs is een panel van monoklonale antilichamen specifiek voor trophozoites, merozoites, type I versus II meronts en macrogamonten beschikbaar gekomen18. Deze antilichamen zouden ook zeer effectief zijn in het markeren van de voortgang van de parasiet door de verschillende levenscyclus stadia in de organoïden.
Immunofluorescentie-assays kunnen ook worden gebruikt om te onderzoeken welke celtypen zijn geïnfecteerd door Cryptosporidium. Dit was vooral belangrijk om te kijken in de luchtweg organoïden als zeer weinig bekend is over respiratoire cryptosporidiosis, en de exacte gastheer cel voor de parasiet was niet bekend. We voerden immunofluorescentie testen uit op Cryptosporidium-geïnfecteerde organoïden, colocaliseren CC10, een marker voor Club cellen en ontdekten dat Cryptosporidium zowel CC10-negatieve als positieve cellen heeft geïnfecteerd (Figuur 3). Deze resultaten werden bevestigd door TEMs waarin we Cryptosporidium infecterende secretoire en niet-secretoire cellen in de luchtweg organoïden10waargenomen.
Nadat gedifferentieerde organoïden zijn geïnfecteerd gedurende vijf dagen, moeten er significante aantallen oöcysten worden geproduceerd. In onze handen, infectie van organoïden van 1 6-well plate leverde ongeveer 4000 oöcysten, die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd en geteld op een hemocytometer door labeling met een oocyste-specifieke antilichaam. De aanwezigheid van vier sporozoïeten in de oöcysten kan worden bevestigd door een deel van de oöcysten op een zelfklevende glijbaan te drogen, te fixeren met methanol en DAPI-kleuring te combineren met oocyste-specifieke antilichamen (Figuur 4). Controle van de productie van dikke ommuurde oöcysten kan worden gedaan door TEM-analyse10.
Figuur 1: bereiding en zuivering van Cryptosporidium oöcysten en sporozoïeten. A) Schematische weergave van de methode die wordt gebruikt voor de bereiding van oocyste en sporozoite voor infectie. (B) afbeelding die in vitro excystation van oöcysten weergeeft. Filtratie van niet-excysted oocyts en schelpen geeft een gezuiverde oplossing van sporozoites. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: micro injectie van oöcysten in de organoïde lumen. Dit cijfer is gewijzigd van Heo et al.10. A) het scannen van elektronenmicroscopie (SEM) beelden van oöcysten en sporozoïeten. (B) afbeelding met oocyste-geïnjecteerde organoïden. De groene kleurstof helpt bij het visualiseren van de injectie van elke organoïde en blijft over ten minste 24 h. (C) beeld van een organoïde geïnjecteerd met oöcysten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: immunofluorescentie beeld van een Cryptosporidium-geïnfecteerde luchtweg organoid. Mucin is gelabeld met anti-mucin 5 antilichaam (rood) in het lumen van de organoid, Club cellen zijn gelabeld met anti-CC10 (geel), Cryptosporidium wordt gedetecteerd met oocyste-specifieke antilichamen (groen), en celkernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). Panel B is een uitbreiding van het gebied aangegeven op het vierkant in paneel A. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: immunofluorescentie beeld van oocyste geïsoleerd van gedifferentieerde intestinale organoïden. Oocyste muur is gelabeld met oocyste-specifieke antilichamen in het groen en de vier sporozoite kernen worden gevisualiseerd met DAPI (blauw) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cultuur van Cryptosporidium parasieten in intestinale en luchtweg organoïden biedt een nauwkeurig model om gastheer-parasiet interacties10 te bestuderen, maar heeft ook veel andere toepassingen. De huidige methoden voor het selecteren en propageren van genetisch gemodificeerde Cryptosporidium parasieten vereisen bijvoorbeeld passage in muizen19 die geen isolatie van parasieten mogelijk maakt die modificaties hebben die essentieel zijn voor in-vivo-infecties. Organoid cultuur van Cryptosporidium biedt een alternatief voor deze procedure. We hebben echter opgemerkt dat elektroporated sporozoieten samen klonteren en de micro pipet blokkeren. Met het oog op de selectie van genetisch gemodificeerde parasieten kunnen organoïden worden geteeld op met collageen beklede trans putten in een tweedimensionaal formaat, onder differentiatie omstandigheden, om besmetting met gegeneerd sporozoïeten mogelijk te maken en bijgevolg de selectie van de genetisch gemodificeerde oöcysten. De transwells bieden toegang tot zowel de apicale als de basolaterale oppervlakken en zijn gedurende langere tijd stabiel.
Op dit moment cultuur we organoïden in een tweedimensionaal formaat voor screening van geneesmiddelen met een hoge doorvoer voor kanker weefsel afgeleide organoïden (niet-gepubliceerde gegevens). Deze methode van organoïde cultuur kan ook worden aangepast voor het testen van anti-Cryptosporidium drugs met behulp van de genetisch gemodificeerde plaats gelabeld Cryptosporidium stammen19. Bovendien, ook al is de infectie niet nauw gesynchroniseerd, infectie van organoïden met sporozoïeten zorgt voor voldoende synchronisatie van de levenscyclus die drugs kunnen worden getest op hun werkzaamheid tegen specifieke levenscyclus stadia.
Organoid co-cultuur systemen worden nu ontwikkeld, rekening houdend met een aantal andere aspecten van het hostsysteem zoals microbiota en immune cellen20. Zo is het vermogen om interacties tussen de parasiet en gastheer cellen, immuuncellen en microbiota te ontleden binnenkort mogelijk in vitro. Genetische manipulatie van Cryptosporidium is nu ook mogelijk19, en de combinatie van fluorescerende reporter stammen van Cryptosporidium en organoïde cultuur zal de hulpmiddelen voor het sequentiëren van de enkelvoudige cel van geïnfecteerde cellen bieden, en nog specifieker de enkelvoudige celvolgorde van cellen die zijn geïnfecteerd met specifieke stadia van de parasiet.
Het succes van de hier beschreven experimenten is sterk afhankelijk van de levensvatbaarheid en infectiviteit van de oöcysten. Verschillende batches van Cryptosporidium oöcysten kunnen sterk variëren in excystation tarieven en het vermogen om gastheer cellen te infecteren. Voldoende opbrengsten van sporozoïeten is afhankelijk van goede excystation tarieven en de excystation rate is niet altijd gecorreleerd aan infectiviteit. Als lage niveaus van infectie of slechte excystation worden waargenomen met een bepaalde partij van oöcysten, tijd en inspanning kunnen worden gered door het verkrijgen van een nieuwe partij van oöcysten in plaats van te proberen te verhogen van oocyste getallen, of verlenging incubatie tijden.
Organoid cultuur media moeten elke alternatieve dag worden vernieuwd. Het gebruik van eerdere passages van organoïde culturen is raadzaam. Het is belangrijk om een nieuwe flacon met organoïden te ontdooien als organoïden in latere passages beginnen te differentiëren, omdat de gezondheid van organoïde culturen de levensvatbaarheid van de parasiet sterk bepaalt. Na infectie moet organoïde media elke dag worden ververst om ophoping van giftige stoffen in de media te voorkomen.
Organoid cultuur van Cryptosporidium is beperkt in dat de parasiet kan niet worden gekweekt voor onbepaalde tijd, en de infectie Peters uit na drie passages over 28 dagen10. Micro injectie van voldoende organoïden voor muis experimenten zoals beschreven, kan tijdrovend en fysiek belastend zijn. Niettemin, tot op heden, geen andere methode maakt de volledige levenscyclus in een in vitro systeem volledig representatief voor menselijke infectie, noch heeft een cultuur systeem beschreven die het mogelijk maakt verkenning van de gastheer-pathogen interacties belangrijk voor infectie van de luchtwegen. Organoid cultuur van Cryptosporidium biedt een krachtige nieuwe tool die opent mogelijkheden van verkenning in gastheer-parasiet interacties niet eerder mogelijk voor Cryptosporidium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn Deborah A. Schaefer dankbaar van de school voor dier-en vergelijkende Biomedische Wetenschappen, het College voor landbouw en levenswetenschappen, de Universiteit van Arizona, Tucson, AZ, USA om ons te helpen met de productie en analyse van oocyste. We danken ook Franceschi Microscopy en Imaging Center en D.L. Mullendore aan de Washington State University voor tem-voorbereiding en beeldvorming van geïsoleerde organoïde-oöcysten.
D.D. is de ontvanger van een VENI-beurs van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. is de ontvanger van een VENI-subsidie van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO-ALW, 863.14.002) en werd gesteund door de Marie Curie-beurzen van de Europese Commissie (voorstel 330571 KP7-PEOPLE-2012-IIF). Het onderzoek dat tot deze resultaten heeft geleid, heeft financiering ontvangen van de Europese Onderzoeksraad onder ERC Advanced subsidie Agreement No. 67013 en van NIH NIAIH onder R21 AT009174 naar RMO. Dit werk maakt deel uit van het Oncode Institute, dat deels wordt gefinancierd door de Nederlandse Kankervereniging en werd gefinancierd door een subsidie van de Nederlandse Kankervereniging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5 µM |
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* - cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5 µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make up to 100 mL |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O'Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
