Summary
우리는 Cryptosporidium parvum에 의하여 인간 장 및 기도 오르가노이드의 감염을 공부하기 위한 난모낭을 준비하고 포자조를 정화하는 프로토콜을 기술합니다. 우리는 장 내 오르가노이드 루멘으로 기생충의 미세 주입 과 오르가노이드의 면역 염색을위한 절차를 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 오르가노이드에서 생성 된 난모낭의 격리를 설명합니다.
Abstract
크립토스포리듐 파르블은 인간 설사 질환의 주요 원인 중 하나입니다. 기생충의 병리학을 이해하고 효율적인 약물을 개발하기 위해서는 숙주의 상태를 재량화하는 체외 문화 시스템이 필요합니다. 그들의 기원의 조직과 밀접하게 닮은 오르가노이드는 호스트 기생충 상호 작용을 연구하는 데 이상적입니다. 오르가노이드는 3차원(3D) 조직 유래 구조로, 성체 줄기세포에서 유래되고 유전적 수차 나 변형을 겪지 않고 장시간 배양에서 성장한다. 그들은 정점과 바소측 표면 모두극성을 잘 정의했다. Organoids는 약물 테스트, 바이오 뱅킹 및 질병 모델링 및 호스트 미생물 상호 작용 연구에서 다양한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 여기에서 우리는 인간 장 및 기도 오르가노이드를 감염시키기 위한 Cryptosporidium의 난모낭및 포자조를 준비하는 방법의 단계별 프로토콜을 제시합니다. 우리는 그 때 어떻게 microinjection가 오르가노이드 lumen로 미생물을 주입하기 위하여 이용될 수 있는지 설명합니다. 오가노이드가 호스트 미생물 상호 작용 연구에 사용될 수 있는 세 가지 주요 방법이 있습니다- 미세 주입, 기계 전단 및 도금, 그리고 단층을 만들어서. 미세 주사는 3D 구조의 유지 보수를 가능하게하고 기생충 볼륨의 정확한 제어 및 미생물에 대한 직접 정점 측면 접촉을 할 수 있습니다. 우리는 화상 진찰 또는 난모낭 생성을 위한 오르가노이드의 최적 성장을 위한 세부사항을 제공합니다. 마지막으로, 우리는 또한 새로 생성된 oocysts가 추가 하류 처리 및 분석을 위해 오르가노이드에서 격리될 수 있는 방법을 보여줍니다.
Introduction
크립토스포리듐 감염의 치료 및 예방을 위한 약물 또는 백신의 개발은 인간1,2의생체내 상황을 정확하게 모방하는 체외 시스템의 부족에 의해 방해받고 있다. 현재 사용 가능한 시스템의 대부분은 단기 감염 (&5 일)을 허용하거나기생충3,4의전체 수명 주기를 지원하지 않습니다. 기생충의 완전한 발달을 가능하게 하는 그밖 시스템은 인간에 있는 생리적인 상황을 충실하게 되풀이하지 않는 불멸한 세포주 또는 암세포주에근거를 두어5,6,7 . 오르가노이드 또는 '미니 장기'는 다양한 조직 특정 성장 인자로 보충된 세포외 매트릭스에서 성장되는 3D 조직 유래 구조입니다. 오르가노이드는 다양한 장기와 조직에서 개발되었습니다. 그(것)들은 유전으로 안정되고 그들의 기원의 기관의 대부분의 기능을 되풀이하고, 시간의 연장된 기간 동안 문화에서 유지될 수 있습니다. 우리는 장 및 호흡기 크립토스포리디오증과 관련된 호스트 기생충 상호 작용의 연구를 위한 정확한 시험관 내 모델을 제공하는 Cryptosporidium으로 인간 장 및 폐 오르가노이드를 감염시키는 방법을 개발했습니다8 ,9,10,11,12,13. 다른 출판 된 문화 모델과는 달리, 오르가노이드 시스템은 실제 호스트 기생충 상호 작용을 대표하며, 기생충 수명 주기의 모든 단계를 연구 할 수 있도록 수명 주기를 완료 할 수 있으며 기생충 전파를 유지합니다. 최대 28 일10.
크립토스포리듐 방부는 호흡기와 장관의 상피를 감염시켜 장기간 설사 질환을 일으키는 양봉복합 기생충입니다. 내성 환경 단계는 오염된 음식과물(14)에서발견되는 난모낭이다. 일단 섭취되거나 흡입되면, 난모낭종은 상피 세포에 부착되는 4개의 포자형을 방출한다. 스포로조이스는 숙주 세포에 미끄러지고 숙주 세포 수용체를 교반하지만, 기생충은 세포를 완전히 침범하지 않으며, 숙주 세포가15를삼키도록 유도하는 것으로 보인다. 기생충, 세포 내 하지만 extracytoplasmic 구획 내에서 내면화, 세포의 꼭대기 표면에 남아, parasitophorous 백액 내에서 복제. 그것은 무성 생식의 두 라운드를 겪는다- 메로고니라는 과정. merogony 도중, 타입 I 메론은 새로운 세포를 침략하기 위하여 풀어 놓인 8개의 merozoites를 포함하는 개발합니다. 이 merozoites는 4개의 merozoites를 포함하는 타입 II 메론으로 발전하기 위하여 새로운 세포를 침략합니다. 이 merozoites, 풀어 놓일 때, 세포를 감염시키고 macrogamonts와 microgamonts로 발전합니다. 마이크로게임테스가 출시되어 난모낭으로 성숙하는 zygotes를 생산하는 매크로게임테스를 비옥하게 한다. 성숙한 난모낭은 이후에 내강으로 풀어 놓입니다. 난모세포는 후피를 재감염시키기 위해 즉시 방신하는 얇은 벽, 또는 다음숙주(14)를감염시키기 위해 환경으로 방출되는 두꺼운 벽중 하나이다. Cryptosporidium 수명 주기의 모든 단계는 이전에 우리의 그룹10에의해 개발 된 오르가노이드 배양 시스템에서 확인되었습니다.
인간 오르가노이드는 인간 조직을 충실하게 복제하기 때문에9,11,13, 및 Cryptosporidium10의모든 복제 단계를 지원하기 때문에 연구하기에 이상적인 조직 배양 시스템입니다. 크립토스포리듐 생물학 및 호스트 기생충 상호 작용. 여기에서 우리는 Cryptosporidium oocysts 및 황삭 한 포자화물 둘 다로 오르가노이드를 감염시키고, 이 조직 배양 시스템에서 생성된 새로운 oocysts를 격리하기 위한 절차를 기술합니다.
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Protocol
모든 조직 취급 및 절제술은 환자 동의를 가진 기관 검토 위원회 (IRB) 승인된 프로토콜의 밑에 수행되었습니다.
1. 주입을 위한 C. parvum Oocysts의 준비
참고: 크립토스포리듐 난낭아는 상업적 출처로부터 구입하였다(재료표참조). 이 난모낭은 송아지에서 생성되고 항생제와 인산완충식염수 (PBS)에 저장됩니다. 그들은 4 °C에서 약 3 개월 동안 보관 할 수 있으며 결코 동결되어서는 안됩니다. 우리는 일반적으로 1 개월 이내에 난모낭을 사용합니다. 오르가노이드는 온전한 난모낭에 감염될 수 있고, 또는 포자형염은 난모낭에서 분리될 수 있고 원래 접종에서 난모낭을 이월하지 않는 것이 중요할 경우 오르가노이드를 감염시키는 데 사용될 수 있다.
-
감염 세포에 대한 크립토 스포리듐 난모 낭종을 준비(그림 1A).
- 그들은 오르가노이드에 추가 될 때까지 모든 조작을 통해 얼음에 oocysts을 유지.
- 오르가노이드의 전체 6 웰 플레이트에 필요한 난모낭의 수를 계산합니다 (일반적으로 플레이트의 경우 약 5 x 105-2.5 x10). 혈세포계에서 난모낭의 수를 계산하여 양을 확인하고 원심 분리관으로 옮깁니다.
참고: 시각화를 돕기 위해, 난모낭은 난모세포 특이적 형광 항체와 1:1혼합될 수 있다(재료 표참조). 형광 표지된 난모낭은 형광 현미경을 사용하여 쉽게 시각화되고 열거될 수 있습니다. 우리는 약 주입하는 것이 좋습니다 100-1,000 난모 낭종 / 오르가노이드. 일반적으로, 1,000-2,000 개의 오르가노이드는 6 웰 플레이트에서 재배 될 수 있습니다. - PBS를 사용하여 최대 900 μL의 난모낭 종탁액의 부피를 가져옵니다. 하이포아염소산나트륨 100 μL(예: 클로록스) 표백제(4°C)를 첨가합니다. 얼음에 10 분 동안 배양.
- 4 °C에서 8,000 x g에서 미세 원심 분리기에서 3 분 동안 원심 분리기. 캡개구형이 안쪽을 향하여 원심분리기의 튜브를 배향합니다. 펠릿은 기생충이 튜브에 펠릿이 있는 곳을 아는 것이 필수적이므로 보기 어려울 수 있습니다.
- 펠릿을 피하기 위해 조심하는 피펫으로 상급자를 제거하십시오. 덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM)와 소용돌이를 섞을 1mL를 추가합니다.
- 4 °C에서 8,000 x g에서 미세 원심 분리기에서 3 분 동안 원심 분리기.
- DMEM으로 두 번 더 세서를 반복합니다.
- 타우로콜레이트가 0.5%(w/v)의 최종 농도에 첨가된 팽창 배지(OME) 또는 분화 오르노이드 배지(OMD)를 준비한다(재료 표참조). 타우로콜레이트는 항상 준비하고 신선을 추가해야합니다.
참고: 우리는 성공적으로 접종이 손상되지 않은 난모낭인 우리의 감염 성 아세포에서 0.5 % 타우로콜레이트를 사용하고, 숙주 세포에 해로운 영향없이 감염의 개선 된 비율을 보았다. 그러나, 타우로콜레이트세포에 예기치 않은 영향을 미칠 수 있고, 낮은 농도는 감염 성 측정기16에서성공적으로 사용되어 왔다. - 0.5% (w/v) 나트륨 타우로콜레이트로 보충된 오르가노이드 배양 배지의 100 μL에서 난모낭을 다시 일시 중단시켰다. 1.1.2단계에서 설명한 대로 난낭을 다시 세십시오.
- 주입을 시각화하기 위해 서스펜션에 빠른 녹색 염료를 추가하십시오.
- 마이크로 로더 팁(재료 표참조)을 난모낭 현탁액으로 채우고 당겨진 모세혈관을 채우는 데 사용합니다.
주의 사항: 전체 절차는 레벨 2 안전 프로토콜이있는 조직 배양 후드에서 수행해야합니다. 크립토스포리듐 난낭균은 공중에 떠있을 때 전염될 수 있기 때문에 마스크를 사용하는 것이 좋습니다.
2. C. 파르브옴 Oocysts에서 스포로 조이의 체외 정화
-
상기와 같이 표백 및 세척 후 C. parvum oocysts에서 포자화물을 정화한다.
- 난모낭을 15 mL 튜브로 옮깁니다. 실온 의 난모낭 매질 (DMEM에서 0.75 % w / v 나트륨 타우로콜레이트)에서 난모 낭포를 다시 일시 중단하여 1 x 107 oocysts / mL을 얻습니다. 타우로콜레이트첨가는 난모세포의 난전속도를 향상시키고, 포자졸수율을 향상시킨다.
- 1-1.5 시간 동안 37 °C에서 난모세포 현탁액을 배양합니다.
- 견본을 현미경으로 임신의 넓이 검사하십시오; 60-80% 엑스코션은 포자형의 좋은 회복을 위해 합리적입니다. 흥분 의 수준이 낮은 경우, 더 이상 배양 (또 다른 30 분 1 시간).
- 시작 난모낭의 수에 비해 퍼센트 내뿜기를 결정합니다. 다음과 같이 계산됩니다.
% 내뿜기 = [1 – (시작 시 난모낭의 수/난모낭수)] x 100 - 14 mL의 PBS 또는 배지를 추가하여 흥분 시약을 제거하는 세포를 세척하고, 세포 (온전한 난모낭, 난모낭 껍질 및 포각체)를 3,400 x g에서 원심분리하여 20 분 동안 포포로조이스를 회수합니다. 세포를 잃지 않도록 조심스럽게 흡인하십시오.
- DMEM의 1-2 mL에서 스포로 조이트 펠릿을 다시 일시 중단하여 3 x 107 oocysts / mL을 얻습니다 (시작 난모낭의 수에 따라).
- 남은 난모낭과 껍질을 제거하려면 3 μm 필터를 통해 현탁액을 걸트(그림1B). 10mL 주사기 배럴에 장착된 폴리카보네이트 필터(3 μm 기공 크기)가 장착된 47mm 필터 홀더 장치를 사용합니다. 필터 홀더 장치를 15mL 튜브 위에 놓습니다. 어셈블리를 얼음 양동이 나 차가운 방에 놓습니다.
- 필터 어셈블리에 스포로조이트 서스펜션의 7.5mL를 추가하고 중력에 의해 필터링할 수 있습니다. DMEM의 또 다른 7.5 mL로 씻어내라.
참고: 포자이트 격리에서 성공을 보장하기 위해 신선한 난모낭과 좋은 흥분이 중요합니다. 너무 많은 비외 난모낭이있는 경우, 현탁액은 중력에 의해 흐르지 않을 것이다. 주사기에 압력을 가하면 비외 난모낭을 강제로 통과시킬 수 있습니다. 포자화물의 미세 주입은 포자가 덩어리와 모세관을 차단 할 수 있기 때문에 난모낭보다 더 도전적이다. 이를 피하려면 포자형으로 오르가노이드를 주입 할 때 더 넓은 모세관 팁을 만드는 것이 좋습니다. 감염의 충분한 수준을 달성하기 위하여는, 2-4 시간 sporozoites의 수는 난모세포에 감염된 organoids에 비해 각 organoid로 주입될 필요가 있습니다. - 3,400 x g에서 여과된 스포로조이트 현탁액을 펠릿 스포로조이트까지 20분 동안 스윙 버킷 로터를 사용하여 원심분리기.
- 50-100 μL의 OME 또는 OMD 오르가노이드 배양 배지(재료 표참조)에서 0.05% (w/v) 빠른 녹색 염료 및 L-글루타티온, 베타인, L-시스테인, 리놀레산 및 타린 함유 환원 완충액5(참조) 재료 표)를 참조하십시오.
참고: 너무 오래 동안 난모낭을 배양하면 포자형의 용해와 가난한 회복이 발생할 수 있으므로 피해야합니다.
3. 미세 주입을 위한 인간 장 및 폐 오르가노이드의 시험관 내 문화
- 배양 장 오르가노이드 는 팽창 및 분화 배지 조건 하에서.
참고:장 과 폐 오르가노이드 전파의 세부 사항은 이전에 다른 기사에서 기술되었습니다8,13(를 참조하십시오.재료 표미디어 레시피용)을 참조하십시오. 여기에서는, 우리는 에 대한 최적화에 대한 구체적인 참조와 함께 오르가노이드 배양 방법을 간략하게 기술한다.Cryptosporidium주사와 성장. 우리는 오르가노이드에 있는 기생충의 화상 진찰을 위해, 확장 매체에서 성장한 organoids가 분화 매체에서 성장한 organoids에서 보인 보다는 더 적은 파편 축적이 있기 때문에 성장한 분화 매체에 있는 사람들보다는 바람직하다는 것을 것을을 발견했습니다. 그러나, 목표가 난모낭을 분리하는 것이 목표인 경우에, 분화 매체에서 성장한 오르가노이드는 난모낭의 훨씬 더 높은 수를 생성합니다.- 세포외 기질에서 3D 배양물의 오르가노이드를 37°C에서 유지합니다(재료 표참조). OME(확장 미디어)를 상단에 추가하고 매일 새로 고칩니다.
참고: 폐 오르가노이드의 경우 별도의 팽창 및 분화 매체가 없습니다. - 미세 주입을 위한 분할 및 플레이트 오르가노이드를 하려면, 인간 오르가노이드가 들어있는 6웰 플레이트에서 매체를 제거하고 F12+++(재료 표참조)를 웰에 추가하고 1mL 파이펫 팁으로 여러 번 파이펫팅하여 매트릭스를 분해합니다. 15 mL 튜브로 세포를 수집 (튜브 당 F12 ++의 2 mL는 추가 절차에 충분하다).
- F12+++의 10-12 mL을 다른 15mL 튜브에 넣고 불에 광택이 나는 유리 파이프를 매체에 넣고, 피펫을 위아래로 3번 하여 인간의 장과 폐 오르가노이드를 분해합니다.
참고: 긴 유리 파이펫 (20-30cm)을 사용하고 잠시 불을 닦습니다. 오르가노이드가 손상될 수 있으므로 개구부(직경 1mm)를 매우 작게 만들지 마십시오. 파이펫 끝을 짧게 연마하여 부드럽게 만듭니다. ~ 50 μm의 작은 조각으로 오르가노이드를 휴식. 폐 오르가노이드는 두꺼운 외부 막을 가지고 있으므로 장 오르가노이드에 비해 유리 파이펫으로 더 강한 전단이 필요합니다. 또한, 그들은 장 오르가노이드보다 느린 성장 속도를 가지고 (각 통과 사이에 최대 14 일). - F12+++를 5-7mL까지 추가하고 원심분리기를 350 x g에서 5분 간 추가합니다.
참고: 이 단계의 원심분리 속도는 세포외 매트릭스로부터 잘 분리된 양호한 세포 펠릿을 만들기 위해 정상보다 높다(재료 표참조). 우리는 마우스 소장 오르가노이드에 비해, 인간의 소장 오르가노이드가 중단하기 어렵다는 것을 관찰했습니다. - 세포를 방해하지 않고 가능한 한 많은 배지를 제거한 다음 4 °C에서 유지 된 매트릭스로 펠렛을 다시 일시 중단하십시오. 6웰 플레이트의 웰당 200-300 μL의 매트릭스가 요구된다. 오르가노이드는 상당히 높은 세포 밀도를 유지하기 위해 3에서 1개를 분할해야합니다.
- 약 5-10 μL의 매트릭스 방울에 오르가노이드를 6 웰 플레이트의 웰에 각각 플레이트. 37 °C에서 20-30 분 동안 인큐베이션 한 다음 팽창 배지 (OME)를 위에 추가합니다.
- 2-3일마다 매체를 변경합니다.
참고: 약 5-7 일, EM에서 성장 하는 organoids의 크기에 도달 100-200 μm 및 주입에 대 한 준비가. - 유기 체를 분화 하기 위해, 후 5-6 EM에서 일, 분화 매체를 변경 (DM) 조건 및 기생충을 주입 하기 전에 5-6 추가 일 동안 유지.
참고: 오르가노이드의 확장을 위해 오르가노이드를 조밀하게 플레이트하는 것이 좋습니다. 미세 주사의 경우, 6 웰 플레이트의 사용은 적은 밀도로 도금 된 오르가노이드와 함께 사용하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 6웰 플레이트의 3개의 웰에서 미세 주입을 위한 완전한 6웰 플레이트로 플레이트 오르가노이드를 넣습니다. 매트릭스는 장기간 보관을 위해 -20°C에서 유지되어야 하며 사용하기 전에 4°C 또는 얼음위에 해동되어야 합니다. 폐 오르가노이드의 팽창은 유사한 방식으로 수행되지만 폐 오르가노이드 특이적 매성분(표1)8을 사용한다.
- 세포외 기질에서 3D 배양물의 오르가노이드를 37°C에서 유지합니다(재료 표참조). OME(확장 미디어)를 상단에 추가하고 매일 새로 고칩니다.
4. 오가노이드 루멘에 난모낭/스포로조이트 의 미세 주입
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3D 오르가노이드의 정점 측으로 기생충을 미세 주입(그림 2).
- 마이크로파이펫 풀러를 사용하여 직경 1mm의 유리 모세혈관을 준비합니다.
참고: 마이크로파이펫 풀러에 사용되는 설정(재료 표참조)은 열 = 663, 당김 = 100, 속도 = 200, 시간 = 40 ms. 설정은 특정 기계에 대한 사용자 지침에 따라 조정되어야 합니다. - 모세관 의 끝을 집게로 자른다. 모세관 말단의 크기/직경은 약 9-12 μm를 측정합니다. 이것은 난모낭 (4-5 μm 크기)의 쉬운 흐름을 가능하게합니다.
- 마이크로 로더 팁을 사용하여 모세 혈관을 난낭성 또는 스포로 조이트 현탁액으로 채웁니다.
- 난모낭이 채워진 모세관을 마이크로 인젝터에 로드합니다.
- 5배 배율로 반전된 현미경으로 각 오르가노이드에 100-200 nL 현탁액을 마이크로주사하여 압력을 일정하게 유지합니다. 미세 주입 후, 매일 OME 또는 OMD로 매체를 새로 고치고 플레이트를 37°C에서 유지합니다.
참고: 우리는 미세 주입을 위해 마이크로 매니퓰레이터를 사용하지 않습니다. 모든 샘플에서 동일한 주입을 보장하기 위해 전체 실험에 동일한 모세관을 사용하는 것이 좋습니다.
- 마이크로파이펫 풀러를 사용하여 직경 1mm의 유리 모세혈관을 준비합니다.
5. 오르가노이드의 면역형광 염색
- 차가운 F12+++를 함유한 15mL 튜브에 P1000 파이펫으로 오가노노이드(1-2 x 24 웰)를 수집합니다.
- 펠릿 오르가노이드를 300 x g에서 2분 간, 펠릿을 방해하지 않고 상류를 제거하고 펠릿을 나머지 부피로 부드럽게 피펫으로 피펫합니다.
- PBS에 2% 파라포름알데히드의 5 mL를 추가합니다. 오르가노이드가 벽에 달라붙지 않도록 튜브를 반전시키지 마십시오. 오르가노이드가 튜브 바닥에 정착하고 실온에서 하룻밤 동안 4 °C 또는 1 시간에서 고정되도록하십시오.
- 고정제를 제거하고 10 mL의 투과 버퍼를 추가합니다(PBS에서 0.2% 트리톤).
- 실온에서 튜브를 20 분 동안 회전시십시오 (이것은 모든 오르가노이드가 현탁액에 남아 있는지 확인합니다).
- 오르가노이드를 300 x g에서 2 분 동안 펠렛한 다음 상류자를 버립니다.
- 500 μL의 차단 용액에서 오르가노이드를 부드럽게 다시 중단하고 (재료 표참조) 2 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김.
- 셰이커에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. 유기체가 중력에 의해 튜브의 바닥에 정착할 수 있도록 하십시오. 차단 용액을 1차 항체 용액(재료 표참조)으로 교체하고 실온에서 또는 4°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.
- 0.1% 트웬을 함유한 PBS로 3x를 씻으소서. 오르가노이드가 매번 정착하고 상류자를 제거하십시오.
- 이차 항체 용액을 추가하고 (재료 표참조) 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
- 0.1% 트웬을 함유한 PBS로 3x를 씻으소서. 세 번째 세척 후 PBS 50 μL을 둡니다.
- 슬라이드에 PBS의 50 μL에 매달린 오르가노이드를 피펫팅하여 슬라이드에 장착한다. 여분의 PBS를 제거하고 장착 제 한 방울을 추가하고 (재료 표참조) 덮개 슬립을 맨 위에 추가하십시오. 측면을 매니큐어로 밀봉하고 말리십시오.
6. 오가노이드에서 난모낭의 분리
- 오르가노이드 루멘으로부터 새로 형성된 난모낭을 분리합니다.
참고:난모세포는 난모분리 키트를 사용하여 면역자기 분리에 의해 오르가노이드로부터 분리된다(재료 표)을 아래와 함께 수정할 수 있습니다. 단부 난모낭은 면역형광및 전자현미경검사법에 의해 분석될 수 있다.- OMD에서 5-7일 동안 유지되고 감염되지 않고 1일 동안 감염되고 5일 동안 감염된 분화 된 오르가노이드로 시작합니다. 처음 두 개를 네거티브 컨트롤로 사용합니다.
참고: 우리는 분화한 오르가노이드가 폐 또는 확장장 오르가노이드10보다더 많은 난모낭을 생성한다는 것을 발견했습니다. - 15 mL 원심 분리튜브에 오르가노이드를 수집합니다. 3,000 x g 및 10 °C에서 20 분 동안 오르가노이드를 원심 분리합니다.
참고: 이 고속은 파손 될 수있는 오르가노이드에서 oocysts가 손실되지 않도록하는 데 필요합니다. - 오르가노이드 매체를 제거하고 5 mL의 물로 교체하십시오.
- 화재 광택 유리 파스퇴르 파이펫으로 반복 활발한 파이펫팅으로 오르가노이드를 방해하십시오.
- 덩어리가 보이면 오르가노이드 현탁액을 유리 균질화로 옮기고 오르가노이드가 잘 중단 될 때까지 균질화하십시오. dounce 균질화는 난모낭에 영향을 미치지 않습니다.
- 눈에 보이는 덩어리가 없는 경우 oocyst 격리 키트에서 버퍼 A 5mL를 추가합니다. 혼합한 다음 항 oocyst IgM으로 코팅된 자기 구슬의 120 μL을 추가합니다.
- 로커 플랫폼에서 연속 혼합하여 실온에서 2 시간 동안 셀 현탁액과 자기 구슬을 배양합니다.
- 인큐베이션이 끝나면 세포와 구슬이 들어있는 튜브를 15 mL 튜브용으로 설계된 자기 분리 랙에 놓습니다.
- 튜브를 자기 분리 랙에서 수동으로 3분 동안 회전시다. 구슬은 자석 옆에 있는 튜브 의 측면에 부착됩니다.
- 조심스럽게 10 mL 파이펫으로 구슬에서 상류를 제거하십시오. 완충B의 450 μL에서 비드를 재중단하고 1.5 mL 의 미세원원지 튜브로 옮김을 옮김.
참고: 난모낭의 분리가 확인될 때까지 상급체를 유지하십시오. - 남은 구슬과 난모낭을 수집하려면 완충B 450 μL로 15 mL 튜브를 세척하고 미세 원심 분리튜브의 자기 구슬에 이 세척을 추가하십시오.
- 6.1.11 단계를 한 번 더 반복합니다. 모든 구슬과 포획된 난모낭은 이제 미세 원심 분리관으로 옮겨져야 합니다.
- 마이크로원심분리튜브를 보관하도록 설계된 자기 분리 랙에 미세원심분리튜브를 놓습니다.
- 자기 분리 랙에서 튜브를 손으로 3분 동안 돌이십시오.
- 조심스럽게 새로운 튜브에 파이펫과 상급을 제거합니다.
참고: 난모낭의 분리가 확인될 때까지 상급체를 유지하십시오. - 자기 분리 랙에서 자기 비드 및 난모낭이 들어있는 미세 원심 분리 튜브를 제거합니다.
- 자기 구슬에 0.1 N HCl의 100 μL을 추가하여 비드에서 난모낭을 용해시다. 30 초 동안 소용돌이.
참고: 소용돌이는 최대 속도보다 약간 작게 설정해야 합니다. - 실온에서 10 분 동안 0.1 N HCl에서 구슬을 배양합니다.
- 다시 소용돌이. 그런 다음 튜브를 자기 분리 랙에 다시 놓습니다. 구슬이 튜브의 측면에 부착 될 때까지 기다린 다음 새로운 미세 원심 분리튜브에 상급을 전송합니다.
- 6.1.17에서 6.1.19단계를 반복하고 두 번째 용출액과 첫 번째 용출을 결합합니다.
- 1 N NaOH의 20 μL, 또는 1 M Tris, pH 8과 같은 다른 중화 완충액으로 용출액을 중화시다.
- 난모낭아를 세려면, 10 μL의 용리수용액을 가지고, 10 μL의 난모낭염 특이적 항체와 결합하고 (재료 표참조) 및 혈세포계에 형광 난모낭을 계산하십시오.
참고: 분리된 난모낭은 4°C에서 저장되거나 면역형광 또는 전자 현미경 이미징을 위해 즉시 사용될 수 있다.
- OMD에서 5-7일 동안 유지되고 감염되지 않고 1일 동안 감염되고 5일 동안 감염된 분화 된 오르가노이드로 시작합니다. 처음 두 개를 네거티브 컨트롤로 사용합니다.
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Representative Results
여기에 제시된 프로토콜은 미세 주입을 위한 준비된 난모낭 및 포자화염(그림 1A)의효율적인 정제 귀착됩니다. excystation 프로토콜은 oocysts의 대략 70-80%에서 sporozoites의 방출 귀착됩니다, 그러므로 3 μm 필터를 통해 나머지 oocysts 및 껍질을 걸레질하는 것이 필수적입니다. 여과 결과 거의 100% 스포로 조이트 정제(그림 1B). 더욱이, 녹색 염료의 추가는 모든 오르가노이드의 주입을 보장하고 주입 된 오르가노이드의 시각화를 허용 적어도 24 주입 후 시간(그림 2B).
난모낭과 포자형의 준비를위한 이러한 프로토콜은 간단하고 수년 동안 사용되어 왔므로 치료 된 난모 낭종 및 정제 된 포자화물이 실행 가능하고 전염성이 있을 것으로 예상됩니다. 그러나, 우리의 연구 결과에서는, 우리는 excystation 프로세스가 포자조제 또는 oocysts를 손상하지 않았다는 것을 확인하기 위하여 주사 전자 현미경 검사법을 이용했습니다(그림 2A)10. 유기성 루멘에 동일한 양의 난모낭을 주사하면 간단한 현미경이미징(도 2C)에의해 육안으로 확인할 수 있다. 우리가 설명한 대로 감염한 오르가노이드의 부분은 정량적인 PCR에 의하여 기생충 전파를 확인하기 위하여 설치되어야 합니다10.
기생충 수명 주기를 통해 진행은 전송 전자 현미경 검사법에 의한 감염 후 감염 및 분석 또는 4′,6-diamidino-2-phenylindole와 결합된 면역 형광에 의하여 다른 시점에서 감염된 오르가노이드의 수집에 의해 가시화될 수 있습니다. DAPI) 기생충 핵의 염색10. 예를 들어, gp40 및gp15 17과 같은 메로조이트 표면 항원항체는 메론트 단계를 식별하는데 사용될 수 있다; 타입 I 메론트는 8개의 핵 및 타입 II 메론, 4 핵10을가질 것이다. 최근에는 trophozoites, merozoites, 타입 I 대 II 메론, 및 매크로가몬트에 특이적인 단일 클론 항체의 패널이18로이용 가능해지고 있다. 이 항체는 또한 organoids에 있는 그것의 각종 생활 주기 단계를 통해 기생충의 진행을 표시에 아주 효과적일 것입니다.
면역형광 분석실험은 또한 크립토스포리듐에의해 감염된 세포 모형을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이것은 호흡기 cryptosporidiosis에 관하여 아주 작은 알려지지 않기 때문에 기도 organoids에서 보는 것이 특히 중요했습니다, 기생충을 위한 정확한 숙주 세포는 알려지지 않았습니다. 우리는 크립토스포리듐-감염된오르가노이드에 대한 면역형광 분석, 클럽 세포에 대한 마커인 CC10을 공동 국소화하고 크립토스포리듐이 CC10-음성 및 양성 세포 모두에 감염되었다는 것을 발견했습니다(그림3). 이러한 결과는 우리가 기도 오르가노이드10에서분비 및 비분비 세포를 감염시키는 Cryptosporidium을 관찰하는 TEM에 의해 확증되었다.
분화 한 오르가노이드가 5 일 동안 감염된 후, 생성되는 oocysts의 상당수가 있어야합니다. 우리의 손에, 1개의 6 웰 격판덮개에서 organoids의 감염은 oocyst 특정 항체로 표지하여 혈세포계에 쉽게 확인되고 계산될 수 있던 대략 4000의 난모낭을 산출했습니다. 난모낭에 있는 4개의 포자조화물의 존재는 접착 슬라이드에 난모세포의 일부를 건조하고, 메탄올로 고정하고, 난모포 특이적 항체와 DAPI 염색을 결합함으로써 확인할 수있었다(도 4). 두꺼운 벽난모낭생가의 생산검증은 TEM 분석10에의해 이루어질 수 있다.
그림 1: 크립토스포리듐 난낭산및 포자화의 준비 및 정제. (A)난모낭및 스포로조이트 감염에 사용되는 방법의 개략적 표현. (B)난모낭의 체외 외전을 보여주는 이미지. 비외 난모세포와 껍질의 여과는 포자화제의 정제 된 용액을 제공합니다. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유기체 내황에 난모낭의 미세 주입. 이 그림은 Heo 등 에서수정되었습니다. 10. (A)난모낭 및 포자화물의 주사 전자 현미경 검사법 (SEM) 이미지. (B)난모낭을 주입한 오르가노이드를 보여주는 이미지. 녹색 염료는 각 오르가노이드의 주입을 시각화하는 것을 돕고 적어도 24 시간 이상 지속됩니다.(C)난모낭을 주입한 오르가노이드의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 크립토스포리듐-감염된기도 오르노이드의 면역형광 이미지. 뮤신은 오르가노이드의 루멘에서 항점5 항체(적색)로 표지되고, 클럽 세포는 항CC10(노란색)으로 표지되고, 크립토스포리듐은 난모세포 특이적 항체(녹색)로 검출되고, 세포 핵은 DAPI(청색)로 염색된다. 패널 B는 패널 A의 사각형에 표시된 영역의 확대입니다.
그림 4: 분화된 장 오르가노이드로부터 분리된 난모낭의 면역형광 이미지. 난모낭벽은 녹색의 난모포특이적 항체로 표지되고 4개의 포자핵은 DAPI(파랑)로 가시화되어 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
장 및 기도 오르가노이드에서 Cryptosporidium 기생충의 문화는 호스트 기생충 상호 작용을 연구하는 정확한 모형을 제공합니다10 그러나 또한 많은 그밖 응용이 있습니다. 예를 들어, 유전자 변형 Cryptosporidium 기생충을 선택하고 전파하는 현재의 방법은 생체 내 감염에 필수적인 수정이있는 기생충의 격리를 허용하지 않는 마우스19의 통과가 필요합니다. 크립토스포리듐의 오르가노이드 배양은 이 절차에 대한 대안을 제공합니다. 그러나, 우리는 전기 포자이트가 함께 뭉쳐마이크로파이펫을 막는다는 것을 주의했습니다. 유전자 변형 기생충을 선택하는 것을 목적으로, 오르가노이드는 형질감염된 포자화체에 감염을 허용하고 결과적으로 선택의 2 차원 조건에서 2 차원 형식으로 콜라겐 코팅 트랜스웰에 성장 할 수있다 유전자 변형 된 난모 낭종. 트랜스웰은 상피 및 바삭한 표면 모두에 접근할 수 있으며 장시간 동안 안정적입니다.
현재, 우리는 암 조직 유래 오르가노이드 (미공개 데이터)에 대한 약물의 높은 처리량 스크리닝을위한 2 차원 형식으로 오르가노이드를 배양합니다. 이 오르가노이드 배양 방법은 또한 유전자 변형 루시퍼라제 태그크립토스포리듐 균주(19)를사용하여항크립토스포리듐 약물의 시험을 위해 적응될 수 있다. 더욱이, 감염이 단단히 동기화되지 않더라도, 포자형염을 가진 organoids의 감염은 약이 특정 생활 주기 단계에 대하여 그들의 효험을 위해 시험될 수 있는 생활 주기의 충분한 동기화를 제공합니다.
오르가노이드 공동 배양 시스템은 현재 미생물체 및 면역세포(20)와같은 숙주 시스템의 다른 측면을 고려하여 개발되고 있다. 따라서, 기생충과 숙주 세포, 면역 세포 및 미생물 간의 상호 작용을 해부하는 능력은 곧 시험관 내에서 가능할 것이다. 크립토스포리듐의 유전자 조작도19일가능하며, 크립토스포리듐과 오르가노이드 배양물의 형광 리포터 균주의 조합은 감염된 세포의 단일 세포 염기서열 분석 도구를 제공할 것이며, 더욱 구체적으로 는 기생충의 특정 단계에 감염된 세포의 단일 세포 시퀀싱.
여기에 설명된 실험의 성공은 난모낭의 생존 력과 감염성에 크게 의존합니다. Cryptosporidium oocysts의 다른 배치는 수용 체 속도 및 호스트 세포를 감염 하는 능력에 광범위 하 게 다를 수 있습니다. 포자화물의 충분한 수율은 좋은 흥분 속도에 의존하고 흥분 율은 항상 감염과 상관관계가 없습니다. 감염 또는 가난한 excystation의 낮은 수준의 oocysts의 특정 배치와 관찰 하는 경우, 시간과 노력 oocyst 의 새로운 많은 oocysts를 획득 하 여 저장 될 수 있습니다., 또는 배양 시간을 길게 시도 하는 대신.
오르가노이드 배양 배지는 매일 번갈아 가며 재충전해야 합니다. 오르가노이드 문화의 이전 구절을 사용하는 것이 좋습니다. 오르가노이드가 기생충의 생존력을 크게 결정하기 때문에 오르가노이드가 나중에 구절에서 분화하기 시작하면 새로운 유기병 의 유리병을 해동하는 것이 중요합니다. 감염 후, 오르가노이드 매체는 미디어에 독성 물질이 축적되지 않도록 매일 새로 고쳐야합니다.
크립토스포리듐의 오르가노이드 배양은 기생충이 무기한 전파될 수 없다는 점에서 제한적이며, 감염은 28일10일에걸쳐 3개의 구절 후에 나온다. 우리가 기술한 것과 같은 마우스 실험을 위한 충분한 오르가노이드의 미세 주입은 시간 소모적이고 물리적으로 부담스러울 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 현재까지, 인간 감염을 완전히 대표하는 시험관 내 시스템에서 완전한 수명 주기를 가능하게 하는 다른 방법은 없으며, 숙주 병원체 상호작용의 탐사를 가능하게 하는 어떠한 배양 시스템도 설명되지 않았다. 호흡기 감염. Cryptosporidium의 오르가노이드 문화는 이전에는 Cryptosporidium에서불가능했던 호스트 기생충 상호 작용으로 탐험의 길을 열어주는 강력한 새로운 도구를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 동물 및 비교 생물 의학 의학교, 농업 및 생명 과학 대학, 애리조나 대학, 투손, 애리조나, 미국, oocyst 생산 및 분석으로 우리를 도와 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 고립된 유기체 난소의 TEM 준비 그리고 화상 진찰을 위한 워싱턴 주립 대학에 프란체증 현미경 검사법 및 화상 진찰 센터 및 D.L. Mullendore 감사합니다.
D.D.는 네덜란드 과학 연구 기구(NWO-ALW, 016.Veni.171.015)로부터 VENI 보조금을 받는 사람입니다. I.H.는 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO-ALW, 863.14.002)의 VENI 보조금 수혜자이며 유럽 위원회 (제안 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF)의 마리 퀴리 펠로우십에 의해 지원되었습니다. 이러한 결과로 이어지는 연구는 ERC 고급 보조금 협정 제 67013호에 따라 유럽 연구 위원회로부터 자금을 받았으며 R21 AT009174에서 RMO에 따라 NIH NIAIH로부터 자금을 받았습니다. 이 작품은 네덜란드 암 학회에 의해 부분적으로 자금을 조달하고 네덜란드 암 학회에서 보조금에 의해 지원된 Oncode 학회의 일부입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5 µM |
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* - cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5 µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make up to 100 mL |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
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