Summary
Bij deze methode kwantificeren we de bindende affiniteit van RNA-bindende eiwitten (rbp's) naar verwant en niet-verwant binding sites met behulp van een eenvoudige, Live, reporter assay in bacteriële cellen. De test is gebaseerd op onderdrukking van een reporter-gen.
Abstract
In de initiatie stap van eiwit vertaling bindt het ribosoom aan het initiatie gebied van de mRNA. Initiatie van de vertaling kan worden geblokkeerd door binding van een RNA bindend eiwit (RBP) aan de initiatie regio van de mRNA, die interfereert met ribosoom binding. In de gepresenteerde methode gebruiken we dit blokkerende fenomeen om de bindende affiniteit van rbp's te kwantificeren naar hun verwant en niet-verwant binding sites. Om dit te doen, voegen we een test binding site in het initiatie gebied van een reporter mRNA en induceren de uitdrukking van de test RBP. In het geval van RBP-RNA binding, observeerden we een sigmoïdale onderdrukking van de reporter expressie als een functie van RBP-concentratie. In het geval van geen affiniteit of een zeer lage affiniteit tussen de bindingsplaats en de RBP, werd geen significante onderdrukking waargenomen. De methode wordt uitgevoerd in levende bacteriële cellen, en vereist geen dure of verfijnde machines. Het is nuttig voor het kwantificeren en vergelijken van de bindende verwantschap van verschillende Rbp's die functioneel zijn in bacteriën tot een set van ontworpen binding sites. Deze methode kan ongeschikt zijn voor binding sites met een hoge structurele complexiteit. Dit is te wijten aan de mogelijkheid van onderdrukking van de ribosomale initiatie door complexe mRNA-structuur in de afwezigheid van RBP, wat zou resulteren in een lagere basale reporter genexpressie, en dus minder waarneembare reporter onderdrukking bij RBP binding.
Introduction
RNA binding protein (RBP)-gebaseerde post-transcriptionele regulatie, specifiek karakteriseren van de interactie tussen Rbp's en RNA, is in de afgelopen decennia uitgebreid bestudeerd. Er zijn meerdere voorbeelden van translationele down-regulatie in bacteriën afkomstig van rbps remming, of rechtstreeks concurreren met, ribosoom binding1,2,3. Op het gebied van de synthetische biologie, RBP-RNA interacties ontstaan als een belangrijk instrument voor het ontwerp van op transcriptie gebaseerde genetische circuits4,5. Daarom is er een toename van de vraag naar karakterisering van zulke RBP-RNA-interacties in een cellulaire context.
De meest voorkomende methoden voor het bestuderen van eiwit-RNA-interacties zijn de elektroforetisch Mobility Shift assay (EMSA)6, die beperkt is tot in vitro-instellingen, en verschillende pull-down testen7, inclusief de clip methode8,9 . Hoewel dergelijke methoden de ontdekking van de Novo RNA binding sites mogelijk maken, lijden ze aan nadelen zoals arbeidsintensieve protocollen en dure Deep sequence-reacties en kunnen ze een specifiek antilichaam voor RBP-pull-down vereisen. Vanwege de gevoelige aard van RNA in zijn omgeving, kunnen veel factoren invloed hebben op RBP-RNA-interacties, waarbij het belang van het ondervragen van RBP-RNA-binding in de cellulaire context wordt benadrukt. Zo hebben wij en anderen aanzienlijke verschillen aangetoond tussen de RNA-structuren in vivo en in vitro10,11.
Op basis van de aanpak van een eerdere studie12, hebben we onlangs10 aangetoond dat bij het plaatsen van vooraf ontworpen binding sites voor de capside rbps van de bacteriofagen ga13, ms214, PP7-15en qβ16 in de Vertaal initiatie regio van een reporter mRNA, reporter expressie wordt sterk onderdrukt. We presenteren een relatief eenvoudige en kwantitatieve methode op basis van dit repressie fenomeen om de affiniteit tussen Rbp's en hun corresponderende RNA bindingsplaatss in vivo te meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van het systeem
- Ontwerp van binding-site plasmiden
- Ontwerp de binding site cassette zoals afgebeeld in Figuur 1. Elke minigene bevat de volgende delen (5 ' tot 3 '): Eagl restriction site, ∼ 40 basissen van het 5 ' einde van het kanamycine (kan) Verzets gen, pLac-Ara Promoter, ribosoom binding site (RBS), aug van het mcherry gen, een spacer (δ), een RBP binding site, 80 bases van de 5 ' van het mCherry-gen en een ApaLI-beperkings site.
Opmerking: Om het succespercentage van de test te verhogen, ontwerpt u drie binding-site cassettes voor elke bindingsplaats, met spacers bestaande uit ten minste één, twee en drie basissen. Zie representatieve resultaten sectie voor verdere richtlijnen.
- Ontwerp de binding site cassette zoals afgebeeld in Figuur 1. Elke minigene bevat de volgende delen (5 ' tot 3 '): Eagl restriction site, ∼ 40 basissen van het 5 ' einde van het kanamycine (kan) Verzets gen, pLac-Ara Promoter, ribosoom binding site (RBS), aug van het mcherry gen, een spacer (δ), een RBP binding site, 80 bases van de 5 ' van het mCherry-gen en een ApaLI-beperkings site.
- Klonen van binding site plasmiden
- Bestel de binding-site cassettes als dubbel-streng DNA (dsDNA) minigenes. Elke minigene is ∼ 500 BP Long en bevat een Eagl restrictie plaats en een ApaLI restrictie plaats aan respectievelijk 5 ' en 3 ' uiteinden (zie stap 1.1.1).
Opmerking: In dit experiment werden mini-genen met de helft van het kanamycine gen gelast om de screening op positieve kolonies te vergemakkelijken. Echter, Gibson assembly17 is hier ook geschikt, in welk geval de binding site kan worden besteld als twee kortere complementaire enkel-streng DNA oligos. - Dubbel-verteren zowel de mini-genen als de doel vector met Eagl-HF en apali door het beperkings protocol18en de kolom zuiveren19.
- Ligate de verteerde minigenes aan de binding-site backbone met de rest van de mCherry reporter gen, terminator, en een kanamycine resistentie Gene20.
- Transformeer de ligatie oplossing in Escherichia coli top10 cellen21.
- Identificeer positieve transformanten via Sanger-sequencing.
- Ontwerp een primer 100 basissen stroomopwaarts naar de regio van belang (Zie tabel 1 voor primer sequenties).
- Miniprep een paar bacteriële kolonies22.
- Bereid 5 μL van een 5 mM oplossing van de primer en 10 μL van het DNA bij een concentratie van 80 ng/μL.
- Stuur de twee oplossing naar een handige faciliteit voor Sanger-sequencing23.
- Bewaar gezuiverde plasmiden bij-20 °C, en bacteriële stammen als glycerol voorraden24, zowel in de 96-well formaat. DNA zal vervolgens worden gebruikt voor de omzetting in E. coli top10 cellen met een van de vier fusie-RBP plasmiden (zie stap 1.3.5).
- Bestel de binding-site cassettes als dubbel-streng DNA (dsDNA) minigenes. Elke minigene is ∼ 500 BP Long en bevat een Eagl restrictie plaats en een ApaLI restrictie plaats aan respectievelijk 5 ' en 3 ' uiteinden (zie stap 1.1.1).
- Ontwerp en bouw van het RBP plasmide
Opmerking: Aminozuur en nucleotide sequenties van de vacht eiwitten die in deze studie worden gebruikt, staan vermeld in tabel 2.- Bestel de vereiste RBP-sequentie zonder stop codon als een op maat gemaakte dsDNA-minigene die geen stop codon heeft met beperkings sites aan de uiteinden (Figuur 1).
- Kloon de geteste RBP ontbreekt een stop codon onmiddellijk stroomafwaarts van een induceerbaar promotor en stroomopwaarts van een fluorescerende eiwit ontbreekt een start codon (Figuur 1), vergelijkbaar met de stappen 1.2.2-1.2.4. Zorg ervoor dat het RBP plasmide een ander gen met antibioticaresistentie bevat dan de binding-site plasmide.
- Identificeer positieve transformanten via Sanger-sequencing, vergelijkbaar met stap 1.2.5 (Zie tabel 1 voor primer-sequenties).
- Kies een positieve transformant en maak het chemisch-competent25. Bewaar als glycerol gezuiverde plasmiden bij-20 °C en glycerol voorraden van bacteriële stammen24 bij-80 °c in 96-goed platen.
- Transformeer de binding-site plasmiden (uit stap 1.2.6) opgeslagen in 96-put platen in chemisch-competente bacteriële cellen die al een RBP-mCerulean plasmide21. Om tijd te besparen, in plaats van het plateren van de cellen op Petri schalen, plaat ze met behulp van een 8-kanaals pipet op 8-Lane platen die Luria-Bertani (lb)26 agar met relevante antibiotica (kan en amp). Kolonies moeten in 16 uur verschijnen.
- Selecteer een enkele kolonie voor elke dubbele transformant en groeien 's nachts in LB medium met de relevante antibiotica (kan en amp) en opslaan als glycerol voorraden24 bij-80 °c in 96-goed platen.
2. experiment instellen
Opmerking: Het hier gepresenteerde protocol werd uitgevoerd met behulp van een robotsysteem met vloeistof behandeling in combinatie met een incubator en een plaat lezer. Elke meting werd uitgevoerd voor 24 inductor concentraties, met twee duplicaten voor elke stam + inductor combinatie. Met behulp van dit Robotic Systeem, gegevens voor 16 stammen per dag met 24 inductor concentraties werd verzameld. Als een dergelijk apparaat echter niet beschikbaar is of als er minder experimenten nodig zijn, kunnen deze gemakkelijk met de hand worden gedaan met behulp van een 8-kanaals multi-pipet en het protocol dienovereenkomstig aanpassen. Bijvoorbeeld, voorlopige resultaten voor vier stammen per dag met 12 inductor concentraties en vier tijdpunten werden op deze manier verworven.
- Bereid, vooraf, 1 L bioassay buffer (BA) door het mengen van 0,5 g Tryptone, 0,3 mL glycerol, 5,8 g NaCl, 50 mL 1 M MgSO4, 1 ml 10 x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer pH 7,4, en 950 ml dubbel gedestilleerd water (DDW). Het autoclaaf of steriel filter de BA-buffer.
- Kweek de dubbel-transformant stammen bij 37 °C en 250 rpm schudden in 1,5 mL LB met geschikte antibiotica (kanamycine in een eindconcentratie van 25 μg/mL en ampicilinein een eindconcentratie van 100 μg/mL), in 48-well platen, over een periode van 18 h (overnachting).
-
In de ochtend, maak de volgende voorbereidingen.
- Inductor plaat. In een schone 96-wells plaat, bereid putten met semi-arme medium (SPM) bestaande uit 95% BA en 5% LB26 in de incubator bij 37 °c. Het aantal putjes komt overeen met het gewenste aantal inductor concentraties. Voeg C4-HSL toe aan de putjes in de inductor plaat die de hoogste inductor concentratie (218 nM) zal bevatten.
- Program meer de robot in een serie verdund medium van elk van de hoogste concentratie putten in 23 lagere concentraties variërend van 0 tot 218 nM. Het volume van elke inductor verdunning moet voldoende zijn voor alle stammen (inclusief duplicaten).
- Terwijl de inductor verdunningen worden voorbereid, warme 180 μL SPM in de incubator bij 37 ° c, in 96-well platen.
- Verdun de nachtelijke stammen van stap 2,2 met een factor 100 door seriële verdunningen: eerst verdunnen met een factor 10 door 100 μL bacteriën te mengen met 900 μL SPM in 48-well Plates, en vervolgens opnieuw te verdunnen met een factor 10 door 20 μL van de verdunde oplossing in 180 μL voorverwarmde SPM, in 96-put platen geschikt voor fluorescerende metingen.
- Voeg de verdunde inductor van de inductor plaat toe aan de 96-put platen met de verdunde stammen volgens de uiteindelijke concentraties.
- Schud de 96-put-platen bij 37 °C gedurende 6 uur, terwijl de optische dichtheid wordt gemeten bij 595 nm (OD595), mcherry (560 Nm/612 nm) en mCerulean (460 nm/510 Nm) fluorescentie via een plaat lezer elke 30 minuten. Voor normalisatie doeleinden, meten van de groei van SMP zonder cellen toegevoegd.
3. voorlopige resultatenanalyse
- Kies voor elke dag van het experiment een tijdsinterval van logaritmische groei volgens de gemeten groeicurves, tussen de lineaire groeifase en de stationaire (T0, tFinal). Neem ongeveer 6 − 8 tijdpunten, terwijl de eerste en laatste metingen worden verwijderd om fout te voorkomen die is afgeleid van onnauwkeurigheid van exponentiële groei detectie (Zie Figuur 2a, bovenste paneel).
Opmerking: Gooi stammen die abnormale groeicurven of stammen vertonen waar de logaritmische groeifase niet kan worden gedetecteerd en herhaal het experiment. -
Bereken de gemiddelde genormaliseerde fluorescentie van mCerulean en de productiesnelheid van mCherry, van de ruwe gegevens van zowel mCerulean als mCherry fluorescentie voor elke inductor concentratie (Figuur 2a).
- Bereken genormaliseerde mCerulean als volgt:
waar Blank (mCerulean) is de mCerulean niveau [a.u.] voor medium alleen, blank (OD) is de optische dichtheid voor medium alleen, en mCerulean en OD zijn de mCerulean fluorescentie en optische dichtheidswaarden, respectievelijk. - Gemiddelde mCerulean over de verschillende tijdspunten (Figuur 2b, bovenste twee panelen) als volgt:
Wanneer #Time punten het aantal gegevens tijdpunten is dat in aanmerking wordt genomen, is T0 het tijdstip waarop de exponentiële groeifase begint, en t-finale het tijdstip waarop de exponentiële groeifase eindigt. - Bereken het percentage van de productie van mCherry (Figuur 2b, onderste twee panelen) als volgt:
waar mCherry (t) is het mCherry niveau [a.u.] op tijd t, OD is de waarde van de optische dichtheid, T0 is de tijd waarop de exponentiële groeifase begint, en tFinal is het moment waarop de exponentiële groeifase eindigt.
- Bereken genormaliseerde mCerulean als volgt:
- Plot ten slotte het mCherry-percentage van de productie als een functie van mCerulean, waardoor dosisrespons curven worden gebruikt als een functie van RBP-mCerulean Fusion fluorescentie (figuur 2c). Dergelijke plots vertegenwoordigen de productie van het reporter-gen als een functie van RBP-aanwezigheid in de cel.
4. dosisrespons functie-aanpassings routine en KRBP -extractie
- Onder de veronderstelling dat het ribosoom Vertaal cijfer met de RBP-binding constant is, model de mcherry-productiesnelheid als volgt (Zie figuur 2D, groene lijn):
waarbij [x] de genormaliseerde gemiddelde mcerulean fluorescentie is, berekend volgens EQ. 2, mcherry productiesnelheid is de waarde berekend volgens EQ. 3, kRBP is de relatieve binding affiniteit [a.u.], k niet-afhankelijk is het ribosoom tarief van vertaling met de RBP ongebonden, n is de cooperativiteit factor, en C is de basis fluorescentie [a.u.]. C, n, K niet-afhankelijken KRBP worden gevonden door de gegevens van de mcherry-productiesnelheid aan het model te monteren (EQ. 4). - Met behulp van data analysis software, voeren een passende procedure op percelen beeltenis van mCherry productiesnelheid als een functie van gemiddelde mCerulean (stap 3,3), en pak de pasvorm parameters volgens de formule in EQ. 4.
Opmerking: Alleen passende resultaten met R2 > 0,6 worden in aanmerking genomen. Voor die fits, KRBP fout is meestal in het bereik van 0,5% tot 20% van KRBP waarden, voor een 0,67 betrouwbaarheidsinterval, terwijl degenen met een hogere KRBP fout kan ook worden geverifieerd door het oog. - Normaliseer KRBP -waarden door de respectieve maximale waarde van gemiddeld mCerulean voor elke dosis-respons functie.
waarbij KRBP in [a.u.] de waarde is die wordt geëxtraheerd uit de aanpassingsprocedure in EQ. 4, en Max (gemiddeld mcerulean) is het maximale gemiddelde mcerulean-signaal [a. u] dat is waargenomen voor de huidige stam.
Opmerking: De normalisatie vergemakkelijkt de juiste vergelijking van het regelgevings effect over stammen door de afhankelijkheid van de specifieke maximale RBP-uitdrukkings niveaus te elimineren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gepresenteerde methode maakt gebruik van de concurrentie tussen een RBP en het ribosoom voor binding aan het mRNA-molecuul (Figuur 1). Deze competitie wordt weerspiegeld door het verminderen van mCherry niveaus als een functie van verhoogde productie van RBP-mCerulean, als gevolg van toenemende concentraties van inductor. In het geval van toenemende mCerulean fluorescentie, zonder significante veranderingen in mCherry, wordt een gebrek aan RBP-binding afgeleid. Representatieve resultaten voor zowel een positieve als een negatieve stam worden afgebeeld in Figuur 2. In Fig. 2aworden de OD-, mcherry-en mCerulean-kanalen gepresenteerd als een functie van de tijd en inductor over een bereik van vier uur, met t0 = 1 h en tFinal = 3,5 h. In Figuur 2bworden gemiddeld mCerulean fluorescentie (boven) en mcherry-percentage van de productie (bodem) gepresenteerd als een functie van inductor concentratie, voor de twee voorbeeld stammen. Zoals te zien is, vertonen de resultaten voor een positieve stam een duidelijk down-regelgevend effect in het mcherry-percentage van de productie (Figuur 2b, C), wat zich vertaalt in een significante niet-nulwaarde van KRBP (figuur 2D). Voor de positieve belasting leverde de aanpassingsprocedure de volgende waarden op: KRBP = 394,6 A.u., k niet-afhankelijk = 275,6, n = 2,1, C = 11,2 a.u. en R2 = 0,93. Na normalisering door de maximale mCerulean fluorescentie, was de KRBP -waarde 0,24. Voor de negatieve stam werd een gebrek aan uitgesproken respons waargenomen (figuur 2c) en werd er geen KRBP -waarde geëxtraheerd (figuur 2D).
In Figuur 3presenteren we de resultaten van deze test voor twee faag Coat rbps, PP7-en ms2, op verschillende gemuleerde binding sites, op verschillende locaties in het initiatie gebied van de mcherry mRNA. De resultaten worden ruwweg ingedeeld in drie soorten reacties (Figuur 3a): stammen die een down-regelgevend effect vertonen op een laag mCerulean-niveau, wat een lage KRBP -waarde weerspiegelt (hoge bindingsaffiniteit); stammen die een down-regulerend effect vertonen op tussenliggende of hoge mCerulean-niveaus, met een hoge KRBP -waarde (gemiddelde of lage affiniteit); en stammen exposeren geen afzonderlijke reactie op stijgende niveaus van mCerulean, weerspiegelen een hogere KRBP waarde dan de maximale RBP concentratie in de cel (geen detecteerbaar binding affiniteit). Afbeelding 3B presenteert de minimale KRBP -waarde berekend voor elke RBP − binding-site combinatie op basis van alle combinaties van de twee rbps en tien binding-sites op verschillende posities. De binding sites bevatten een negatieve controle (geen binding site), niet-overeenkomende binding sites en een positieve controle ― de native binding site voor elke RBP (PP7--WT voor PP7-Coat Protein [PCP], en MS2-WT voor MS2 Coat Protein [MCP]). De resultaten overeenkomen met de voorspellingen, omdat beide Rbp's een hoge affiniteit voor hun positieve besturingselementen en een niet-detecteerbaar binding affiniteit voor de negatieve besturingselementen presenteren. Bovendien, eerdere studies met behulp van deze twee rbps27,28 hebben geconstateerd dat ze orthogonaal, die duidelijk wordt overgebracht in de heatmap gepresenteerd: zowel MCP en PCP binden niet de inheemse site van de andere RBP. Bovendien, de gemuleerde binding sites presenteren wisselende resultaten, waarbij sommige bindende sites een vergelijkbaar niveau van affiniteit weergegeven als die van de oorspronkelijke site, zoals PP7--Mut-1, PP7--Mut-2, en MS2-Mut-3, terwijl anderen een aanzienlijk lagere affiniteit weergegeven, zoals PP7--Mut-3 en MS2-Mut-2. Zo presenteerde de assay een kwantitatieve in vivo meting van de bindingsaffiniteit van Rbp's, wat resultaten oplevert die vergelijkbaar zijn met die van eerdere experimenten met deze Rbp's.
Aangezien de test is gebaseerd op onderdrukking van het mCherry-gen, is een levensvatbaar mCherry-signaal vereist. Bij het ontwerpen van de binding site cassette zijn er dus twee ontwerpregels om in gedachten te houden. Eerst moet het open Lees frame (ORF) van de mCherry worden gehouden. Omdat de binding-site lengte kan variëren, kan het inbrengen in het gen leiden tot een verschuiving van een of twee basissen van de oorspronkelijke mCherry ORF. Voeg zo nodig (Fig. 4a) een of twee basissen onmiddellijk na de binding plaats in. Bijvoorbeeld, een binding site die 20-base lang is, met een δ van twee basissen, zal een toevoeging van 22 basissen opleveren voor het mCherry-gen. Om de ORF te houden, moeten we twee bases toevoegen, voor een totaal van 24 bases. De tweede Ontwerpregel is om inserties van stop Codons in de mCherry ORF te voorkomen. Sommige binding sites, zoals de MS2-Mut-2 (figuur 4b, inset), bevatten stop Codons wanneer ze in een of meer van de drie mogelijke orf's worden geplaatst. Een dergelijk voorbeeld wordt geïllustreerd in Fig. 4a, waar de binding site een stop codon bevatte die in-frame is met de MCHERRY ORF alleen wanneer er geen bases worden toegevoegd. Zoals te zien is in de dosis-responscurve voor die positie (figuur 4b), was de productiesnelheid van mcherry niet detecteerbaar, waardoor de bindingsaffiniteit niet kon worden gemeten.
Een kijkje bij figuur 4b toont het effect van de ruimte δ op de productie van mcherry. Bijvoorbeeld, voor δ = 4, was het basale productie percentage een factor van zes meer dan die voor δ = 5, waardoor een hoger plooi-onderdrukkings effect werd verzekerd. Voor δ = 14 waren de basale productieniveaus echter te laag om een down regulerend effect te observeren.
Afbeelding 1: overzicht van de stappen voor systeemontwerp en klonen. Illustratie van het cassette ontwerp voor de bindingsplaats plasmide (links) en RBP-mCerulean plasmide (rechts). De volgende stap is opeenvolgende transformaties van beide plasmiden in competente E. coli cellen, met RBP plasmiden eerst. Dubbel-transformanten worden vervolgens getest op hun mCherry expressieniveaus in toenemende inductor concentraties; Als de RBP bindt aan de bindingsplaats, dalen mCherry niveaus als een functie van mCerulean (grijze bubbel). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: analyseschema. A) driedimensionale (3D) plots die de onbewerkte od-niveaus (boven), mCerulean fluorescentie (midden) en mcherry fluorescentie (bodem) als functie van de tijd en inductor-concentratie afbeelden, voor een positieve belasting. B) boven: mCerulean steady-state expressieniveaus voor elke inductor concentratie wordt berekend door elk fluorescentie niveau te delen door de respectieve od en gemiddelden over alle waarden in de 2 − 3 h exponentiële groeitijd venster voor zowel de positieve (links) en negatieve (rechts) stammen. Bodem: mCherry productiesnelheid berekend volgens EQ. 3 voor tijd-punten 2 − 3 h na inductie. C) de productiesnelheid van mcherry die wordt uitgezet als een functie van gemiddelde mCerulean fluorescentie gemiddeld over twee biologische duplicaten voor twee stammen. Foutbalken zijn standaarddeviatie van zowel de productiesnelheid van mCherry als de gemiddelde mCerulean fluorescentie verkregen uit ten minste twee replicaten. D) geschikt voor KRBP met behulp van de aanpassings formule in EQ. 4, weergegeven voor de positieve stam (links), waarbij een specifieke bindende respons wordt tentoongesteld. Voor de negatieve stam (rechts) werd geen KRBP -waarde geëxtraheerd. Gegevens worden in tweevoud weergegeven. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Katz et al.10. Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve eindresultaten. A) genormaliseerde dosis-respons curves voor dertig verschillende stammen op basis van twee rbp's en tien binding sites op verschillende locaties. Er worden drie typen reacties waargenomen: hoge affiniteit, lage affiniteit en geen affiniteit. B) kwantitatieve KRBP -resultaten voor twee rbp's (MCP en PCP) met vijf verschillende bindingsplaats cassettes (vermeld). Alle RBP − binding-site stammen werden in tweevoud gemeten. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Katz et al.10. Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: voorbeeld ontwerp en resultaten voor MCP met een mutant binding site. A) ontwerp illustratie van de bindingsplaats cassettes op vier verschillende locaties. Cassette met inbegrip van de ribosoom binding site, start codon voor de mcherry, δ spacer bases, de binding site getest, een of twee bases om de ORF te handhaven, en de rest van het mcherry gen. Rode sterren duiden op een halte codon. B) dosisrespons curves voor MCP met een Mutante bindingsplaats op vier verschillende locaties. Inzet: de sequentie van de geteste gemuleerde binding plaats. De gepresenteerde resultaten zijn voor duplicaten van elke stam. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Naam | Locatie van de binidng site, A in AUG = 1 | Binding site Sequence (RBS voor besturingselementen) | Site: ATG naar tweede mCherry codon GTG Besturingselementen: RBS naar tweede mCherry codon GTG |
Bron |
| MS2_wt_d5 | 5 | acatgaggattacccatgt | een van de meest gesmokkelde bloemen | Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d6 | 6 | acatgaggattacccatgt | een van de meest gesmokkelde bloemen | Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d8 | 8 | acatgaggattacccatgt | een van de meest gesmokkelde bloemen cgtg |
Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d9 | 9 | acatgaggattacccatgt | een van de meest gesmokkelde discussies |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d8 | 8 | een van de meest | een van de meest gekade Gs |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d9 | 9 | een van de meest | een van de meest gesmokkelde bloemen Gs |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d8 | 8 | geaspte | een van de meest gekade Gs |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) G_d9 | 9 | geaspte | een van de meest gesmokkelde bloemen Gs |
Gen9 Inc. |
| MS2_struct_d9 | 9 | een van de meest gekken | een van de meest gekken. Gs |
Gen9 Inc. |
| MS2_struct_d8 | 8 | een van de meest gekken | een van de meest gekken van het bord Gs |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d5' | 5 | taaggagtttatatggaaaccctta | een van de meest bezigheid cttacgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d6' | 6 | taaggagtttatatggaaaccctta | een van de meest geaspte ccttagtg |
Twist Bioscience |
| PP7wt_d8' | 8 | taaggagtttatatggaaaccctta | een van de meest geaglijde schoenen acccttacgtg |
Twist Bioscience |
| PP7wt_d9' | 9 | taaggagtttatatggaaaccctta | een van de meest geaagde aacccttagtg |
Twist Bioscience |
| PP7_USLSBm_d6 | 6 | een van de meest geaagde | een van de meest gesmokkelde schoenen ggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USLSBm_d15 | 15 | een van de meest geaagde | een van de meest gesmokkelde tatggaaagggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d5 | 5 | taagggtttatatggaaaccctta | een van de meest bezigheid! ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d6 | 6 | taagggtttatatggaaaccctta | atggctaagggtttatatggaaacc cttatgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USs_d5 | 5 | taaggagttatatggaaccctta | een van de meest gemikt tagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USs_d6 | 6 | taaggagttatatggaaccctta | een van de meest gesmokkelde schoenen ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d1 | - | - | een van de meest gekken. Gs |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d4 | - | - | een van de meest gekken. gcgtg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d10 | - | - | een van de meest gekken. gcgccggcgtg |
Gen9 Inc. |
| Sequencing primer voor binding site cassettes | geaspte, de | Idt | ||
| Sequencing primer voor RBP cassettes | gcggcgctgggtctcatctaataa | Idt | ||
Tabel 1: bindende plaatsen en primers voor sequentiëren. Sequenties voor de binding sites en de binding site cassettes die in deze studie worden gebruikt, evenals de primers voor de sequentie reacties die gedetailleerd zijn in het Protocol (stappen 1.2.5.1 en 1.3.3).
| RBP-naam in dit werk | naam van bron organisme, eiwit | gen van het bron organisme | Bron organisme refseq | WT AA SEQ | wijzigingen van WT (en referenties) | de a-SEQ gebruikt in dit werk | NT SEQ gebruikt in dit werk |
| Mcp | Escherichia virus MS2 | Cp | NC_001417.2 | MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGVA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKVatqt VGGVELPVA AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG GEZWOM AIAANSGIY |
delF-G 1 V29I [1] ontleend aan addgene plasmide 27121 |
MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGIA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKG AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG GEZWOM AIAANSGIY |
ATGGCTTCTA ACTTTACTCA GTTCGTTCTC GTCGACAATG GCGGAACTGG CGACGTGACT GTCGCCCCAA GCAACTTCGC TAACGGGATC GCTGAATGGA TCAGCTCTAA CTCGCGTTCA CAGGCTTACA AAGTAACCTG TAGCGTTCGT CAGAGCTCTG CGCAGAATCG CAAATACACC ATCAAAGTCG AGGTGCCTAA AGGCGCCTGG CGTTCGTACT TAAATATGGA ACTAACCATT CCAATTTTCG CCACGAATTC GEKKEN CTTATTGTTA AGGCAATGCA AGGTCTCCTA AAAGATGGAA ACCCGATTCC CTCAGCAATC GCAGCAAACT CCGGCATCTAC |
| Pcp | Pseudomonas faag PP7- | Cp | NC_001628.1 | MSKTIVLSVGEA TRTLTEIQST ADRQIFEEKV GPLVGRLRLT ASLRQNGAKT AYRVNLKLDQ ADVVDCstsvc GElpkvrytq VWSHDVTIVA NSTEASRKSL YDLTKSLVAT SQVEDLVVNL VPLGR |
delF-G [2] ontleend aan addgene plasmide 40650 |
Van de schedel EATRTLTEIQ STADRQIFEE KVGPLVGRLR LTASLRQNGA KTAYRVNLKL DQADVVDSG LPKVRYTQVW SHDVTIVANS TEASRKSLYD LTKSLVATSQ VEDLVVNLVP LGR |
ATGCTAGCCTC CAAAACCATC GTTCTTTCGG TCGGCGAGGC TACTCGCACT CTGACTGAGA TCCAGTCCAC CGCAGACCGT CAGATCTTCG AAGAGAAGGT CGGGCCTCTG GTGGGTCGGC TGCGCCTCAC GGCTTCGCTC CGTCAAAACG GAGCCAAGAC CGCGTATCGC GTCAACCTAA AACTGGATCA GGCGGACGTC GTTGATTCCG GACTTCCGAA De GEKKEN ACTCAGGTAT GGTCGCACGA CGTGACAATC GTTGCGAATA GCACCGAGGC CTCGCGCAAA TCGTTGTACG ATTTGACCAA GTCCCTCGTC GCGACCTCGC AGGTCGAAGA TCTTGTCGTC AACCTTGTGC CGCTGGGCCGT |
| Verwijzingen: | |||||||
| 1. Peabody, D.S., Ely, K.R. beheersing van translationele onderdrukking door eiwit-eiwit interacties. Nucleïnezuren onderzoek. 20 (7), 1649 – 1655 (1992). | |||||||
| 2. Chao, J.A., Patskovsky, Y., almo, S.C., zanger, R.H. structurele basis voor de coevolutie van een virale RNA-eiwit complex. Natuur structuur &Amp; moleculaire biologie. 15 (1), 103 – 105, DOI: 10.1038/nsmb1327 (2008) | |||||||
Tabel 2: RBP-reeksen. Aminozuur en nucleotide sequenties van de vacht eiwitten gebruikt in deze studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in dit artikel beschreven methode vergemakkelijkt kwantitatieve in vivo meting van RBP-RNA bindingsaffiniteit in E. coli cellen. Het protocol is relatief eenvoudig en kan worden uitgevoerd zonder het gebruik van geavanceerde machines, en data-analyse is eenvoudig. Bovendien worden de resultaten onmiddellijk geproduceerd, zonder de relatief lange wachttijd in verband met de volgende generatie sequencing (NGS) resultaten.
Een beperking van deze methode is dat het alleen in bacteriële cellen werkt. Een eerdere studie12 heeft echter een onderdrukkings effect aangetoond met een soortgelijke aanpak voor de L7AE RBP in zoogdiercellen. Een extra beperking van de methode is dat het inbrengen van de binding site in de mCherry initiatie regio kan onderdrukken basale mCherry niveaus. Structurele complexiteit of hoge stabiliteit van de bindingsplaats kan interfereren met ribosomale initiatie, zelfs bij afwezigheid van RBP, resulterend in verminderde mCherry basale niveaus. Als de basale niveaus te laag zijn, zal de extra onderdrukking die wordt veroorzaakt door het verhogen van de concentraties van RBP niet waarneembaar zijn. In dat geval is het het beste om de binding site cassette te ontwerpen met de binding site nog in de initiatie regio, maar op de rand van de overgang van initiatie gebied naar rek gebied (δ in het bereik van 12 − 15 BP10,29). We hebben laten zien dat voor dergelijke δ waarden nog steeds een onderdrukkings effect kan worden waargenomen. Om de kans te vergroten dat de assay zal werken, ongeacht de structurele complexiteit, adviseren wij het uitvoeren van de assay op ten minste drie verschillende posities voor een bepaalde bindingsplaats.
Het belangrijkste nadeel van de methode in vergelijking met in vitro methoden, zoals EMSA, is dat de bindingsaffiniteit van RBP-RNA niet wordt gemeten in absolute eenheden van de concentratie van RBP, maar veeleer in termen van fusie-RBP-fluorescentie. Dit nadeel is een direct gevolg van de in vivo setting, die ons vermogen om de werkelijke concentraties van RBP te lezen beperkt. Dit nadeel wordt gecompenseerd door de voordelen van meten in de instelling in vivo. We hebben bijvoorbeeld verschillen in bindende verwantschappen gevonden bij het vergelijken van de resultaten van onze in vivo assay met eerdere in vitro en in situ testen. Deze verschillen kunnen voortvloeien uit discrepanties in de structuur van de mRNA-moleculen in vivo die voortkomen uit hun aanwezigheid in de cellen10,11,30,31. Dergelijke structurele verschillen kunnen leiden tot veranderingen in de stabiliteit van de gevouwen toestanden in vivo, die op hun beurt de RBP-binding stabiliseren of de-stabiliseren.
Omdat de methode relatief eenvoudig en goedkoop is, adviseren wij het uitvoeren van meerdere besturingselementen naast het eigenlijke experiment. Het uitvoeren van een negatieve controle, dat wil zeggen, een reeks die geen affiniteit heeft met de RBP heeft nog soortgelijke structurele functies, kan helpen voorkomen dat valse positieven die voortvloeien uit niet-specifieke interacties met de mRNA. In de getoonde representatieve resultaten waren de twee negatieve controles alleen het mCherry-gen (geen bindingsplaats) en de inheemse bindingsplaats van de andere RBP (d.w.z. PP7--WT voor MCP en MS2-WT voor PCP). Bovendien stellen we voor om een positieve controle te integreren (zoals een RBP en zijn eigen bindende site). Een dergelijke controle zal helpen bij het kwantificeren van de bindende affiniteit door een referentiepunt te presenteren, en om valse negatieven te voorkomen die voortvloeien uit een lage onderdrukking.
Ten slotte, voor degenen die een structureel perspectief van RBP-RNA binding willen verkrijgen, stellen wij voor om een selectieve 2 ′-hydroxyl acylering uit te voeren, geanalyseerd met een primer-uitbreidings volgorde (shape-SEQ)11,32,33 Experiment. SHAPE-SEQ is een NGS-benadering gecombineerd met chemische indringende van RNA, die kan worden gebruikt om de secundaire structuur van RNA en RNA-interacties met andere moleculen, zoals eiwitten, te schatten. In ons vorige werk voerden we een vorm-SEQ-experiment uit op een representatieve stam in zowel in vivo-condities34 als in vitro met gezuiverd recombinant eiwit10,35. In ons geval toonden de resultaten aan dat RBP-binding een veel breder segment van RNA beïnvloede dan eerder gerapporteerd voor deze RBPs in vitro36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project ontving financiering uit het I-CORE-programma van het plannings-en budgetterings Comité en de Israel Science Foundation (Grant nr. 152/11), Marie Curie re-integratie subsidie nr. PCIG11-GA-2012-321675, en van het Horizon 2020 onderzoeks-en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 664918-MRG-grammatica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
- Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
- Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
- Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
- Strein, C., Alleaume, A. -M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
- Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
- Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
- Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- NEB. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions. , Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018).
- Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol. , Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018).
- NEB. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202). , Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018).
- Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018).
- NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit. , Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Addgene. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018).
- NEB. Making your own chemically competent cells. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018).
- Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling. , Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018).
- Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
- Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
- Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
- Bernardi, A., Spahr, P. -F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).
