Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

Published: June 12, 2019 doi: 10.3791/59611
* These authors contributed equally

Summary

Bei dieser Methode quantifizieren wir die Bindungsaffinität von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) zu kognazierenden und nicht-kogatierten Bindungsstellen mit einem einfachen, live, Reporter-Assay in Bakterienzellen. Der Test basiert auf der Unterdrückung eines Reportergens.

Abstract

Im Initiationsschritt der Proteintranslation bindet das Ribosom an den Initiationsbereich der mRNA. Die Translationsinitiation kann durch Bindung eines RNA-bindenden Proteins (RBP) an den Initiationsbereich der mRNA blockiert werden, der die Ribosome-Bindung stört. In der vorgestellten Methode nutzen wir dieses Blockierungsphänomen, um die Bindungsaffinität von RBPs zu ihren kognitierten und nicht kognierten Bindungsstellen zu quantifizieren. Dazu fügen wir eine Testbindungsstelle im Initiationsbereich einer Reporter-mRNA ein und induzieren die Expression des Test-RBP. Bei der RBP-RNA-Bindung beobachteten wir eine sigmoidale Unterdrückung des Reporterausdrucks als Funktion der RBP-Konzentration. Bei no-affinity oder sehr geringer Affinität zwischen Bindungsseite und RBP wurde keine signifikante Repression beobachtet. Die Methode wird in lebenden Bakterienzellen durchgeführt und erfordert keine teuren oder ausgeklügelten Maschinen. Es ist nützlich für die Quantifizierung und den Vergleich zwischen den Bindungsaffinitäten verschiedener RBPs, die in Bakterien funktionsfähig sind, zu einer Reihe von entworfenen Bindungsstellen. Diese Methode kann für die Bindung von Standorten mit hoher struktureller Komplexität ungeeignet sein. Dies ist auf die Möglichkeit der Unterdrückung der ribosomalen Initiation durch komplexe mRNA-Struktur in Abwesenheit von RBP zurückzuführen, was zu einer niedrigeren Basalreporter-Genexpression und damit zu einer weniger beobachtbaren Reporterrepression auf DIE RBP-Bindung führen würde.

Introduction

Die RNA-bindende Protein-basierte posttranskriptionelle Regulation, speziell die Charakterisierung der Interaktion zwischen RBPs und RNA, wurde in den letzten Jahrzehnten ausgiebig untersucht. Es gibt mehrere Beispiele für translationale Down-Regulierung bei Bakterien, die von RBPs stammen, die Ribosombindung1,2,3hemmen oder direkt mit ihnen konkurrieren. Im Bereich der synthetischen Biologie entwickeln sich RBP-RNA-Wechselwirkungen zu einem bedeutenden Werkzeug für die Entwicklung von Transkriptionsbasierten genetischen Schaltkreisen4,5. Daher steigt die Nachfrage nach Charakterisierung solcher RBP-RNA-Wechselwirkungen im zellulären Kontext.

Die gebräuchlichsten Methoden zur Untersuchung von Protein-RNA-Wechselwirkungen sind der elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA)6, der auf In-vitro-Einstellungen beschränkt ist, und verschiedene Pull-Down-Assays7, einschließlich der CLIP-Methode8,9 . Während solche Methoden die Entdeckung von de novo RNA-Bindungsstellen ermöglichen, leiden sie unter Nachteilen wie arbeitsintensiven Protokollen und teuren tiefen Sequenzierungsreaktionen und erfordern möglicherweise einen spezifischen Antikörper für RBP-Pull-down. Aufgrund der anfälligen Natur der RNA für ihre Umgebung können viele Faktoren RBP-RNA-Wechselwirkungen beeinflussen, was die Bedeutung der Rekation der RBP-RNA-Bindung im zellulären Kontext unterstreicht. Zum Beispiel haben wir und andere signifikante Unterschiede zwischen RNA-Strukturen in vivo und in vitro10,11gezeigt.

Basierend auf dem Ansatz einer früheren Studie12, haben wir vor kurzem10 gezeigt, dass bei der Platzierung vorgefertigter Bindungsstellen für die Kapsid-RBPs aus den Bakteriophagen GA13, MS214, PP715und Q.16 in der ÜbersetzungInitiationsregion eines Reporters mRNA, Reporter Ausdruck wird stark unterdrückt. Wir präsentieren eine relativ einfache und quantitative Methode, basierend auf diesem Repressionsphänomen, um die Affinität zwischen RBPs und ihrer entsprechenden RNA-Bindungsstelle in vivo zu messen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Systemvorbereitung

  1. Design von Bindungs-Standort-Plasmiden
    1. Entwerfen Sie die Bindungsplatzkassette wie in Abbildung 1dargestellt. Jedes Minigen enthält die folgenden Teile (5' bis 3'): Eagl-Restriktionsstelle, 40 Basen des 5'-Endes des Kanamycin-Resistenzgens, pLac-Ara-Promotor, Ribosomenbindungsstelle (RBS), AUG des mCherry-Gens, ein Abstandsabstand , eine RBP-Bindungsstelle, 80 Basen des 5'-Ens des mCherry-Gens und einer ApaLI-Einschränkungsseite.
      HINWEIS: Um die Erfolgsrate des Assays zu erhöhen, entwerfen Sie drei Bindungs-Seitenkassetten für jede Bindungsstelle, mit Abstandshaltern, die aus mindestens einer, zwei und drei Basen bestehen. Weitere Richtlinien finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
  2. Klonen von Bindungsstellenplasmiden
    1. Bestellen Sie die Bindungsplatzkassetten als doppelsträngige DNA(dsDNA) Minigene. Jedes Minigen ist 500 bp lang und enthält eine Eagl-Einschränkungsseite und eine ApaLI-Einschränkungsstelle an den Enden 5' bzw. 3' (siehe Schritt 1.1.1).
      HINWEIS: In diesem Experiment wurden Minigene mit der Hälfte des Kanamycin-Gens bestellt, um das Screening auf positive Kolonien zu erleichtern. Allerdings eignet sich hier auch die Gibson-Baugruppe17, in diesem Fall kann die Bindungsstelle als zwei kürzere komplementäre einsträngige DNA-Oligos bestellt werden.
    2. Doppelverdauen Sie sowohl die Minigene als auch den Zielvektor mit Eagl-HF und ApaLI durch das Restriktionsprotokoll18und Spaltenreinigung19.
    3. Ligate die verdauten Minigene an das Bindungs-Standort-Rückgrat, das den Rest des mCherry-Reportergens, Terminator und ein Kanamycin-Resistenzgen20enthält.
    4. Verwandeln Sie die Ligationslösung in Escherichia coli TOP10 Zellen21.
    5. Identifizieren Sie positive Transformationsmittel über die Sanger-Sequenzierung.
      1. Entwerfen Sie eine Grundierung 100 Basen vor dem Interessengebiet (siehe Tabelle 1 für Primersequenzen).
      2. Miniprep ein paar Bakterienkolonien22.
      3. Bereiten Sie 5 l einer 5 mM-Lösung des Primers und 10 l der DNA bei 80 ng/l Konzentration vor.
      4. Senden Sie die beiden Lösungen an eine praktische Einrichtung für Sanger-Sequenzierung23.
    6. Speichern Sie gereinigte Plasmide bei -20 °C und Bakterienstämme als Glycerinbestände24, beide im 96-Well-Format. DIE DNA wird dann zur Umwandlung in E. coli TOP10-Zellen verwendet, die eines von vier Fusions-RBP-Plasmiden enthalten (siehe Schritt 1.3.5).
  3. Entwurf und Konstruktion des RBP-Plasmids
    HINWEIS: Aminosäure- und Nukleotidsequenzen der in dieser Studie verwendeten Mantelproteine sind in Tabelle 2aufgeführt.
    1. Bestellen Sie die erforderliche RBP-Sequenz ohne Stop-Codon als benutzerdefiniertes dsDNA-Minigen ohne Stop-Codon mit Restriktionsstellen an den Enden (Abbildung 1).
    2. Klonen Sie das getestete RBP ohne Stop-Codon unmittelbar nach einem induzierbaren Promotor und vor einem fluoreszierenden Protein ohne Startcodon (Abbildung 1), ähnlich den Schritten 1.2.2-1.2.4. Stellen Sie sicher, dass das RBP-Plasmid ein anderes Antibiotikaresistenzgen enthält als das Bindungs-Standort-Plasmid.
    3. Identifizieren Sie positive Transformationsmittel über sanger-Sequenzierung, ähnlich wie Schritt 1.2.5 (siehe Tabelle 1 für Primersequenzen).
    4. Wählen Sie ein positives Transformant und machen Sie es chemisch kompetent25. Als Glycerin-gereinigte Plasmide bei -20 °C und Glycerinbestände von Bakterienstämmen24 bei -80 °C in 96-Well-Platten lagern.
    5. Verwandeln Sie die in 96-Well-Platten gelagerten Bindungs-Standort-Plasmide (ab Schritt 1.2.6) in chemisch kompetente Bakterienzellen, die bereits ein RBP-mCerulean-Plasmid21enthalten. Um Zeit zu sparen, anstatt die Zellen auf Petrischalen zu beschichten, bedecken Sie sie mit einem 8-Kanal-Pipettor auf 8-spurigen Platten mit Luria-Bertani (LB)26 Agar mit relevanten Antibiotika (Kan und Amp). Kolonien sollten in 16 h erscheinen.
    6. Wählen Sie für jedes Doppel-Transformant eine einzelne Kolonie aus und wachsen Sie über Nacht im LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika (Kan und Amp) und lagern Sie als Glycerinbestände24 bei -80 °C in 96-Well-Platten.

2. Experiment-Setup

HINWEIS: Das hier vorgestellte Protokoll wurde mit einem Flüssigkeitshandling-Robotersystem in Kombination mit einem Inkubator und einem Plattenleser durchgeführt. Jede Messung wurde für 24 Induktorkonzentrationen mit zwei Duplikaten für jede Dehnung + Induktor-Kombination durchgeführt. Mit diesem Robotersystem wurden Daten für 16 Stämme pro Tag mit 24 Induktorkonzentrationen gesammelt. Wenn ein solches Gerät jedoch nicht verfügbar ist oder weniger Experimente erforderlich sind, können diese einfach von Hand mit einer 8-Kanal-Multipipetette durchgeführt werden und das Protokoll entsprechend anpassen. So wurden beispielsweise vorläufige Ergebnisse für vier Stämme pro Tag mit 12 Induktorenkonzentrationen und vier Zeitpunkten auf diese Weise ermittelt.

  1. 1 L Bioassaypuffer (BA) im Voraus durch Mischen von 0,5 g Trypton, 0,3 ml Glycerin, 5,8 g NaCl, 50 ml 1 M MgSO4,1 ml 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 und 950 ml Doppeldestilliertem Wasser (DDW) vorbereiten. Autoklav oder steriler Filter des BA-Puffers.
  2. Die doppeltransformierenden Stämme bei 37 °C und 250 Umdrehungen pro Minute in 1,5 ml LB mit geeigneten Antibiotika (Kanamycin in einer Endkonzentration von 25 g/ml und Ampicillin bei einer Endkonzentration von 100 g/ml) in 48-Well-Platten über einen Zeitraum von 18 h (Übernachtung) anbauen.
  3. Am Morgen die folgenden Vorbereitungen treffen.
    1. Induktorplatte. In einer sauberen 96-Well-Platte Brunnen mit halbarmem Medium (SPM) zubereiten, bestehend aus 95% BA und 5% LB26 im Inkubator bei 37 °C. Die Anzahl der Brunnen entspricht der gewünschten Anzahl von Induktorkonzentrationen. Fügen Sie C4-HSL zu den Brunnen in der Induktorplatte hinzu, die die höchste Induktorkonzentration (218 nM) enthalten.
    2. Programmieren Sie den Roboter, um das Medium von jedem der hochkonzentrierten Brunnen in 23 niedrigere Konzentrationen von 0 bis 218 nM zu verdünnen. Das Volumen jeder Induktorverdünnung sollte für alle Stämme (einschließlich Duplikate) ausreichen.
    3. Während die Induktorenverdünnungen vorbereitet werden, 180 l SPM im Inkubator bei 37 °C in 96-Well-Platten warm.
    4. Verdünnen Sie die Übernachtstämme von Schritt 2.2 um den Faktor 100 durch serielle Verdünnungen: zuerst um den Faktor 10 verdünnen, indem Sie 100 l Bakterien mit 900 l SPM in 48-Well-Platten mischen und dann um den Faktor 10 erneut verdünnen, indem 20 l aus der verdünnten Lösung in 180 l vorgewärmte SPM, in 96-Well-Platten geeignet für fluoreszierende Messungen.
    5. Fügen Sie den verdünnten Induktor von der Induktorplatte zu den 96-Well-Platten mit den verdünnten Stämmen entsprechend den Endkonzentrationen hinzu.
  4. Schütteln Sie die 96-Well-Platten bei 37 °C für 6 h, während Sie Messungen der optischen Dichte bei 595 nm (OD595), mCherry (560 nm/612 nm) und mCerulean (460 nm/510 nm) Fluoreszenz über einen Plattenleser alle 30 min. Messen Sie für Normalisierungszwecke das Wachstum von SMP ohne Zellen.

3. Vorläufige Ergebnisanalyse

  1. Wählen Sie für jeden Experimenttag ein Zeitintervall des logarithmischen Wachstums entsprechend den gemessenen Wachstumskurven zwischen der linearen Wachstumsphase und der stationären (T0, Tfinal). Nehmen Sie etwa 6 bis 8 Zeitpunkte, während Sie die erste und letzte Messung verwerfen, um Fehler zu vermeiden, die durch Ungenauigkeiten der exponentiellen Wachstumserkennung abgeleitet werden (siehe Abbildung 2A, oberes Panel).
    HINWEIS: Verwerfen Sie Stämme, die abnormale Wachstumskurven oder Dehnungen aufweisen, bei denen die logarithmische Wachstumsphase nicht erkannt werden konnte, und wiederholen Sie das Experiment.
  2. Berechnen Sie die durchschnittliche normalisierte Fluoreszenz von mCerulean und die Produktionsrate von mCherry aus den Rohdaten von mCerulean und mCherry Fluoreszenz für jede Induktorkonzentration (Abbildung 2A).
    1. Berechnen Sie normalisiertem mCerulean wie folgt:
      Equation 1
      wobei blank(mCerulean) die mCerulean-Ebene [a.u.] nur für Medium ist, blank(OD) die optische Dichte nur für Medium und mCerulean und OD die mCerulean-Fluoreszenz- bzw. optischedichte Dichtewerte sind.
    2. Durchschnittlicher mCerulean über die verschiedenen Zeitpunkte (Abbildung2B, zwei Top-Panels) wie folgt:
      Equation 2
      wobei #Time Punkte die Anzahl der berücksichtigten Datenzeitpunkte ist, T0 der Zeitpunkt, zu dem die exponentielle Wachstumsphase beginnt, und Tfinal der Zeitpunkt, zu dem die exponentielle Wachstumsphase endet.
    3. Berechnen Sie die mCherry-Produktionsrate (Abbildung2B, untere zwei Panels) wie folgt:
      Equation 3
      wobei mCherry(t) die mCherry-Ebene [a.u.] zum Zeitpunkt t, OD der optische Dichtewert, T0 der Zeitpunkt ist, zu dem die exponentielle Wachstumsphase beginnt, und Tfinal ist der Zeitpunkt, zu dem die exponentielle Wachstumsphase endet.
  3. Schließlich zeichnen Sie die mCherry-Produktionsrate als Funktion von mCerulean, wodurch Dosis-Antwort-Kurven in Abhängigkeit von RBP-mCerulean-Fusionsfluoreszenz erstellt werden (Abbildung 2C). Solche Plots stellen die Produktion des Reportergens als Funktion der RBP-Präsenz in der Zelle dar.

4. Dosis-Response-Funktion Fitting Routine und K RBP-Extraktion

  1. Unter der Annahme, dass die Ribosomrate der Übersetzung mit der RBP-Gebunden konstant ist, modellieren Sie die mCherry-Produktionsrate wie folgt (siehe Abbildung 2D,grüne Linie):
    Equation 4
    wobei [x] die normalisierte durchschnittliche mCerulean-Fluoreszenz ist, berechnet nach Eq. 2, mCherry Produktionsrate ist der Wert, der nach Eq. 3 berechnet wird, KRBP ist die relative Bindungsaffinität [a.u.], Kungebunden ist die Ribosomrate von Übersetzung mit dem RBP ungebunden, n ist der Kooperatoritätsfaktor, und C ist die Basisfluoreszenz [a.u.]. C, n, Kunboundund KRBP werden gefunden, indem die mCherry Produktionsratendaten an das Modell anpasst (Eq. 4).
  2. Mit Hilfe der Datenanalyse-Software führen Sie ein Anpassungsverfahren auf Diagrammen durch, die die mCherry-Produktionsrate als Funktion von gemittelten mCerulean (Schritt 3.3) darstellen, und extrahieren Sie die Anpassungsparameter gemäß der Formel in Eq. 4.
    HINWEIS: Berücksichtigt werden nur passende Ergebnisse mit R2 > 0,6. Für diese Passte, KRBP Fehler ist meist im Bereich von 0,5% bis 20% der K RBP-Werte, für ein 0,67 Konfidenzintervall, während diejenigen mit höheren KRBP Fehler kann auch durch Auge überprüft werden.
  3. Normalisieren Sie Die K-RBP-Werte um den jeweiligen Maximalwert von gemittelt emCerulean für jede Dosis-Wirkungs-Funktion.
    Equation 5
    wobei KRBP in [a.u.] der Wert ist, der aus dem Fitting-Verfahren in Eq. 4 extrahiert wird, und max (gemittelt mCerulean) das maximal gemittelte mCerulean-Signal [a.u], das für den aktuellen Stamm beobachtet wird.
    HINWEIS: Die Normalisierung erleichtert den korrekten Vergleich der regulatorischen Wirkung über Stämme hinweg, indem die Abhängigkeit von den jeweiligen maximalen RBP-Expressionsebenen beseitigt wird.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Die vorgestellte Methode nutzt den Wettbewerb zwischen einem RBP und dem Ribosom zur Bindung an das mRNA-Molekül (Abbildung 1). Dieser Wettbewerb spiegelt sich in sinkenden mCherry-Spiegeln als Funktion der erhöhten Produktion von RBP-mCerulean wider, aufgrund steigender Konzentrationen von Induktoren. Im Falle einer zunehmenden mCerulean-Fluoreszenz, ohne signifikante Änderungen in mCherry, wird ein Mangel an RBP-Bindung abgeleitet. Repräsentative Ergebnisse für eine positive und eine negative Belastung sind in Abbildung 2dargestellt. In Abbildung 2Awerden die Kanäle OD, mCherry und mCerulean als Funktion von Zeit und Induktor über einen Bereich von vier Stunden dargestellt, wobei T0 = 1 h und Tfinal = 3,5 h vorliegen. In Abbildung 2Bwerden die durchschnittliche mCerulean-Fluoreszenz (oben) und die mCherry-Produktionsrate (unten) als Funktion der Induktorkonzentration dargestellt, für die beiden Beispielstämme. Wie man sieht, zeigen die Ergebnisse für eine positive Dehnung einen deutlichen Down-Regulierungseffekt in der mCherry-Produktionsrate (Abbildung 2B,C), was sich in einem signifikanten Wert ungleich Null von KRBP (Abbildung 2D) niederschlägt. Für die positive Dehnung ergab das Anpassungsverfahren folgende Werte: KRBP = 394,6 a.u., Kunbound = 275.6, n = 2.1, C = 11.2 a.u. und R2 = 0.93. Nach der Normalisierung durch die maximale mCerulean-Fluoreszenz betrug derK-RBP-Wert 0,24. Für den negativen Stamm wurde ein Mangel an eindeutiger Reaktion beobachtet (Abbildung 2C), und es wurde kein K-RBP-Wert extrahiert (Abbildung 2D).

In Abbildung 3stellen wir die Ergebnisse dieses Testes für zwei Phagenmantel-RBPs, PP7 und MS2, an mehreren mutierten Bindungsstellen an verschiedenen Stellen innerhalb des Initiationsbereichs der mCherry mRNA vor. Die Ergebnisse sind grob in drei Arten von Antworten eingeteilt (Abbildung3A):Stämme, die einen down-regulatorischen Effekt auf einem niedrigen mCerulean-Niveau aufweisen, was einen niedrigenK-RBP-Wert widerspiegelt (hohe Bindungsaffinität); Belastungen mit downregulatorischen Auswirkungen auf mittlerem oder hohem mCerulean-Niveau, die einen hohenK-RBP-Wert (zwischengeschaltete oder niedrige Affinität) widerspiegeln; und Stämme, die keine deutliche Reaktion auf steigende mCerulean-Werte aufweisen, was einen höherenK-RBP-Wert als die maximale RBP-Konzentration in der Zelle widerspiegelt (keine nachweisbare Bindungsaffinität). Abbildung 3B zeigt den minimalen K-RBP-Wert, der für jede RBP-Bindungs-Standort-Kombination basierend auf allen Kombinationen der beiden RBPs und zehn Bindungsstellen an unterschiedlichen Positionen berechnet wird. Die Bindungsstellen umfassen eine Negative Kontrolle (keine Bindungsstelle), nicht übereinstimmende Bindungsstellen und eine positive Kontrolle – die native Bindungsstelle für jeden RBP (PP7-wt für PP7-Beschichtungsprotein [PCP] und MS2-wt für MS2-Beschichtungsprotein [MCP]). Die Ergebnisse stimmen mit den Vorhersagen überein, da beide RBPs eine hohe Affinität zu ihren positiven Steuerelementen und eine nicht erkennbare Bindungsaffinität für die negativen Steuerelemente darstellen. Darüber hinaus haben frühere Studien mit diesen beiden RBPs27,28 beobachtet, dass sie orthogonal sind, was in der vorgestellten Heatmap deutlich vermittelt wird: sowohl MCP als auch PCP binden die native Site des anderen RBP nicht. Darüber hinaus zeigen die mutierten Bindungsstellen unterschiedliche Ergebnisse, wobei einige Bindungsseiten eine ähnliche Affinität wie die native Website aufweisen, z. B. PP7-mut-1, PP7-mut-2 und MS2-mut-3, während andere eine signifikant geringere Affinität aufweisen, z. B. PP7-mut-3 und MS2-mut-2. So präsentierte der Assay eine quantitative In-vivo-Messung der Bindungsaffinität von RBPs, die Ergebnisse lieferte, die mit denen früherer Experimente mit diesen RBPs vergleichbar sind.

Da der Test auf der Unterdrückung des mCherry-Gens basiert, ist ein lebensfähiges mCherry-Signal erforderlich. Daher gibt es beim Entwerfen der Bindungswebsitekassette zwei Entwurfsregeln zu beachten. Zunächst sollte der offene Leserahmen (ORF) des mCherry beibehalten werden. Da die Bindungs-Standortlänge variieren kann, kann das Einfügen in das Gen zu einer Verschiebung von ein oder zwei Basen aus dem ursprünglichen mCherry ORF führen. Fügen Sie daher bei Bedarf (Abbildung4A) eine oder zwei Basen unmittelbar nach der Bindungsstelle ein. Zum Beispiel ergibt eine Bindungsstelle, die 20-Basis lang ist, mit einem Wert von zwei Basen, eine Zugabe von 22 Basen zum mCherry-Gen. Um den ORF zu halten, müssen wir zwei Basen hinzufügen, insgesamt 24 Basen. Die zweite Designregel besteht darin, Einfügungen von Stop-Codons in den mCherry ORF zu vermeiden. Einige Bindungsstellen, wie die MS2-mut-2 (Abbildung 4B, Einset), enthalten Stopp-Codons, wenn sie in einem oder mehreren der drei möglichen ORFs positioniert sind. Ein solches Beispiel ist in Abbildung 4Adargestellt, wo die Bindungsstelle ein Stop-Codon enthielt, das mit dem mCherry ORF nur dann im Rahmen enthalten ist, wenn keine Basen hinzugefügt werden. Wie in der Dosis-Wirkungs-Kurve für diese Position zu sehen ist (Abbildung 4B), war die mCherry-Produktionsrate nicht nachweisbar, so dass die Bindungsaffinität nicht gemessen werden konnte.

Ein genauerer Blick auf Abbildung 4B zeigt die Auswirkungen des Abstands auf die mCherry-Produktion. So war z. B. für die Basalproduktionsrate ein Faktor von sechs mehr als für die für n = 5, was einen höheren Faltenrepressionseffekt gewährleistete. Für die B = 14 waren die Basalproduktionsniveaus jedoch zu niedrig, um einen abwärtsregulierenden Effekt zu beobachten.

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht über Systemdesign und Klonschritte. Abbildung des Kassettendesigns für das Bindungs-Plasmid (links) und das RBP-mCerulean-Plasmid (rechts). Der nächste Schritt sind die aufeinanderfolgenden Umwandlungen beider Plasmide in kompetente E. coli-Zellen, wobei zunächst RBP-Plasmide durchgeführt werden. Doppel-Transformants werden dann auf ihre mCherry Expressionsniveaus in steigenden Induktorkonzentrationen getestet; Wenn der RBP an die Bindungsstelle gebunden ist, sinken die mCherry-Ebenen als Funktion von mCerulean (graue Blase). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Analyseschema. (A) Dreidimensionale (3D) Diagramme, die rohe OD-Spiegel (oben), mCerulean-Fluoreszenz (Mitte) und mCherry-Fluoreszenz (unten) als Funktion der Zeit- und Induktorkonzentration für eine positive Dehnung darstellen. (B) Oben: mCerulean Steady-State-Expressions-Levels für jede Induktorkonzentration werden berechnet, indem jedes Fluoreszenzniveau durch die jeweilige OD dividiert und über alle Werte im 2-3 h exponentiellen Wachstumszeitfenster für beide positiven (links) und negative (rechte) Dehnungen. Unten: mCherry Produktionsrate berechnet nach Eq. 3 für Zeitpunkte 2 x 3 h nach Induktion. (C) mCherry Produktionsrate, die in Abhängigkeit von der mittleren mCerulean-Fluoreszenz dargestellt wird, durchschnittlich über zwei biologische Duplikate für zwei Stämme. Fehlerbalken sind Standardabweichungen sowohl der mCherry-Produktionsrate als auch der gemittelten mCerulean-Fluoreszenz, die aus mindestens zwei Replikationen gewonnen wurde. (D) Fit für KRBP unter Verwendung der Fitting-Formel in Eq. 4 für die positive Dehnung (links) mit einer spezifischen Bindungsreaktion. Für den negativen Stamm (rechts) wurde keinK-RBP-Wert extrahiert. Die Daten werden in dupliziert angezeigt. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Katz et al.10angepasst. Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Endergebnisse. (A) Normalisierte Dosis-Wirkungs-Kurven für dreißig verschiedene Stämme basierend auf zwei RBPs und zehn Bindungsstellen an verschiedenen Standorten. Es werden drei Arten von Antworten beobachtet: hohe Affinität, geringe Affinität und keine Affinität. (B) Quantitative KRBP-Ergebnisse für zwei RBPs (MCP und PCP) mit fünf verschiedenen Bindungs-Site-Kassetten (aufgeführt). Alle RBP-Bindungs-Standortstämme wurden in doppelter Ausführung gemessen. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Katz et al.10angepasst. Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Beispielentwurf und Ergebnisse für MCP mit einer mutierten Bindungsstelle. (A) Design-Illustration der Bindungsplatzkassetten an vier verschiedenen Orten. Kassette mit Ribosomenbindung, Startcodon für die mCherry, Spacer Basen, die getestete Bindungsstelle, ein oder zwei Basen zur Aufrechterhaltung des ORF und der Rest des mCherry-Gens. Rote Sterne weisen auf einen Stop-Codon hin. (B) Dosis-Wirkungs-Kurven für MCP mit einer mutierten Bindungsstelle an vier verschiedenen Stellen. Inset: die Reihenfolge der getesteten mutierten Bindungsstelle. Die dargestellten Ergebnisse beziehen sich auf Duplikate jedes Stammes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

name Standort Binidng, A in AUG = 1 Bindung sorzierst (RBS für Steuerelemente) Site: ATG zum zweiten mCherry codon GTG
Steuerung: RBS bis zweiter mCherry codon GTG
Quelle
MS2_wt_d5 5 acatgaggattacccatgt atgcacatgaggattacccatgtcgtg Gen9 Inc.
MS2_wt_d6 6 acatgaggattacccatgt atggcacatgaggattacccatgtg Gen9 Inc.
MS2_wt_d8 8 acatgaggattacccatgt atggcgcacatgaggattacccatgt
cgtg
Gen9 Inc.
MS2_wt_d9 9 acatgaggattacccatgt atggcgccacatgaggattacccatg
tgtg
Gen9 Inc.
MS2_U(-5)C_d8 8 acatgaggatcacccatgt atgcacatgaggatcacccatgtgg
Sf
Gen9 Inc.
MS2_U(-5)C_d9 9 acatgaggatcacccatgt atggcacatgaggatcacccatgtg
Sf
Gen9 Inc.
MS2_U(-5)C_d8 8 acatgaggatgacccatgt atgcacatgaggatgacccatgtgg
Sf
Gen9 Inc.
MS2_U(-5)G_d9 9 acatgaggatgacccatgt atggcacatgaggatgacccatgtg
Sf
Gen9 Inc.
MS2_struct_d9 9 cacaagaggttcacttatg atggccacaagaggttcacttatgg
Sf
Gen9 Inc.
MS2_struct_d8 8 cacaagaggttcacttatg atgccacaagaggttcacttatggg
Sf
Gen9 Inc.
PP7wt_d5' 5 taaggagtttatatggaaaccctta atgctaaggagtttatatggaaacc
cttacgtg
Gen9 Inc.
PP7wt_d6' 6 taaggagtttatatggaaaccctta atgaataaggagtttatatggaaac
ccttagtg
Twist Bioscience
PP7wt_d8' 8 taaggagtttatatggaaaccctta atgaacataaggagtttatatggaa
acccttacgtg
Twist Bioscience
PP7wt_d9' 9 taaggagtttatatggaaaccctta atgaacaataagtttatatgga
aacccttagtg
Twist Bioscience
PP7_USLSBm_d6 6 taaccgctttatatggaaagggtta atggctaaccgctttatatggaag
ggttagtg
Gen9 Inc.
PP7_USLSBm_d15 15 taaccgctttatatggaaagggtta atgggcgccggcgctaaccgcttta
tatggaaagggttagtg
Gen9 Inc.
PP7_nB_d5 5 taagggtttatatggaaaccctta atgctaagggtttatatggaaaccc
ttagcgtg
Gen9 Inc.
PP7_nB_d6 6 taagggtttatatggaaaccctta atggctaagtttatatggaaacc
cttatgtg
Gen9 Inc.
PP7_USs_d5 5 taaggagttatatggaaccctta atgctaaggagttatatggaaccct
tagtg
Gen9 Inc.
PP7_USs_d6 6 taaggagttatatggaaccctta atggctaaggagttatatggaaccc
ttagcgtg
Gen9 Inc.
No_BS_d1 - - ttaaagaggagaaagagacccatgg
Sf
Gen9 Inc.
No_BS_d4 - - ttaaagaggagaaagagacccatgg
gcgtg
Gen9 Inc.
No_BS_d10 - - ttaaagaggagaaagagacccatgg
gcgccggcgtg
Gen9 Inc.
Sequenzierungsprimer für Bindungsplatzkassetten gcatttttatccataagattagcgg Idt
Sequenzierungsprimer für RBP-Kassetten gcggcgctggctctcatctaataaa Idt

Tabelle 1: Bindungsstellen und Sequenzierungsprimer. Sequenzen für die in dieser Studie verwendeten Bindungsstellen und Bindungsstellenkassetten sowie die Primer für die im Protokoll beschriebenen Sequenzierungsreaktionen (Schritte 1.2.5.1 und 1.3.3).

RBP-Name in dieser Arbeit Quelle Organismus Name, Protein Quelle Organismus Gen Quellorganismus refseq wt aa seq Änderungen von wt (und Referenzen) aa seq in dieser Arbeit verwendet nt seq wird in dieser Arbeit verwendet
Mcp Escherichia-Virus MS2 Cp NC_001417.2 MASNFTQFVLV
DNGGTGDVTV
APSNFANGVA
EWISSNSRSQ
AYKVTCSVRQ
SSAQNRKYTI
KVEVPKVATQT VGGVELPVA
AWRSYLNMEL
TIPIFATNSD
CELIVKAMQG
LLKDGNPIPS
AIAANSGIY
delF-G [1]
V29I [1]
entnommen aus Addgenplasmid 27121
MASNFTQFVLV
DNGGTGDVTV
APSNFANGIA
EWISSNSRSQ
AYKVTCSVRQ
SSAQNRKYTI
KVEVPKG
AWRSYLNMEL
TIPIFATNSD
CELIVKAMQG
LLKDGNPIPS
AIAANSGIY
ATGGCTTCTA
ACTTTACTCA
GTTCGTTCTC
GTCGACAATG
GCGGAACTGG
CGACGTGACT
GTCGCCCCAA
GCAACTTCGC
TAACGGGATC
GCTGAATGGA
TCAGCTCTAA
CTCGCGTTCA
CAGGCTTACA
AAGTAACCTG
TAGCGTTCGT
CAGAGCTCTG
CGCAGAATCG
CAAATACACC
ATCAAAGTCG
AGGTGCCTAA
AGGCGCCTGG
CGTTCGTACT
TAAATATGGA
ACTAACCATT
CCAATTTTCG
CCACGAATTC
CGACTGCGAG
CTTATTGTTA
AGGCAATGCA
AGGTCTCCTA
AAAGATGGAA
ACCCGATTCC
CTCAGCAATC
GCAGCAAACT
CCGGCATCTAC
Pcp Pseudomonas Phagen PP7 Cp NC_001628.1 MSKTIVLSVGEA
TRTLTEIQST
ADRQIFEEKV
GPLVGRLRLT
ASLRQNGAKT
AYRVNLKLDQ
ADVVDCSTSVC
GE
LPKVRYTQ
VWSHDVTIVA
NSTEASRKSL
YDLTKSLVAT
SQVEDLVVNL
VPLGR
delF-G [2]
entnommen aus Addgenplasmid 40650
MLASKTIVLSVG
EATRTLTEIQ
STADRQIFEE
KVGPLVGRLR
LTASLRQNGA
KTAYRVNLKL
DQADVVDSG
LPKVRYTQVW
SHDVTIVANS
TEASRKSLYD
LTKSLVATSQ
VEDLVVNLVP
LGR
ATGCTAGCCTC
CAAAACCATC
GTTCTTTCGG
TCGGCGAGGC
TACTCGCACT
CTGACTGAGA
TCCAGTCCAC
CGCAGACCGT
CAGATCTTCG
AAGAGAAGGT
CGGGCCTCTG
GTGGGTCGGC
TGCGCCTCAC
GGCTTCGCTC
CGTCAAAACG
GAGCCAAGAC
CGCGTATCGC
GTCAACCTAA
AACTGGATCA
GGCGGACGTC
GTTGATTCCG
GACTTCCGAA
AGTGCGCTAC
ACTCAGGTAT
GGTCGCACGA
CGTGACAATC
GTTGCGAATA
GCACCGAGGC
CTCGCGCAAA
TCGTTGTACG
ATTTGACCAA
GTCCCTCGTC
GCGACCTCGC
AGGTCGAAGA
TCTTGTCGTC
AACCTTGTGC
CGCTGGGCCGT
Verweise:
1.Peabody, D.S., Ely, K.R. Kontrolle der translationalen Repression durch Protein-Protein-Wechselwirkungen. Nukleinsäuren Forschung. 20 (7), 1649–1655 (1992).
2. Chao, J.A., Patskovsky, Y., Almo, S.C., Singer, R.H. Strukturelle Basis für die Koevolution eines viralen RNA-Protein-Komplexes. Natur Struktur-& Molekularbiologie. 15 (1), 103–105, doi: 10.1038/nsmb1327 (2008)

Tabelle 2: RBP-Sequenzen. Aminosäure- und Nukleotidsequenzen der in dieser Studie verwendeten Mantelproteine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die in diesem Artikel beschriebene Methode erleichtert die quantitative In-vivo-Messung der RBP-RNA-Bindungsaffinität in E. coli-Zellen. Das Protokoll ist relativ einfach und kann ohne den Einsatz ausgeklügelter Maschinen durchgeführt werden, und die Datenanalyse ist einfach. Darüber hinaus werden die Ergebnisse sofort erstellt, ohne die relativ lange Wartezeit, die mit den Ergebnissen der Next Generation Sequencing (NGS) verbunden ist.

Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass es nur in Bakterienzellen funktioniert. Eine frühere Studie12 hat jedoch einen Repressionseffekt mit einem ähnlichen Ansatz für den L7AE RBP in Säugetierzellen nachgewiesen. Eine zusätzliche Einschränkung der Methode besteht darin, dass das Einfügen der Bindungsstelle im mCherry-Initiationsbereich die basalen mCherry-Ebenen unterdrücken kann. Strukturelle Komplexität oder hohe Stabilität der Bindungsstelle kann die ribosomale Initiation auch ohne RBP stören, was zu einem rückgangen mCherry Basalgehalt führt. Wenn die Basalwerte zu niedrig sind, wird die zusätzliche Repression, die durch die erhöhungen RBP-Konzentrationen herbeigeführt wird, nicht zu beobachten sein. In einem solchen Fall ist es am besten, die Bindungsplatzkassette mit der Bindungsstelle noch im Initiierungsbereich zu entwerfen, aber am Rande des Übergangs von der Initiationsregion zur Dehnungsregion (im Bereich von 12 x 15 bp10,29). Wir haben gezeigt, dass bei solchen Werten immer noch ein Repressionseffekt zu beobachten ist. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass der Test unabhängig von der strukturellen Komplexität funktioniert, empfehlen wir, den Test an mindestens drei verschiedenen Positionen für eine bestimmte bindungsstelle durchzuführen.

Der Hauptnachteil der Methode im Vergleich zu In-vitro-Methoden wie EMSA besteht darin, dass die RBP-RNA-Bindungsaffinität nicht in absoluten Einheiten der RBP-Konzentration gemessen wird, sondern in Bezug auf die Fusion-RBP-Fluoreszenz. Dieser Nachteil ist ein direktes Ergebnis der in vivo Einstellung, die unsere Fähigkeit, die tatsächlichen Konzentrationen von RBP auszulesen, einschränkt. Dieser Nachteil wird durch die Vorteile der Messung in der in vivo Einstellung ausgeglichen. Zum Beispiel haben wir Unterschiede in bindungsaffinitäten beim Vergleich der Ergebnisse aus unserem In-vivo-Assay mit früheren In-vitro- und In-situ-Assays gefunden. Diese Unterschiede können auf Unterschiede in der Struktur der mRNA-Moleküle in vivo zurückzuführen sein, die aus ihrer Anwesenheit in den Zellen10,11,30,31entstehen. Solche strukturellen Unterschiede können zu Veränderungen in der Stabilität der gefalteten Zustände in vivo führen, die wiederum die RBP-Bindung entweder stabilisieren oder destabilisieren.

Da die Methode relativ einfach und kostengünstig ist, empfehlen wir, mehrere Steuerelemente neben dem eigentlichen Experiment auszuführen. Das Ausführen einer negativen Kontrolle, d. h. einer Sequenz, die keine Affinität zum RBP hat, aber ähnliche strukturelle Merkmale aufweist, kann dazu beitragen, Fehlalarme zu vermeiden, die aus unspezifischen Wechselwirkungen mit der mRNA resultieren. In den gezeigten repräsentativen Ergebnissen waren die beiden negativen Kontrollen das mCherry-Gen allein (keine Bindungsstelle) und die native Bindungsstelle des anderen RBP (d. h. PP7-wt für MCP und MS2-wt für PCP). Darüber hinaus schlagen wir vor, eine positive Kontrolle (z. B. ein RBP und seine native Bindungsseite) zu integrieren. Eine solche Kontrolle wird dazu beitragen, die Bindungsaffinität zu quantifizieren, indem sie einen Bezugspunkt darstellt und Falschnegative vermeidet, die aus einer geringen Faltenrepression resultieren.

Schließlich schlagen wir für diejenigen, die eine strukturelle Perspektive der RBP-RNA-Bindung erhalten möchten, die Durchführung einer selektiven 2-Hydroxyl-Acylierung durch Primer-Erweiterungssequenzierung (SHAPE-Seq)11,32,33 versuch. SHAPE-Seq ist ein NGS-Ansatz in Kombination mit der chemischen Sondierung von RNA, der zur Abschätzung der sekundären Struktur von RNA sowie der RNA-Interaktionen mit anderen Molekülen, wie Proteinen, verwendet werden kann. In unserer bisherigen Arbeit führten wir ein SHAPE-Seq-Experiment an einem repräsentativen Stamm sowohl in vivo-Bedingungen34 als auch in vitro mit gereinigtem rekombinantem Protein10,35durch. In unserem Fall zeigten die Ergebnisse, dass DIE RBP-Bindung ein viel breiteres Segment von RNA beeinflusste, als bisher für diese RBPs in vitro36berichtet wurde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Dieses Projekt wurde aus dem I-CORE-Programm des Planungs- und Budgetierungsausschusses und der Israel Science Foundation (Grant No. 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675 und aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 664918 - MRG-Grammar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin sodium salt SIGMA A9518
Magnesium sulfate (MgSO4) ALFA AESAR 33337
48 plates Axygen P-5ML-48-C-S
8-lane plates Axygen RESMW8I
96-well plates Axygen P-DW-20-C
96-well plates for plate reader Perkin Elmer 6005029
ApaLI NEB R0507
Binding site sequences Gen9 Inc. and Twist Bioscience see Table 1
E. coli TOP10 cells Invitrogen C404006
Eagl-HF NEB R3505
Glycerol BIO LAB 071205
Incubator TECAN liconic incubator
Kanamycin solfate SIGMA K4000
KpnI- HF NEB R0142
Ligase NEB B0202S
Liquid-handling robotic system TECAN EVO 100, MCA 96-channel
Matlab analysis software Mathworks
Multi- pipette 8 lanes Axygen BR703710
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) cayman K40982552 019
PBS buffer Biological Industries 020235A
Platereader TECAN Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polymerase NEB M0493
RBP seqeunces Addgene 27121 & 40650 see Table 2
Sodium Chloride (NaCL) BIO LAB 190305
SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9281
Tryptone BD 211705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
  2. Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
  3. Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
  4. Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
  5. Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
  6. Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
  7. Strein, C., Alleaume, A. -M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
  8. Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  9. Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
  10. Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
  11. Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
  12. Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
  13. Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
  14. Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
  15. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  16. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
  17. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  18. NEB. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions. , Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018).
  19. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol. , Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018).
  20. NEB. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202). , Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018).
  21. Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018).
  22. NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit. , Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018).
  23. Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
  24. Addgene. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018).
  25. NEB. Making your own chemically competent cells. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018).
  26. Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling. , Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018).
  27. Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
  28. Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
  29. Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
  30. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
  31. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  32. Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
  33. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
  34. Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
  35. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
  36. Bernardi, A., Spahr, P. -F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).

Tags

Genetik Ausgabe 148 RNA-Bindungsprotein (RBP) MS2 PP7 Phagenmantelprotein Bindungstest posttranskriptionelle Regulation Translation Repression synthetische Schaltung RBP-Bindungsaffinität RNA-Schaltung Reportergen RBP-Interaktion
Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katz, N., Cohen, R., Atar, O.,More

Katz, N., Cohen, R., Atar, O., Goldberg, S., Amit, R. An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria. J. Vis. Exp. (148), e59611, doi:10.3791/59611 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter