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Genetics

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

Published: June 12, 2019 doi: 10.3791/59611
* These authors contributed equally

Summary

이 방법에서, 우리는 세균 세포에서 단순, 살아있는, 리포터 분석법을 사용하여 동축 및 비동종 결합 부위에 RNA 결합 단백질(RBPs)의 결합 친화도를 정량화한다. 분석은 기자 유전자의 억압에 근거를 둔다.

Abstract

단백질 번역의 개시 단계에서, 리보솜은 mRNA의 개시 부위에 결합한다. 번역 개시는 리보솜 결합을 방해하는 mRNA의 개시 지구에 RNA 결합 단백질 (RBP)의 결합에 의해 차단될 수 있습니다. 제시된 방법에서는, 우리는 그들의 동체 및 비 cognate 결합 사이트에 대한 RP의 결합 친화도를 정량화하기 위해 이 차단 현상을 이용한다. 이를 위해, 우리는 리포터 mRNA의 개시 부위에 시험 결합 부위를 삽입하고 시험 RBP의 발현을 유도한다. RBP-RNA 결합의 경우, 우리는 RBP 농도의 함수로서 리포터 발현의 시그노이드 억압을 관찰했다. 결합 부위와 RBP 사이의 친화성 또는 매우 낮은 친화력의 경우, 유의한 억압이 관찰되지 않았다. 이 방법은 살아있는 세균 세포에서 수행되며 비싸거나 정교한 기계가 필요하지 않습니다. 박테리아에서 기능하는 상이한 RP의 결합 친화도를 설계된 결합 부위세트에 정량화하고 비교하는 데 유용합니다. 이 방법은 구조적 복잡성이 높은 사이트를 바인딩하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. 이는 RBP가 없는 복잡한 mRNA 구조에 의한 리보좀 개시의 억제 가능성, 이는 낮은 기저 리포터 유전자 발현을 초래할 것이고, 따라서 RBP 결합에 대한 관찰력이 떨어지는 리포터 억압에 기인한다.

Introduction

RNA 결합 단백질(RBP)-기반 전사 후 조절, 특히 RBPs와 RNA 사이의 상호작용의 특성화는 최근 수십 년 동안 광범위하게 연구되고 있다. RBPs 억제에서 유래 하는 박테리아에서 번역 다운 조절의 여러 예가 있다, 또는직접 경쟁, 리보솜 바인딩 1,2,3. 합성 생물학 분야에서, RBP-RNA 상호 작용은 전사 기반 유전 회로4,5의설계를위한 중요한 도구로 부상하고 있다. 따라서, 세포 문맥에서 이러한 RBP-RNA 상호작용의 특성화에 대한 수요가 증가하고 있다.

단백질 RNA 상호 작용을 연구하기 위한 가장 일반적인 방법은 시험관내 설정으로 제한되는 전기동이동성 시프트 분석법(EMSA)6,및 CLIP 방법8,9를 포함한 다양한 풀다운 분석7이다. . 이러한 방법은 de novo RNA 결합 부위의 발견을 가능하게 하는 동안, 그들은 노동 집약적인 프로토콜 및 비싼 깊은 시퀀싱 반응과 같은 결점 때문에 손해를 입고 RBP 풀다운을 위한 특정 항체를 요구할 수 있습니다. 그것의 환경에 RNA의 영향을 받기 쉬운 특성 때문에, 많은 요인은 세포 문맥에서 RBP-RNA 결합을 심문하는 의 중요성을 강조하는 RBP-RNA 상호 작용에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 우리 및 그 외는 생체내 RNA 구조와 체외10,11사이의 유의한 차이를 입증하였다.

이전 연구12의접근법에 기초하여, 우리는 최근에 박테리오파지 GA13,MS214,PP715및 Qβ16에서 캡시드 RBP에 대한 미리 설계된 결합 부위를 배치할 때 10을 입증했다. [mRNA] 기자의 번역 개시 부위, 리포터 표현이 강하게 억압된다. 우리는 이 억압 현상에 근거하여, RBP와 그들의 대응하는 RNA 결합부위의 생체 내 친화성을 측정하기 위해 비교적 간단하고 정량적인 방법을 제시한다.

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Protocol

1. 시스템 준비

  1. 바인딩 사이트 플라스미드 설계
    1. 그림1에 설명된 대로 바인딩 사이트 카세트를 디자인합니다. 각 미니유전자는 다음과 같은 부분(5' ~ 3')을 포함하며, Eagl 제한 부위, +40 기저의 카나마이신(Kan) 저항 유전자, pLac-Ara 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), mCherry 유전자의 AUG, 스페이서(δ), RBP 결합 부위, 5' 말단의 80염기 mCherry 유전자, 및 ApaLI 제한 부위.
      참고: 분석의 성공률을 높이기 위해 각 바인딩 부위에 대해 3개의 바인딩 사이트 카세트를 설계하고 스페이서가 적어도 1개, 2개 및 3개의 염기로 구성됩니다. 자세한 지침은 대표 결과 섹션을 참조하십시오.
  2. 바인딩 사이트 플라스미드의 복제
    1. 결합 부위 카세트를 이중 가닥 DNA(dsDNA) 미니유전자로 주문합니다. 각 미니유전자는 ~500 bp 길이이며, 각각 5' 및 3' 말단에 Eagl 제한 사이트 및 ApaLI 제한 사이트를 함유하고 있다(1.1.1단계 참조).
      참고: 본 실험에서, 카나마이신 유전자의 절반을 가진 미니 유전자는 양성 콜로니에 대한 스크리닝을 용이하게 하기 위해 주문하였다. 그러나, 깁슨 어셈블리(17)는 또한 여기에 적합하며, 이 경우 결합 부위는 2개의 짧은 상보적인 단일 가닥 DNA 올리고스로서 주문될 수 있다.
    2. 제한 프로토콜18에의해 Eagl-HF 및 ApaLI를 가진 미니 유전자 및 표적 벡터 둘 다 이중 소화하고, 컬럼 은19를정제한다.
    3. mCherry 리포터 유전자, 터미네이터 및 카나마이신 내성 유전자(20)의 나머지를 포함하는 결합 부위백본에 소화된 미니유전자를 리게이트.
    4. 결찰 액을 대장균 TOP10세포(21)로변형시킨다.
    5. Sanger 시퀀싱을 통해 양성 변압자를 식별합니다.
      1. 관심 영역까지 상류에 프라이머(100) 염기를 설계합니다(프라이머 서열에 대한 표 1 참조).
      2. 미니 프렙 몇 가지 세균 식민지22.
      3. 프라이머의 5 mM 용액의 5 μL및 80 ng/μL 농도에서 DNA의 10 μL을 준비한다.
      4. Sanger 시퀀싱23을위한 편리한 시설로 두 가지 솔루션을 보냅니다.
    6. 정제된 플라스미드를 -20°C에서 저장하고, 글리세롤이24를스톡함에 따라 세균 균주를 96웰 형식으로 저장한다. DNA는 이어서 4개의 융합-RBP 플라스미드 중 하나를 함유하는 대장균 TOP10 세포로의 형질전환을 위해 사용될 것이다(단계 1.3.5 참조).
  3. RBP 플라스미드의 설계 및 시공
    참고: 본 연구에 사용된 외투 단백질의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 2에 열거되어 있다.
    1. 필요한 RBP 서열을 주문하여 정지 코돈이 결여된 정지 코돈이 단말에 제한 부위가있는 스톱 코돈이 결여된 맞춤형 dsDNA 미니유전자를 주문한다(도 1).
    2. 시험된 RBP를 복제하여 유도성 프로모터의 바로 하류및 시작 코돈이 결여된 형광 단백질의 상류하류에 정지 코돈이 결여된 것을 복제(도1),단계 1.2.2-1.2.4와 유사. RBP 플라스미드가 결합 부위 플라스미드와는 다른 항생 저항 유전자를 포함하고 있는지 확인한다.
    3. Sanger 시퀀싱을 통해 양성 변압자를 식별합니다(1.2.5단계와 유사).(프라이머 시퀀스의 경우 표 1 참조).
    4. 하나의 긍정적 인 변형을 선택하고 화학적으로 유능한25합니다. -20°C에서 글리세롤 정제 플라스미드로 보관하고, 96웰 플레이트에서 -80°C에서 세균 균주24의 글리세롤 스톡을 저장한다.
    5. 96웰 플레이트에 저장된 결합 부위 플라스미드(단계 1.2.6)를 이미 RBP-mCerulean 플라스미드(21)를함유하고 있는 화학적으로 유능한 세균 세포로 변형시킨다. 시간을 절약하기 위해 페트리 접시에 세포를 도금하는 대신 관련 항생제 (칸 및 Amp)가있는 루리아 베르타니 (LB)26 한천을 함유 한 8 채널 파이프터를 사용하여 접시에 담습니다. 식민지는 16 시간 안에 나타나야합니다.
    6. 각 이중 형질전환제에 대한 단일 콜로니를 선택하고 관련 항생제(Kan and Amp)로 LB 배지에서 하룻밤 동안 성장시키고 96웰 플레이트에서 -80°C에서 글리세롤 스톡24로 저장합니다.

2. 실험 설정

참고: 여기에 제시된 프로토콜은 인큐베이터 및 플레이트 리더와 함께 액체 처리 로봇 시스템을 사용하여 수행하였다. 각 측정은 24개의 유도자 농도에 대해 수행되었고, 각 스트레인 + 유도기 조합에 대해 2개의 중복이 있었다. 이 로봇 시스템을 사용하여 하루에 16 개의 균주에 대한 데이터를 24 유도체 농도로 수집했습니다. 그러나 이러한 장치를 사용할 수 없거나 실험이 더 적은 경우 8채널 멀티 파이펫을 사용하여 프로토콜을 적절하게 조정하여 수작업으로 쉽게 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 12개의 유도자 농도와 4개의 시간 포인트를 가진 4개의 균주에 대한 예비 결과가 이런 식으로 획득되었다.

  1. 미리, 바이오분석완충제(BA) 1L의 트립톤 0.5 g, 글리세롤 0.3 mL, NaCl 5.8 g, 1 MMgSO4의50 mL, 10x 인산완충식염수(PBS) 완충액 pH 7.4, 및 950 mL의 이중 DW(diStillD)를 혼합하여 준비한다. BA 버퍼를 오토클레이브 또는 멸균 필터로 필터링합니다.
  2. 적절한 항생제 (100 μg / mL의 최종 농도에서 25 μg / mL및 ampicillin의 최종 농도에서 카나마이신)와 함께 1.5 mL LB에서 37 °C 및 250 rpm에서 흔들리는 이중 형질전환 균주를 48 웰 플레이트에서 18 시간 (하룻밤)의 기간 동안 성장시킵니다.
  3. 아침에 다음 을 준비하십시오.
    1. 유도판. 깨끗한 96웰 플레이트에서, 37°C에서 인큐베이터에서 95% BA 및 5% LB26으로 구성된 반불량 배지(SPM)로 우물을 준비한다. 웰의 수는 유도자 농도의 원하는 수에 해당합니다. 가장 높은 유도자 농도(218 nM)를 포함하는 유도판의 웰에 C4-HSL을 첨가한다.
    2. 로봇을 0에서 218 nM에 이르는 23개의 낮은 농도로 각각의 고농도 우물에서 매질을 연속적으로 희석하도록 프로그래밍합니다. 각 유도기 희석의 부피는 모든 균주(중복 포함)에 충분해야 합니다.
    3. 유도기 희석이 제조되는 동안, 96웰 플레이트에서 37°C에서 인큐베이터에서 SPM의 180 μL을 따뜻하게 한다.
    4. 2.2 단계에서 하룻밤 균주를 연속 희석에 의해 100 의 요인으로 희석 : 먼저 48 웰 플레이트에서 SPM의 900 μL과 박테리아 100 μL을 혼합하여 10 의 요인으로 희석 한 다음 희석 된 용액에서 20 μL을 복용하여 다시 10 배로 희석하십시오. 형광 측정에 적합한 96웰 플레이트에서 180 μL의 사전 따뜻화 된 SPM.
    5. 유도판으로부터 희석된 유도기를 최종 농도에 따라 희석된 균주를 가진 96웰 플레이트에 첨가한다.
  4. 37°C에서 37°C에서 6시간 동안 96웰 플레이트를 흔들면서 30분마다 플레이트 리더를 통해 595 nm(OD595),mCherry(560 nm/612 nm) 및 mCerulean(460 nm/510 nm)에서 광학 밀도를 측정합니다. 정규화를 위해 셀이 첨가되지 않은 SMP의 성장을 측정합니다.

3. 예비 결과 분석

  1. 실험의 각 일에 대해, 선형 성장 단계와 고정된(T 0, T최종)사이의 측정된성장 곡선에 따라 로그 성장의 시간 간격을 선택한다. 지수 성장 감지의 부정확성에서 파생된 오류를 방지하기 위해 첫 번째 및 마지막 측정값을 폐기하면서 약 6~8개의 시간 지점을 취합니다(그림 2A,상단 패널 참조).
    참고: 비정상적인 성장 곡선 또는 로그 성장 단계를 감지할 수 없는 균주를 보여주는 균주를 버리고 실험을 반복합니다.
  2. mCerulean의 평균 정규화 형광 및 mCherry의 생산 속도, 각 유도체 농도에 대한 mCerulean 및 mCherry 형광의 원시 데이터로부터 계산 (도2A).
    1. 다음과 같이 정규화된 mCerulean을 계산합니다.
      Equation 1
      여기서 블랭크(mCerulean)는 mCerulean 수준[a.u.]이 중간 값에만, 블랭크(OD)는 중간 값에만 광학 밀도이고, mCerulean 및 OD는 각각 mCerulean 형광 및 광학 밀도 값입니다.
    2. 서로 다른 시간 포인트(그림2B,상위 2개 패널)에 대한 평균 mCerulean은 다음과 같습니다.
      Equation 2
      #Time 포인트가 고려되는 데이터 타임포인트의 수인 경우 T0은 지수 증가 단계가 시작되는 시간이며 Tfinal은 지수 증가 단계가 끝나는 시간입니다.
    3. m체리 생산속도 계산(그림2B,하단 2개 패널) 다음과 같다.
      Equation 3
      여기서 mCherry(t)는 시간 t에서 mCherry 수준[a.u.]이고, OD는 광학 밀도 값이고, T 0은 지수 성장 단계가 시작되는 시간이며, Tfinal은 지수 성장 단계가 끝나는 시간입니다.
  3. 마지막으로, mCerulean의 함수로서 생산의 mCherry 비율을 플롯하고, RBP-mCerulean 융합 형광의 함수로서투여량 응답 곡선을 생성한다(도 2C). 이러한 플롯은 세포내 RBP 존재의 함수로서 리포터 유전자의 생산을 나타낸다.

4. 복용량 응답 기능 피팅 루틴 및 KRBP 추출

  1. RBP 바운드를 가진 번역의 리보솜 비율이 일정하다는 가정 하에, mCherry 생산 속도를 다음과 같이 모델링합니다(그림 2D, 녹색 선 참조).
    Equation 4
    여기서 [x]는 Eq. 2에 따라 계산된 정규화된 평균 mCerulean 형광이, mCherry 생산률은 Eq. 3에 따라 계산된 값이며, KRBP는 상대적 결합 친화성 [a.u.], K언바운드는 리보솜 비율이다. RBP 언바운드로 변환, n은 협력 계수이고, C는 기본 형광 [a.u.]입니다. C, n, K언바운드및 KRBP는 mCherry 생산 속도 데이터를 모델(Eq. 4)에 피팅하여 발견됩니다.
  2. 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 mCherry 생산 속도를 평균 mCerulean(단계 3.3)의 함수로 묘사하는 플롯에 피팅 절차를 수행하고 Eq. 4의 수식에 따라 맞춤 매개변수를 추출합니다.
    참고: R2 > 0.6을 가진 피팅 결과만 고려됩니다. 이러한 적합의 경우, KRBP 오차는 주로 KRBP 값의 0.5%에서 20% 범위이며, 0.67 신뢰 구간의 경우 KRBP 오류가 높은 값도 눈으로 확인할 수 있습니다.
  3. KRBP 값을 각 투여량-응답 함수에 대한 평균 mCerulean의 각각 최대 값으로 정규화합니다.
    Equation 5
    여기서 [a.u.]의 KRBP는 Eq. 4의 피팅 프로시저로부터 추출된 값이며, 최대(평균 mCerulean)는 현재 변형에 대해 관찰된 최대 평균 mCerulean 신호[a.u]이다.
    참고: 정규화는 특정 최대 RBP 발현 수준에 대한 의존도를 제거하여 균주 전반에 걸친 조절 효과의 정확한 비교를 용이하게 합니다.

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Representative Results

제시된 방법은 mRNA 분자에 결합하기 위한 RBP와 리보솜사이의 경쟁을 이용한다(도 1). 이 경쟁은 유도제의 농도 증가로 인해 RBP-mCerulean의 증가 생산의 함수로 mCherry 수준을 감소시킴으로써 반영됩니다. mCherry에 큰 변화가 없는 mCerulean 형광이 증가하는 경우, RBP 결합의 부족은 추론된다. 양수 및 음의 변형모두에 대한 대표적인 결과는 그림2에 도시되어 있습니다. 도 2A에서,OD, mCherry 및 mCerulean 채널은 T0 = 1 시간 및 T최종 = 3.5 시간의 범위에 걸쳐 시간 및 유도기의 함수로서 제시된다. 2B에서, 평균 mCerulean 형광(top) 및 m체리 생산속도(아래)는 유도체 농도의 함수로서, 두 가지 예의 균주에 대해 제시된다. 알 수 있듯이, 양성 스트레인에 대한 결과는 K RBP(도2D)의유의한 비-0값으로 변환되는 생산의 mCherry 속도(도2B,C)에서명확한 하향 조절 효과를 표시한다. 양수 변형의 경우 피팅 프로시저는 KRBP = 394.6 a.u. 및 K언바운드 = 275.6, n = 2.1, C = 11.2 a.u. 및 R2 = 0.93값을 산출했습니다. 최대 mCerulean 형광에 의해 정규화 한 후, KRBP 값은 0.24이었다. 음의 변형에 대해, 뚜렷한 반응의 부족이 관찰되었다(도2C),및 KRBP 값이 추출되지 않았다(도2D).

3에서, 우리는 mCherry mRNA의 개시 부위 내의 상이한 위치에서, 여러 돌연변이 결합 부위에, PP7 및 MS2, 2개의 파지 코트 RBPs에 대한 이 분석의 결과를 제시한다. 상기 결과는 대략 3가지 반응(도3A)- 낮은 mCerulean 수준에서 하향 조절 효과를 나타내는 균주, 낮은 KRBP 값(높은 결합 친화성)을 반영한다; 높은 KRBP 값 (중간 또는 낮은 선호도)을 반영, 중간 또는 높은 mCerulean 수준에서 하향 조절 효과를 나타내는 균주; 및 균주는 mCerulean의 상승 수준에 뚜렷한 반응을 나타내지 않으며, 세포내의 최대 RBP 농도보다 더 높은 KRBP 값을 반영한다(검출가능한 결합 친화도 없음). 그림 3B는 서로 다른 위치에서 두 RBP 및 10개의 바인딩-사이트의 모든 조합을 기반으로 모든 RBP 바인딩 사이트 조합에 대해 계산된 최소 K RBP 값을 제공합니다. 결합 부위는 음성 대조군(결합 부위 없음), 비매칭 결합 부위 및 양성 대조군-각 RBP에 대한 네이티브 결합 부위(PP7-wt for PP7-wt)와 MS2 코트 단백질에 대한 MS2-wt[MCP]를 포함한다. 결과는 두 RP 모두 포지티브 컨트롤에 대해 높은 선호도를 제시하고 음성 컨트롤에 대한 비검출 가능한 결합 선호도를 제시하므로 예측과 일치합니다. 추가적으로, 이 2개의 RBP27,28를 이용한 이전 연구는 제시된 히트맵에서 명확하게 전달되는 직교인 것을 관찰했다: MCP와 PCP 는 모두 다른 RBP의 네이티브 사이트를 결합하지 않는다. 더욱이, 돌연변이 된 결합 사이트는 다양한 결과를 제시하며, 일부 결합 사이트는 PP7-mut-1, PP7-mut-2 및 MS2-mut-3와 같은 네이티브 사이트의 선호도와 유사한 수준의 선호도를 표시하는 반면, 다른 사이트는 와 같이 상당히 낮은 친화도를 보였다. PP7-뮤-3 및 MS2-뮤-2. 따라서, 상기 분석법은 이러한 RP를 가진 과거 실험과 비교할 수 있는 결과를 산출하는 RP의 결합 친화도의 생체 내 측정을 제시하였다.

분석은 mCherry 유전자의 억압에 근거하기 때문에, 실행 가능한 mCherry 신호가 요구됩니다. 따라서 바인딩 사이트 카세트를 디자인할 때 염두에 두어야 할 두 가지 디자인 규칙이 있습니다. 첫째, mCherry의 개방 판독 프레임(ORF)을 유지해야 합니다. 결합 부위 길이가 다를 수 있기 때문에, 유전자내로 삽입하는 것은 원래 mCherry ORF로부터 하나 또는 두 개의 염기의 이동을 일으킬 수 있다. 따라서 필요한 경우(도4A)바인딩 부위에 즉시 하류에 하나 또는 두 개의 염기를 삽입합니다. 예를 들어, 20-염기 길이의 결합 부위는 2개의 염기의 δ를 가지며, mCherry 유전자에 22개의 염기를 첨가할 것이다. ORF를 유지하려면 총 24개의 기지를 위해 두 개의 기지를 추가해야 합니다. 두 번째 설계 규칙은 mCherry ORF에 스톱 코돈이 삽입되는 것을 방지하는 것입니다. MS2-mut-2(도4B,인세트)와 같은 일부 결합 부위는 가능한 3개의 ORF 중 하나 이상에 위치할 때 스톱 코돈이 포함되어 있다. 이러한 예는 그림 4A에나와 있는데, 여기서 바인딩 사이트는 베이스가 추가되지 않은 경우에만 mCherry ORF와 프레임 내에 있는 스톱 코돈이 포함되어 있습니다. 그 위치에 대한 투여-응답 곡선에서 알 수 있듯이(도4B),mCherry 생산 속도는 검출되지 않았고, 따라서 결합 친화도를 측정할 수 없었다.

그림 4B를 자세히 살펴보면 간격 δ가 mCherry 생산에 미치는 영향을 보여 줍니다. 예를 들어, δ = 4의 경우, 기저 생산률은 δ = 5에 대한 것보다 6 배 더 높았으며, 더 높은 접이식 억압 효과를 보장합니다. 그러나 δ = 14의 경우 기저 생산 수준이 너무 낮아 규제 가 하향 조정 효과를 관찰할 수 없었습니다.

Figure 1
그림 1: 시스템 설계 및 복제 단계 개요 결합 부위 플라스미드(왼쪽)와 RBP-mCerulean 플라스미드(오른쪽)에 대한 카세트 디자인의 그림. 다음 단계는 RBP 플라스미드를 먼저 갖춘 유능한 대장균 세포로 두 플라스미드의 연속적인 변형입니다. 이중 형질전환제는 유도체 농도 증가에서 그들의 mCherry 발현 수준에 대해 시험된다; RBP가 바인딩 사이트에 바인딩되면 mCherry 수준이 mCerulean(회색 버블)의 함수로 감소합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 분석 체계. (a) 원시 OD 수준(위), mCerulean 형광(중간), mCherry 형광(하단)을 시간 및 유도체 농도의 함수로서, 양성 균주를 묘사하는 3차원(3D) 플롯. (B) 상단: 각 유도자 농도에 대한 mCerulean 정상 상태 발현 수준은 각각의 형광 레벨을 각각OD로 나누고 양수(왼쪽)에 대한 2-3h 지수 성장 시간 창의 모든 값에 대해 평균화하여 계산됩니다. 음수 (오른쪽) 균주. 하단: mCherry 생산 속도 계산 Eq. 3 에 대 한 시간 포인트 2−3 유도 후 시간. (C) mCherry 생산율은 2개의 균주에 대해 평균 2개의 생물학적 복제물 이상평균mCerulean 형광의 함수로서 플롯되었다. 오차 바는 적어도 2개의 복제로부터 획득된 mCherry 생산 속도 및 평균 mCerulean 형광둘 다의 표준 편차이다. (D) Eq. 4에서 피팅 공식을 사용하여 KRBP에 적합하여 양성 변형(왼쪽)에 대해 도시된, 특정 결합 반응을 나타낸다. 음수 변형률(오른쪽)의 경우 KRBP 값이 추출되지 않았습니다. 데이터가 중복으로 표시됩니다. 이 그림은 카츠 외10의허가하에 조정되었습니다. 저작권 2018 미국 화학 협회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 대표적인 최종 결과. (A) 서로 다른 위치에서 2개의 RbP 및 10개의 결합 부위에 기초하여 30개의 다른 균주에 대한 정규화된 투여량-응답 곡선. 응답의 세 가지 유형이 관찰된다: 높은 선호도, 낮은 선호도, 그리고 아니 선호도. (B) 5개의 상이한 결합 부위 카세트(나열됨)를 가진 2개의 RBP(MCP 및 PCP)에 대한 정량적 KRBP 결과. 모든 RBP-결합-부위 균주는 중복으로 측정하였다. 이 그림은 카츠 외10의허가하에 조정되었습니다. 저작권 2018 미국 화학 협회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 돌연변이 결합 부위를 가진 MCP에 대한 예시 설계 및 결과. (A) 네 개의 다른 위치에서 바인딩 사이트 카세트의 디자인 그림. 리보솜 결합 부위를 포함하는 카세트, mCherry, δ 스페이서 염기, 결합 부위 시험된 코돈, ORF를 유지하기 위해 하나 또는 두 개의 염기, 및 mCherry 유전자의 나머지 부분을 포함한다. 빨간 별은 정지 코던을 나타냅니다. (B) 4개의 상이한 위치에서 돌연변이 결합 부위를 가진 MCP에 대한 투여-반응 곡선. 인세트: 테스트된 돌연변이 결합 부위의 시퀀스. 제시된 결과는 각 변형균의 복제에 대한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이름 Binidng 사이트 위치, 8 월에 A = 1 바인딩 사이트 시퀀스(컨트롤용 RBS) 사이트: ATG에서 두 번째 m체리 코돈 GTG
컨트롤 : 두 번째 mCherry 코돈 GTG에 RBS
소스
MS2_wt_d5 5개 아카가가타카캣트 atgcacatgaggattaccttgggg 주식회사 젠9
MS2_wt_d6 6개 아카가가타카캣트 atggcacatgaggattacctgtgg 주식회사 젠9
MS2_wt_d8 8개 아카가가타카캣트 atggcgcacatgaggattatcatgt
cgtg
주식회사 젠9
MS2_wt_d9 9개 아카가가타카캣트 atggcgccacatgaggattcatg
tgtg
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MS2_U(-5)C_d8 8개 아카가트카카카트 아그카카가트카차트그그
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MS2_U(-5)C_d9 9개 아카가트카카카트 atggcacatgaggatcacccatggg
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MS2_U(-5)C_d8 8개 아카가가가카캣트 아그카카가가가가카카트그
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MS2_U(-5)G_d9 9개 아카가가가카캣트 atggcacatgaggatgacccatgtg
안내
주식회사 젠9
MS2_struct_d9 9개 카카가그트크랙타그 아차카아그택트크랙타그
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타트가그그타그
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바인딩 사이트 카세트에 대한 시퀀싱 프라이머 gcatttatatatagattagc Idt
RBP 카세트시퀀싱 프라이머 gcggcgctgtctctctataaa Idt

표 1: 바인딩 사이트 및 시퀀싱 프라이머. 본 연구에서 사용된 결합 부위 및 결합 부위 카세트에 대한 서열은 프로토콜에 상세히 설명된 시퀀싱 반응에 대한 프라이머(단계 1.2.5.1 및 1.3.3 단계).

이 작품의 RBP 이름 소스 유기체 이름, 단백질 소스 유기체 유전자 소스 유기체 refseq wt aa seq wt (및 참조)에서 변경 이 작품에 사용되는 aa seq 이 작업에 사용되는 nt seq
Mcp 에슈리치아 바이러스 MS2 Cp NC_001417.2 마센프트QFLv
DNGGTGDVTV
APSN판그바
이비스시서스Q
AYKVTCSVRQ
사크르키티
KVEVPKVATQT VGGVELPVA
아우르실른멜
티피파트
셀리브캄크
LLKDGNPIPS
아이아안기
델프-G [1]
V29I [1]
아드진 플라스미드 27121에서 가져온
마센프트QFLv
DNGGTGDVTV
APSN판지아
이비스시서스Q
AYKVTCSVRQ
사크르키티
KVEVPKG
아우르실른멜
티피파트
셀리브캄크
LLKDGNPIPS
아이아안기
애틀CTCtA
액트액카
GTTCGTTC
GTCGACAATG
GCGGAACTGG
CGACGTGACT
GTCGCCAA
GCAACTTCGC
타아CG가트
GCTGAATGGA
TCAGCTCTAA
CTCGTTCA
카그타카 주
아그타크트G
타빗트CGT
카가카트
CGCAGAATCG
카아타카크
아카아그츠CG
아그티그CTAA
아그CGTGG
CGTTCGTACT
타타타트가
액타카카트
CCAATTTTCG
CCACGAATTC
CGACTGCGAG
CTTATTGTTA
아그카트GC카
애트CTCCTA
아가가아
ACCC가트CC
CTCAGCAATC
GCAGCAAACT
CCGGCATCTAC
주치의 슈도모나스 파지 PP7 Cp NC_001628.1 MSKTIVLSVGEA
TRTLTEIQST
아드르키피크V
GPLVGRLRLT
아스크랑가크
에어브NLKlDQ
ADVVDCSTSVC
GE
LPKVRYTQ
폭스바겐스HDVTIVA
NSTEASRKSL
YDLTKSLVAT
SQVEDLVVNL
VPLGR
델프-G [2]
애드진 플라스미드 40650에서 가져온
MLASKTIVLSVG
이트틀틱
스타드르키피
KVGPLVGRLR
LTASLRQNGA
KTAYRVNLKL
DQADVVDSG
LPKVRYTQVW
SHDVTIVANS
티스크슬린
LTKSLVATSQ
VEDLVVNLVP
LGR
ATGCTAGCCTC
카아카카
GTTCTTTCGG
TCGGCGAGGC
택지크크
CTGACTGAGA가가가가
TCCAGTCCAC
CGCAGGT
카가트트트CG
아가가그트
CGGGCCTCtG
GTGTCGGC
TGCGCCTCAC
GGCTTCGCTC
CGTCAAAACG
가그카악
CGCGTATCGC
GTCAACCTAA
아액가카
GGCGGACGTC
GTTGATTCCG
가크트CCGAA
아그GCGCTAC
액카그타트
GGTCGCACGA
CGTGACAATC
GTGCGAATA
GCACCGAGGC
CTCGCAAA
TCGTTGTACG
아트가카아
GTCCCTCGTC
GCGACCTCGC
아그트CG아가가
TCTTGTCGTC
아흐트GTGC
CGCTGGGCCGT
참조:
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표 2: RBP 시퀀스. 본 연구에서 사용되는 외투 단백질의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열.

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Discussion

본 항에 기술된 방법은 대장균 세포에서 RBP-RNA 결합 친화도의 생체 내 정량적 측정을 용이하게 한다. 이 프로토콜은 비교적 쉽고 정교한 기계를 사용하지 않고도 수행될 수 있으며 데이터 분석은 간단합니다. 더욱이, 결과는 차세대 염기서열 분석(NGS) 결과와 관련된 비교적 긴 대기 시간 없이 즉시 생성된다.

이 방법의 한 가지 제한은 세균 세포에서만 작동한다는 것입니다. 그러나, 이전 연구12 포유류 세포에서 L7AE RBP에 대 한 유사한 접근을 사용 하 여 억압 효과 입증 했다. 이 방법의 추가적인 제한은 mCherry 개시 영역에서 결합 부위의 삽입이 기저 mCherry 레벨을 억압할 수 있다는 것입니다. 구조적 복잡성 또는 결합 부위의 높은 안정성은 RBP가 없는 경우에도 리보좀 개시를 방해할 수 있으며, 이로 인해 mCherry 기저 농도가 감소할 수 있다. 기저 수준이 너무 낮으면 RBP의 농도를 증가시킴으로써 초래된 추가적인 억압은 관찰할 수 없습니다. 이러한 경우, 개시 영역에서 여전히 결합 부위와 결합 부위카세트를 설계하는 것이 가장 좋지만, 개시 영역에서 신장 영역으로의 전환 직전에 (12-15 bp10,29의 범위에서 δ). 우리는 이러한 δ 값에 대한 억압 효과가 여전히 관찰 될 수 있음을 보여 주었다. 구조적 복잡성에 관계없이 분석이 작동할 가능성을 높이려면 주어진 바인딩 사이트에 대해 적어도 세 개의 서로 다른 위치에 대한 분석 작업을 수행하는 것이 좋습니다.

EMSA와 같은 체외 내 방법과 비교하여 이 방법의 주요 단점은 RBP-RNA 결합 친화도가 RBP 농도의 절대 단위로 측정되지 않고 오히려 융합-RBP 형광의 관점에서 측정된다는 것입니다. 이러한 단점은 생체 내 설정의 직접적인 결과, RBP의 실제 농도 를 읽는 우리의 능력을 제한 하는. 이러한 단점은 생체 내 설정에서 측정의 이점에 의해 상쇄된다. 예를 들면, 우리는 생체 외 에서 이전 시험관외 및 심상 분석실험에 우리의 생체 내 분석에서 결과를 비교할 때 결합 친화성에 있는 다름을 찾아냈습니다. 이러한 차이는 세포 내부의 존재로부터 나타나는 생체 내 mRNA 분자의 구조에서 불일치에서 유래 할 수있다10,11,30,31. 이러한 구조적 차이는 생체 내에서 접힌 상태의 안정성의 변화로 이어질 수 있으며, 이는 차례로 RBP 결합을 안정화 또는 안정화시되게 한다.

이 방법은 비교적 간단하고 저렴하기 때문에 실제 실험과 함께 여러 컨트롤을 실행하는 것이 좋습니다. 음의 대조군, 즉 RBP에 대한 친화력이 없는 서열은 아직 유사한 구조적 특징을 가지며, mRNA와의 비특이적 상호작용으로부터 유래되는 거짓 양성을 피하는 데 도움이 될 수 있다. 도시된 대표적인 결과에서, 2개의 음성 대조군은 mCherry 유전자 단독(결합 부위 없음) 및 다른 RBP의 네이티브 결합 부위(즉, MCP및 PCP를 위한 MS2-wt에 대한 PP7-wt)였다. 또한, 우리는 긍정적 인 제어 (RBP 및 기본 바인딩 사이트 등)를 통합 하는 것이 제안 합니다. 이러한 제어는 기준점을 제시하고 낮은 접기 억압에서 비롯된 거짓 부정을 피함으로써 결합 친화성을 정량화하는 데 도움이 됩니다.

마지막으로, RBP-RNA 결합의 구조적 관점을 얻고자하는 사람들을 위해, 우리는 프라이머 확장 시퀀싱에 의해 분석 된 선택적 2′-하이드록실 아실화를 수행 제안 (SHAPE-Seq)11,32,33 실험. SHAPE-Seq는 RNA의 화학적 프로빙과 결합된 NGS 접근법으로, 단백질과 같은 다른 분자와의 RNA 상호 작용뿐만 아니라 RNA의 이차 구조를 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 이전 작업에서 우리는 생체 내 조건 모두에서 대표적인 균주에 SHAPE-Seq 실험을 실시34 정제 재조합 단백질 체외에서 10,35. 우리의 경우에, 결과는 RBP 결합이 시험관내36에서이 RBPs를 위해 이전에 보고된 보다는 RNA의 훨씬 더 넓은 세그먼트에 영향을 미쳤다는 것을 밝혔습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 프로젝트는 기획 및 예산 위원회의 I-CORE 프로그램과 이스라엘 과학 재단 (그랜트 번호 152/11), 마리 퀴리 재통합 보조금 번호에서 자금을 받았다. PCIG11-GA- 2012-321675, 및 보조금 계약 번호 664918에 따라 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 - MRG-문법.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin sodium salt SIGMA A9518
Magnesium sulfate (MgSO4) ALFA AESAR 33337
48 plates Axygen P-5ML-48-C-S
8-lane plates Axygen RESMW8I
96-well plates Axygen P-DW-20-C
96-well plates for plate reader Perkin Elmer 6005029
ApaLI NEB R0507
Binding site sequences Gen9 Inc. and Twist Bioscience see Table 1
E. coli TOP10 cells Invitrogen C404006
Eagl-HF NEB R3505
Glycerol BIO LAB 071205
Incubator TECAN liconic incubator
Kanamycin solfate SIGMA K4000
KpnI- HF NEB R0142
Ligase NEB B0202S
Liquid-handling robotic system TECAN EVO 100, MCA 96-channel
Matlab analysis software Mathworks
Multi- pipette 8 lanes Axygen BR703710
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) cayman K40982552 019
PBS buffer Biological Industries 020235A
Platereader TECAN Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polymerase NEB M0493
RBP seqeunces Addgene 27121 & 40650 see Table 2
Sodium Chloride (NaCL) BIO LAB 190305
SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9281
Tryptone BD 211705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Katz, N., Cohen, R., Atar, O., Goldberg, S., Amit, R. An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria. J. Vis. Exp. (148), e59611, doi:10.3791/59611 (2019).

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