Summary
En este método, cuantificamos la afinidad de unión de proteínas de unión al ARN (RBP) a sitios de unión cognados y no cognados utilizando un ensayo de reportero simple, vivo y en células bacterianas. El ensayo se basa en la represión de un gen reportero.
Abstract
En el paso de iniciación de la traducción proteica, el ribosoma se une a la región de iniciación del ARNm. La iniciación de la traducción se puede bloquear mediante la unión de una proteína de unión al ARN (RBP) a la región de iniciación del ARNm, lo que interfiere con la unión ribosoma. En el método presentado, utilizamos este fenómeno de bloqueo para cuantificar la afinidad de unión de los BBP con sus sitios de enlace cognados y no cognados. Para ello, insertamos un sitio de enlace de prueba en la región de iniciación de un ARNm de reportero e inducemos la expresión de la RBP de prueba. En el caso de la unión RBP-RNA, observamos una represión sigmoidal de la expresión del reportero en función de la concentración de RBP. En el caso de la no afinidad o la afinidad muy baja entre el sitio de enlace y la RBP, no se observó una represión significativa. El método se lleva a cabo en células bacterianas vivas, y no requiere maquinaria costosa o sofisticada. Es útil para cuantificar y comparar entre las afinidades de unión de diferentes PBP que son funcionales en bacterias a un conjunto de sitios de unión diseñados. Este método puede ser inapropiado para sitios de enlace con alta complejidad estructural. Esto se debe a la posibilidad de represión de la iniciación ribosomal por compleja estructura de ARNm en ausencia de RBP, lo que resultaría en una expresión genética de reportero basal más baja, y por lo tanto una represión de reportero menos observable sobre la vinculación de la RBP.
Introduction
La regulación post-transcripción basada en proteína de unión al ARN (RBP), caracterizada específicamente de la interacción entre los PBP y el ARN, se ha estudiado extensamente en las últimas décadas. Hay múltiples ejemplos de regulación descendente traslacional en bacterias originadas por PBP que inhiben, o compiten directamente con, la unión ribosoma1,2,3. En el campo de la biología sintética, las interacciones RBP-ARN están emergiendo como una herramienta significativa para el diseño de circuitos genéticos basados en transcripción4,5. Por lo tanto, hay un aumento en la demanda de caracterización de tales interacciones RBP-ARN en un contexto celular.
Los métodos más comunes para estudiar las interacciones proteína-ARN son el ensayo de cambio de movilidad electroforético (EMSA)6, que se limita a entornos in vitro, y varios ensayos desplegables7,incluido el método CLIP8,9 . Si bien estos métodos permiten el descubrimiento de sitios de enlace de ARN novo, sufren de inconvenientes tales como protocolos intensivos en mano de obra y costosas reacciones de secuenciación profunda y pueden requerir un anticuerpo específico para la extracción de RBP. Debido a la naturaleza susceptible del ARN a su entorno, muchos factores pueden afectar las interacciones RBP-ARN, haciendo hincapié en la importancia de interrogar la unión RBP-ARN en el contexto celular. Por ejemplo, nosotros y otros hemos demostrado diferencias significativas entre las estructuras de ARN in vivo e in vitro10,11.
Basándonos en el enfoque de un estudio anterior12, recientemente demostramos10 que al colocar sitios de unión prediseñados para los PBP cápside de los bacteriófagos GA13, MS214, PP715y Q-16 en el región de iniciación de traducción de un ARNm reportero, la expresión del reportero está fuertemente reprimida. Presentamos un método relativamente simple y cuantitativo, basado en este fenómeno de represión, para medir la afinidad entre los PBP y su correspondiente sitio de unión de ARN in vivo.
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Protocol
1. Preparación del sistema
- Diseño de plásmidos de sitio de encuadernación
- Diseñe el cassette del sitio de enlace como se muestra en la Figura1. Cada minigen contiene las siguientes partes (5' a 3'): sitio de restricción de Eagl, 40 bases del extremo de 5' del gen de resistencia de kanamicina (Kan), promotor pLac-Ara, sitio de unión ribosoma (RBS), AUG del gen mCherry, un espaciador ( ) , un sitio de unión RBP, 80 bases del extremo 5' del gen mCherry, y un sitio de restricción de ApaLI.
NOTA: Para aumentar la tasa de éxito del ensayo, diseñe tres casetes de sitio de enlace para cada sitio de enlace, con espaciadores que consisten en al menos una, dos y tres bases. Consulte la sección Resultados representativos para obtener más directrices.
- Diseñe el cassette del sitio de enlace como se muestra en la Figura1. Cada minigen contiene las siguientes partes (5' a 3'): sitio de restricción de Eagl, 40 bases del extremo de 5' del gen de resistencia de kanamicina (Kan), promotor pLac-Ara, sitio de unión ribosoma (RBS), AUG del gen mCherry, un espaciador ( ) , un sitio de unión RBP, 80 bases del extremo 5' del gen mCherry, y un sitio de restricción de ApaLI.
- Clonación de plásmidos de sitios de encuadernación
- Ordene los casetes del sitio de unión como minigenes de ADN de doble cadena (dsDNA). Cada minigene tiene 500 bp de largo y contiene un sitio de restricción de Eagl y un sitio de restricción ApaLI en los extremos de 5' y 3', respectivamente (ver paso 1.1.1).
NOTA: En este experimento, se ordenaron minigenes con la mitad del gen kanamicina para facilitar la detección de colonias positivas. Sin embargo, Gibson ensamblaje17 también es adecuado aquí, en cuyo caso el sitio de unión se puede pedir como dos oligos de ADN complementarios más cortos de una sola cadena. - Digerir dos veces tanto los minigenes como el vector de destino con Eagl-HF y ApaLI mediante el protocolo de restricción18,y purificar la columna19.
- Ligar los minigenes digeridos a la columna vertebral del sitio de unión que contiene el resto del gen reportero mCherry, terminador, y un gen de resistencia a la kanamicina20.
- Transformar la solución de ligación en Escherichia coli TOP10 células21.
- Identifique transformadores positivos a través de la secuenciación de Sanger.
- Diseñe una imprimación de 100 bases aguas arriba de la región de interés (véase el Cuadro 1 para las secuencias de imprimación).
- Miniprep algunas colonias bacterianas22.
- Preparar 5 ml de una solución de 5 mM de la imprimación y 10 ml del ADN a una concentración de 80 ng/L.
- Envíe las dos soluciones a una instalación conveniente para la secuenciación de Sanger23.
- Almacene los plásmidos purificados a -20 oC, y las cepas bacterianas como las existencias de glicerol24,ambas en el formato de 96 oC. El ADN se utilizará para la transformación en células De. coli TOP10 que contienen uno de los cuatro plásmidos de fusión-RBP (ver paso 1.3.5).
- Ordene los casetes del sitio de unión como minigenes de ADN de doble cadena (dsDNA). Cada minigene tiene 500 bp de largo y contiene un sitio de restricción de Eagl y un sitio de restricción ApaLI en los extremos de 5' y 3', respectivamente (ver paso 1.1.1).
- Diseño y construcción del plásmido RBP
NOTA: Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las proteínas de capa utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla2.- Ordene la secuencia RBP requerida que carezca de un codón de parada como un minigénmino dsDNA ordenado a medida que carece de un codón de parada con sitios de restricción en los extremos (Figura1).
- Clonar la RBP probada que carece de un codón de parada inmediatamente aguas abajo de un promotor inducible y aguas arriba de una proteína fluorescente que carece de un codón de inicio (Figura1), similar a los pasos 1.2.2-1.2.4. Asegúrese de que el plásmido RBP contiene un gen de resistencia a los antibióticos diferente del plásmido del sitio de unión.
- Identifique transformadores positivos mediante la secuenciación de Sanger, similar al paso 1.2.5 (consulte la Tabla 1 para las secuencias de imprimación).
- Elija un transformador positivo y hacerlo químicamente competente25. Conservar como plásmidos purificados de glicerol a -20 oC y reservas de glicerol de cepas bacterianas24 a -80 oC en placas de 96 pocillos.
- Transformar los plásmidos del sitio de unión (del paso 1.2.6) almacenados en placas de 96 pocillos en células bacterianas químicamente competentes que ya contienen un plásmido RBP-mCerulean21. Para ahorrar tiempo, en lugar de enchapar las células en los platos de Petri, placarlos usando un pipeteador de 8 canales en placas de 8 carriles que contienen Luria-Bertani (LB)26 agar con antibióticos relevantes (Kan y Amp). Las colonias deben aparecer en 16 h.
- Seleccione una sola colonia para cada doble transformador y crezca durante la noche en medio LB con los antibióticos relevantes (Kan y Amp) y almacene como reservas de glicerol24 a -80 oC en placas de 96 pocillos.
2. Configuración del experimento
NOTA: El protocolo presentado aquí se realizó utilizando un sistema robótico de manipulación de líquidos en combinación con una incubadora y un lector de placas. Cada medición se llevó a cabo para 24 concentraciones de inductores, con dos duplicados para cada cepa + combinación de inductor. Usando este sistema robótico, se recogieron datos de 16 cepas por día con 24 concentraciones de inductores. Sin embargo, si un dispositivo de este tipo no está disponible, o si se realizan menos experimentos, estos se pueden hacer fácilmente a mano utilizando una multipipe de 8 canales y adaptando el protocolo en consecuencia. Por ejemplo, se adquirieron resultados preliminares para cuatro cepas al día con 12 concentraciones de inductores y cuatro puntos de tiempo de esta manera.
- Preparar, de antemano, 1 L de tampón de bioensayo (BA) mezclando 0,5 g de tripatona, 0,3 ml de glicerol, 5,8 g de NaCl, 50 ml de 1 M MgSO4, 1 ml de 10x de tampón de solución salina con fosfato (PBS) pH 7,4 y 950 ml de agua destilada doble (DDW). Autoclave o filtro estéril del búfer BA.
- Cultivar las cepas de doble transformación a 37 oC y 250 rpm agitando en 1,5 ml de LB con antibióticos adecuados (kanamicina a una concentración final de 25 g/ml y ampicilina a una concentración final de 100 ég/ml), en placas de 48 pocillos, durante un período de 18 h (durante la noche).
-
Por la mañana, haga los siguientes preparativos.
- Placa de inductor. En una placa limpia de 96 pocillos, prepare los pozos con un medio semi-pobre (SPM) que consta de 95% BA y 5% LB26 en la incubadora a 37oC. El número de pozos corresponde al número deseado de concentraciones de inductores. Añadir C4-HSL a los pocillos de la placa inductora que contendrá la mayor concentración de inductor (218 nM).
- Programe el robot para diluir en serie el medio de cada uno de los pozos de mayor concentración en 23 concentraciones más bajas que van de 0 a 218 nM. El volumen de cada dilución del inductor debe ser suficiente para todas las cepas (incluidos los duplicados).
- Mientras se preparan las diluciones del inductor, caliente 180 s de SPM en la incubadora a 37 oC, en placas de 96 pocillos.
- Diluir las cepas durante la noche del paso 2.2 por un factor de 100 por diluciones en serie: primero diluir por un factor de 10 mezclando 100 s de bacterias con 900 sL de SPM en placas de 48 pocillos, y luego diluir de nuevo por un factor de 10 tomando 20 s de la solución diluida en 180 l de SPM precalentado, en placas de 96 pocillos adecuadas para mediciones fluorescentes.
- Agregue el inductor diluido de la placa del inductor a las placas de 96 pocillos con las cepas diluidas de acuerdo con las concentraciones finales.
- Agitar las placas de 96 pocillos a 37oC durante 6 h, mientras se toman medidas de densidad óptica a 595 nm (OD595),mCherry (560 nm/612 nm) y fluorescencia mCerulean (460 nm/510 nm) a través de un lector de placas cada 30 minutos. Para fines de normalización, mida el crecimiento de SMP sin necesidad de agregar células.
3. Análisis preliminar de resultados
- Para cada día de experimento, elija un intervalo de tiempo de crecimiento logarítmico de acuerdocon las curvas de crecimiento medidas, entre la fase de crecimiento lineal y la estacionaria (T 0, Tfinal). Tome aproximadamente 6 x 8 puntos de tiempo, mientras descarta la primera y la última mediciones para evitar errores derivados de la inexactitud de la detección exponencial del crecimiento (véase la figura 2A,panel superior).
NOTA: Deseche las cepas que muestran curvas de crecimiento anormales o cepas en las que no se pudo detectar la fase de crecimiento logarítmico y repita el experimento. -
Calcular la fluorescencia normalizada media de mCerulean y la tasa de producción de mCherry, a partir de los datos brutos de fluorescencia mcerulean y mCherry para cada concentración de inductor (Figura2A).
- Calcule mCerulean normalizado de la siguiente manera:
donde blank(mCerulean) es el nivel mCerulean [a.u.] para medio solamente, blank(OD) es la densidad óptica para medios solamente, y mCerulean y OD son los valores de fluorescencia mceruleana y densidad óptica, respectivamente. - MCerulean promedio sobre los diferentes puntos de tiempo (Figura2B,dos paneles superiores) de la siguiente manera:
donde #Time puntos es el número de puntos de tiempo de datos que se tienen en cuenta, T0 es el momento en el que comienza la fase de crecimiento exponencial, y Tfinal es el momento en el que finaliza la fase de crecimiento exponencial. - Calcule la tasa de producción de mCherry (Figura2B,dos paneles inferiores) de la siguiente manera:
donde mCherry(t) es el nivel de mCherry [a.u.] en el momento t, OD es el valor de densidad óptica, T0 es el momento en el que comienza la fase de crecimiento exponencial, y Tfinal es el momento en el que finaliza la fase de crecimiento exponencial.
- Calcule mCerulean normalizado de la siguiente manera:
- Por último, trazar la tasa de producción de mCherry en función de mCerulean, creando curvas de respuesta a la dosis en función de la fluorescencia de fusión RBP-mCerulean (Figura2C). Tales tramas representan la producción del gen reportero en función de la presencia de la RBP en la célula.
4. Rutina de ajuste de la función de respuesta de la dosis y extracción de KRBP
- Bajo el supuesto de que la tasa de traducción ribosoma con el límite RBP es constante, modele la tasa de producción de mCherry de la siguiente manera (véase la figura 2D,línea verde):
donde [x] es la fluorescencia media normalizada de mCerulean calculada de acuerdo con Eq. 2, la tasa de producción de mCherry es el valor calculado de acuerdo con Eq. 3, KRBP es la afinidad de unión relativa [a.u.], Ksin consolidar es la tasa ribosoma de traducción con la RBP sin consolidar, n es el factor de cooperatividad, y C es la fluorescencia base [a.u.]. C, n, Ksin consolidary KRBP se encuentran ajustando los datos de la velocidad de producción de mCherry al modelo (Eq. 4). - Utilizando el software de análisis de datos, lleve a cabo un procedimiento de ajuste en parcelas que representen la tasa de producción de mCherry en función de mCerulean promedio (paso 3.3) y extraiga los parámetros de ajuste de acuerdo con la fórmula en Eq. 4.
NOTA: Solo se tienen en cuenta los resultados de ajuste con R2 > 0,6. Para esos ajustes, error KRBP está principalmente en el rango de 0.5% a 20% de los valores de KRBP, para un intervalo de confianza 0.67, mientras que aquellos con mayor error KRBP también pueden ser verificados por ojo. - Normalizar los valores deK RBP por el valor máximo respectivo de mCerulean promediado para cada función dosis-respuesta.
donde KRBP en [a.u.] es el valor extraído del procedimiento de ajuste en Eq. 4, y max (mCerulean promediado) es la señal mCerulean media máxima [a.u] observada para la cepa actual.
NOTA: La normalización facilita la comparación correcta del efecto regulador entre las cepas al eliminar la dependencia de los niveles máximos de expresión de RBP particulares.
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Representative Results
El método presentado utiliza la competencia entre una RBP y el ribosoma para la unión a la molécula de ARNm (Figura1). Esta competencia se refleja en la disminución de los niveles de mCherry en función del aumento de la producción de RBP-mCerulean, debido al aumento de las concentraciones de inductor. En el caso del aumento de la fluorescencia de la macurrulenta, sin cambios significativos en el mCherry, se deduce la falta de unión RBP. Los resultados representativos de una cepa positiva y negativa se muestran en la Figura2. En la Figura 2A,los canales OD, mCherry y mCerulean se presentan en función del tiempo y del inductor en un intervalo de cuatro horas, con T0 a 1 h y Tfinal a 3,5 h. En la Figura 2B,la fluorescencia media de la mceruleana (arriba) y la tasa de producción de mCherry (abajo) se presentan en función de la concentración del inductor, para las dos cepas de ejemplo. Como se puede observar, los resultados de una tensión positiva muestran un claro efecto regulador descendente en la tasa de producción de mCherry (Figura2B,C), que se traduce en un valor significativo distinto de cero de KRBP (Figura2D). Para la deformación unitaria positiva, el procedimiento de ajuste arrojó los siguientes valores: KRBP a 394,6 a.u., Ksin consolidar a 275,6, n a 2,1, C a 11,2 a.u., y R2 a 0,93. Después de la normalización por la fluorescencia máxima de la guapero, el valor de KRBP fue de 0,24. Para la tensión negativa, se observó una falta de respuesta distinta (Figura2C)y no se extrajo ningún valor KRBP (Figura 2D).
En la Figura3, presentamos los resultados de este ensayo para dos PBP de capa de fago, PP7 y MS2, en varios sitios de unión mutados, en diferentes ubicaciones dentro de la región de iniciación del ARNm mCherry. Los resultados se clasifican aproximadamente en tres tipos de respuestas (Figura3A):cepas que presentan un efecto regulador descendente a un nivel mCerulean bajo, lo que refleja un bajo valor deKRBP (alta afinidad de unión); cepas que presentan un efecto regulador descendente a niveles intermedios o altos de mCerulean, reflejando un alto valor deKBP (afinidad intermedia o baja); y cepas que no presentan una respuesta distinta al aumento de los niveles de mCerulean, reflejando un valor de KRBP más alto que la concentración máxima de RBP en la célula (sin afinidad de unión detectable). La Figura 3B presenta el valor mínimo de KRBP calculado para cada combinación de sitio de enlace RBP basada en todas las combinaciones de los dos RBP y diez sitios de enlace en posiciones diferentes. Los sitios de unión incluyen un control negativo (sin sitio de unión), sitios de unión no coincidentes y un control positivo: el sitio de unión nativo para cada RBP (PP7-wt para la proteína de recubrimiento PP7 [PCP] y MS2-wt para la proteína de capa MS2 [MCP]). Los resultados coinciden con las predicciones, ya que ambos RBP presentan una alta afinidad por sus controles positivos y una afinidad de enlace no detectable para los controles negativos. Además, estudios previos con estos dos RBP27,28 han observado que son ortogonales, lo que se transmite claramente en el mapa de calor presentado: tanto MCP como PCP no enlazan el sitio nativo de la otra RBP. Además, los sitios de enlace mutados presentan resultados variables, donde algunos sitios de enlace mostraron un nivel de afinidad similar al del sitio nativo, como PP7-mut-1, PP7-mut-2 y MS2-mut-3, mientras que otros mostraron una afinidad significativamente menor, como PP7-mut-3 y MS2-mut-2. Por lo tanto, el ensayo presentó una medición cuantitativa in vivo de la afinidad vinculante de los BBP, dando resultados comparables a los de experimentos anteriores con estos PBP.
Dado que el ensayo se basa en la represión del gen mCherry, se requiere una señal mCherry viable. Por lo tanto, al diseñar el casete del sitio de enlace, hay dos reglas de diseño a tener en cuenta. En primer lugar, se debe mantener el marco de lectura abierto (ORF) del mCherry. Dado que la longitud del sitio de unión puede variar, insertarlo en el gen puede causar un desplazamiento de una o dos bases del mCherry ORF original. Por lo tanto, si es necesario (figura4A),inserte una o dos bases inmediatamente aguas abajo en el sitio de enlace. Por ejemplo, un sitio de unión de 20 bases de largo, con un valor de dos bases, producirá una adición de 22 bases al gen mCherry. Para mantener el ORF, necesitamos añadir dos bases, para un total de 24 bases. La segunda regla de diseño es evitar inserciones de codones de parada en el mCherry ORF. Algunos sitios de enlace, como el MS2-mut-2 (Figura4B, inset), contienen codones de detención cuando se colocan en uno o más de los tres ORF posibles. Tal ejemplo se ilustra en la Figura 4A, donde el sitio de enlace contenía un codón de detención que está en fotograma con el mCherry ORF solo cuando no se agregan bases. Como se puede ver en la curva dosis-respuesta para esa posición (Figura4B),la tasa de producción de mCherry era indetectable, por lo que no se pudo medir la afinidad de unión.
Una mirada más detallada a la Figura 4B demuestra el efecto del espaciado en la producción de mCherry. Por ejemplo, para el valor 4, la tasa de producción basal fue un factor de seis más que las de 5 euros, lo que garantiza un mayor efecto de represión. Sin embargo, para el valor 14, los niveles de producción basales eran demasiado bajos para observar un efecto regulador descendente.
Figura 1: Descripción general del diseño del sistema y los pasos de clonación. Ilustración del diseño del cassette para el plásmido del sitio de encuadernación (izquierda) y plásmido RBP-mCerulean (derecha). El siguiente paso son las transformaciones consecutivas de ambos plásmidos en células competentes de E. coli, con plásmidos RBP primero. Los transformadores dobles se prueban para sus niveles de expresión de mCherry en el aumento de las concentraciones de inductores; si la RBP se une al sitio de enlace, los niveles de mCherry disminuyen en función de mCerulean (burbuja gris). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de análisis. (A) Gráficas tridimensionales (3D) que representan los niveles de OD crudos (arriba), fluorescencia mceruleana (medio) y fluorescencia mCherry (abajo) en función del tiempo y la concentración del inductor, para una cepa positiva. (B) Parte superior: los niveles de expresión de estado estacionario mCerulean para cada concentración de inductor se calculan dividiendo cada nivel de fluorescencia por el DO respectivo y promediando sobre todos los valores en la ventana de tiempo de crecimiento exponencial de 2 x 3 h tanto para el positivo (izquierda) y cepas negativas (derechas). Parte inferior: tasa de producción de mCherry calculada según Eq. 3 para puntos de tiempo 2 x 3 h después de la inducción. (C) tasa de producción de mCherry trazada en función de la fluorescencia media de la mceruleana promedió en dos duplicados biológicos para dos cepas. Las barras de error son la desviación estándar de la tasa de producción de mCherry y la fluorescencia media de mCerulean adquirida de al menos dos réplicas. (D) Ajuste para KRBP utilizando la fórmula de ajuste en Eq. 4 mostrada para la tensión positiva (izquierda), exhibiendo una respuesta de unión específica. Para la cepa negativa (derecha), no se extrajo ningún valor KRBP. Los datos se muestran duplicados. Esta figura ha sido adaptada con el permiso de Katz et al.10. Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados finales representativos. (A) Curvas de dosis-respuesta normalizadas para treinta cepas diferentes basadas en dos RBP y diez sitios de encuadernación en diferentes ubicaciones. Se observan tres tipos de respuestas: alta afinidad, baja afinidad y ninguna afinidad. (B) Resultados cuantitativos de KRBP para dos PBP (MCP y PCP) con cinco casetes de sitio de enlace diferentes (listados). Todas las cepas del sitio de unión RBP se midieron por duplicado. Esta figura ha sido adaptada con el permiso de Katz et al.10. Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplo de diseño y resultados para MCP con un sitio de enlace mutante. (A) Ilustración de diseño de los casetes del sitio de enlace en cuatro ubicaciones diferentes. Cassette incluyendo el sitio de unión ribosoma, iniciar el codón para el mCherry, bases espaciadores, el sitio de unión probado, una o dos bases para mantener el ORF, y el resto del gen mCherry. Las estrellas rojas indican un codón de parada. (B) Curvas de dosis-respuesta para MCP con un sitio de unión mutante en cuatro ubicaciones diferentes. Inset: la secuencia del sitio de enlace mutado probado. Los resultados presentados son para duplicados de cada cepa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Ubicación del sitio binidng, A en AUG 1 | Secuencia de sitio de enlace (RBS para controles) | Sitio: ATG al segundo mCherry codon GTG Controles: RBS al segundo mCherry codon GTG |
Fuente |
| MS2_wt_d5 | 5 | acatgaggattacccatgt | atgcacatgaggattacccatgtcgg | Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d6 | 6 | acatgaggattacccatgt | atggcacatgaggattacccatgtgg | Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d8 | 8 | acatgaggattacccatgt | atggcgcacatgaggattacccatgt Cgtg |
Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d9 | 9 | acatgaggattacccatgt | atggcgccacatgaggattacccatg tgtg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U(-5)C_d8 | 8 | acatgaggatcacccatgt | atgcacatgaggatcacccatgtgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U(-5)C_d9 | 9 | acatgaggatcacccatgt | atggcacatgaggatcacccatgtg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U(-5)C_d8 | 8 | acatgaggatgacccatgt | atgcacatgaggatgacccatgtgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U(-5)G_d9 | 9 | acatgaggatgacccatgt | atggcacatgaggatgacccatgtg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_struct_d9 | 9 | cacaagaggttcacttatg | atggccacaagaggttcacttatgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_struct_d8 | 8 | cacaagaggttcacttatg | atgccacaagaggttcacttatggg Tg |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d5' | 5 | taaggagtttatatggaaccctta | atgctaaggagtttatatggaaacc cttacgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d6' | 6 | taaggagtttatatggaaccctta | atgaataaggagtttatatggaaac ccttagtg |
Twist Bioscience |
| PP7wt_d8' | 8 | taaggagtttatatggaaccctta | atgaacataaggagtttatatggaa acccttacgtg |
Twist Bioscience |
| PP7wt_d9' | 9 | taaggagtttatatggaaccctta | atgaacaataaggagtttatatgga aacccttagtg |
Twist Bioscience |
| PP7_USLSBm_d6 | 6 | taaccgctttatatggaaagggtta | atggctaaccgctttatatggaaag ggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USLSBm_d15 | 15 | taaccgctttatatggaaagggtta | atgggcgccggcgctaaccgcttta tatggaaagggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d5 | 5 | taagggtttatatggaaccctta | atgctaagggtttatatggaaaccc ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d6 | 6 | taagggtttatatggaaccctta | atggctaagggtttatatggaaacc cttatgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USs_d5 | 5 | taaggagttatatggaccctta | atgctaaggagttatatggaaccct tagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USs_d6 | 6 | taaggagttatatggaccctta | atggctaaggagttatatggaaccc ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d1 | - | - | ttaaagaggagaaagacccatgg Tg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d4 | - | - | ttaaagaggagaaagacccatgg gcgtg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d10 | - | - | ttaaagaggagaaagacccatgg gcgccggcgtg |
Gen9 Inc. |
| Imprimación de secuenciación para casetes de sitio de enlace | gcatttttatccataagattagcgg | IDT | ||
| Imprimación de secuenciación para casetes RBP | gcggcgctgggtctcatctaataa | IDT | ||
Tabla 1: Sitios de encuadernación y imprimaciones de secuenciación. Secuencias para los sitios de encuadernación y casetes de sitio de enlace utilizados en este estudio, así como las imprimaciones para las reacciones de secuenciación detalladas en el protocolo (pasos 1.2.5.1 y 1.3.3).
| Nombre RBP en esta obra | nombre del organismo fuente, proteína | fuente del organismo gen | organismo fuente refseq | wt aa seq | cambios de wt (y referencias) | aa seq utilizado en este trabajo | nt seq utilizado en este trabajo |
| Mcp | Virus Escherichia MS2 | Cp | NC_001417.2 | MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGVA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKVATQT VGGVELPVA AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
delF-G [1] V29I [1] tomado del plásmido de addgene 27121 |
MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGIA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKG AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
ATGGCTTCTA ACTTTACTCA GTTCGTTCTC GTCGACAATG GCGGAACTGG CGACGTGACT GTCGCCCCAA GCAACTTCGC TAACGGGATC GCTGAATGGA TCAGCTCTAA CTCGCGTTCA CAGGCTTACA AAGTAACCTG TAGCGTTCGT CAGAGCTCTG CGCAGAATCG CAAATACACC ATCAAAGTCG AGGTGCCTAA AGGCGCCTGG CGTTCGTACT TAAATATGGA ACTAACCATT CCAATTTTCG CCACGAATTC CGACTGCGAG CTTATTGTTA AGGCAATGCA AGGTCTCCTA AAAGATGGAA ACCCGATTCC CTCAGCAATC GCAGCAAACT CCGGCATCTAC |
| Pcp | Pseudomonas phage PP7 | Cp | NC_001628.1 | MSKTIVLSVGEA TRTLTEIQST ADRQIFEEKV GPLVGRLRLT ASLRQNGAKT AYRVNLKLDQ ADVVDCSTSVC GELPKVRYTQ VWSHDVTIVA NSTEASRKSL YDLTKSLVAT SQVEDLVVNL VPLGR |
delF-G [2] tomado de plásmido de addgene 40650 |
MLASKTIVLSVG EATRTLTEIQ STADRQIFEE KVGPLVGRLR LTASLRQNGA KTAYRVNLKL DQADVVDSG LPKVRYTQVW SHDVTIVANS TEASRKSLYD LTKSLVATSQ VEDLVVNLVP Lgr |
ATGCTAGCCTC CAAAACCATC GTTCTTTCGG TCGGCGAGGC TACTCGCACT CTGACTGAGA TCCAGTCCAC CGCAGACCGT CAGATCTTCG AAGAGAAGGT CGGGCCTCTG GTGGGTCGGC TGCGCCTCAC GGCTTCGCTC CGTCAAAACG GAGCCAAGAC CGCGTATCGC GTCAACCTAA AACTGGATCA GGCGGACGTC GTTGATTCCG GACTTCCGAA AGTGCGCTAC ACTCAGGTAT GGTCGCACGA CGTGACAATC GTTGCGAATA GCACCGAGGC CTCGCGCAAA TCGTTGTACG ATTTGACCAA GTCCCTCGTC GCGACCTCGC AGGTCGAAGA TCTTGTCGTC AACCTTGTGC CGCTGGGCCGT |
| Referencias: | |||||||
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Cuadro 2: Secuencias RBP. Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las proteínas de la capa utilizadas en este estudio.
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Discussion
El método descrito en este artículo facilita la medición cuantitativa in vivo de la afinidad de unión RBP-ARN en células de E. coli. El protocolo es relativamente fácil y se puede llevar a cabo sin el uso de maquinaria sofisticada, y el análisis de datos es sencillo. Además, los resultados se producen inmediatamente, sin el tiempo de espera relativamente largo asociado con los resultados de la secuenciación de próxima generación (NGS).
Una limitación a este método es que sólo funciona en células bacterianas. Sin embargo, un estudio anterior12 ha demostrado un efecto de represión utilizando un enfoque similar para la L7AE RBP en células de mamíferos. Una limitación adicional del método es que la inserción del sitio de unión en la región de iniciación de mCherry puede reprimir los niveles basales de mCherry. La complejidad estructural o la alta estabilidad del sitio de unión pueden interferir con la iniciación ribosomal incluso en ausencia de RBP, lo que resulta en una disminución de los niveles basales de mCherry. Si los niveles basales son demasiado bajos, la represión adicional provocada por el aumento de las concentraciones de RBP no será observable. En tal caso, es mejor diseñar el cassette del sitio de enlace con el sitio de enlace todavía en la región de iniciación, pero al borde de la transición de la región de iniciación a la región de elongación (en el intervalo de 12 a 15 bp10,29). Hemos demostrado que, para esos valores, todavía se puede observar un efecto de represión. Para aumentar las posibilidades de que el ensayo funcione, independientemente de la complejidad estructural, recomendamos realizar el ensayo en al menos tres posiciones diferentes para un sitio de enlace determinado.
La principal desventaja del método en comparación con los métodos in vitro, como EMSA, es que la afinidad de unión RBP-ARN no se mide en unidades absolutas de concentración de RBP, sino más bien en términos de fluorescencia fusión-RBP. Esta desventaja es un resultado directo del ajuste in vivo, que limita nuestra capacidad de leer las concentraciones reales de RBP. Esta desventaja se ve compensada por los beneficios de medir en el entorno in vivo. Por ejemplo, hemos encontrado diferencias en las afinidades vinculantes al comparar los resultados de nuestro ensayo in vivo con ensayos in vitro e in situ anteriores. Estas diferencias pueden derivarse de discrepancias en la estructura de las moléculas de ARNm in vivo que surgen de su presencia dentro de las células10,11,30,31. Tales diferencias estructurales pueden dar lugar a cambios en la estabilidad de los Estados plegados in vivo que, a su vez, estabilizan o desestabilizan la unión RBP.
Dado que el método es relativamente simple y económico, recomendamos ejecutar varios controles junto con el experimento real. Ejecutar un control negativo, es decir, una secuencia que no tiene afinidad con la RBP pero tiene características estructurales similares, puede ayudar a evitar falsos positivos derivados de interacciones no específicas con el ARNm. En los resultados representativos mostrados, los dos controles negativos fueron el gen mCherry solo (sin sitio de unión), y el sitio de unión nativo de la otra RBP (es decir, PP7-wt para MCP y MS2-wt para PCP). Además, proponemos incorporar un control positivo (como una RBP y su sitio de enlace nativo). Este control ayudará a cuantificar la afinidad vinculante presentando un punto de referencia y evitando falsos negativos derivados de una baja represión de los pliegues.
Por último, para aquellos que deseen obtener una perspectiva estructural de la unión RBP-ARN, proponemos llevar a cabo una acilación selectiva de 2o-hidroxilo analizada mediante secuenciación de extensión de imprimación (SHAPE-Seq)11,32,33 Experimento. SHAPE-Seq es un enfoque NGS combinado con sondeo químico de ARN, que se puede utilizar para estimar la estructura secundaria del ARN, así como las interacciones de ARN con otras moléculas, como las proteínas. En nuestro trabajo anterior realizamos un experimento SHAPE-Seq en una cepa representativa tanto en condiciones in vivo34 como in vitro con proteína recombinante purificada10,35. En nuestro caso, los resultados revelaron que la unión a RBP afectó a un segmento mucho más amplio de ARN que el reportado anteriormente para estos PBP in vitro36.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto recibió financiación del Programa I-CORE del Comité de Planificación y Presupuesto y de la Fundación Científica de Israel (Grant No 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675, y del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención no 664918 - MRG-Grammar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
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