Summary
Bu yöntemle, RNA bağlayıcı proteinlerin (RBPs) bağlayıcı benzeşimini, bakteriyel hücrelerde basit, canlı ve muhabir bir tahlil kullanarak bilat ve bileksiz bağlayıcı sitelere göre ölçeceğiz. Tahlil bir muhabir geni baskının dayanmaktadır.
Abstract
Protein çevirisinin başlatılması aşamasında, ribozom mRNA 'nın başlatma bölgesine bağlanır. Tercüme başlatma, bir RNA bağlayıcı proteinin (RBP) mRNA 'nın başlama bölgesine bağlanması ile bloke edilebilir, bu da ribozom bağlayıcılığı ile müdahale eder. Sunulan yöntemle, bu engelleme fenomenini, RBPs 'in bilat ve bileksiz bağlayıcı sitelerine bağlayıcı benzeşimini ölçmek için kullanıyoruz. Bunu yapmak için bir muhabir mRNA başlatma bölgesinde bir test bağlama sitesi ekleyin ve test RBP ifadesine neden. RBP-RNA bağlayıcı durumunda, RBP konsantrasyonunun bir işlevi olarak gazetecinin ifadesinin sigmoidal baskının gözlemlendiği görülmüştür. Bağlayıcı site ile RBP arasında yakınlık yok veya çok düşük bir yakınlık durumunda önemli bir baskı görülmemiştir. Yöntem canlı bakteriyel hücrelerde gerçekleştirilir ve pahalı veya sofistike makineler gerektirmez. Bir dizi tasarlanmış bağlayıcı site için bakterilerde işlevsel olan farklı RBPs 'in bağlayıcı ekfeleri arasında ölçülmesi ve karşılaştırılması için yararlıdır. Bu yöntem, yüksek yapısal karmaşıklık içeren siteler bağlama için uygun olmayabilir. Bu RBP yokluğunda karmaşık mRNA yapısı tarafından ribozomal inisiyasyon baskının olasılığı nedeniyle, hangi alt bazal muhabir gen ifade neden olur, ve böylece RBP bağlayıcı üzerine daha az gözlemlenebilir muhabir baskı.
Introduction
RNA bağlayıcı protein (RBP) tabanlı post-transcriptional düzenleme, özellikle RBPs ve RNA arasındaki etkileşimi karakterize, son yıllarda yaygın olarak incelenmiştir. Rbps inhibe kaynaklanan bakterilerde translasyonel aşağı-düzenleme birden fazla örnek vardır, ya da doğrudan rakip, ribozom bağlayıcı1,2,3. Sentetik biyoloji alanında, RBP-RNA etkileşimleri transkripsiyon bazlı genetik devreler4,5tasarımı için önemli bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle, bir hücresel bağlamda bu tür RBP-RNA etkileşimlerini karakterizasyonu için talep bir artış vardır.
Protein-RNA etkileşimlerini incelemek için en yaygın yöntemler, in vitro ayarlarla sınırlı olan elektroforetik hareketlilik vardiya tahlil (EmSa)6' dır ve klip yöntemi de dahil olmak üzere çeşitli çekme testi7,8,9 . Bu tür yöntemler de Novo RNA bağlayıcı sitelerin keşfi etkinleştirmek iken, onlar emek yoğun protokoller ve pahalı derin sıralı reaksiyonlar gibi dezavantajları muzdarip ve RBP Pull-Down için belirli bir antikor gerektirebilir. RNA 'nın çevreye duyarlı doğası nedeniyle, birçok faktör RBP-RNA etkileşimlerini etkileyebilir ve hücresel bağlamda RBP-RNA bağlayıcılığı sorgulayanın önemini vurgulıyor. Örneğin, biz ve başkaları RNA yapıları arasında vivo ve in vitro10,11arasında önemli farklar göstermiştir.
Bir önceki çalışmanın yaklaşımı dayanarak12, biz Geçenlerde göstermiştir10 bu zaman önceden hazırlanmış bağlayıcı siteleri için kapsid rbps Bakteriyofajlar GA13, MS214, PP715, ve qβ16 bir muhabir mRNA çevirisi başlatma bölgesi, muhabir ifade güçlü bastırılmış. RBPs ile ilgili RNA bağlayıcı sitesis in vivo arasındaki benzeşimini ölçmek için, bu baskı fenomenine dayanan nispeten basit ve nicel bir yöntem sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sistem hazırlığı
- Ciltleme-site plazmids tasarımı
- Bağlayıcı site kaseti Şekil 1' de tasvir edilen şekilde tasarlayın. Her minigeni aşağıdaki parçaları içerir (5 '-3 '): EAGL kısıtlama sitesi, ∼ 40 üsleri kanamisin (kan) direnç geni 5 ' sonu, pLac-ara Promoter, ribozom bağlayıcı site (RBS), MCherry geni Aug, bir spacer (δ), bir RBP bağlayıcı site, 80 üsleri 5 ' End mCherry geni ve ApaLI kısıtlama sitesi.
Not: Testin başarı oranını artırmak için, her bağlayıcı site için üç bağlayıcı site kasetleri tasarlayın, en az bir, iki ve üç üslerden oluşan mesafe tutucular ile. Diğer yönergeler için temsili sonuçlar bölümüne bakın.
- Bağlayıcı site kaseti Şekil 1' de tasvir edilen şekilde tasarlayın. Her minigeni aşağıdaki parçaları içerir (5 '-3 '): EAGL kısıtlama sitesi, ∼ 40 üsleri kanamisin (kan) direnç geni 5 ' sonu, pLac-ara Promoter, ribozom bağlayıcı site (RBS), MCherry geni Aug, bir spacer (δ), bir RBP bağlayıcı site, 80 üsleri 5 ' End mCherry geni ve ApaLI kısıtlama sitesi.
- Bağlayıcı site plazmids klonlama
- Bağlayıcı site kasetlerini çift telli DNA (dsDNA) minigenes olarak sipariş et. Her minigeni ∼ 500 BP uzunluğundadır ve bir EAGL kısıtlama sitesi ve 5 ' ve 3 ' sondaki bir ApaLI kısıtlama sitesi içerir (bkz. Adım 1.1.1).
Not: Bu deneyde kanamisin geni yarısını içeren mini genler pozitif koloniler için taramanın kolaylaştırılması emrini verdi. Ancak, Gibson derleme17 de burada uygun, bu durumda bağlayıcı site iki kısa tamamlayıcı tek telli DNA oligos olarak sipariş edilebilir. - Hem mini-genleri hem de hedef vektörü EAGL-HF ve ApaLI ile kısıtlama Protokolü18ile çift özetleyin ve sütun19' u temizler.
- MCherry muhabiri geni, Terminator ve kanamyisin direnç geni20' nin geri kalanını içeren bağlayıcı site omurgasına sindirilmiş minigenleri ligate.
- Ligasyon çözümünü Escherichia coli Top10 hücrelerine dönüştürün21.
- Sanger sıralaması ile pozitif transformanlar belirleyin.
- Tasarım bir primer 100 ilgi bölgeye upstream üsleri (bkz Tablo 1 primer dizileri için).
- Miniprep birkaç bakteriyel koloniler22.
- 80 ng/μL konsantrasyonunda 5 ml 'Lik bir astar ve 10 μL DNA çözeltisi hazırlayın.
- İki çözümü, Sanger sıralaması23için uygun bir tesise gönderin.
- 96-Well formatında her ikisi de-20 °C ' de arıtılmış plazmids ve gliserol stokları24olarak bakteriyel suşlar saklayın. DNA daha sonra dört Fusion-RBP plazmidinden birini içeren E. coli Top10 hücrelerine dönüşümü için kullanılacaktır (bkz. Adım 1.3.5).
- Bağlayıcı site kasetlerini çift telli DNA (dsDNA) minigenes olarak sipariş et. Her minigeni ∼ 500 BP uzunluğundadır ve bir EAGL kısıtlama sitesi ve 5 ' ve 3 ' sondaki bir ApaLI kısıtlama sitesi içerir (bkz. Adım 1.1.1).
- RBP plazmid tasarımı ve inşaatı
Not: Bu çalışmada kullanılan kat proteinlerinin amino asit ve nüklotid dizileri Tablo 2' de listelenmiştir.- Gerekli RBP sırasını bir stop kodon eksik bir özel sipariş dsDNA minigeni bir stop kodon eksik sınırlama siteleri ile sona erer (Şekil 1).
- Test RBP bir stop kodon hemen aşağı bir indüklenebilir organizatör ve upstream bir floresan protein bir başlangıç kodon eksik (Şekil 1), adım 1.2.2-1.2.4 benzer eksik Clone. RBP Plasmid bağlayıcı site plazmid daha farklı bir antibiyotik direnci geni içerdiğinden emin olun.
- Sanger sıralamasına göre pozitif transformanlar belirleyin, adım 1.2.5 benzer (bkz Tablo 1 primer dizileri için).
- Bir pozitif transformant seçin ve kimyasal olarak-yetkili25olun. -20 °C ' de gliserol arıtılmış plazmidler ve 96-kuyu plaklarında24 at-80 °c ' de bakteriyel suşların gliserol stokları olarak saklayın.
- 96-Well plaklarda saklanan bağlayıcı site plazmidleri (adım 1.2.6), zaten bir RBP-mCerulean Plasmid21içeren kimyasal olarak yetkili bakteriyel hücrelere dönüştürün. Zaman kazanmak için, Petri yemeklerinde hücreleri kaplama yerine, 8 kanallı pipetör ile ilgili antibiyotikler (kan ve amp) ile Luria-Bertani (lb)26 agar içeren sekiz şeritli plakaları kullanarak onları plaka. Koloniler 16 saat içinde görünmelidir.
- Her çift transformant için tek bir koloni seçin ve ilgili antibiyotikler (kan ve amp) ile LB orta gecede büyümek ve gliserol stokları olarak saklamak24 at-80 °c 96-kuyu plakaları.
2. deney kurulumu
Not: Burada sunulan protokol bir küvatör ve bir plaka okuyucu ile birlikte bir sıvı taşıma robotik sistemi kullanılarak yapılmıştır. Her ölçüm, her gerinim + İndükleme kombinasyonu için iki kopya ile 24 İndükleme konsantrasyonu için yapılmıştır. Bu robotik sistemi kullanarak, 24 indükleştirici konsantrasyonlarla günde 16 suşlar için veriler toplandı. Ancak, böyle bir cihaz kullanılamıyorsa veya daha az deney gerekiyorsa, 8 kanallı çok pipet kullanarak ve protokole buna göre adapte olmak suretiyle kolayca el ile yapılabilir. Örneğin, 12 indükör konsantrasyonu ve dört zaman noktası ile günde dört suşlar için ön sonuçlar bu şekilde elde edildi.
- Hazırlamak, önceden, 1 L Biyotahlil tampon (BA) 0,5 g tryptone karıştırılarak, 0,3 mL gliserol, 5,8 g NaCl, 50 mL 1 M MgSO4, 1 ml 10X fosfat-tamponlu tuz (PBS) tampon pH 7,4, ve 950 ml çift distile su (DDW). Otoklav veya steril filtre BA tampon.
- 37 °C ' de çift transformant suşları ve 250 rpm 'de uygun antibiyotiklerle 1,5 mL LB 'de sallayarak (kanamycin, son konsantrasyonda 25 μg/mL ve ampisilin, 100 μg/mL), 48-kuyu plaklarında, 18 saat (gecede) bir süre içinde büyür.
-
Sabah, aşağıdaki hazırlıkları yapın.
- İndükleştirici plaka. Temiz bir 96-kuyu plakasında, 95% BA ve% 5 LB26 ' dan oluşan yarı yoksul Orta (SPM), 37 °c ' de inkübatör ile kuyuları hazırlayın. Kuyu sayısı indükleştirici konsantrasyonların istenilen sayısına karşılık gelir. En yüksek indükleştirici konsantrasyonu (218 nM) içerecektir indükör plakasında kuyulara C4-HSL ekleyin.
- Program robot seri olarak en yüksek konsantrasyon kuyuları her itibaren Orta seyreltmeli 23 alt konsantrasyonları arasında değişen 0 için 218 nM. Her indüksiyon seyreltme hacmi tüm suşları (kopyaları dahil) için yeterli olmalıdır.
- İndükleştirici seyreltme hazırlanması sırasında, 37 °C ' de, 96-Well plakaları içinde kuluçk SPM sıcak 180 μL.
- Seri dilüsyonlar tarafından 100 bir faktör tarafından adım 2,2 bir gece suşları seyreltme: ilk seyreltilmiş 10 bir faktör tarafından 100 μL bakterilerin, 48-Well plakaları içinde 900 μL mikm ile karıştırılarak ve sonra tekrar 10 faktörüyle seyreltilerek,% 20 μL alarak 180 ön ısıtılmış SPM μL, floresan ölçümleri için uygun 96-kuyu plakaları.
- Son konsantrasyonlara göre seyreltilmiş suşları ile 96-kuyu plakaları indükleştirici plaka seyreltilmiş indükör ekleyin.
- 96-kuyu plakalarını 37 °C ' de 6 saat boyunca sallayın, her 30 dakikada bir plaka okuyucu ile 595 Nm (OD595), mcherry (560 nm/612 Nm) ve mCerulean (460 nm/510 Nm) Floresan optik yoğunluğun ölçümlerini alarak. Normalleştirme amacıyla, hücre eklenmeden SMP 'nin büyümesini ölçün.
3. ön sonuçlar Analizi
- Denemenin her günü için, ölçülen büyüme eğrilerine göre, doğrusal büyüme aşaması ile sabit (T0, tfinal) arasındaki Logaritmik büyüme zaman aralığını seçin. Üstel büyüme algılamanın hatasız oluşmaması için ilk ve son ölçümleri atarken yaklaşık 6 − 8 zaman noktası alın (bkz. Şekil 2a, üst panel).
Not: Logaritmik büyüme aşamasının algılanabileceği anormal büyüme eğrileri veya suşları gösteren suşlar atın ve deneyi tekrarlayın. -
Her indükleştirici konsantrasyon için mcerulean ve mCherry floresans ham verilerinden, mCerulean ortalama normalleştirilmiş floresans ve mCherry üretim oranı hesaplayın (Şekil 2a).
- Normalleştirilmiş mCerulean aşağıdaki gibi hesaplayın:
nerede boş (mCerulean) mCerulean düzeyi [a.u.] sadece orta, boş (OD) sadece orta için optik yoğunluğu ve mCerulean ve OD mcerulean floresans ve optik yoğunluk değerleri, sırasıyla. - Ortalama mCerulean farklı zaman noktaları üzerinde (Şekil 2B, üst iki panel) aşağıdaki gibi:
Burada #Time noktaları dikkate alınan veri zaman noktaları sayısıdır, T0 üstel büyüme aşaması başladığı zaman ve tfinal , üstel büyüme aşaması sona erdiği zamandı. - Üretim mCherry oranını hesaplayın (Şekil 2B, alt iki panel) aşağıdaki gibi:
Burada mCherry (t) mCherry düzeyidir [a.u.] zaman t, OD optik yoğunluk değerdir, T0 üstel büyüme aşaması başladığı zaman, ve tfinal zaman üstel büyüme aşaması sona erer.
- Normalleştirilmiş mCerulean aşağıdaki gibi hesaplayın:
- Son olarak, mCerulean bir fonksiyon olarak üretim mCherry oranı arsa, RBP-mCerulean Fusion floresans bir işlevi olarak doz yanıt eğrileri oluşturma (Şekil 2C). Bu tür araziler hücredeki RBP varlığının bir işlevi olarak muhabir geni üretimini temsil eder.
4. doz yanıt fonksiyonu Fitting rutin ve KRBP ekstraksiyon
- RBP bağlı ile ribozom çeviri hızı sabit olduğunu varsayımı altında, model MCherry üretim hızı aşağıdaki gibi (bkz Şekil 2D, yeşil çizgi):
Burada [x], EQ. 2 ' ye göre hesaplanan normalleştirilmiş ortalama mcerulean floresans olduğunu, MCherry üretim oranı EQ. 3 ' e göre hesaplanan değerdir, kRBP göreli bağlayıcı benzeşimi [a.u.], kilişkisiz ribozom oranı RBP ilişkisiz ile çeviri, n kooperatiflik faktörüdür, ve C temel floresans [a.u.]. MCherry üretim hızı verilerini modele sığdırarak C, n, Kilişkisizve kRBP bulunur (EQ. 4). - Veri analiz yazılımını kullanarak, ortalama mCerulean (adım 3,3) bir fonksiyon olarak mCherry üretim hızını tasvir araziler üzerinde uygun bir prosedür yürütmek ve EQ. 4 formülüne göre uygun parametreleri ayıklamak.
Not: Yalnızca R2 > 0,6 ile uygun sonuçlar dikkate alınır. Bu uygun için, KRBP hatası% 0,5 aralığında çoğunlukla olduğunu kRBP değerlerinin% 20, bir 0,67 güven aralığı Için, yüksek KRBP hatası olanlar da göz tarafından doğrulanabilir iken. - Her doz-yanıt fonksiyonu için Ortalama mCerulean ilgili maksimal değere göre KRBP değerlerini normalleştirmek.
Burada KRBP içinde [A.u.] EQ. 4 ve maksimum (ortalama mcerulean) uygun prosedür ayıklanan değerdir en fazla ortalaması mcerulean sinyal [a. u] geçerli gerinim için gözlenen.
Not: Normalleştirme, özellikle maksimal RBP ifade düzeylerine olan bağımlılığı ortadan kaldırarak suşlar arasında düzenleyici efektin doğru şekilde karşılaştırılmasını kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunulan yöntem, mRNA molekülüne bağlamak için RBP ile ribozom arasındaki yarışmayı kullanır (Şekil 1). Bu yarışma RBP-mCerulean artan üretim bir fonksiyon olarak mCherry seviyeleri azalan tarafından yansıtılır, indüksiyonlu artan konsantrasyonları nedeniyle. MCerulean floresans artan durumunda, mCherry önemli bir değişiklik ile, RBP bağlayıcı eksikliği düşülür. Şekil 2' de hem pozitif hem de negatif gerginlik için temsili sonuçlar tasvir edilir. Şekil 2a'DA, od, MCherry ve mCerulean kanalları, t0 = 1 h ve tfinal = 3,5 h ile dört saatlik bir aralıkta zaman ve indükleştirici bir fonksiyon olarak sunulur. Şekil 2B'de, ortalama mCerulean Floresan (üst) ve MCherry üretim oranı (alt), iki örnek suşları için indükör konsantrasyonunun bir işlevi olarak sunulur. Görüldüğü gibi, pozitif bir gerinim sonuçları, KRBP 'nin (Şekil 2D) sıfır olmayan bir değere çevrilmesi halinde (Şekil 2B, C), MCherry üretim oranında net bir aşağı Düzenleyici etki göstermektedir. Pozitif gerginlik için, sığdırma prosedürü aşağıdaki değerleri vermiştir: kRBP = 394,6 a.u., kilişkisiz = 275,6, n = 2,1, C = 11,2 a.u., ve R2 = 0,93. Maksimal mCerulean floresans ile normalleştikten sonra KRBP değeri 0,24 idi. Olumsuz gerginlik için, farklı bir yanıt eksikliği gözlendi (Şekil 2C), ve hiçbir KRBP değeri çıkarıldı (Şekil 2D).
Şekil 3' te, bu testin sonuçlarını iki Phage Coat RBPs, PP7 ve MS2, çeşitli mutasyona uğramış bağlayıcı sitelerde, MCherry mRNA 'nın başlatma bölgesi içinde farklı konumlarda sunuyoruz. Sonuçlar kabaca üç tür yanıt olarak sınıflandırılır (Şekil 3A): düşük mCerulean düzeyinde bir aşağı Düzenleyici etki gösteren suşlar, düşük KRBP değerini yansıtan (yüksek bağlayıcı benzeşimi); Orta veya yüksek mCerulean düzeylerinde aşağı-Düzenleyici etki gösteren suşlar, yüksek KRBP değerini yansıtan (orta veya düşük yakınlık); ve suşlar mCerulean yükselen seviyelere farklı bir yanıt sergileme, hücredeki maksimum RBP konsantrasyonu daha yüksek bir KRBP değeri yansıtan (hiçbir algılanabilir bağlama benzeşimi). Şekil 3B , Iki RBPs 'in tüm kombinasyonlarına ve farklı konumlarda on bağlayıcı sitelere dayanan her RBP − bağlayıcı site kombinasyonu için hesaplanan en az KRBP değerini sunar. Bağlayıcı siteler negatif bir denetim (bağlama sitesi yok), eşleşen olmayan bağlama siteleri ve pozitif bir denetim (PP7 kat protein [PCP] için PP7-WT ve MS2 Coat protein [MCP] için MS2-WT) her RBP için yerel bağlama sitesi içerir. Her iki RBPs olumlu denetimleri için yüksek bir benzeşimi ve negatif denetimler için algılanabilir olmayan bağlama benzeşimi mevcut olduğu gibi sonuçları predictions eşleşir. Ayrıca, bu iki rbps kullanarak önceki çalışmalar27,28 onlar ortogonal olduğunu gözlemledik, hangi açıkça heatmap sunulan iletilir: hem MCP ve PCP diğer RBP yerel site bağlamak yok. Dahası, mutasyona uğramış bağlama siteleri, bazı bağlama sitelerinin benzer bir benzeşim düzeyini PP7-mut-1, PP7-mut-2 ve MS2-mut-3 gibi yerel sitenin olduğu gibi görüntülerken, diğerleri de önemli ölçüde daha düşük bir benzeşimi görüntülenirken değişen sonuçlar sunar PP7-mut-3 ve MS2-mut-2. Böylece, tahlil RBPs bağlayıcı benzeşimi bir nicel in vivo ölçümü sundu, bu RBPs ile geçmiş deneylerin karşılaştırılabilir sonuçlar sağladı.
Tahlil mCherry geni baskının dayalı olduğundan, uygun bir mCherry sinyali gereklidir. Bu nedenle, bağlayıcı site kaseti tasarlarken, akılda tutulması gereken iki tasarım kuralı vardır. İlk olarak, mCherry 'nin açık okuma çerçevesi (ORF) tutulması gerekir. Bağlayıcı site uzunluğu değişebilir beri, gen içine eklemek orijinal mCherry ORF bir veya iki üslerin bir vardiya neden olabilir. Bu nedenle, gerekirse (Şekil 4A), bağlama sitesine hemen aşağı doğru bir veya iki taban ekleyin. Örneğin, 20-Base uzun bir bağlayıcı site, bir δ iki temeli ile, mCherry geni 22 üsleri bir ilavesi verecektir. ORF 'un tutulması için, toplam 24 üs için iki baz eklemelisiniz. İkinci tasarım kuralı stop kodon MCherry ORF içine eklemeler önlemek için. Bazı bağlayıcı siteler, MS2-mut-2 (Şekil 4b, inset) olarak, üç olası ORFS bir veya daha fazla konumlandırıldığında stop kodon içerir. Böyle bir örnek Şekil 4A, burada bağlama site yalnızca hiçbir temelleri eklendiğinde MCherry ORF ile kare içinde bir stop kodon içerdiği gösterilmiştir. Bu pozisyon için doz-yanıt eğrisi görülebilir (Şekil 4b), MCherry üretim hızı saptanamayan, böylece bağlayıcı benzeşimi ölçülemedi.
Figure 4B 'ye daha yakından bakmak, Aralık δ ' nın MCherry üretiminde etkisini gösterir. Örneğin, δ = 4 için, bazal üretim hızı, δ = 5 ' ten daha yüksek bir kat-baskı efekti sağlayarak 6 ' dan fazla bir faktördür. Ancak δ = 14 için, bazal üretim seviyeleri bir aşağı düzenleyici etkiyi gözlemlemek için çok düşüktü.
Şekil 1: sistem tasarımı ve klonlama adımlarına genel bakış. Bağlayıcı site Plasmid (sol) ve RBP-mCerulean Plasmid (sağ) için kaset tasarımı Illustration. Bir sonraki adım, her iki plazmidin yetkili E. coli hücrelerine ardışık dönüşümleri, ilk olarak RBP plazmids ile. Çift transformanlar daha sonra indükleştirici konsantrasyonlarda artan mCherry ifade seviyeleri için test edilir; RBP bağlayıcı siteye bağlandığında, Mkiraz seviyeleri mCerulean (gri kabarcık) bir işlevi olarak düşüş. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: analiz şeması. (A) ham od seviyeleri (üst), mCerulean Floresan (orta) ve MCherry Floresan (alt) zaman ve İndükleme konsantrasyonu bir fonksiyon olarak tasvir üç boyutlu (3D) çizimler, olumlu bir gerinim için. (B) üst: her indükleştirici konsantrasyonu Için mCerulean kararlı durum ifade seviyeleri her floresan SEVIYESINI ilgili od tarafından bölünerek ve 2 − 3 h üstel büyüme zaman penceresindeki tüm değerlerin ortalamasını pozitif (sol) için Ortalama olarak hesaplanır. ve negatif (sağ) suşları. Alt: mCherry üretim hızı, indüksiyon sonrası 2 − 3 saat zaman noktalarıyla EQ. 3 ' e göre hesaplanır. (C) iki suşların iki biyolojik kopyası üzerinde ortalama mCerulean floresans ortalamalı bir fonksiyon olarak çizilen MCherry üretim oranı. Hata çubukları, hem mCherry üretim hızı hem de en az iki çoğaltır elde edilen ortalama mCerulean floresan standart sapmadır. (D) EQ. 4 ' teki Fitting formülünü kullanarak KRBP için uygun pozitif gerilme (sol) için gösterilen, belirli bir bağlayıcı yanıtı sergiler. Negatif gerilme (sağda) için KRBP değeri çıkarılmaz. Veriler yinelenen olarak gösterilir. Bu rakam Katz ve ark.10' dan izin ile adapte edilmiştir. Copyright 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Temsili final sonuçları. (A) Iki RBPs ve farklı konumlarda on bağlayıcı site dayalı otuz farklı suşları için normalleştirilmiş doz-yanıt eğrileri. Üç tür yanıt görülür: yüksek benzeşimi, düşük benzeşimi ve hiçbir benzeşimi. (B) beş farklı bağlayıcı site kasetleri (listelenen) Ile Iki RBPs (MCP ve PCP) için nicel KRBP sonuçları. Tüm RBP − bağlayıcı site suşları yinelenen olarak ölçülmüştür. Bu rakam Katz ve ark.10' dan izin ile adapte edilmiştir. Copyright 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: mutant bağlama sitesi Ile MCP Için örnek tasarım ve sonuçlar. (A) dört farklı yerlerde bağlayıcı site kasetleri tasarım Illustration. Ribozom bağlayıcı site dahil kaset, MCherry için kodon başlatmak, δ spacer üsleri, bağlayıcı site test, ORF korumak için bir veya iki üsleri, ve MCherry geni geri kalanı. Kırmızı yıldızlar bir stop Codon gösterir. (B) dört farklı yerde mutant bağlayıcı bir site ile MCP için doz-yanıt eğrileri. Inset: test edilmiş mutasyona uğramış bağlayıcı sitenin sırası. Sunulan sonuçlar her gerilimin kopyaları içindir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Adı | Binidng site konumu, A Ağustos = 1 | Bağlama site sırası (denetimler için RBS) | Site: ATG ikinci MCherry kodon GTG için Kontroller: RBS ikinci MCherry kodon GTG için |
Kaynak |
| MS2_wt_d5 | 5 | akatgaggattacccatgt | (atgcacatgaggattacccatgtcgtg) | Gen9 A.ş. |
| MS2_wt_d6 | 6 | akatgaggattacccatgt | atggcacatgaggattacccatgtgtg | Gen9 A.ş. |
| MS2_wt_d8 | 8 | akatgaggattacccatgt | atggcgcacatgaggattacccatgt CGTG |
Gen9 A.ş. |
| MS2_wt_d9 | 9 | akatgaggattacccatgt | atggcgccacatgaggattacccatg Tosun |
Gen9 A.ş. |
| MS2_U (-5) C_d8 | 8 | akatgaggatcacccatgt | (atgcacat) Tg |
Gen9 A.ş. |
| MS2_U (-5) C_d9 | 9 | akatgaggatcacccatgt | atggcacatgaggatcacccatgtg Tg |
Gen9 A.ş. |
| MS2_U (-5) C_d8 | 8 | akatgaggatgacccatgt | (atgcacat) Tg |
Gen9 A.ş. |
| MS2_U (-5) G_d9 | 9 | akatgaggatgacccatgt | atggcacatgaggatgacccatgtg Tg |
Gen9 A.ş. |
| MS2_struct_d9 | 9 | Bu konuda | atggccacaagaggttcacttatgg Tg |
Gen9 A.ş. |
| MS2_struct_d8 | 8 | Bu konuda | (atgccacaagaggttcacttatggg) Tg |
Gen9 A.ş. |
| PP7wt_d5' | 5 | hüseyin öztaş | (atgctaaggagtttatatggaaacc) (cttacgtg) |
Gen9 A.ş. |
| PP7wt_d6' | 6 | hüseyin öztaş | hüseyin özgül bir |
Twist Bioscience |
| PP7wt_d8' | 8 | hüseyin öztaş | gökhan özgül acccttacgtg |
Twist Bioscience |
| PP7wt_d9' | 9 | hüseyin öztaş | atgaacaataaggagtttatatgga aacccttagtg, İngilizce |
Twist Bioscience |
| PP7_USLSBm_d6 | 6 | emrah özkan. | (atggctaaccgctttatatggaaag) ggttagtg, İngilizce |
Gen9 A.ş. |
| PP7_USLSBm_d15 | 15 | emrah özkan. | atgggcgccggcgctaaccgcttta hüseyin gürgen |
Gen9 A.ş. |
| PP7_nB_d5 | 5 | mustafa cağık | (atgctaagggtttatatggaaaccc) ttagcgtg |
Gen9 A.ş. |
| PP7_nB_d6 | 6 | mustafa cağık | mustafa cağas Bu konuda |
Gen9 A.ş. |
| PP7_USs_d5 | 5 | (aktaş) | bir daha yok. süleyman tanrıverdi |
Gen9 A.ş. |
| PP7_USs_d6 | 6 | (aktaş) | atggctaaggagttatatggaaccc ttagcgtg |
Gen9 A.ş. |
| No_BS_d1 | - | - | (aktaş) Tg |
Gen9 A.ş. |
| No_BS_d4 | - | - | (aktaş) oktay gül |
Gen9 A.ş. |
| No_BS_d10 | - | - | (aktaş) gccggcgtg |
Gen9 A.ş. |
| Bağlayıcı site kasetleri için sıralı astar | (gcatttttatccataagattagcgg) | ıdt | ||
| RBP kasetleri için sıralı astar | mehmet gökhan özkenci | ıdt | ||
Tablo 1: bağlayıcı siteler ve sıralı astar. Bu çalışmada kullanılan bağlayıcı siteler ve bağlayıcı site kasetleri için diziler, aynı zamanda protokolde ayrıntılı sıralama reaksiyonları için astar (Steps 1.2.5.1 ve 1.3.3).
| Bu çalışmanın RBP adı | Kaynak organizma adı, protein | Kaynak organizma geni | Kaynak organizma RefSeq | sinan acar | WT 'den değişiklikler (ve referanslar) | aa Seq bu çalışma kullanılır | NT Seq kullanılan bu iş |
| Mcp | Escherichia virüs MS2 | Cp | NC_001417.2 | AHMET d DNGGTGDVTV (APSNFANGVA) EWıSSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKVatqt VGGVELPVA DENIZ TÜıATNSD ÇIVKAMQG ILKDGNPIPS ABAANSGıA |
DELF-G 1 V29I [1] alınan addgene plazmid 27121 |
AHMET d DNGGTGDVTV APSNFANGıA EWıSSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI orhanG DENIZ TÜıATNSD ÇIVKAMQG ILKDGNPIPS ABAANSGıA |
ATGGCTTCTA 'da AKTTAKCA GTCGTTCTC (GCGACAATG) BIR (CGACGTGACT) (GCCCCA) (GCAACTTCGC) AKıN ÇAÇCı GGA TCAGCTCTAA CTCGCGTTCA CAGGCTTACA AAGTAACCTG TANER ças ÇAĞAGCTCTG CGCAGAATCG AKıN ÇAKıR ATCAAAGTCG AGGTGCCTAA AGGCGCCTGG (CGTTCGTACT) TAAATATGGA (ACTAACCATT) (CCAATTTTCG) GACGAATTC (CGACTGCGAG) TGTTA AGGCAATGCA AGGTCTCCTA MEHMET mehmet BIR (CTCAGCAATC) GCAGCAAACT KGGCATCTAC |
| Pcp | Pseudomonas Phage PP7 | Cp | NC_001628.1 | MSKTIVLSVGEA TRTLTEIQST için BARıŞ GPLVGRLRLT MUSTAFA k AYRVNLKLDQ ADVVDCstsvc GElpkvrytq (VWSHDVTIVA) NSTEASRKSL YDLTKSLVAT INGILIZCE (VPLGR) |
delF-G [2] alınan addgene plazmid 40650 |
MLASKTIVLSVG BIR STADRQIFEE KVGPLVGRLR LTASLRQNGA, İtalya HASAN efe DQADVVDSG Bu SHDVTIVANS ÇAY RKSLYD LTKSLVATSQ, Litvanya Bu LGR |
ATGCTAGCCTC Emre k GTCTTTCGG hakkında KGGCGAGGC, DOVIZ TAKTIK (CTGACTGAGA) CÇCAGTCCAC (CGCAGACCGT) ÇAĞATCTTCG AAGAGAAGGT CGGGCCTCTG GGGGTCGGC TGCGCCTCAC GGCTTCGCTC CGTCAAAACG GAGCCAAGAC CGCGTATCGC GCAACCTAA AACTGGATCA GGCGGACGTC GTGATTCCG (GACTTCCGAA) AGTGCGCTAC AKCAGGTAT GGTCGCACGA CGTGACAATC GTGCGAATA BIR CTCGCGCAAA ÇGTTGTACG MEHMET mehmet GTCCCTCGTC GACCTCGC, Kanada AGGTCGAAGA ÇTTGTCGTC (AACCTTGTGC) CGCTGGGCCGT |
| Başvuru: | |||||||
| 1. Peabody, SII, Ely, kahraman protein-protein etkileşimleriyle translasyonel baskının kontrolü. Nüksel asitler araştırma. 20 (7), 1649 – 1655 (1992). | |||||||
| 2. Chao, ja, Patskovsky, Y., Almo, S.C., şarkıcı, bağıl viral RNA-protein kompleksinin koevrim için yapısal temeli. Doğa yapısal &Amp; moleküler biyoloji. 15 (1), 103 – 105, doi: 10.1038/nsmb1327 (2008) | |||||||
Tablo 2: RBP dizileri. Bu çalışmada kullanılan kat proteinlerinin amino asit ve nüklotid dizileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede açıklanan yöntem, E. coli HÜCRELERINDE RBP-RNA bağlama benzeşiminin nicel in vivo ölçümünü kolaylaştırır. Protokol nispeten kolay ve sofistike makineler kullanmadan yapılabilir, ve veri analizi basittir. Dahası, sonuçlar, sonraki nesil sıralama (NGS) sonuçları ile ilişkili nispeten uzun bekleme süresi olmadan hemen üretilir.
Bu yönteme bir sınırlama sadece bakteriyel hücrelerde çalışır olmasıdır. Ancak, bir önceki çalışma12 meme HÜCRELERINDE L7AE RBP için benzer bir yaklaşım kullanarak bir baskı etkisi göstermiştir. Yöntemin ek bir sınırlama mCherry başlatma bölgesinde bağlama sitenin eklenmesi bazal mCherry düzeylerini yeniden basabilir olmasıdır. Bağlayıcı sitenin yapısal karmaşıklığı veya yüksek stabilitesi RBP yokluğunda bile ribozomal girişimi engelleyebilir, azaltılmış mCherry bazal seviyeleri ile sonuçlanan. Bazal seviyeleri çok düşük ise, RBP konsantrasyonları artan tarafından getirilen ek baskı gözlemlenebilir olmayacaktır. Böyle bir durumda, bağlayıcı site kaseti hala başlatma bölgesinde bağlama sitesi ile tasarlamak en iyisidir, ancak başlatma bölgesinden uzama bölgesine geçişin eşiğinde (12 − 15 BP10,29aralığında δ). Biz bu tür δ değerleri için bir baskı etkisi hala gözlenebilir göstermiştir. Tahlil çalışacaktır şansını artırmak için, ne olursa olsun yapısal karmaşıklık, biz belirli bir bağlayıcı site için en az üç farklı konumlarda tahlil gerçekleştirme tavsiye.
EMSA gibi in vitro yöntemlerle karşılaştırıldığında yöntemin ana dezavantajı, RBP-RNA bağlayıcı benzeşiminin RBP konsantrasyonunun mutlak birimlerinde değil, Fusion-RBP floresans açısından da ölçülmesi. Bu dezavantajı RBP gerçek konsantrasyonlarını okumak için yeteneğimizi sınırlar in vivo ayarı, doğrudan bir sonucudur. Bu dezavantaj in vivo ayarında ölçüm yararları tarafından sapma. Örneğin, bizim in vivo tahlil önceki in vitro ve situ assays için sonuçları karşılaştırmak zaman bağlama karışık farklılıklar bulduk. Bu farklılıklar hücrelerin içinde varlığını ortaya çıkan mRNA molekülleri in vivo yapısında tutarsızlıkları olabilir10,11,30,31. Bu tür yapısal farklar, aynı şekilde RBP bağlayıcılığı dengelendiğinde veya stabilize eden, katlanmış devletlerin stabilitesine neden olabilir.
Yöntem nispeten basit ve ucuz olduğundan, gerçek denemenin yanında birden fazla denetim çalıştırmanızı öneriyoruz. Negatif bir denetim, yani, RBP için hiçbir benzeşimi olan bir dizi henüz benzer yapısal özelliklere sahip çalışan yanlış olumlu mRNA ile özel olmayan etkileşimler kaynaklanan önlemek yardımcı olabilir. Gösterilen temsili sonuçlarda, iki negatif kontrol tek başına mCherry geni (bağlayıcı site yok) ve diğer RBP 'nin yerel bağlama sitesi (örneğin, MCP için PP7-WT ve PCP için MS2-WT) idi. Dahası, olumlu bir kontrol (örneğin, bir RBP ve yerel bağlayıcı sitesi) dahil etmek öneriyoruz. Bu tür bir denetim, bir referans noktası sunarak ve düşük katlama baskılından kaynaklanan yanlış negatiflerin önlenmesi sırasında bağlama benzeşimi ölçümleme konusunda yardımcı olacaktır.
Son olarak, RBP-RNA bağlayıcı yapısal bir perspektif elde etmek isteyenler için, biz seçici bir yürütmek teklif 2 ′-hidroksil asilasyonu primer uzatma sıralaması tarafından analiz (Shape-seq)11,32,33 Deney. SHAPE-Seq RNA 'nın ikincil yapısını tahmin etmek için kullanılan RNA 'nın kimyasal problama ile birlikte, proteinler gibi diğer moleküllerle RNA etkileşimlerini de içeren bir NGS yaklaşımıdır. Önceki çalışmalarımız içinde, hem in vivo koşullarda34 hem de in vitro olarak saflaştırılmış Rekombinant protein10,35ile bir temsili gerginlik üzerinde bir Şekil-SEQ deneyi yaptık. Bizim durumumuzda, sonuçlar RBP-bağlayıcı daha önce bu RBPs in vitro36için BILDIRILEN daha RNA çok daha geniş bir segment etkilenen ortaya çıktı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu proje, planlama ve bütçeleme Komitesi ve Israil Bilim Vakfı (Grant No. 152/11), Marie Curie Reentegrasyon Grant No ı-CORE programı fon aldı. PCIG11-GA-2012-321675, ve Avrupa Birliği 'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı No. 664918-MRG-dilbilgisi Grant anlaşması altında.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
- Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
- Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
- Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
- Strein, C., Alleaume, A. -M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
- Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
- Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
- Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- NEB. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions. , Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018).
- Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol. , Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018).
- NEB. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202). , Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018).
- Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018).
- NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit. , Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Addgene. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018).
- NEB. Making your own chemically competent cells. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018).
- Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling. , Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018).
- Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
- Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
- Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
- Bernardi, A., Spahr, P. -F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).
