Summary
여기에 제시된 프로토콜은 전임상 연구를 위한 설치류에서 사중 운동의 3차원 운동학을 수집하고 분석하는 프로토콜이다.
Abstract
3차원(3D) 운동 운동 분석 시스템의 유용성은 설치류에서 제한됩니다. 이러한 부적절성의 원인 중 하나는 3D 데이터 수집 및 분석 절차에 수반되는 복잡한 알고리즘과 수학적 모델링을 사용하기 때문입니다. 이 작품은 6 카메라 모션 캡처 시스템을 사용하여 건강하고 신경 외상성 쥐의 러닝 머신 운동 중 3D 운동 걸음걸이 분석을위한 간단하고 사용자 친화적 인 단계별 세부 방법론을 제공합니다. 또한 1) 네 개의 사지에 위치한 마커를 사용하여 성인 쥐의 러닝 머신 운동을위한 데이터 수집, 비디오 추적에 사용할 수있는 옵션에 대한 1) 실험 설정에서 시스템의 교정에 대한 자세한 내용은 제공됩니다 4) 기본 3D 운동학 데이터 생성 및 시각화 및 내장 된 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 데이터의 정량화. 마지막으로, 이 모션 캡처 시스템의 유용성은 신경 외상 전후의 다양한 운동 행동을 연구하는 것으로 확장될 것을 제안합니다.
Introduction
설치류에서, 신경 장애 후 앞다리와 뒷다리 운동 적자는 일반적으로 주관적인점수 시스템을 사용하여 평가1. 자동화된 시스템 2,3,4,5 보행 분석을 위해 채택되었지만 기본 결과는 풋 프린트 분석을 기반으로하고 중요한 캡처에 실패하기 때문에 단점으로 고통받고 있습니다. 그렇지 않으면 사지 운동의 진정한 운동학을 공개 할 수있는 세그먼트 및 관절 운동 변수2. 대부분의 보행 매개변수는 상관관계가 있기 때문에 모터 적자를 완전히 평가하기 위해 쥐가 채택한 보상을 이해하기 위해 보행 매개변수 모음이 필요합니다.
지난 10년 동안, 인간의 생물 의학 연구를 위해 여러 3D 모션 분석 시스템 6이 개발되었습니다. 이러한 시스템은 성공적이고 건강한 인간 성인의 운동에서 적자를 포착하는 데 효과적일 뿐만 아니라걷기의 변질된 운동학 6,7. 설치류에서 현재 사용 가능한 3D 운동 운동 시스템은 이동 동작에 대한 복잡한 알고리즘과모델링을 채택하고 정교한 데이터 분석 기법을 활용 8,9,10,11 결국 그들의 다양성을 제한. 또한 대부분의 3D 모션 캡처 시스템으로 데이터를 수집하는 데 사용되는 방법은 문헌에 적절하게 설명되지 않습니다. 시스템 사용과 관련된 데이터 수집 및 분석 절차, 제한 사항 및 기술에 대한 세부 정보가 부족합니다.
따라서 연구원들 사이에서 공통된 개념 중 하나는 3D 모션 트래킹 운동학 평가가 기술 전문 지식과 정교한 데이터 분석이 필요한 다소 힘들고 시간이 많이 소요되는 절차라는 것입니다. 이 작업의 목적은 데이터 수집 및 분석 프로토콜을 세분화하고 단계별 프로세스를 통해 방법론을 설명하여 객관적이고 배우기 쉽고 체계적으로 접근할 수 있도록 하는 것입니다. 오늘날, 전임상 연구에서 신경 학적 상해 및 개입에 따라 보다 포괄적이고 체계적인 방식으로 기능적 운동 행동을 평가하는 데 새로운 중점을 두고 있습니다.
여기에 제시된 사중 운동 영역에서는 신체 자세, 신체 축에 대한 발 회전, 관절의 상호 관계 및 보다 정확한 정보와 같은 추가 정보를 제공할 수 있는 3D 모션 추적 시스템의 사용이 있습니다. 조정에 관해서는, 모든 평면에서 전체 동물을 동시에 시각화하는 동안. 이것은, 차례차례로, 다중 결과를 통해 건강하고 다친 쥐 사이 모터 행동에 있는 중요한 다름을 드러낼 수 있습니다. 정확하고 객관적인 보다 정교한 운동학 분석을 통해 개입의 효과를 잘못 추론할 위험이 최소화됩니다. 이 모션 캡처 소프트웨어에서 생성된 데이터는 이동 품질을 위해 프레임별로 시각화되고 자동으로 추적될 수 있으며 데이터 수집 또는 정량화에는 추가 알고리즘이나 모델링이 필요하지 않습니다. 이 연구의 목적은 건강하고 척수 손상 된 쥐의 러닝 머신 운동 중 3D 걸음걸이 운동학의 데이터 수집 및 분석에 관련된 방법론적 세부 사항 및 고려 사항을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 실험에서 신경 학적 쥐 모델을 활용 하는 전 임상 연구자에 의해 사용을 위한 것입니다.
Protocol
이 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 건강 가이드의 국가 학회의 권고에 따라 수행 되었다. 이 프로토콜은 스토니 브룩 대학 총장의 동물 연구위원회에 의해 승인되었다.
1. 모션 캡처 시스템 설정
- 설정
- 미세조정이 가능한 기어드 헤드를 사용하여 벽(또는 삼각대)에 6대의 카메라를 장착할 수 있습니다. 러닝머신의 양쪽에 세 대의 카메라를 배치하고 각 카메라가 수평선 아래 20°-45°로 기울어져 있고, 러닝머신에서 약 2.0m, 인접한 카메라에서약 0.5m 떨어진 곳에 배치하여 마커의 최대 커버리지를 제공합니다(그림 1).
- 각 카메라에 반사 마커의 시각화를 위한 링 라이트를 장착합니다.
- 모션 캡처 시스템을 시작합니다.
- 프로젝트 중 | 사양,실험에 대한 원하는 마커를 정의합니다.
참고: 데모를 위해, 양측 사중 운동을 평가하기 위해 앞다리와 뒷다리 (각 면에 11 개의 마커)에 대해 총 22 개의 마커가 사용됩니다. 또는 특정 마커 ID 옵션이 있는 가져오기 마커 세트를 사용하면 소프트웨어 내에서 미리 설정된 계산을 수행할 수 있습니다.
- 프로젝트 중 | 사양,실험에 대한 원하는 마커를 정의합니다.
2. 모션 캡처 시스템의 교정
- 보정 비디오 캡처
- L자형 교정 프레임(이하 "L-프레임"이라고 함)을 러닝머신에 직교로 놓고, L-프레임의 긴 다리가 쥐의 보행 방향을 가리킵니다(그림 2).
- 모션 캡처 소프트웨어를 열고 녹화를 선택하여 보정 비디오를 캡처합니다.
- 쥐가 들어올 모든 영역을 커버하도록 공간의 러닝머신 영역에 걸쳐 삼지창 모양의 교정 프레임(이하 "지팡이"라고 함)을 이동합니다.
참고: L-프레임에는 전역 좌표계를 설정하는 네 개의 마커가 포함되어 있으며 지팡이에는 쥐의 3D 보행 공간을 보정하는 세 개의 마커가 포함되어 있습니다. - 최소 1분 분의 영상을 녹화하여 120프레임/s에서 적절한 보정을 위해 적절한 지팡이 데이터 요소가 있는지 확인합니다.
- 비디오를 3D 교정 파일로 저장합니다.
- L-프레임 추적
- 카메라 그룹을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 3D추적을 선택합니다. 드롭다운 창 아래에서 3D 교정 비디오를선택한 다음 모든 교정 카메라를선택합니다.
- 고정점 기능을 사용하여 6개의 보정 비디오에서 L-프레임 원점, L 프레임 단락, L 프레임 중간 및 L 프레임 롱을 추적합니다. 모든 점을 정의하고 자동으로 검색 버튼을 선택합니다.
참고: 좌표계가 이동하는 것을 방지하기 위해 전체 실험 중에 러닝머신을 기준으로 L 프레임 위치를 일관되게 유지해야 합니다.
- 지팡이 추적
- 카메라 그룹을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 자동 3D-지팡이추적을 선택합니다.
- 카메라 선택에서 모든 카메라를 선택합니다. 창 오른쪽 하단에서 옵션을선택하고 L 프레임감지를 선택 취소하고 추적 시작을선택합니다.
- 자동 추적 후 6대의 모든 카메라에 지팡이 단락, 지팡이 중간 및 지팡이 긴 마커 할당을 선택합니다.
- 3D 추적 창에서 원시 데이터로 내보내기를선택한 다음 기존 지팡이 데이터 덮어쓰기 옵션을 선택하여 추적을 저장합니다.
- 가장 정확한 데이터를 저장하려면 마지막 단계 다음에 나타나는 창에서 예를 선택합니다.
참고: 이 새 추적은 왼쪽 사이드바의 자동 추적 탭 아래에 추적으로 저장됩니다. 저장된 추적은 나중에 액세스하고 편집할 수 있습니다.
- 교정 계산
- 카메라 보정 그룹을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 새 지팡이 보정 그룹을선택합니다.
- 모든 카메라를 선택하고 확인을 선택하는 동안 Ctrl (제어) 키를 누를 수 있습니다.
- 지팡이 길이를 100.00mm로 변경하고, L 프레임 바닥 오프셋을 7.00mm로 변경하고, 이상값 감지를 위한 반복을 4로 변경하고, 지팡이 길이 편차를 0.300으로 허용합니다.
- 지팡이가 옵션에서 표시되어야 하는 카메라를 4로 변경하고 가로 세로 비율 수정, 기울이기 매개 변수 수정 및 주점 수정(표 1)을 켭니다.
참고: 이러한 설정은 실험적으로 이 설정에 가장 적합한 것으로 결정되었습니다. - 지팡이 길이가 3mm 미만이고 잔여 값이 0.004 미만인 교정을 허용합니다.
참고: 카메라 또는 관련 장비가 이 지점을 벗어나면 시스템을 다시 보정해야 합니다.
3. 러닝머신 운동을 위한 동물 훈련 및 준비
- 러닝머신 운동을 위한 훈련 쥐
- 훈련 세션12전에 5 분 동안 러닝 머신에 쥐를 적응.
- 쥐를 훈련하여 1주일 동안 아침에 15분/세션 동안 13cm/s의 팔다리에 몸무게가 가득 합니다. 러닝머신(12)에서 일관되게 걸을 수 있도록(최소 10개의 연속걸음)이 가능할 때까지 모든 쥐를 훈련한다.
- 각 쥐에 대한 하루 의 동일한 시간에 대한 교육 세션을 완료합니다.
- 데이터 수집 전에 쥐를 인큐베이션 챔버에 배치하여 쥐를 마취시다.
- 이소플루란 가스 공급(1.0%-2.5%) 약 5 분 동안 산소의 0.4 L. 마취의 깊이를 확인하기 위해 쥐의 발을 꼬집어.
- 쥐가 발 꼬집기 (네거티브 발 철수 반사)에 반응하지 않을 때 진행하십시오.
- 마커 추적을 방해하는 모피를 피하기 위해 마커가 배치 될 영역에서쥐를 면도 (그림 1).
- 뼈 랜드마크의 피부를 만져 마커를 배치합니다. 팔꿈치와 무릎에 관절 말단에 대한 펜 마커를 사용합니다(그림3).
참고 : 역반사 마커는 역반사 테이프로 덮인 직경 0.5cm의 플라스틱 반구입니다. - 데이터 수집 전에 뼈 랜드마크에 원하는 대로 마커를 배치합니다(그림 3).
참고: 건강한 비신경 외상성 쥐에서는 말단 관절 위에 놓인 역반사 마커가 쥐에 의해 제거되는 경우가 많습니다. 데모 목적을 위해, 역반사 마커는 근위 뼈 랜드 마크 위에 배치됩니다 (장골 문장, 엉덩이, 앞다리에 대한 무릎 관절, 어깨와 앞다리에 대한 팔꿈치 관절), 펜 마커는 더 말단 랜드 마크에 사용됩니다. 우리의 손에, 이것은 쥐 (게시되지 않은 데이터) 사이 와 내 재현 가능한 결과를 산출했다.
- 뼈 랜드마크의 피부를 만져 마커를 배치합니다. 팔꿈치와 무릎에 관절 말단에 대한 펜 마커를 사용합니다(그림3).
4. 모션 캡처
- 모션 캡처 소프트웨어의 상단 막대에 있는 빨간색 카메라 버튼을 선택하여 평가판을 기록합니다. 컴퓨터에서 저장 위치를 지정하고 120프레임/s로 기록할 기록 시작을 선택합니다.
- 사용자 정의 러닝머신 속도를 설정하고 쥐가 약 30s 또는 최소 10개의 연속 걸음을 걸을 수 있도록 합니다.
- 녹화를 중지하고 계속하기 전에 푸티지에 최소 ~10단계의 연속 단계가 포함되어 있는지 확인합니다.
- 녹화된 비디오를 저장한 후 각 평가판에 대해 새 카메라 그룹을 만듭니다.
5. 모션 추적
- 저장된 카메라 그룹에 인접한 "+ " 기호를 선택합니다. 그러면 6개의 카메라 목록이 모두 표시됩니다.
- 카메라 파일에 3D 보정 할당
- 카메라 교정 그룹으로 이동하여 계산된보정을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 3D 카메라 매개변수 할당을선택합니다. 교정 파일을 저장된 카메라 그룹의 적절한 카메라 파일에 할당합니다. 카메라 파일 위로 마우스를 가져가서 교정을 확인합니다(3D 교정이 유효한것으로 읽힙니다).
- 개별 카메라 2D 추적
- 모션 추적을 위해 카메라 그룹을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 2D추적을 선택합니다.
- 추적을 위한 7~10개의 최고의 연속적이고 일관된 단계를 선택합니다. 각 단계에 대한 러닝머신에서 참조 팔다리의 첫 번째 접촉에서 프레임 번호를 기록합니다.
참고: 데모를 위해 왼쪽 뒷다리가 참조 사지로 선택되었습니다.
- 다양한 추적 옵션을 사용할 수 있습니다.
- 관심 있는 마커를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 자동 추적을 선택하면 역반사 마커에 의해 생성된 밝은 원형 반점을 감지합니다(그림 4).
- 또는 패턴일치를 사용하여 마커를 추적하여 소프트웨어에 내장된 알고리즘을 사용하여 크기와 색상에 따라 마커를 추적합니다(그림 4).
- 추적에서 감지할 수 없는 마커 또는 오류를 수동으로 추적하고 수정합니다.
- 말단 관절 역반사 마커가 불가능한 경우 검은색 마커를 사용합니다.
- 자동 추적을 위해 검정 마커를 밝은 반점으로 반전시켜 고급 이미지 처리를 사용하여 검정 마커를 추적합니다.
참고: 이미지 처리 옵션을 사용하여 감지하거나 보기 어려운 마커를 추적할 수 있습니다. - 2D 추적 창에서 쥐 비디오를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 이미지 처리를선택합니다.
- 고급 뷰를 선택하고 네 개의 필터(밝기, 대비, 감마)의 조합을 추가하여 주변 환경과 비교하여 검정 마커를 가능한 한 어둡게 만듭니다. 마지막으로 반전을 추가하면 검정 마커가 자동으로 추적할 수 있는밝은 마커가 됩니다(그림 5).
- 자동 추적을 위해 검정 마커를 밝은 반점으로 반전시켜 고급 이미지 처리를 사용하여 검정 마커를 추적합니다.
- 마커 배치 보정
- 추적에서 감지할 수 없는 마커 또는 오류를 수동으로 추적하고 수정합니다.
- 비디오를 수동으로 추적하려면 오른쪽 사이드바에서 원하는 마커를 선택합니다. 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 수동추적을 선택합니다. 프레임별로 나타나는 쥐 비디오에서 선택한 마커추적을 시작합니다.
- 오류를 수정하려면 추적 오류가 발생한 프레임으로 이동합니다. 오른쪽 사이드바의 특정 마커 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 점삭제를 클릭합니다. 정확한 위치에서 수동으로 점을 다시 추적합니다.
- 위의 방법을 사용하여 연속 단계의 프레임 범위에서 원하는 모든 마커에 사용되는 모든 카메라에 대해 완전한 2D 추적을 수행합니다.
- 추적 프로세스 전체에서 저장을 클릭합니다.
6. 운동분석
- 단계 할당
- 위상을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 위상 모델편집을 선택합니다.
- 적자에 따라 각 사지에 대한 걸음걸이 주기 단계를 사용자 정의 (예를 들어, 드래그 단계의 추가, 발가락 컬 단계 등) 스텝 사이클의 전통적인 자세와 스윙 단계 내에서. 실험에 대한 단계를 정의합니다(그림 6).
참고: 데모를 위해 3단계가 여기에 표시되고 왼쪽 뒷다리는 7~10보행 사이클의 참조 사지로 사용됩니다. - 카메라 그룹에서 카메라를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 비디오표시를 선택합니다.
- 추가 위상 버튼 또는 F11 바로 가기 키를 사용하여 소프트웨어 내의 각 팔다리에 걸음걸이 주기의 단계를 할당합니다.
- 분석에서 적절한 팔다리를 선택하고 첫 번째 추적 프레임을 자세 단계의시작으로 지정합니다.
- 스탠스 위상이 끝나고 스윙 단계가 시작되는 프레임으로 비디오를 진행합니다. 이 프레임을 스윙단계의 시작으로 지정합니다.
- 비디오가 발이 내려오기 시작하는 첫 번째 프레임으로 진행합니다. 이 프레임을 미드 스윙단계의 시작으로 지정합니다.
참고: 본 명세서에서, 각 사지에 대한 스텝 사이클의 자세 단계는 사지가 러닝머신 표면에 접촉하는 제1 프레임으로 정의된다. 스윙 위상은 팔다리가 러닝머신 표면을 떠나는 첫 번째 프레임으로 정의됩니다. 중간 스윙 단계는 사지가 최대 간격을 달성하고 하강하기 시작하는 프레임입니다. 완전한 걸음걸이 주기는 초기 자세의 개시부터 다음 걸음걸이 주기의 자세 위상 할당에 이르기까지 정의됩니다. - 각 단계에 대해 팔다리 단계 할당이 완료될 때까지 이 단계를 반복합니다. 다른 세 개의 팔다리에 대해 반복합니다.
- 3D 좌표 계산
- 6대의 카메라를 모두 추적한 후 3D 계산을 수행합니다.
- 카메라 그룹을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 새 3D계산을 선택하고 카메라 선택을 위해 모두를 클릭한 다음 확인을선택합니다.
참고: 새 폴더가 나타납니다. 이 폴더에는 추적된 모든 마커에 대한 모든 3D 좌표 데이터가 포함되어 있습니다. 위상을 보거나 편집하려면 왼쪽 사이드바에서 3D 좌표를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 단계 편집(그림 7)을선택합니다. - 관심 있는 마커를 드래그하여 지정된 걸음걸이 단계와 나란히 볼 수 있도록 데이터 요소가 있는 조인트 높이 또는 속도 다이어그램과 같은 관심 있는 데이터를 생성합니다. (예를 들어, 도8의 관절 운동학).
- 3D 다이어그램
- 3D 다이어그램을 클릭하여 평가판의 3D 그림을 생성합니다.
- 3D 좌표/내보내기를마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 원시 데이터를 내보냅니다.
- 3D 좌표 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 내보내기를선택합니다.
- 스프레드시트 소프트웨어에서 파일을 열고 데이터를 MATLAB으로 가져옵니다.
- 사지 단계 높이 조정플롯을 작성하는 프로그램을 작성합니다.
참고: 3D 좌표 데이터를 분석 소프트웨어 또는 사용자 정의 매크로 스크립트로 내보내 소프트웨어 기능이 제공하는 것 이상으로 더 많은 데이터를 생성할 수 있습니다.
Representative Results
이 프로토콜은 간단한 내장 소프트웨어를 사용하여 설치류의 러닝머신 운동을 위한 정량적 3D 운동학 데이터 수집 및 분석을 위한 방법을 보여줍니다. 결과는 프로토콜이 건강하고 척수 손상 된 쥐에서 사중 운동 운동학을 수집하고 분석하는 것이 가능하다는 것을 보여줍니다. 쥐 취급 경험이 있는 연구원은 쥐에 마커를 배치한 다음 중요한 문제 없이 모션 캡처 시스템을 교정하고 사용해야 합니다. 복잡한 알고리즘을 사용하지 않고도 데이터를 쉽게 생성할 수 있습니다.
여기서, 프로토콜은 건강한 척수 부상(C5 우측 하부) 랫트에서 구현되었다. 이 원고의 목적에는 대표적인 결과만 표시됩니다. 전반적으로, 조인트 및 사지 세그먼트 운동의 다양한 운동학은 각 마커의 3D 좌표로부터 쉽게 얻을 수 있었다. 비정상적인 걸음걸이 주기와 건강한 걸음걸이 주기 사이의 중요한 차이는 단계 높이 측정, 관절 속도, 관절 각도(그림9), 4개의 사지 모두에 대한 단계 주기 단계 기간,을 포함하여(이에 국한되지 않음) 여러 결과로 쉽게 검출되었다. 및 사지협응 (그림 10). 플롯 및 스틱 다이어그램의 형태로 정성적 데이터의 분석은 이러한 분석 접근법의 최종 결과를 위해 구현하는데 사용되는 정량적 도구의 결정을 안내할 수 있다(그림 11).
대표적인 건강한 랫트에서, 팔꿈치 각도 프로파일은 완전한 운동 범위를 표시하는 일관된 인접한 걸음걸이사이클을 가진 매끄럽고 단일 피크를 입증하였다(도 9). 트레이스의 교대 자세 단계 및 스윙 위상 기간은 일관된 내다리 협응을 제안했습니다. 대조적으로, 대표적인 척수 부상 쥐의 팔꿈치 각도 프로파일은 덜 일관되고 운동 범위가 작은 여러 왜곡 된 피크를 보여 주었다. 길어진 자세 단계와 단축된 스윙 단계 의 변경 외에도 RFL에 대한 내다리 조정의 결핍이 있었습니다.
조정을 위해 플롯 된 제시 된 대표 데이터에서, 그것은 조정 플롯 (그림10)대표적인 건강한 쥐에서 생성 된 잘 정의 된 것으로 나타났다, 보행 동안 입시 측측 사지에 교대리듬 조정 사이클 (L 자형 패턴) 및 반대 측다리와 위상 D 자형 패턴. 이에 비해, 대표적인 척수 손상(C5 우측 절제술) 쥐는 동측 사지의 불쌍한 비교대 및 비리듬적 협응과, 특이한 교대리듬 협응(L자형 패턴)을 보였다. 사지 페어링 (그림10). 기록된 모션 비디오에서 오른쪽 앞다리의 관찰 가능한 적자를 감안할 때, 이것은 RFL과 LHL이 주어진 시간에 LFL 또는 RHL의 지원없이 전체 무게를 견딜 수 없음을 시사합니다. 이러한 경향은 러닝머신에서 강제 보행 속도에 대처하기 위한 보상 메커니즘을 제안합니다.
정량화 가능한 데이터는 3D 시스템을 사용하여 쉽게 생성되었지만, 이는 별도의 탭에 액세스하고 소프트웨어 내에서 사용할 수 있는 다양한 옵션 중에서 선택하는 것을 포함했습니다. 정량적 및 정성적 데이터를 단일 보고서로 생성하는 자동화된 템플릿을 개발하는 작업이 현재 진행 중입니다(개별적으로 다른 결과를 생성할 필요 없이) 일상적으로 수행되는 것처럼 임상 연구에 활용된 운동학 시스템. 따라서 여러 끝점을 평가판 직후쉽게 시각화할 수 있는 보고서 형식으로 컴파일하고 내보낼 수 있습니다.
그림 1 : 실험적인 설정. (A) 러닝머신 워킹 태스크를 위한 6카메라 운동학 데이터 수집 설정의 회로도. 러닝머신 양쪽에 3대의 카메라 세트가 배치되어 운동 중에 좌우 마커 모션을 캡처합니다. (B) 설치류의 앞다리와 뒷다리에 뼈가 있는 랜드마크 위에 마커 배치를 묘사한 다이어그램은 사중 운동 운동학을 포착합니다. 총 11 개의 마커가 쥐의 각 측면에 배치됩니다. 그늘진 영역은 쥐가 면도되는 영역을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 교정용 마커. (A) 지팡이 보정 시스템에 대한 마커 세트 할당은 두 개의 보정 프레임을 사용하여 L-프레임과 지팡이 (B) 좌표계는 L-프레임에 의해 정의되며, 여기서 L-프레임 원점(프레임의 두 다리의 교차)은 (0,0)로 정의된다. L-프레임, L-프레임 짧은 및 L-프레임의 두 팔다리는 각각 x-및 y 축을 정의하며 z축은 XY 평면에 수직으로 정의됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 마커 유형. (A) 쥐의 하부 트렁크 사진은 사용되는 두 가지 유형의 마커를 보여 주다. (B) 사진은 피부에 부착하도록 설계된 양면 테이프 (원 빨간색)와 장골 문장에 배치 된 역반사 마커를 보여줍니다. (C) 사진은 오른쪽 메타토포날란게알 관절(빨간색 원)에 펜 마커의 배치를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 모션 추적. (A) 이미지는 "자동으로 추적"과 "패턴 일치를 사용하여 추적"기능을 사용하여 여러 마커를 동시에 추적 할 수있는 모션 추적 인터페이스를 보여줍니다. (B) 마커 할당 중에 "자동으로 추적" 기능에서 역반사 마커의 확대보기가 밝은 흰색 원형 지점으로 감지됩니다. 이 소프트웨어는 이 지점을 밝은 파란색 원형 지점으로 인식합니다. 빨간 점은 결국 규정된 마커의 중심으로 인식됩니다. 원형 마커 내의 가운데 빨간색 점이 면 데이터 추적 중에 실험 오류가 발생할 가능성이 줄어듭니다. 센터의 편차는 후속 측정 및 분석이 부정확할 수 있음을 시사합니다. (C) 패턴 일치를 위해 선택된 역반사 마커의 확대보기입니다. 선택한 마커의 크기, 모양 및 색상에 따라 소프트웨어는 후속 비디오 프레임의 설명과 일치하는 마커를 자동으로 식별합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 기본 및 고급 추적 옵션. (A) 불분명하거나 흐릿한 마커가 자동 추적을 허용하도록 명확하게 시각화되도록 분석 중에 비디오를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 소프트웨어 내에서 비디오를 처리할 수 있습니다. 데모를 위해 데이터 수집 중에 서로 다른 주변 조명 조건을 수용하도록 조정된 두 가지 유형의 이미지 처리 설정이 표시되어 쉽게 추적할 수 있습니다. (B) 이미지 처리 전에 대표적인 비디오 프레임. (C) 기본 이미지 처리 (처리 유형 I)의 경우 밝기 및 대비 설정을 조정하여 보다 선명한 시야를 제공합니다. (D) 고급 이미지 처리 설정(처리 유형 II)을 사용하여 오른쪽 중족조 마커(검정 마커)를 반전한 다음 자동으로 추적할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 단계 할당. 각 사지에 대한 걸음걸이 주기는 실험 설계에 따라 개별 단계로 나눌 수 있다. 데모를 위해 3개의 보행 사이클 단계가 표시됩니다. (A) 자세 위상은 팔다리가 러닝머신 표면에 접촉하는 첫 번째 프레임으로 정의됩니다. (B) 스윙 단계는 팔다리가 러닝머신 표면(C) 중간스윙 위상을 떠나는 첫 번째 프레임으로 정의되며, 중간 스윙 단계는 발이 하강하기 시작하는 사지 클리어런스 후 첫 번째 프레임이다. (D)에서, 완전한 걸음걸이 사이클은 초기 자세의 개시로부터 다음 걸음걸이 사이클의 자세 위상 할당에 정의된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 단계별 분석을 위한 고급 옵션. 이 옵션을 사용하면 추적 및 단계 할당을 심층보기뿐만 아니라 위상 할당을 변경할 수 있습니다. (A) 마커 선택 상자를 클릭하여 원하는 마커를 보고 선택합니다. (B) 좌표 선택 창: 관심 있는 좌표(이 경우 z 좌표)를 강조 표시하면 기본 다이어그램 창에 빨간색으로 표시됩니다. (C) 위상 선택 창:(A) 및 (B)에서 선택한 마커 및 좌표에 대해 팔다리에 할당된 위상을 볼 수 있습니다. 이 창을 통해 단계를 편집할 수도 있습니다. (D) 다이어그램 창: 특정 마커에 대한 좌표를 개별 보행 사이클 단계에서 동시에 비교할 수 있다. 녹색과 노란색은 사중 운동 동안 오른쪽 뒷다리에 대한 자세와 스윙 단계를 각각 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 3D 운동학 데이터 샘플. (A) 각 조인트 마커의 다양한 결과는 비디오 추적 후 3D 좌표 데이터 세트에서 그림으로 시각화 할 수 있습니다 (B) 각 앞다리와 뒷다리에 대한 자세 및 스윙 위상 주기에 대해 생성 된 대표 데이터 쥐를 걷는 네 번째. 색상은 연속적인 스텝 사이클의 자세와 스윙 단계를 나타냅니다. 빨간색과 녹색은 각각 오른쪽 앞다리와 뒷다리 자세 단계에 해당합니다. 파란색과 청록색은 각각 왼쪽 앞다리와 뒷다리 자세 단계에 해당합니다. 노란색은 각 팔다리의 스윙 단계에 해당합니다. (C) 여러 데이터 그룹(이산 마커 또는 결과)을 동시에 쉽게 비교할 수 있습니다. 왼쪽 및 오른쪽 무릎 관절 마커의 z 좌표 속도 데이터는 러닝머신 표면으로부터 무릎 관절 마커의 수직 속도를 나타내기 위해 임의로 선택된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 : 러닝머신 운동 중 건강하고 자궁경부 척수 손상 쥐의 대표적인 관절 각 운동학 데이터. (A) 건강한 대표 래트의 팔꿈치 관절 각 프로파일은 완전한 운동 범위를 표시하는 일관된 인접한 걸음걸이 주기로 관절 각도 트레이스의 매끄럽고 단일 피크를 보여줍니다. 빨간색과 노란색 막대는 앞다리 스텝 사이클의 자세와 스윙 단계를 각각 나타냅니다. (B) 대조적으로, 대표적인 척수 손상 된 쥐의 흔적은 상대적으로 더 왜곡되고 관절 운동의 전체 작은 범위와 일치하지 않는 여러 피크를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10 : 러닝머신 운동 중 건강한 자궁경부 척수 에서 나온 대표적인 사지 협응데이터. (a) 단계 높이 측정을 묘사하는 메타카르포팔란게알(MCP) 및 메타소팔란게알(MTP) 마커의 z-좌표값은 사중 보행 동안 약 10걸음에서 팔다리 사이의 6가지 조합으로 플롯된다. 모든 6개의 가능한 사지 협응 쌍의 대표적인 데모가 도시되어 있습니다. (B) 건강한 랫트는 모든 쌍(i, ii, iii, iv)에 대해 명확한 교대 리듬 조정(L자 형 패턴)을 나타낸다. 팔다리가 위상(v, vi)에 있을 때, 조정 쌍은 D 자형 패턴을 따릅니다. (C) 자궁 경부 척수 부상 쥐, 참고 (i) 두 앞다리 사이의 가난한 조정, (iii) 오른쪽 ipsilateral 페어링 및 (iv) 반대 쪽 사지 쌍 중 하나에 대한 비정상적인 조정. 조정 플롯(B,C)은 동일한 축척을 공유하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11 : 애니메이션 3D 스틱 그림. 추적된 데이터에서 생성된 3D 스틱 그림의 예입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 교정 매개 변수 | 교정 입력 |
| 지팡이 길이 【mm] | 100개 |
| L-프레임 바닥 오프셋 [mm] | 7명 |
| 이상값 검색을 위한 반복 | 4개 |
| 지팡이 길이 편차 허용 | 0.3 |
| 지팡이는 적어도 __ 카메라에 표시되어야 합니다. | 4개 |
| 종횡비 수정 | 확인 |
| 스큐 매개 변수 수정 | 확인 |
| 주점 수정 | 확인 |
표 1: 교정을 위한 고급 설정. 이 표에는 6대의 카메라 설정을 정확하게 보정하는 데 사용한 매개 변수가 요약되어 있습니다. 이러한 설정은 실험적으로 테스트되었으며 설정에 가장 적합한 것으로 나타났습니다.
Discussion
이 프로토콜 문서에서는 설치류에서 사중 러닝머신 운동 중 3D 운동학 데이터의 수집 및 분석을 위한 모션 추적 시스템의 사용을 보여 줍니다. 3D 운동 운동 분석 시스템의 중요한 특징으로는 여러 관절과 사지에서 동시에 관절 운동 (스텝 위상 운동학, 관절 각도, 운동 범위, 스텝 속도)의 운동학의 상세한 정량화, 감지 모터 적자는 육안으로 측정 할 수없는, 데이터 수집 및 분석의 주관적 편견의 제거, 운동 전체 쥐의 동시 병치와 비교 될 수있는 전체 사지 및 자세 운동학의 쉬운 시각화. 추가 된 알고리즘 및 모델링없이, 방법은 매우 세부 사항, 효율성, 용이성, 정밀도 및 재현성보의 운동학을 정량적으로 분석하는 소프트웨어의 능력을 보여줍니다.
설치류에서 척수 손상 후 앞다리 및 뒷다리 운동 적자 (SCI)는 일반적으로 BBB 채점 시스템1과같은 주관적이고 표준화 된 운동 점수 시스템을 사용하여 평가됩니다. 주관적인 채점 시스템은 일반적으로 다른 연구자들이 동일한 모터 적자에 대해 동일한 점수 또는 동일한 점수에 대해 다른 점수를 할당할 수 있기 때문에 시험기 편향을 도입하여 테스트 13의 재현성과 민감도를 감소시켰습니다. . 또한, 미묘한 적자를 감지 할 수없는 것은 개입의 효과에 잘못 추론의 위험을 착용.
이러한 문제에 대처하기 위해, 자동화 된 시스템2,3,4,5 및 복잡한 알고리즘14,15의 사용 유무에 관계없이 일부 조사자가 채택되었습니다. 이 시험은 활주로를 가로질러 걷는 쥐의 발 배치 운동에서 파생된 무게 베어링 프로파일 및 단계 순서 패턴을 드러내는 단계 주기 분석을 수행합니다. 그러나, 복부 평면 비디오 보행 분석의 주요 단점은 피사체의 몸자체가 직접 보이지 않는다는 것입니다 2,3. 이러한 데이터는 적자 평가에서 걸음걸이 매개 변수의 선택 및 해석에 의문을 제기, 발과 발의 움직임의 노출에서 얻은 정보로 제한됩니다 (첸 등16참조). 사지 운동과 위치의 동적 세그먼트 운동학을 드러내는 운동의 세부 사항은 운동 분석3,5를위해 정확하게 얻을 수 없습니다 . 관절 각도 데이터의 중요 편차(예: 동작 범위, 이동 속도 등), 사지 내 및 팔다리 사이의 서로에 대한 관절의 관계, 걸음걸이 패턴을 변경하는 기본 신체 역학을 얻을 수 없습니다. 이와 같이, 어떤 관찰 가능한 보행 장애가 단일 및/또는 다중 세그먼트 관절 운동(즉, 근위-말단 내측 협응, 위치 및 보행 주기에 대하여 트렁크의 자세 관계)의 변경으로 인한 것인지 여부 사지 등) 마스크 된 상태로 유지됩니다.
현재 사용 가능한 몇 가지 시스템은 걸음걸이 운동학을 캡처하고 정성적 및 정량적으로 모터 기능 장애를 평가하지만 덜 널리 사용되지 않습니다. 전신 고속 비디오 추적 보행 분석 시스템은 3면 (1 개의 복부 및 두 개의 측면 평면)에서 자발적인 보행 주기를 촬영하고 보닛 랜드 마크를 추적하여 보행 결과17,18을출력합니다. 시상평면 운동체 보행 분석은 일부 연구자들이 관심 있는 뒷다리(19,20)의2D 모션 데이터를 얻기 위해 채용된다. 그러나, 관찰평면(측방 또는 시상)에 직교적으로 발생하는 운동의 제3차원은 분석11,18,19에서검출할 수 없다.
기타 보다 정교한 3D, 3개의 바디 세그먼트 설치류 신체 자세 데이터 수집 시스템은 데이터 수집의 3D 수학적 모델링뿐만 아니라 분석 시스템을 활용하여 설치류의 신체 세그먼트의 3D 모션을 추적하고 정량화합니다. 모션 패턴8. Madete 등9는 7개의 카메라 시스템을 사용하여 보행 빔에서 지상 운동 중에 3D 신체 자세 운동학을 정량화하는 마커 기반 의 광전자 모션 캡처 시스템을 개발했습니다. 후자의 두 작품에서 공부 된 주요 결과는 주로 보행 분석보다는 설치류의 전반적인 자세에 초점을 맞춥니다. 3D 모션 캡처 시스템은 Bhimani 등21에서검토한 대로 여러 카메라와 정교한 소프트웨어 시스템을 사용하여 높은 처리량의 3D 운동 걸음걸이 데이터를 제공합니다. 제시된 3D 운동 분석 시스템의 이전 버전은 또한 신경 외상12,22,23의유무에 관계없이 쥐에서 이전 작업에서 사용되어 왔다.
연구를 위한 3D 모션 수집 및 분석 시스템의 가용성에도 불구하고, 설치류에 있는 이 기술의 전임상 사용은 상대적으로 한정된 남아 있습니다. 이 문제의 이유 중 하나는 데이터 수집 및 분석 프로토콜이 걷는 동안 쥐의 뒷다리의 운동 학적 모델에 맞는 운동 학 모델과 복잡한 알고리즘을 구축하여 미세하고 고해상도를 생성하기 위해 사용하는 데 크게 의존하기 때문입니다. 걸음걸이 운동학8,9,11,22. 여기에 제시된 상세한 방법론은 동물 취급, 교육, 실험 설정, 데이터 수집 및 분석 단계를 포함하여 실험 과정 전반에 걸쳐 관련된 절차에 대한 세부 정보를 제공합니다.
또한 프로토콜의 기본 부분인 시스템의 교정에 대한 세부 정보가 제공되며, 이는 피험자 들 사이의 인접 한 시험 사이의 재현성을 보장합니다. 설명된 단계별 기술은 데이터 수집 절차에 객관성을 도입하고 재현성이 높습니다. 이 모션 캡처 소프트웨어에서 생성된 데이터는 프레임별로 시각화하여 이동 품질을 확보하고 자동으로 추적할 수 있습니다. 또한 이 데이터 수집 또는 정량화에는 추가 알고리즘이나 모델링이 필요하지 않은 방식이 설명되어 있습니다. 학생, 교직원 및 연구원은 간단한 통계 소프트웨어를 사용하여 특정 기술 전문 지식에 의존하지 않고 기본적인 운동 학 출력을 생성 할 수 있습니다.
이 시스템은 또한 지상 운동, 도달 및 잡기, 실험 목표에 맞게 다른 실험 설정에 사용할 수 있습니다. 마커의 수와 유형은 필요에 따라 꼬리, 등, 트렁크 또는 귀에 맞게 조정할 수도 있습니다. 시스템에 비해 제시된 소프트웨어의 더 큰 장점은 피사체의 고해상도 비디오 데이터를 수집하는 기능입니다. 따라서 복잡한 계산 세트(예: 각도 모션, 여러 관절을 연결하는 스틱 라인 등)가 녹화된 비디오에 중첩될 수 있습니다. 마커 배치 및 생성된 3D 데이터는 쥐의 실제 움직임을 통해 확인할 수 있습니다. 반대로 다른 3D 모션 캡처 시스템에서는 마커만 캡처되며 실제 피사체의 비디오 대신 스틱 다이어그램(골격 프레임워크)에서 재분석을 수행해야 합니다. 따라서 실제 피사체 이동에 대한 마커 배치의 검증이 부족합니다.
이 시스템에 대한 경험을 바탕으로 교정은 데이터 수집의 성공에 중요한 역할을 합니다. 시스템의 교정은 변화에 매우 민감합니다. 한 카메라의 약간의 움직임은 전체 3D 좌표 데이터 수집 및 분석 프로세스를 손상시킬 수 있습니다. 보기 평면의 각 측면에 두 대의 카메라만 필요 하지만 세 번째 카메라는 다른 카메라와 각 마커의 위치를 상호 참조 하 여 더 많은 정확도를 제공 하는 것이 좋습니다. 추적 카메라의 수가 증가함에 따라 특정 마커에 대한 3D 좌표의 정확도도 증가합니다. 걸음걸이 적자로 인해 마커가 가려지는 경우(예: 발가락 컬링 또는 신경 외상 후 걸음걸이의 경우 드래그) 이러한 조건은 광범위한 수동 추적을 요구할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 결국 추적에서 생성되는 데이터의 양은 마커를 수동으로 추적하는 데 투자한 시간의 가치가 있으므로 미묘한 모터 적자를 감지하는 데 매우 중요한 도구가 됩니다.
우리의 경험에서, 시스템의 사용과 관련된 지루함은 장비 와 기술 자체의 사용을 넘어있다. 운동 행동의 평가를 위한 그밖 프로토콜과 유사하게, 쥐가 처리되고 작업에 대해 훈련되는 방법은 결과에 크게 영향을 미칩니다. 예를 들어, 그들의 코호트에서 쥐를 격리 하는 것은 테스트 하는 동안 중요 한; 그렇지 않으면 테스트되지 는 않지만 테스트 중에 여전히 존재하는 쥐는 작업 성능의 최종 저하를 보여줍니다. 최적의 실내 온도, 조명 및 소음 수준은 다른 결정 요인입니다. Fouad 외. 쥐24에 있는 기능적인모터 시험을 수반하는 그밖 도전을 간행했습니다. 실제로 이 방법을 올바르게 따르는 이 실험실의 눈을 멀게 한 사용자는 데이터 수집, 모션 추적 및 데이터 분석과 관련된 주요 장애물을 경험하지 못했습니다.
이 백서에서는 연구원들이 여러 쥐로부터 엄청난 양의 심층 적인 운동 데이터를 신속하게 수집 할 수 있도록 운동 데이터를 효과적으로 수집하고 분석하는 3D 모션 캡처 시스템을 설명합니다. 우리는 현재 소프트웨어에 내장할 수 있는 자동화된 데이터 분석 템플릿을 만들기 위해 노력하고 있으며, 설치류의 러닝머신 운동에 대해 몇 초 이내에 미리 결정된 결과 보고서를 생성할 수 있습니다. 모션 캡처 및 분석시스템을 이용한 연구 6,25. 이 템플릿의 개발은 마우스 버튼의 몇 번의 클릭의 편의에 상세한 설치류 운동 데이터를 얻기 위해 전임상 연구원을 허용합니다. 이 연구에서 제공된 방법은 설치류 운동 행동을 보다 객관적으로 평가하기 위해 전임상 연구자에게 유용할 것으로 기대됩니다. 이제 이 시스템을 사용하여 도달 및 파악과 같은 일반적이고 숙련된 앞다리 동작 중에 고처리량 3D 운동 학 데이터를 수집합니다. 중요한 것은,이 방법의 유용성은 다양한 신경 외상 및 비 신경 외상성 부상을 가진 쥐로 확장 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 프로젝트에 대한 비디오 및 지적 기여에 대한 실험적 설정에 도움을 준 Pawan Sharma에게 특별한 감사를 드립니다. 우리는 또한 비디오 프로토콜의 데모에 도움에 대한 그의 기여 크리스토퍼 팔라시오 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 camera Basler (Scout scA640-120gu) motion capture system. | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | Recording device for motion analytics. |
| Calibration Frame and Wand | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | L-shaped calibration defining the global coordinate sysetem, and the trident shape wand (100 mm) |
| Markers | Shah Lab | N/A | Recording device for motion analytics. Markers are Custom made in our lab from 0.5cm googly-eyes covered with reflective tape. |
| Matlab | Mathworks, Inc, Natic, Ca | N/A | Data analysis software |
| Rodent Cage | Custom Made within Stony Brook. | N/A | Clear plexiglass cage used to keep the rodent on the treadmill. |
| Simi Reality Motion Systems | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | 3D tracking Software. |
| Treadmill | Mk Automation Inc., Bloomfield, CT 06002 | N/A | Treadmill used for rodent locomotion. |
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