Summary
Здесь представлен протокол по сбору и анализу трехмерной кинематики четырехпалопедального передвижения у грызунов для доклинических исследований.
Abstract
Полезность трехмерных (3D) систем анализа кинематической движения ограничена у грызунов. Одной из причин такой неадекватности является использование сложных алгоритмов и математического моделирования, которые сопровождают процедуры сбора и анализа 3D-данных. Эта работа обеспечивает простой, удобный, пошаговый подробный методологии для 3D кинематического анализа походки во время беговой дорожки передвижения у здоровых и нейротравматических крыс с помощью шестикамерной системы захвата движения. Также приведены подробная информация о 1) калибровки системы в экспериментальной настройки настроены для четырехрупедного передвижения, 2) сбор данных для беговой дорожке передвижения у взрослых крыс с помощью маркеров, расположенных на всех четырех конечностях, 3) варианты, доступные для отслеживания видео и обработка, и 4) базовая 3D-генерация кинематической данных и визуализация и количественная оценка данных с использованием встроенного программного обеспечения для сбора данных. Наконец, предлагается расширить полезность этой системы захвата движения до изучения различных моторных поведений до и после нейротравмы.
Introduction
У грызунов, передних конечностей и задних конечностей локомотивных дефицитов после неврологических расстройств обычно оцениваются с помощью субъективных систем скоринга1. Автоматизированные системы2,3,4,5 были приняты для анализа походки, но страдают от недостатков, потому что первичные результаты основаны на анализе следа и не в состоянии захватить решающее значение сегментатические и совместные кинематические переменные, которые в противном случае могут выявить истинную кинематику движений конечностей2. Поскольку большинство параметров походки коррелируют, набор параметров походки необходим для понимания компенсаций, принятых крысами, чтобы полностью оценить дефицит двигателя.
В последнее десятилетие для биомедицинских исследований на людях было разработано несколько 3D-систем анализа движения6. Эти системы были успешными и доказали свою эффективность в захвате дефицита в передвижении у здоровых взрослых людей, а также изменены кинематики ходьбе6,7. У грызунов, в настоящее время доступны 3D кинематические системы движения принять сложные алгоритмы и моделирования для движения поведения и использовать сложные методы анализа данных8,9,10,11 , которые в конечном итоге ограничить их универсальность. Кроме того, методы, используемые для сбора данных с большинством 3D систем захвата движения, не объясняются должным образом в литературе. Отсутствуют подробные сведения о процедурах сбора и анализа данных, ограничениях и методах эффективного использования системы.
Следовательно, одним из распространенных понятий среди исследователей является то, что 3D движения отслеживания кинематической оценки довольно усилий и трудоемких процедур, которые требуют технических знаний и тщательного анализа данных. Цель этой работы состоит в том, чтобы разбить протоколы сбора и анализа данных и описать методологию с помощью поэтапного процесса, с тем чтобы она была объективной, легкой в освоении и с помощью которого можно было систематически подходить к ней. Сегодня, будет вытекать на оценивать функциональное моторное поведение в более всестороннем и систематическом образе следуя за неврологическими ушибами и интервенциями в доклинических изучениях.
В области четырехрупедного передвижения, представленный здесь является использование 3D системы отслеживания движения, которые могут предоставить дополнительную информацию, такую как осанка тела, вращение лап по отношению к телу осей, взаимосвязи суставов, и более точную информацию в отношении координации, все в то время как одновременно визуализации всего животного из всех плоскостей. Это, в свою очередь, может выявить критические различия в поведении двигателя внутри и между здоровыми и раненых крыс через несколько результатов. При более точном кинематический анализ, который является точным и объективным, риск неправильного вывода последствий вмешательства сведен к минимуму. Генерируемые данные из этого программного обеспечения захвата движения визуализированы кадр за кадром для качества движения и могут быть автоматически отслеживаться, а сбор или количественная оценка данных не требует каких-либо дополнительных алгоритмов или моделирования. Целью этой работы является предоставление методологических деталей и соображений, связанных со сбором данных и анализом 3D-кинематики походки во время движения беговой дорожки у здоровых и травмированных спинного мозга крыс. Этот протокол предназначен для использования доклиническими исследователями, которые используют неврологические модели крыс в экспериментах.
Protocol
Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных. Протокол был одобрен Комитетом по исследованиям в отношении животных ректора Университета Стоуни-Брук.
1. Настройка системы захвата движения
- Настройка
- Установите шесть камер на стене (или штативы) с помощью тонко регулируемых головок. Позиция три камеры выше на каждой стороне беговой дорожки, с каждой камерой под углом 20 "-45" ниже горизонта, примерно 2,0 м от беговой дорожки и примерно 0,5 м от соседних камер для максимального охвата маркеров (Рисунок 1).
- Оборудуйте каждую камеру кольцевым светом для визуализации ретрофлебных маркеров.
- Запустите систему захвата движения.
- В рамках проекта Спецификация,определить желаемые маркеры для эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для демонстрационных целей, в общей сложности 22 маркеров используется как для передних конечностей и задних конечностей (11 маркеров с каждой стороны) для оценки двусторонних четырехколесных передвижения. Кроме того, набор маркеров Импорта с определенным вариантом идентификатора маркера позволяет предустановленные вычисления в программном обеспечении.
- В рамках проекта Спецификация,определить желаемые маркеры для эксперимента.
2. Калибровка системы захвата движения
- Захват видео калибровки
- Поместите L-образную калибровочную рамку (далее именуемую как "L-рама") ортогоналино на беговой дорожке, с длинной ногой L-рамки, указывающей в направлении ходьбы крысы(рисунок 2).
- Откройте программное обеспечение захвата движения и выберите запись для захвата калибровки видео.
- Переместите трезубец формы калибровки кадра (в дальнейшем называют "wand") по всей беговой дорожке области в пространстве, с тем чтобы охватить все области, что крыса будет ходить дюйма
ПРИМЕЧАНИЕ: L-кадр содержит четыре маркера, которые устанавливают глобальную систему координат, а палочка содержит три маркера, которые будут откалибровать 3D проходное пространство крысы. - Запись как минимум 1 мин кадры для обеспечения адекватной палочки данных присутствуют для надлежащей калибровки на 120 кадров / с.
- Сохранить видео в виде 3D калибровочных файлов.
- Отслеживание L-Frame
- Право нажмите на группу камеры и выберите 3D-отслеживание. Под выпадающим окном выберите 3D калибровочныевидео, затем все калибровочныекамеры.
- Используя функцию фиксированной точки, отслеживайте происхождение L-кадров, L-кадр короткий, L-кадр середине, и L-кадр долго на каждом из шести калибровочных видео. Определите все точки и выберите кнопку "Автоматически поиск".
ПРИМЕЧАНИЕ: Положение L-кадра должно оставаться последовательным по отношению к беговой дорожке в течение всего эксперимента, чтобы предотвратить смещение системы координат.
- Отслеживание палочки
- Нажмите правой кнопкой мыши на камеру группы и выберите Автоматическое отслеживание 3D-Wand.
- Выберите все камеры в выборе камеры. В правом нижнем углу окна выберите параметры, отменить выбор кадра Detect Lи выбрать Start Tracking.
- После автоматического отслеживания, выберите Назначить Wand Короткий, Wand Mid, и Wand Long маркеры для всех шести камер.
- На окне 3D-отслеживания выберите Экспорт в необработанные данные,а затем выберите существующий вариант данных о палочке Overwrite, чтобы сохранить отслеживание.
- Выберите «Да» в окне, которое появляется после последнего шага, чтобы сохранить наиболее точные данные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это новое отслеживание будет сохранено как отслеживание под автоматическим отслеживанием вкладке в левой боковой панели. Сохраненный отслеживание можно получить и отредактировать позже.
- Расчет калибровки
- Право нажмите калибровки камеры групп и выбрать Новую группу калибровки палочки.
- Выберите все камеры и удерживайте ключ Ctrl (контроль) при выборе Ok.
- Изменение длины палочки до 100,00 мм, L-рамки пол смещены до 7,00 мм, итерации для обнаружения выбросов до 4, и позволило палочки длина отклонения до 0,300.
- Измените камеру, что палочка должна быть видна в варианте до 4, и включите следующее: исправить соотношение сторон, исправить перекос параметра, и исправить основную точку (Таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки были экспериментально определены как оптимальные для этой настройки. - Примите калибровки со стандартным отклонением от длины палочки менее 3 мм и остаточной стоимостью менее 0,004.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если камеры или связанное с ними оборудование будет перемещено за пределы этой точки, потребуется перекалибровать систему.
3. Обучение и подготовка животного к передвижению беговой дорожки
- Обучение крыс для передвижения беговой дорожки
- Акклиматизовать крыс на беговой дорожке в течение 5 минут до тренировки12.
- Поезд крыс ходить с полным весом подшипника на конечностях на 13 см / с в течение 15 мин / сессии по утрам в течение 1 недели. Поезд всех крыс, пока они не способны последовательно ходить (минимум 10 непрерывных шагов) на беговой дорожке12.
- Полные тренировки примерно в одно и то же время дня для каждой крысы.
- Перед сбором данных, анестезируют крысу, поместив крысу в инкубационную камеру.
- Доставка изофруранового газа (1,0%-2,5%) и 0,4 л кислорода в течение примерно 5 мин. Pinch ноги крысы, чтобы проверить на глубину анестезии.
- Продолжить, когда крыса не реагирует на лапу щепотку (отрицательный рефлекс вывода лапы).
- Бритье крысы в регионах, где маркеры будут размещены, чтобы избежать меха от вмешательства с маркером отслеживания(рисунок 1).
- Palpate кожи для костлявой ориентир разместить маркеры. Используйте маркеры пера для суставов дистальных до локтя и колена(рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ретроотражающие маркеры пластиковых полушарий 0,5 см в диаметре покрыты светоотражающей лентой. - Поместите маркеры по желанию на костлявые ориентиры до сбора данных(рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: У здоровых, ненейротравматических крыс, ретроотражающие маркеры, размещенные над дистальными суставами, часто удаляются крысами. Для демонстрационных целей, ретроотражающие маркеры размещены над проксимальной костлявые ориентиры (подлый гребень, бедро, коленный сустав для задних конечностей, плечевые и локтевые суставы для переднего конечности), и перо маркеры используются для более дистальных ориентиров. В наших руках, это дало воспроизводимые результаты между крысами и внутри (неопубликованные данные).
- Palpate кожи для костлявой ориентир разместить маркеры. Используйте маркеры пера для суставов дистальных до локтя и колена(рисунок 3).
4. Захват движения
- Выберите кнопку «красная камера» на верхней панели программного обеспечения для захвата движения для записи пробной версии. Обозначьте место сохранения на компьютере и выберите запись Begin для записи на частоте 120 кадров/с.
- Установите пользователь-определенный беговой дорожке скорость и позволяют крысе ходить около 30 с, или как минимум 10 непрерывных шагов.
- Остановите запись и убедитесь, что отснятый материал содержит не менее 10 непрерывных шагов, прежде чем продолжить.
- Создайте новую группу камер для каждого испытания после сохранения записанного видео.
5. Отслеживание движения
- Выберите знак «К», примыкающий к сохраненной группе камер. Это будет отображать список всех шести камер.
- Назначить 3D калибровку файлу камеры
- Перейти к группе калибровки камеры и справа щелкните по расчетной калибровке. Выберите параметры 3Dкамеры. Назначаем файл калибровки соответствующим файлам камеры в группе сохраненной камеры. Навистенад над файлом камеры для проверки калибровки (читается как 3D калибровка действительна).
- Индивидуальная камера 2D слежения
- Нажмите правой кнопкой камеры группы для отслеживания движения. Выберите 2D отслеживание.
- Выберите семь-десять лучших непрерывных и последовательных шагов для отслеживания. Запись номера кадра при первом контакте эталонной конечности на беговой дорожке для каждого шага.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для демонстрационных целей левая задняя конечность была выбрана в качестве эталонной конечности.
- Доступны различные варианты отслеживания.
- Право нажмите маркер интереса и выберите автоматическое отслеживание, который будет обнаруживать яркие круглые пятна, созданные ретрофлюративной маркеров (Рисунок 4).
- Кроме того, отслеживать маркеры с помощью шаблона соответствия, который будет использовать алгоритм, встроенный в программное обеспечение для отслеживания маркеров на основе размера и цвета (Рисунок 4).
- Вручную отслеживать и исправлять обнаруживаемые маркеры или ошибки в отслеживании.
- Используйте черные маркеры, когда дистальные суставы ретроотражающие маркеры не возможны.
- Отслеживайте черные маркеры с помощью расширенной обработки изображений, инвертируя черные маркеры в яркие пятна для автоматического отслеживания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опция обработки изображений может быть использована для отслеживания маркеров, которые трудно обнаружить или увидеть. - Нажмите справа на крысиное видео в 2D слежении окно. Выберите обработку изображений.
- Выберите Расширенный вид и добавьте комбинацию из четырех фильтров (яркость, контрастность, гамма), чтобы сделать черный маркер как можно более темным по сравнению с его окружением. Наконец, добавить invert, и черный маркер станет ярким маркером, который может быть отслежены автоматически(рисунок 5).
- Отслеживайте черные маркеры с помощью расширенной обработки изображений, инвертируя черные маркеры в яркие пятна для автоматического отслеживания.
- Коррекция размещения маркеров
- Вручную отслеживать и исправлять обнаруживаемые маркеры или ошибки в отслеживании.
- Чтобы вручную отследить видео, выберите нужный маркер на правой боковой панели. Нажмите правой кнопкой мыши и выберите Руководство отслеживания. Начните отслеживать выбранный маркер на крысином видео, которое появляется кадр за кадром.
- Чтобы исправить любые ошибки, перейдите к кадру, где произошла ошибка отслеживания. Нажмите правой кнопкой мыши на конкретной вкладке маркера в правой боковой панели и нажмите Кнопка Удалить точку. Повторяйте точку вручную в точном положении.
- Используя вышеуказанный метод, полное 2D отслеживание для всех камер, используемых для всех желаемых маркеров в диапазоне кадра непрерывных шагов.
- Нажмите на Save на протяжении всего процесса отслеживания.
6. Кинематический анализ
- Фазовые назначения
- Фазы правого щелчка и выберите модель фазы edit.
- Настройте фазы походки цикла для каждой конечности в соответствии с дефицитом один выбирает для изучения (например, добавление перетаскивания фаз, палец локон фазы и т.д.) в рамках традиционной позиции и качели фазы шаг цикла. Определите фазы эксперимента(рисунок 6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для демонстрационных целей здесь показаны три фазы, а левая задняя конечность используется в качестве эталонной конечности для семи-десяти циклов походки. - Право нажмите камеру в группе камеры и выберите показать видео.
- Назначайте фазы цикла походки для каждой конечности в программном обеспечении с помощью кнопки добавления фазы или ключа ярлыка F11.
- Выберите подходящую конечность под анализом и обозначите первый кадр отслеживания как начало фазы Stance.
- Продвините видео в кадр, где заканчивается фаза позиции и начинается фаза качели. Обозначите этот кадр как начало фазы Swing.
- Продвините видео к первому кадру, где нога начинает спускаться. Обозначите этот кадр как начало фазы среднего качели.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом смысле, этап позиции цикла шага для каждой конечности определяется как первый кадр, в котором конечность контактов с поверхностью беговой дорожки. Фаза качели определяется как первый кадр, в котором конечность покидает поверхность беговой дорожки. Середина качели фазы является рама, где конечности достигнута максимальная очистка и начинает спускаться. Полный цикл походки определяется с начала первоначальной позиции до назначения фазы позиции следующего цикла походки. - Повторяйте эти шаги до тех пор, пока назначения фаз конечностей не будут завершены для каждого шага. Повторите для других трех конечностей.
- Расчеты 3D-координат
- Выполняйте 3D-вычисления после отслеживания всех шести камер.
- Нажмите право йнагнете на группу камеры и выберите новый 3Dрасчет, нажмите Все для выбора камеры, а затем выберите OK.
ПРИМЕЧАНИЕ: Появится новая папка. Эта папка содержит все данные 3D-координат для всех отслеживаемых маркеров. Для просмотра и/или отсвачения фаз, нажмите на 3D-координаты в левой боковой панели и выберите фазы edit (рисунок7). - Генерировать данные, представляющие интерес, такие как диаграммы совместной высоты или скорости с точками данных, перетащив маркер интереса для просмотра бок о бок с назначенными фазами походки. (например, совместная кинематика на рисунке8).
- 3D диаграмма
- Нажмите 3D-схему, чтобы создать 3D-фигуру пробной версии.
- Экспорт необработанных данных путем нажатия на кнопку 3D-координаты/экспорт.
- Нажмите правой кнопкой 3D координат файл и выберите Экспорт.
- Откройте файл в программном обеспечении электронной таблицы и импортируйте данные в MATLAB.
- Создайте программу для создания участков координации высоты высоты конечностей.
ПРИМЕЧАНИЕ: данные 3D-координат могут быть экспортированы в аналитические программы или пользовательские определенные макросценарии для генерации большего количества данных, помимо того, что предлагают функции программного обеспечения.
Representative Results
Этот протокол демонстрирует методологию количественного 3D-кинематической коллекции и анализа беговой дорожки у грызунов с помощью простого, встроенного программного обеспечения. Результаты показывают, что протокол осуществим в сборе и анализе четырехпедальных локомотивных кинематики у здоровых и спинного мозга раненых крыс. Исследователи с крысами опыт должен место маркеры на крысах, а затем калибровать и использовать систему захвата движения без каких-либо критических вопросов. Данные легко генерируются без использования сложных алгоритмов.
Здесь протокол был реализован у здоровых и травмированных спинного мозга (C5 правой гемисекции) крыс. Для целей данной рукописи отображаются только репрезентативные результаты. В целом, различные кинематические движения суставов и конечностей сегмента были легко получить от 3D координат каждого маркера. Критические различия между аномальной походкой и здоровой походкой были легко обнаружены с несколькими исходами, включая (но не ограничиваемый) измерения высоты шага, скорость совместной работы, угол сустава(рисунок 9), продолжительность фазы цикла шага для всех четырех конечностей, и координация конечностей(рисунок 10). Анализ качественных данных в виде графиков и диаграмм палки может определять количественные инструменты, используемые для реализации окончательных результатов этого аналитического подхода(рисунок 11).
В репрезентативной здоровой крысы, локоть угол профиля продемонстрировали гладкие, одиночные пики с последовательной смежной походки циклов, которые отображаются полный диапазон движения(Рисунок 9). Чередование фазы и фазы качели продолжительности следов предложил последовательную координацию внутриконечности. В отличие от этого, профиль угла локтя репрезентативной поврежденной крысы спинного мозга продемонстрировал несколько искаженных пиков, которые были менее последовательными и меньшими диапазонами движения. В дополнение к изменениям в удлиненной фазе позиции и укороченной продолжительности фазы качели, был дефицит в координации внутриконечности для RFL.
В представленных репрезентативных данных, составленных для координации, было установлено, что координационные участки(рисунок 10),созданные из репрезентативных здоровых крыс, показали четко определенные, чередующиеся ритмические координации в ипсилатеральных конечностях во время походки циклов (L-образный узор) и в фазе D-образный узор с контралатеральными конечностями. Для сравнения, представитель спинного мозга раненых (C5 правой гемисекции) крыса показала плохой не-переменной и неритмической координации в ипсилатеральных конечностей и необычной переменной ритмической координации (L-образный шаблон) в одном из контралатеральных конечностей спаривания(рисунок 10). Учитывая наблюдаемый дефицит в правой передней конечности в записанном видео движения, это говорит о том, что RFL и LHL были не в состоянии нести полный вес без поддержки либо LFL или RHL в любой момент времени. Эта тенденция предполагает компенсационный механизм, чтобы справиться с вынужденной скоростью ходьбы на беговой дорожке.
Количественные данные были легко генерируемые из использования 3D-системы, но это включало доступ к отдельным вкладок и выбор из множества вариантов, доступных в программном обеспечении. В настоящее время ведется работа по разработке автоматизированного шаблона, который будет генерировать количественные и качественные данные в единый отчет для наиболее очевидных результатов, представляющих интерес (без необходимости индивидуально говоруть различные результаты), как это обычно делается с кинематическая система, используемая для клинических исследований. Таким образом, несколько конечных точек могут быть собраны и экспортированы в формате отчета, который может быть легко визуализирован сразу же после испытания.
Рисунок 1 : Экспериментальная настройка. (A) Схема шестикамерного кинематической настройки сбора данных для беговой дорожки ходьбе задачи. Набор из трех камер помещается по обе стороны беговой дорожки для захвата (кадр за кадром) левый и правый маркер движения во время передвижения. (B) Диаграмма с изображением маркера размещения над костлявыми ориентирами на передних конечностях грызунов и задних конечностей, чтобы захватить четырехколесный локомотив кинематики. В общей сложности 11 маркеров помещается на каждой стороне крысы. Затененные области показывают область, где крыса побрилась. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Маркеры для калибровки. (A) Маркер набор назначений для системы калибровки палочки, используя два калибровочных кадров: L-Frame и палочка (B) Координат система определяется L-Frame, где L-Frame происхождения (пересечение двух ног кадра) определяется как (0,0). Две конечности L-Frame, L-Frame короткие и L-Frame длинные определяют x- и y-axs, соответственно, и z-оси определяется как перпендикулярно плоскости XY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Типы маркеров. (A) Фотография нижнего ствола крысы с указанием двух типов маркеров, используемых. (B) Фотография демонстрирует светоотражающий маркер, размещенный на подвздошном гребне с двусторонней лентой, которая предназначена для прилипания к коже (обведенный красным). (C) Фотография демонстрирует размещение маркера пера над правым плюсневофаллангевым суставом (обведенным красным). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Отслеживание движения. (A) Изображение показывает интерфейс отслеживания движения, где несколько маркеров могут быть отслежены одновременно с помощью функций "Track автоматически" и "Track с помощью шаблона соответствия" функций. (B) Увеличенное представление ретрофлеативного маркера обнаруживается как яркое белое круглое пятно в функции "Track automatically" во время назначения маркера. Программное обеспечение распознает это пятно как ярко-голубое круглое пятно. Красная точка в конечном итоге признается в качестве центра предписанного маркера. Центрированное красное пятно в круговом маркере снижает вероятность экспериментальных ошибок при отслеживании данных. Отклонение от центра позволяет предположить, что последующие измерения и анализы могут быть неточными. (C) Увеличенное представление ретрофлеативного маркера, выбранного для сопоставления шаблона. Основываясь на размере, форме и цвете выбранного маркера, программное обеспечение автоматически определяет маркеры, соответствующие описанию в последующих видеокадрах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Основные и продвинутые параметры отслеживания. (A) Видео могут быть обработаны в рамках программного обеспечения, право нажав видео во время анализа, так что неясные или размытые маркеры четко визуализированы, чтобы автоматическое отслеживание. Для демонстрационных целей показаны два типа параметров обработки изображений, которые корректируются с учетом различных условий освещения во время сбора данных для легкого отслеживания. (B) Представитель видео кадр амдостоянии до обработки изображений. (C) Для базовой обработки изображений (обработка типа I), настройки яркости и контрастности корректируются для более четкого представления. (D) Используя расширенные настройки обработки изображений (обработка типа II), правильный плюсневалангеальный маркер сустава (черный маркер) инвертируется и затем может быть отслежена автоматически. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 : Фазовые задания. Цикл gait для каждой конечностью можно разделить в дискретные участки согласно экспериментальному конструкции. Для демонстрационных целей показаны три фазы цикла походки. (A) Этап stance определяется как первый кадр, в котором конечность контактирует с поверхностью беговой дорожки. (B) Качели фазы определяется как первый кадр, в котором конечности покидает беговой дорожке поверхности (C) Средняя фаза качели является первым кадром после оформления конечностей, где лапа начинает спускаться. В (D), полный цикл походки определяется с начала первоначальной позиции до назначения фазы позиции следующего цикла походки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7 : Расширенные варианты для анализа фазы шага. Эта опция позволяет углубленное представление отслеживания и фазовых назначений, а также возможность изменять фазовые назначения. (A) Поле выбора маркера для просмотра и выбора желаемого маркера. (B) Окно выбора координации: выделение координат интереса (в данном случае z-координат) будет отображаться как красный в окне основной диаграммы. (C) Окно выбора фазы: назначенные фазы для конечности могут быть просмотрены в отношении маркеров и координат, выбранных в (A) и (B). Фазы также могут быть отредактированы через это окно. (D) Окно диаграммы: координаты для определенного маркера можно сравнить одновременно во время индивидуальных фаз цикла походки. Зеленый и желтый представляют позицию и фазы качели соответственно для правой задней во время четырехколесного передвижения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8 : Образец 3D кинематической данных. (A) Различные результаты от каждого совместного маркера могут быть живописно визуализированы из набора данных 3D-координат после отслеживания видео (B) Представитель данных, генерируемых для позиции и фазы качели циклов для каждого передних конечностей и задних конечностей во время квадроцикл ходить в крысы. Цвета представляют фазы stance и качания последовательных циклов шага. Красный и зеленый соответствуют правым фазам позиции передних конечностей и задних конечностей соответственно. Синий и чирок соответствуют левым фазам позиции передних конечностей и задним конечностям соответственно. желтый цвет соответствует фазе качели каждой конечности. (C) Несколько групп данных (дискретные маркеры или результаты) можно одновременно сравнить с легкостью. Данные о скорости z-координаторалевого и правого коленного сустава произвольно отбираются для демонстрации вертикальной скорости маркера коленного сустава с поверхности беговой дорожки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9 : Представитель совместных угловой кинематики данных от здоровых и шейного спинного мозга травмированных крыс во время беговой дорожки передвижения. (A) Локоть совместный угол профиля в здоровой репрезентативной крысы демонстрирует гладкие, одиночные пики совместных следов угла с последовательными смежных циклов походки, которые отображают полный диапазон движения. Красные и желтые полосы обозначают фазы позиции и качели соответственно цикла ступеней передних конечностей. (B) В отличие от этого, следы в репрезентативном спинном мозге поврежденной крысы являются относительно более искаженными и показывают несовместимые несколько пиков с общим меньшим диапазоном совместных движений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 10 : Представитель конечностей координации данных от здорового и шейного спинного мозга ранения крысы во время беговой дорожки передвижения. (A) Значения z-координки метакарпофаланга (MCP) и metatarsophalangeal (MTP) маркеры, изображающие меры высоты шага, построены в шести различных комбинациях между конечностями примерно из 10 шагов во время четырехрупедной ходьбы. Показаны репрезентативная демонстрация всех шести возможных пар координации конечностей. (B) Здоровая крыса показывает четкую переменную ритмическую координацию (L-образный узор) для всех пар (i, ii, iii, iv). Когда конечности находятся в фазе (v, vi), координационные пары следуют D-образной схеме. (C) В шейного спинного мозга ранения крысы, обратите внимание (i) плохая координация между двумя передними конечностями, (iii) право ипсилатерального спаривания и (iv) необычная координация для одного из пар контралатеральных конечностей. Обратите внимание, что координационные участки (B,C) не имеют одной и той же шкалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 11 : Анимированные 3D палка фигура. Пример фигуры 3D-палки, полученной из отслеживаемых данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
| Параметры калибровки | Входные данные калибровки |
| Длина палочки (мм) | 100 |
| L-Frame Пол смещения (мм) | 7 (г. |
| Итерации для обнаружения выбросов | 4 |
| Разрешено палочка длина отклонения | 0,3 |
| Палочка должна быть видна, по крайней мере, в камерах | 4 |
| Исправить соотношение сторон | Проверил |
| Исправление параметра перекоса | Проверил |
| Исправление основного пункта | Проверил |
Таблица 1: Расширенные настройки для калибровки. Таблица обобщает параметры, которые мы использовали для точной калибровки шестикамерной настройки. Эти настройки были экспериментально протестированы и найдены оптимальными для нашей настройки.
Discussion
Данная статья протокола демонстрирует использование системы отслеживания движения для сбора и анализа 3D кинематической данных во время движения четырехрупедной беговой дорожки у грызунов. Важные особенности 3D-системы анализа кинематической движения включают детальную количественную оценку кинематики совместного движения (дефектная фазовая кинематика, уголки суставов, диапазон движения, скорость шага) от нескольких суставов и конечностей одновременно, обнаружение двигательные дефициты, неизмеримые невооруженным глазом, устранение субъективного смещения в сборе и анализе данных, а также легкая визуализация всей конечности и постуральной кинематики, которую можно сравнить с одновременным сопоставлением всей крысы в движении. Без необходимости дополнительных алгоритмов и моделирования, методы показывают способность программного обеспечения количественно анализировать кинематику походки с большой детализацией, эффективностью, легкостью, точностью и воспроизводимостью.
У грызунов, передних конечностей и задних локомотивных дефицитов после травмы спинного мозга (SCI) обычно оцениваются с помощью субъективных и стандартизированных локомотивных систем скоринга, таких как система оценки BBB1. Субъективные системы скоринга обычно вводят предубеждение тестера, потому что разные исследователи могут назначать разные баллы за один и тот же дефицит двигателя или один и тот же балл для различных двигательных дефицитов, что приводит к снижению воспроизводимости и чувствительности теста13 . Кроме того, неспособность обнаружить тонкие дефициты изнашивает риск неправильного выводов о воздействии вмешательства.
Для борьбы сэтими проблемами некоторые исследователи приняли на вооружение автоматизированные системы 2,3,4,5 и системы с использованием или без использования сложных алгоритмов14,15. Эти тесты выполняют шаг цикла анализа, которые показывают вес подшипника профилей и шаг последовательности моделей, полученных от лапы размещения движений крыс ходить по взлетно-посадочной полосы. Тем не менее, основным недостатком вентральной плоскости видео походка анализа является то, что тело субъекта само по себе не видно непосредственно2,3. Эти данные ограничиваются информацией, полученной от впечатлений движений ног и лап, подвергая сомнению выбор и интерпретацию параметров походки при оценке дефицита (см. Chen et al.16). Детали движения, которые показывают динамическую сегментную кинематику движения конечностей и позиционирования, точно не доступны для анализа передвижения3,5. Критические отклонения данных о наклоне суставов (т.е. диапазон движений, скорость движений и т.д.), отношения суставов по отношению друг к другу в пределах конечностей и между конечностями, а также основные механики тела, которые изменяют узоры походки, невозможно получить. Таким образом, являются ли какие-либо наблюдаемые нарушения походки повлекшими по своему делу изменениями в одноитовых и/или нескольких сегментальных совместных движениях (т.е. проксимально-дистальной внутриконечной координации, постуральных отношениях ствола в отношении положения и цикла походки конечностей и т.д.) остаются в масках.
Немногие имеющиеся в настоящее время системы захватывают кинематику походки и оценивают дисфункцию двигателя качественно и количественно, но используются менее широко. Полное тело высокой скорости видео-отслеживания походка системы анализа фильмов спонтанной походки циклов с трех сторон (один вентральный и два боковых плоскостей) и отслеживать костлявые ориентиры для выхода ряда результатов походки17,18. Sagittal плоскости кинематического анализа походки используется некоторыми исследователями для получения 2D данных движения заинтересованных hindlimb19,20. Тем не менее, третье измерение движения, которое происходит ортогонал к плоскости просмотра (боковой или сагиттальный) не обнаруживается в анализах11,18,19.
Другие более сложные, 3D, три тела сегмента тела тела постуральных систем сбора данных использовать 3D математическое моделирование сбора данных, а также система анализа для отслеживания и количественной оценки 3D движения тела сегментов грызунов в то время как в том числе головы модели движения8. Madete et al.9 разработали маркер на основе оптоэлектронной системы захвата движения для количественной оценки 3D тела постурачной кинематики во время надземного передвижения на пешеходных лучах с помощью семи камер системы. Основные исходы, изученные в двух последних работах, в первую очередь сосредоточены на общей позе грызунов, а не на анализе походки. 3D системы захвата движения обеспечивают высокую пропускную связь 3D кинематической gait данных с помощью нескольких камер и сложных программных систем, как рассмотрено Bhimani и др.21. Старые версии представленной 3D системы анализа движения также были использованы в предыдущей работе у крыс с и без нейротравмы12,22,23.
Несмотря на наличие 3D-систем сбора и анализа для исследований, доклиническое использование этого метода у грызунов остается относительно ограниченным. Одной из причин этой проблемы является то, что протоколы сбора и анализа данных в значительной степени зависят от использования кинематических моделей и сложных алгоритмов, которые соответствуют кинематической модели задней конечности крысы во время ходьбы для создания штрафа, с высоким разрешением гайткины8,9,11,22. Подробная методология, представленная здесь, содержит подробную информацию о процедуре, связанной на протяжении всего экспериментального процесса, включая обработку животных, обучение, экспериментальную настройку, сбор данных и шаги по анализу.
Также представлены подробные сведения об калибровке системы, которая является основной частью протокола, которая обеспечит воспроизводимость между смежными испытаниями внутри и между субъектами. Описанные пошаговые методы внедряют объективность в процедуру сбора данных и делают ее высоковоспроизводимой. Генерируемые данные из этого программного обеспечения захвата движения могут быть визуализированы кадр за кадром для качества движения и автоматически отслеживаются. Далее описано, как этот сбор данных или количественной оценки не требует каких-либо дополнительных алгоритмов или моделирования. Студенты, сотрудники и исследователи могут использовать простое статистическое программное обеспечение для создания основных кинематической продукции без опоры на конкретные технические знания.
Эта система также может быть использована для наземного передвижения, достижения и захвата, а также других экспериментальных наснасил в соответствии с экспериментальной целью. Количество и тип маркеров также могут быть скорректированы для хвоста, спины, туловища или ушей, по мере необходимости. Большим преимуществом представленного программного обеспечения по сравнению с системами является его способность собирать видеоданные с высоким разрешением субъекта. Таким образом, сложные наборы вычислений (т.е. угловые движения, линии палки, соединяющие несколько суставов и т.д.) могут быть наложены на записанное видео. Размещение маркеров и генерируемые 3D-данные могут быть проверены с фактическими движениями крысы в движении. В отличие от другой 3D-системы захвата движения, фиксируются только маркеры, и любой повторанализа необходимо сделать на диаграммах палки (скелетной структуры) вместо видео фактического объекта съемки. Следовательно, отсутствует проверка размещения маркеров на фактическом движении объекта.
Основываясь на опыте работы с этой системой, калибровка играет решающую роль в успехе сбора данных. Калибровка системы очень чувствительна к изменениям. и небольшое движение одной камеры может скомпрометировать весь процесс сбора и анализа данных 3D-координат. Только две камеры с каждой стороны плоскости просмотра необходимы для сбора данных, но третья камера настоятельно рекомендуется обеспечить большую точность путем перекрестного ссылки на расположение каждого маркера с другими камерами. По мере увеличения числа камер слежения повысится также точность 3D-координат для конкретного маркера. Во время случаев, в которых маркеры становятся скрытыми из-за дефицита походки (например, палец керлинг или перетащить в случае походки после нейротравмы), эти условия могут потребовать обширного ручного отслеживания. Тем не менее, объем данных, в конечном итоге генерируемых от отслеживания является достойным времени, вложенного в ручное отслеживание маркеров, что делает его бесценным инструментом в обнаружении тонких дефицитов двигателя.
По нашему опыту, любая утомительность, связанная с использованием системы, лежит вне использования самого оборудования и технологий. Как и в других протоколах для оценки поведения двигателя, метод, с помощью которого крысы обрабатываются и обучаются для задачи значительно влияет на результаты. Например, изоляция крыс из их когорты имеет решающее значение во время тестирования; в противном случае, крысы, которые не проверены, но все еще присутствуют во время тестирования показывают возможное ухудшение производительности задачи. Оптимальная комнатная температура, освещение и уровень шума являются другими детерминантами. Fouad et al. опубликовали другие проблемы, которые сопровождают функциональное тестирование двигателя у крыс24. Действительно, ослепленные пользователи из этой лаборатории, которые правильно следовали методологии, не испытывали каких-либо серьезных препятствий при сборе данных, отслеживании движения и анализе данных.
В этой работе описана 3D-система захвата движения для эффективного сбора и анализа данных о локомотиве, чтобы исследователи могли быстро собирать огромное количество данных о лобомоторном потоке от нескольких крыс. В настоящее время мы работаем над созданием автоматизированного шаблона анализа данных, который может быть встроен в программное обеспечение и стать способным генерировать отчет о заранее определенных результатов в течение нескольких секунд для беговой дорожки передвижения у грызунов, подобно тому, что делается в человеке исследования с использованием систем захвата и анализа движения6,25. Разработка этого шаблона позволит доклиническим исследователям получить подробные данные о локомотиве грызунов при удобстве нескольких кликов кнопки мыши. Есть надежда, что методы, предусмотренные в этой работе, окажутся полезными для доклинических исследователей для более объективной оценки поведения грызунов. В настоящее время мы утончив использование этой системы для сбора высокопроизводительных 3D кинематические данные во время общего, квалифицированного поведения передних конечностей, таких как достижение и захват. Важно отметить, что полезность этого метода может быть расширена до крыс с различными нейротравматическими и ненейротравматическими травмами.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы выражаем особую благодарность Павану Шарме за помощь в экспериментальной настройке видео и интеллектуальном вкладе в этот проект. Мы также благодарим Кристофера Паласио за его вклад в демонстрацию видеопротокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 camera Basler (Scout scA640-120gu) motion capture system. | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | Recording device for motion analytics. |
| Calibration Frame and Wand | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | L-shaped calibration defining the global coordinate sysetem, and the trident shape wand (100 mm) |
| Markers | Shah Lab | N/A | Recording device for motion analytics. Markers are Custom made in our lab from 0.5cm googly-eyes covered with reflective tape. |
| Matlab | Mathworks, Inc, Natic, Ca | N/A | Data analysis software |
| Rodent Cage | Custom Made within Stony Brook. | N/A | Clear plexiglass cage used to keep the rodent on the treadmill. |
| Simi Reality Motion Systems | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | 3D tracking Software. |
| Treadmill | Mk Automation Inc., Bloomfield, CT 06002 | N/A | Treadmill used for rodent locomotion. |
References
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Beare, J. E., et al. Gait analysis in normal and spinal contused mice using the TreadScan system. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2045-2056 (2009).
- Nakamura, A., et al. Low-cost three-dimensional gait analysis system for mice with an infrared depth sensor. Neuroscience Research. 100, 55-62 (2015).
- Pfister, A., West, A. M., Bronner, S., Noah, J. A. Comparative abilities of Microsoft Kinect and Vicon 3D motion capture for gait analysis. Journal of Medical Engineering & Technology. 38 (5), 274-280 (2014).
- Alt Murphy, M., Murphy, S., Persson, H. C., Bergstrom, U. B., Sunnerhagen, K. S. Kinematic Analysis Using 3D Motion Capture of Drinking Task in People With and Without Upper-extremity Impairments. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Karakostas, T., Hsiang, S., Boger, H., Middaugh, L., Granholm, A. C. Three-dimensional rodent motion analysis and neurodegenerative disorders. Journal of Neuroscience Methods. 231, 31-37 (2014).
- Madete, J. K., et al. Challenges facing quantification of rat locomotion along beams of varying widths. Journal of Engineering in Medicine. 224 (11), 1257-1265 (2010).
- Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
- Valdez, S. I., et al. Modeling hind-limb kinematics using a bio-inspired algorithm with a local search. Biomedical Engineering Online. 17, (2018).
- Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain: A Journal of Neurology. 136 (Pt 11), 3362-3377 (2013).
- Barros Filho, T. E., Molina, A. E. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo). 63 (1), 103-108 (2008).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of osteoarthritis). Currend Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Kloefkorn, H. E., et al. Automated Gait Analysis Through Hues and Areas (AGATHA): A Method to Characterize the Spatiotemporal Pattern of Rat Gait. Annals of Biomedical Engineering. 45 (3), 711-725 (2017).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a reliable gait evaluation method for rodent studies. Journal of Neuroscience Methods. 283, 92-100 (2017).
- Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nature Methods. 7 (9), 701-708 (2010).
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
- Fiander, M. D., Chedrawe, M. A., Lamport, A. C., Akay, T., Robertson, G. S. Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
- Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behavioural Brain Research. 317, 95-108 (2017).
- Bhimani, A. D., et al. Functional gait analysis in a spinal contusion rat model. Neuroscience Biobehavioral Reviews. 83, 540-546 (2017).
- Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nature Neuroscience. 12 (10), 1333-1167 (2009).
- Shah, P. K., et al. Unique Spatiotemporal Neuromodulation of the Lumbosacral Circuitry Shapes Locomotor Success after Spinal Cord Injury. Journal of Neurotrauma. 33 (18), 1709-1723 (2016).
- Fouad, K., Hurd, C., Magnuson, D. S. Functional testing in animal models of spinal cord injury: not as straight forward as one would think. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 85 (2013).
- Miller, E., et al. Mechanical testing for three-dimensional motion analysis reliability. Gait & Posture. 50, 116-119 (2016).
