Summary
Här presenteras ett protokoll för att samla in och analysera tredimensionell kinematik av fyrbent förflyttning i gnagare för prekliniska studier.
Abstract
Nyttan av tredimensionell (3D) kinematiska rörelseanalys system är begränsad i gnagare. En del av orsaken till denna otillräcklighet är användningen av komplexa algoritmer och matematisk modellering som åtföljer 3D-datainsamling och analysförfaranden. Detta arbete ger en enkel, användarvänlig, steg-för-steg detaljerad metod för 3D-kinematisk gånganalys under löpbandet förflyttning i friska och neurotraumatiska råttor med hjälp av en sex-kamera motion capture-system. Finns också Detaljer om 1) kalibrering av systemet i en experimentell uppsättning anpassad för fyrbent förflyttning, 2) datainsamling för löpband förflyttning hos vuxna råttor med hjälp av markörer placerade på alla fyra armar och ben, 3) alternativ för video spårning och bearbetning, och 4) grundläggande 3D kinematisk data generering och visualisering och kvantifiering av data med hjälp av den inbyggda datainsamlingsprogrammet. Slutligen, det föreslås att nyttan av denna motion capture system utvidgas till att studera en mängd olika motoriska beteenden före och efter Neurotrauma.
Introduction
I gnagare, forelimb och bakbenet rörelseunderskott efter neurologiska sjukdomar är vanligen bedömas med hjälp av subjektiva poängsystem1. Automatiserade system2,3,4,5 har antagits för gånganalys men lider av nackdelar, eftersom de primära resultaten bygger på fotavtryck analys och misslyckas med att fånga avgörande segmentella och gemensamma kinematiska variabler som annars kan avslöja sann kinematik i extremitets rörelser2. Eftersom de flesta gång parametrar är korrelerade, en samling av gång parametrar behövs för att förstå ersättningar som antagits av råttor för att helt bedöma motoriska underskott.
Under det senaste decenniet har flera 3D-rörelseanalys system6 utvecklats för biomedicinsk forskning på människor. Dessa system har varit framgångsrika och visat sig vara effektiva i att fånga underskott i förflyttning hos friska vuxna människor samt förändrad kinematik att gå6,7. I gnagare, för närvarande tillgängliga 3D kinematiska rörelsesystem anta komplexa algoritmer och modellering för rörelse beteende och utnyttja sofistikerade dataanalys tekniker8,9,10,11 , som så småningom begränsar deras mångsidighet. Dessutom är de metoder som används för att samla in data med de flesta 3D-motion capture system inte tillräckligt förklaras i litteraturen. Detaljerna om datainsamling och analysförfaranden, begränsningar och tekniker som är involverade i att effektivt använda systemet saknas.
Följaktligen är en av de vanligaste begreppen bland forskarna att 3D-motion tracking kinematiska bedömningar är ganska framgångsrika och tidskrävande förfaranden som behöver teknisk expertis och utarbeta dataanalys. Avsikten med detta arbete är att bryta ner datainsamlings-och analys protokollen och beskriva metoden genom en stegvis process så att den är objektiv, lätt att lära, och kan systematiskt kontaktas. Idag finns det en framväxande betoning på att bedöma funktionella motoriska beteende på ett mer omfattande och systematiskt sätt efter neurologiska skador och interventioner i prekliniska studier.
I riket av fyrbent förflyttning, som presenteras här är användningen av en 3D motion tracking system som kan ge ytterligare information såsom kroppshållning, tass rotation med avseende på kropps axlar, Inter-relationer av lederna, och mer exakt information När det gäller samordning, samtidigt visualisera hela djuret från alla plan. Detta kan i sin tur avslöja kritiska skillnader i motoriskt beteende inom och mellan friska och skadade råttor genom flera utfall. Med en mer förfinad kinematisk analys som är korrekt och objektiv minimeras risken för felaktigt inferringseffekter av en intervention. De genererade data från denna motion capture programvara visualiseras ram för bild för kvaliteten på rörligheten och kan spåras automatiskt, och datainsamling eller kvantifiering kräver inte några ytterligare algoritmer eller modellering. Syftet med detta arbete är att ge metodologiska detaljer och överväganden involverade i datainsamling och analys av 3D-gång kinematik under löpbandet förflyttning i friska och ryggmärgs skadade råttor. Detta protokoll är avsett att användas av prekliniska forskare som använder neurologiska råtta modeller i experiment.
Protocol
Denna studie utfördes i enlighet med rekommendationerna från National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur. Protokollet godkändes av Stony Brook universitets kansler djur forskningskommittén.
1. uppsättning av motion capture-systemet
- Set-up
- Montera sex kameror på väggen (eller stativ) med hjälp av fint justerbara växel huvuden. Placera tre kameror ovan på vardera sidan av löpbandet, med varje kamera vinklad 20 °-45 ° under horisonten, cirka 2,0 m från löpbandet och cirka 0,5 m från intilliggande kameror för maximal täckning av markörer (figur 1).
- Utrusta varje kamera med en ring ljus för visualisering av retroreflekterande markörer.
- Starta motion capture-systemet.
- Under projekt | Specifikation, definiera önskade markörer för experimentet.
Anmärkning: i demonstrationssyfte används totalt 22 markörer för både frambenen och bakbenen (11 markörer på vardera sidan) för att bedöma bilateral fyrbent förflyttning. Alternativt kan alternativet Importera markör uppsättning med specifikt markör-ID för förinställda beräkningar i programvaran.
- Under projekt | Specifikation, definiera önskade markörer för experimentet.
2. kalibrering av motion capture-systemet
- Fånga kalibrerings videon
- Placera den L-formade kalibrerings ramen (nedan kallad "L-Frame") ortogonalt på löpbandet, med den långa benet av L-ramen pekar i råttans gångriktning (figur 2).
- Öppna programvaran för motion capture och välj spela in för att avbilda kalibrerings videon.
- Flytta Trident formade kalibrerings ramen (hädanefter kallad "trollspö") i hela löpbandet området i rymden så att den täcker alla områden som råttan kommer att gå i.
L-ramen innehåller fyra markörer som upprättar det globala koordinatsystemet och Trollstaven innehåller tre markörer som kommer att kalibrera råttans 3D-gångyta. - Spela in minst 1 min av film för att säkerställa adekvat trollstav datapunkter finns för korrekt kalibrering vid 120 frames/s.
- Spara videorna som 3D-kalibreringsfiler.
- L-Frame spårning
- Högerklicka på kameragruppen och välj 3D-spårning. Under rullgardinsmenyn väljer du 3D-kalibreringsvideoroch sedan alla kalibrerings kameror.
- Med hjälp av fast punkt funktion, spåra L-Frame ursprung, L-Frame kort, L-Frame mitten och L-Frame länge på var och en av de sex kalibrering videor. Definiera alla punkter och välj knappen Sök automatiskt .
Obs: L-Frame position måste förbli konsekvent i förhållande till löpbandet under hela experimentet för att förhindra att koordinatsystemet skiftar.
- Spårning av trollspö
- Högerklicka på kameragruppen och välj automatisk spårning av 3D-trollspö.
- Välj alla kameror i kamera valet. Längst ned till höger i fönstret väljer du alternativ, de-Välj identifiera L-ramoch välj Starta spårning.
- Efter automatisk spårning väljer du tilldela Wand Short, Wand Mid och Wand Long Markers för alla sex kamerorna.
- Välj Exportera till rådatai fönstret 3D-spårning och välj sedan alternativet Skriv över befintliga troll stavs data för att spara spårningen.
- Välj Ja i fönstret som visas efter det sista steget för att spara de mest exakta data.
ANMÄRKNINGAR: denna nya spårning kommer att sparas som spårning under automatisk spårning fliken i det vänstra sidofältet. Sparad spårning kan kommas åt och redigeras senare.
- Beräkna kalibrering
- Högerklicka på kamera kalibrerings grupper och välj kalibrerings grupp för ny trollstav.
- Välj alla kameror och håll ned CTRL (kontroll)-tangenten medan du väljer OK.
- Ändra trollstavens längd till 100,00 mm, L-Frame golv offset till 7,00 mm, iterationer för outlier-detektering till 4, och tillåten Wand längd-avvikelse till 0,300.
- Ändra kameran som staven måste vara synlig i alternativ till 4, och slå på följande: Fix bildförhållande, Fix skeva parameter och Fix Principal Point (tabell 1).
Obs: dessa inställningar var experimentellt fast beslutna att vara optimala för denna inställning. - Acceptera kalibreringar med standardavvikelse av stavens längd mindre än 3 mm och restvärdet mindre än 0,004.
Anmärkning: om kamerorna eller tillhörande utrustning flyttas bortom denna punkt, en kommer att krävas för att kalibrera om systemet.
3. utbildning och förbereda djuret för löpband Locomotion
- Utbildning råttor för löpband Locomotion
- Acklimatisera råttor till löpbandet för 5 min före en träningssession12.
- Utbilda råttor att gå med full viktbärande på sina armar och ben vid 13 cm/s för 15 min/session på morgnarna för 1 vecka. Träna alla råttor tills de kan konsekvent gå (minst 10 kontinuerliga steg) på löpbandet12.
- Kompletta träningspass runt samma tid på dagen för varje råtta.
- Före datainsamlingen, söva råttan genom att placera råtta i en inkubations kammare.
- Leverera isofluran gas (1,0%-2,5%) och 0,4 L syre i ca 5 min. nypa foten av råtta för att kontrollera djupet av anestesi.
- Fortsätt när råttan inte svarar på Paw nypa (negativ tass abstinens reflex).
- Raka råttan i regioner där markörer kommer att placeras för att undvika att pälsen stör markör spårning (figur 1).
- Palpate huden för beniga landmärke att placera markörer. Använd penna markörer för lederna distalt till armbågen och knäet (figur 3).
Anmärkning: de retroreflekterande markörer är plast halvklot 0,5 cm i diameter täckt med retroreflex tejp. - Placera markörerna efter behov på beniga landmärken före datainsamlingen (figur 3).
Anmärkning: i friska, icke-neurotraumatiska råttor, de retroreflekterande markörer placerade över distala lederna avlägsnas ofta av råttor. I demonstrationssyfte är retroreflekterande markörer placerade över den proximala beniga landmärken (iliaca Crest, höft, knäled för bakbenen, axel och armbåge lederna för forelimb), och penna markörer används för de mer distala landmärken. I våra händer, detta har gett reproducerbara resultat mellan och inom råttor (opublicerade data).
- Palpate huden för beniga landmärke att placera markörer. Använd penna markörer för lederna distalt till armbågen och knäet (figur 3).
4. motion capture
- Välj den röda kameraknappen i det övre fältet i motion capture-programvaran för att spela in en utvärderingsversion. Ange spara plats på datorn och välj börja inspelningen för att spela in på 120 frames/s.
- Ange en användardefinierad löp bands hastighet och låta råttan att gå för cirka 30 s, eller minst 10 kontinuerliga steg.
- Stoppa inspelningen och kontrollera att filmen innehåller minst ~ 10 kontinuerliga steg innan du fortsätter.
- Skapa en ny kameragrupp för varje utvärderingsversion när du har sparat den inspelade videon.
5. motion tracking
- Välj " +"-tecknet intill den sparade kameragruppen. Detta kommer att visa en lista över alla sex kameror.
- Tilldela 3D-kalibrering till kamera filen
- Gå till kamerans kalibrerings grupp och högerklicka på Beräknad kalibrering. Välj tilldela 3D-kameraparametrar. Tilldela kalibrerings filen till lämpliga kamerafiler i den sparade kameragruppen. Håll muspekaren över kamera filen för att kontrollera kalibreringen (läser som 3D-kalibrering giltig).
- Individuell kamera 2D-spårning
- Högerklicka på kameragruppen för rörelsespårning. Välj 2D-spårning.
- Välj sju till tio bästa kontinuerliga och konsekventa steg för spårning. Registrera bildrutenumret vid den första kontakten av referens extremiteten på löpbandet för varje steg.
Anmärkning: i demonstrationssyfte valdes vänster bakben som referens lem.
- Olika spårningsalternativ finns tillgängliga.
- Högerklicka på markören av intresse och välj automatisk spårning, som kommer att upptäcka ljusa cirkulära fläckar som skapats av retroreflekterande markörer (figur 4).
- Alternativt, spåra markörer med hjälp av mönstermatchning, som kommer att använda en algoritm inbyggd i programvaran för att spåra markörer baserat på storlek och färg (figur 4).
- Spåra och korrigera ej detekterbara markörer eller fel i spårningen manuellt.
- Använd svarta markörer då distala leder retroreflekterande markörer inte är möjliga.
- Spåra svarta markörer med hjälp av avancerad bildbehandling genom att invertera svarta markörer till ljusa fläckar för automatisk spårning.
Notera: bildbehandlings alternativet kan användas för att spåra markörer som är svåra att upptäcka eller se. - Högerklicka på Rat-videon i 2D-spårningsfönstret. Välj bildbehandling.
- Välj Avancerad vy och Lägg till en kombination av de fyra filtren (ljusstyrka, kontrast, gamma) för att göra den svarta markören så mörk som möjligt i förhållande till omgivningen. Slutligen, Lägg till Invertera, och den svarta markören blir en ljus markör som kan spåras automatiskt (figur 5).
- Spåra svarta markörer med hjälp av avancerad bildbehandling genom att invertera svarta markörer till ljusa fläckar för automatisk spårning.
- Korrigering av markör placering
- Spåra och korrigera ej detekterbara markörer eller fel i spårningen manuellt.
- Om du vill spåra videon manuellt väljer du önskad markör i det högra sidofältet. Högerklicka och välj Manuell spårning. Börja spåra den markerade markören på råttvideon som visas bildruta för bildruta.
- Om du vill åtgärda eventuella fel går du till den bildruta där spårnings felet inträffade. Högerklicka på fliken specifik markör i det högra sidofältet och klicka på ta bort punkt. Retrack punkten manuellt vid exakt position.
- Med ovanstående metod, komplett 2D-spårning för alla kameror som används för alla önskade markörer i ramen intervall av kontinuerliga steg.
- Klicka på Spara under hela spårningsprocessen.
6. kinematisk analys
- Fas tilldelningar
- Högerklicka på faser och välj Redigera fas modell.
- Anpassa gång cykeln faser för varje lem enligt de underskott man väljer att studera (t. ex., tillägg av dra faser, tå curl faser, etc.) inom den traditionella hållning och swing faser av ett steg cykel. Definiera faserna för experimentet (figur 6).
Anmärkning: i demonstrationssyfte, tre faser visas här, och den vänstra bakbenen används som referens lem för de sju till tio gång cykler. - Högerklicka på kameran i kameragruppen och välj Visa video.
- Tilldela faser i gång cykeln för varje lem i programvaran med hjälp av knappen Lägg till fas eller F11 kortkommando.
- Välj lämplig lem under analys och utse den första bildrutan för spårning som början av inriktningen fas.
- Framsteg videon till ramen där Stance fas slutar och swing fas startar. Ange den här ramen som start för sväng fasen.
- Framsteg videon till den första bildrutan där foten börjar sjunka. Utse denna ram som början av mitten Swing fas.
Observera: häri definieras inriktningen för en steg cykel för varje lem som den första bildruta där extremiteten kontaktar löp bands ytan. Swing fasen definieras som den första ramen där extremiteten lämnar löpbandet ytan. Mid Swing fas är ramen där extremiteten uppnått maximal clearance och börjar sjunka. En komplett gång cykel definieras från början av initial hållning till inriktningen fas tilldelning av nästa gång cykeln. - Upprepa dessa steg tills faserna för extremitets faser har slutförts för varje steg. Upprepa för de andra tre extremiteterna.
- 3D-koordinerade beräkningar
- Utför 3D-beräkningar efter att ha spårat alla sex kamerorna.
- Högerklicka på kameragruppen och välj ny 3D-beräkning, klicka på alla för kamera val och välj sedan OK.
Obs: en ny mapp visas. Den här mappen innehåller alla 3D-koordinatdata för alla markörer som spåras. Om du vill visa och/eller redigera faser högerklickar du på 3D-koordinater i det vänstra sidofältet och väljer Redigera faser (bild 7). - Generera data av intresse, till exempel gemensamma höjd-eller hastighetsdiagram med datapunkter genom att dra ut markör av intresse för att Visa sida vid sida med de tilldelade gång faserna. (t. ex. gemensam kinematik i figur 8).
- 3D-diagram
- Klicka på 3D-diagram om du vill generera en 3D-siffra för utvärderingsversionen.
- Exportera rådata genom att högerklicka på 3D-koordinater/export.
- Högerklicka på 3D- koordinatfilen och välj Exportera.
- Öppna filen i ett kalkylbladsprogram och importera data till MATLAB.
- Skapa ett program för att skapa tomter av lem steg höjd samordning.
Obs: 3D samordna data kan exporteras till analys mjukvaror eller anpassade definierade makro skript för att generera mer data, utöver vad programvarufunktioner erbjuder.
Representative Results
Detta protokoll visar en metod för kvantitativ 3D kinematisk datainsamling och analys för löpband förflyttning på gnagare med hjälp av en enkel, inbyggd programvara. Resultaten visar att protokollet är genomförbart att samla in och analysera fyrbent förflyttning kinematik i friska och ryggmärgs skadade råttor. Forskare med rått hantering erfarenhet måste placera markörer på råttor, sedan kalibrera och använda motion capture-systemet utan några kritiska problem. Data genereras enkelt utan användning av komplexa algoritmer.
Här, protokollet genomfördes i friska och ryggmärgen skadade (C5 höger hemisection) råttor. För detta manuskript visas endast representativa resultat. Sammantaget var olika kinematik av leden och lem segment rörelse lätt erhållas från 3D-koordinater för varje markör. Kritiska skillnader mellan onormal gång och friska gång cykler upptäcktes lätt med flera utfall, inklusive (men inte begränsat till) steg höjd åtgärder, gemensam hastighet, LED vinkel (figur 9), steg cykel fas varaktigheter för alla fyra armar och ben, och extremiteter (figur 10). Analys av kvalitativa data i form av tomter och stick diagram kan vägleda fastställandet av de kvantitativa verktyg som används för att genomföra det slutliga resultatet av denna analysmetod (figur 11).
I en representativ frisk råtta visade vinkelprofilen släta, enkla toppar med konsekventa intilliggande gång cykler som visade ett komplett rörelseomfång (figur 9). Alternerande hållning fas och swing fas varaktigheter spår föreslog konsekvent intralimb samordning. I kontrast, armbågen vinkelprofil av en representativ ryggmärgen skadade råtta visat flera förvrängda toppar, som var mindre konsekvent och av mindre rörelseomfång. Förutom förändringar i den förlängda hållning fas och förkortad Swing fas varaktigheter, det fanns en brist i intralimb samordning för RFL.
I de presenterade representativa uppgifterna för samordning konstaterades det att samordnings områden (figur 10) som genererats från representativa friska råttor uppvisade väldefinierad, omväxlande rytmisk koordination i ipsilaterala extremiteter undergång cykler (L-formade mönster) och i-fas D-formade mönster med kontralaterala armar och ben. I jämförelse, en representativ ryggmärg-skadade (C5 höger hemisection) råtta visade dålig icke-alternerande och icke-rytmisk samordning i ipsilaterala extremiteter och en ovanlig omväxlande rytmisk koordination (L-formade mönster) i en av de kontralaterala extremiteterna (figur 10). Med tanke på det observerbara underskottet i den högra forelimb i inspelad rörlig video, tyder detta på att RFL och LHL inte kunde bära full vikt utan stöd av antingen LFL eller RHL vid en given tidpunkt. Denna trend tyder på en kompenserande mekanism för att klara av den tvingade gånghastigheten på ett löpband.
Kvantifierbara data var lätt genererade från användning av 3D-systemet, men detta innebar tillgång till separata flikar och välja från en mängd olika alternativ som finns i programvaran. Det finns pågående arbete med att utveckla en automatiserad mall som kommer att generera kvantitativa och kvalitativa data i en enda rapport för de mest uppenbara resultat av intresse (utan att individuellt generera olika resultat), som rutinmässigt görs med kinematik används för kliniska studier. Därför kan flera slutpunkter kompileras och exporteras i ett rapportformat som enkelt kan visualiseras direkt efter en utvärderingsversion.
Figur 1 : Experimentell uppsättning. (A) schematiskt av en kinematisk datainsamlings uppsättning med sex kameror för en löp bands gång uppgift. En uppsättning av tre kameror är placerad på båda sidor av löpbandet för att fånga (bildruta för bildruta) vänster och höger markör rörelser under förflyttning. (B) diagram som skildrar markör placering över beniga landmärken på gnagare ' s frambenen och bakbenen för att fånga fyrbent förflyttning kinematik. Sammanlagt 11 markörer placeras på vardera sidan av råttan. De skuggade regionerna visar området där råttan rakas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Markörer för kalibrering. A) markör uppsättnings tilldelningar för kalibrerings systemet för Trollstaven med två kalibrerings ramar: l-ram och trollstavB) koordinatsystemet definieras av l-ramen, där l-ramens ursprung (skärningspunkten mellan två ben i ramen) definieras som (0,0). De två lemmar av L-ramen, L-Frame kort, och L-Frame lång definiera x-och y-axlarna, respektive, och z-axeln definieras som vinkelrät mot XY planet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Markörtyper. Afotografi av råttans nedre bål som visar de två typer av markörer som används. B Fotografi visar en reflex markör placerad på höftbenskammen med dubbelhäftande tejp som är utformad för att hålla sig till huden (inringad röd). C Fotografi visar placeringen av en penna markör över höger metatarsophalangeala leden (inringad röd). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Rörelsespårning. (A) bild visar rörelse spårnings gränssnittet där flera markörer kan spåras samtidigt med hjälp av funktionerna "spåra automatiskt" och "spåra med hjälp av mönstermatchning". (B) förstorade bild av en reflex markör upptäcks som en ljus vit cirkulär punkt i "Track automatiskt" funktion under markör tilldelning. Programvaran känner igen denna plats som en klarblå cirkulär plats. Den röda pricken är så småningom erkänd som centrum för den föreskrivna markören. En centrerad röd fläck inom cirkel markören minskar risken för experimentella fel vid dataspårning. Avvikelse från centrum tyder på att efterföljande mätningar och analyser sannolikt är felaktiga. C Förstorad bild av en reflex markör som valts för mönstermatchning. Baserat på den valda markörens storlek, form och färg, identifierar programvaran automatiskt markörer som matchar beskrivningen i de efterföljande video ramarna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Grundläggande och avancerade spårningsalternativ. (A) videor kan bearbetas i programvaran genom att högerklicka på videon under analysen så att oklara eller suddiga markörer tydligt visualiseras för att möjliggöra automatisk spårning. I demonstrationssyfte visas två typer av bildbehandlings inställningar som justeras för att rymma olika omgivningsljus förhållanden under datainsamlingen för enkel spårning. (B) en representativ videobildruta före bild bearbetningen. (C) för grundläggande bildbehandling (bearbetning typ I), ljusstyrka och kontrastinställningar justeras för en tydligare vy. (D) med hjälp av avancerade bildbehandlings inställningar (behandling typ II), är den högra metatarsofalangeala gemensamma markör (svart markör) inverterad och kan sedan spåras automatiskt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Fas tilldelningar. Gång cykeln för varje lem kan delas in i diskreta faser enligt experimentell design. I demonstrationssyfte visas tre gång cykel faser. (A) inställning fas definieras som den första ramen där extremiteten kontakter löpbandet ytan. B) svängradie definieras som den första ramen där extremiteterna lämnar löpbandet (C) Mid Swing fasen är den första ramen efter lem clearance där tass börjar sjunka. I (D), en komplett gång cykel definieras från början av den ursprungliga hållning till inriktningen fas tilldelning av nästa gång cykeln. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Avancerade alternativ för steg fas analys. Det här alternativet ger en djupgående bild av spårning och fas tilldelningar, samt möjligheten att ändra fas tilldelningar. (A) markeringsruta för markering för att visa och välja önskad markör. (B) samordna urvalsfönstret: Markera koordinaten (i det här fallet z-koordinater) kommer att dyka upp som röd i huvuddiagram fönstret. (C) fas vals fönster: tilldelade faser för en lem kan visas med avseende på markörer och koordinater som valts i (a) och (B). Faser kan också redigeras genom detta fönster. (D) diagram fönster: koordinater för en specifik markör kan jämföras samtidigt under enskilda gång cykel faser. Den gröna och gula representerar hållning och swing faser respektive för den högra bakbenen under fyrbent förflyttning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Exempel på 3D-kinematiska data. (A) olika utfall från varje gemensam markör kan visualiseras från 3D-koordinat datauppsättningen efter video spårningB) representativa data som genererats för hållning och sväng fascykler för varje forelimb och bakben under fyrbent vandring i en råtta. Färger representerar hållning och swing faser i följd steg cykler. Röd och grön motsvarar den högra forelimb och bakbenet hållning faser respektive. Blå och Teal motsvarar den vänstra forelimb och bakbenet hållning faser respektive. Gult motsvarar svängning fasen av varje lem. (C) flera datagrupper (diskreta markörer eller resultat) kan samtidigt jämföras med lätthet. Z-koordinat hastighetsdata för vänster och höger knäled markörer väljs godtyckligt för att demonstrera den vertikala hastigheten av knäled markören från löpbandet ytan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9 : Representativa gemensamma vinkelformiga kinematik data från friska och livmoderhalscancer ryggmärgen-skadade råttor under löpbandet Locomotion. (A) armbågsled vinkelprofil i en hälsosam representativ råtta visar släta, enkla toppar av LED vinkel spår med konsekventa intilliggande gång cykler som visar komplett rörelseomfång. Röda och gula staplar betecknar hållning och swing faser respektive forelimb steg cykel. B) i motsats till detta är spåren i en representativ ryggmärgs skadad råtta relativt mer förvrängda och uppvisar inkonsekvent multipla toppar med ett totalt mindre antal gemensamma rörelser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10 : Representativa lem samordningsdata från en hälsosam och livmoderhalscancer ryggmärgen skadade råtta under löpbandet förflyttning. (A) z-Koordinatvärdena för de metakarpofalangeala (MCP) och metatarsophalangeala (MTP) markörer som skildrar steg Höjds mått ritas i sex olika kombinationer mellan extremiteter från cirka 10 steg under fyrbent gång. Visas representativa demonstration av alla sex möjliga lem samordning par. (B) en frisk råtta visar tydlig alternerande rytmisk koordination (L-formad mönster) för alla par (i, II, III, IV). När extremiteterna är i fas (v, vi), koordinations paren följer en D-formad mönster. (C) i en livmoderhalscancer ryggmärgen skadade råtta, notera (i) den dåliga samordningen mellan de två frambenen, (III) höger ipsilaterala ihopkoppling och (IV) ovanlig samordning för en av de kontralaterala extremiteterna par. Observera att samordnings områdena (B, C) inte delar samma skala. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11 : Animerad 3D Stick Figur. Exempel på en 3D-streckfigur som genererats från spårade data. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
| Kalibrerings parameter | Kalibrerings ingångar |
| Stavs längd [mm] | 100 |
| L-Frame golv offset [mm] | 7 |
| Iterationer för outlier-identifiering | 4 |
| Tillåten Wand-length-avvikelse | 0,3 |
| Staven måste vara synlig i minst _ | 4 |
| Korrigera bildförhållande | Kontrolleras |
| Fix skeva parameter | Kontrolleras |
| Korrigera huvudpunkt | Kontrolleras |
Tabell 1: avancerade inställningar för kalibrering. Tabellen sammanfattar de parametrar som vi använde för att exakt kalibrera sex-kamerans set-up. Dessa inställningar testades experimentellt och fann optimala för vår inställning.
Discussion
Denna protokoll artikel visar användningen av ett motion tracking-system för insamling och analys av 3D-kinematiska data under fyrbent löpband förflyttning på gnagare. Viktiga funktioner i 3D kinematisk rörelseanalys system inkluderar detaljerad kvantifiering av kinematik av ledrörelse (steg fas kinematik, gemensamma vinklar, rörelseomfång, steg hastigheter) från flera leder och armar och ben samtidigt, detektering av motoriska underskott omätbara av blotta ögat, eliminering av subjektiva bias i datainsamling och analys, och enkel visualisering av hela extremiteten och postural kinematik som kan jämföras med samtidig sammanställning av hela råtta i rörelse. Utan behovet av extra algoritmer och modellering, metoderna visar programvarans förmåga att kvantitativt analysera kinematik av gång med stor detaljrikedom, effektivitet, lätthet, precision, och reproducerbarhet.
I gnagare, forelimb och bakbenet rörelseunderskott efter en ryggmärgsskada (SCI) är vanligen bedöms med hjälp av subjektiva och standardiserade Rörelseresultat system såsom BBB scoring system1. Subjektiva poängsystem införa i allmänhet testare bias eftersom olika forskare kan tilldela olika Poäng för samma motor underskott eller samma poäng för olika motoriska underskott, vilket resulterar i minskad reproducerbarhet och känslighet av testet13 . Dessutom bär oförmågan att upptäcka subtila underskott risken för felaktigt slutsatser om effekterna av en intervention.
För att bekämpa dessa problem, automatiserade system2,3,4,5 och system med eller utan användning av komplexa algoritmer14,15 har antagits av vissa utredare. Dessa tester utföra steg cykel analys som avslöjar viktbärande profiler och steg sekvens mönster som härrör från Paw placering rörelser av råttor som går över en landningsbana. Emellertid, en stor nackdel med ventrala plan video gånganalys är att motivet kropp själv inte är direkt synlig2,3. Dessa uppgifter blir begränsade till information som erhållits från exponeringar av fot-och Paw-rörelser, som ifrågasätter urvalet och tolkningen av gång parametrar vid bedömningen av underskott (se Chen et al.16). Detaljer om rörelse som avslöjar dynamiska segmentell kinematik av lem rörelse och positionering är inte korrekt erhållas för rörelseanalys3,5. Kritiska avvikelser av fogvinkeln data (dvs. olika rörelser, hastighet av rörelser, etc.), förhållandet mellan lederna med avseende på varandra inom en lem och mellan extremiteter, och underliggande organ mekanik som förändrar gångmönster är omöjliga att få. Som sådan, om någon observerbar gång nedskrivningar är till följd av förändringar i enstaka och/eller flera segmentell gemensamma rörelser (dvs., proximala distala intralimb koordination, postural relationer av stammen med avseende på position och gång cykeln av armar och ben, etc.) förbli maskerade.
Få för närvarande tillgängliga system fångar gång kinematik och bedömer motorisk dysfunktion kvalitativt och kvantitativt, men används mindre ofta. En full-body hög hastighet video-tracking gånganalys system filmer spontana gång cykler från tre sidor (en ventrala och två laterala plan) och spåra beniga landmärken att mata ut ett antal gång resultat17,18. Sagittal plan kinematisk gånganalys är anställd av vissa forskare för att få 2D-rörelsedata av den berörda bakbenet19,20. Men en tredje dimension av rörelse som sker ortogonalt till visnings planet (lateral eller sagittal) är omöjlig att upptäcka i analyserna11,18,19.
Andra mer sofistikerade, 3D, tre kropp-segmentet gnagare kropp postural datainsamlingssystem utnyttja 3D matematisk modellering av datainsamling samt analyssystem för att spåra och kvantifiera 3D rörelse av gnagare kropp segment medan inklusive huvud rörelsemönster8. Madete et al.9 har utvecklat en markör baserad optoelektroniska motion capture system för att kvantifiera 3D Body postural kinematik under Overground förflyttning på gång balkar med hjälp av en sju kamerasystem. De viktigaste resultaten som studerades i de två sistnämnda arbetena fokuserar främst på den övergripande hållningen hos gnagare snarare än gånganalys. 3D motion capture-system ger hög genomströmning 3D kinematiska gång data med hjälp av flera kameror och utarbeta mjukvarusystem, som granskats av Bhimani et al.21. Äldre versioner av det presenterade 3D-rörelseanalys systemet har också använts i tidigare arbete hos råttor med och utan neurotraumakirurg12,22,23.
Trots tillgängligheten av 3D-motion insamlings-och analyssystem för forskning, är preklinisk användning av denna teknik på gnagare relativt begränsad. En del av orsaken till detta problem är att datainsamlings-och analys protokollen är starkt beroende av att bygga kinematiska modeller och komplicerade algoritmer som passar en kinematisk modell av råttans bakben undergång för att generera fina, högupplösta gång kinematik8,9,11,22. Den detaljerade metod som presenteras här ger information om det förfarande som ingår i hela experiment processen, inklusive djurhantering, utbildning, experimentell uppsättning, datainsamling och analys steg.
Det finns också Detaljer om kalibrering av systemet, som är den grundläggande delen av protokollet, som kommer att garantera reproducerbarhet mellan angränsande prövningar inom och mellan ämnen. De beskrivna steg-för-steg-teknikerna introducerar objektivitet i datainsamlings förfarandet och gör det mycket reproducerbart. De genererade data från den här motion capture-programvaran kan visualiseras genom bildruta för bildkvalitet och spåras automatiskt. Vidare beskrivs hur denna datainsamling eller kvantifiering inte kräver några ytterligare algoritmer eller modellering. Studenter, personal och forskare kan använda enkel statistisk programvara för att generera grundläggande kinematisk produktion utan att förlita sig på specifik teknisk expertis.
Detta system kan också användas för Overground förflyttning, nå och greppa, och andra experimentella uppställningar för att passa det experimentella målet. Antal och typ av markörer kan också justeras för svans, rygg, bål, eller öron, efter behov. En större fördel med den presenterade programvaran i jämförelse med system är dess förmåga att samla in högupplösta video data i ämnet. Som sådan kan komplexa uppsättningar av beräkningar (dvs. vinkelrörelser, streck linjer som förbinder flera fogar etc.) läggas ovanpå den inspelade videon. Markör placering och den genererade 3D-data kan verifieras med faktiska rörelser av en råtta i rörelse. I motsats, med andra 3D motion capture-system, endast markörer fångas, och eventuella omanalys måste göras på Stick diagram (skelett ram) i stället för video av själva ämnet. Följaktligen saknas kontroll av markör placering på faktisk ämnes rörelse.
Baserat på erfarenheterna av detta system spelar kalibreringen en avgörande roll för att datainsamlingen ska bli framgångsrik. Kalibreringen av systemet är mycket känslig för förändring. och lätt förflyttning av en kamera kan äventyra hela 3D samordna datainsamling och analys process. Endast två kameror på vardera sidan av ett visnings plan krävs för datainsamling, men den tredje kameran rekommenderas starkt för att ge mer noggrannhet genom korsreferering av platserna för varje markör med andra kameror. När antalet spårnings kameror ökar ökar också noggrannheten i 3D-koordinaten för en specifik markör. Vid tillfällen då markörer blir skymmas på grund av gång underskott (t. ex. tå curling eller dra i händelse av gång efter Neurotrauma), dessa villkor kan kräva omfattande Manuell spårning. Ändå är mängden data som så småningom genereras från spårningen värdig den tid som investeras i Manuell spårning av markörer, vilket gör det till ett ovärderligt verktyg för att upptäcka subtila motoriska underskott.
Enligt vår erfarenhet, alla TRÅKIGHET i samband med användning av systemet ligger bortom användning av utrustning och teknik själv. I likhet med andra protokoll för bedömning av motoriska beteenden, den metod med vilken råttor hanteras och utbildas för uppgiften kraftigt påverkar resultaten. Till exempel, isolera råttor från deras kohort är kritisk under provningen; Annars, råttor som inte testas men är fortfarande närvarande under provningen visar eventuell försämring av uppgifts prestanda. Optimala rumstemperaturer, belysning och ljudnivåer är andra bestämningsfaktorer. Fouad et al. publicerade andra utmaningar som åtföljer funktionell motorprovning hos råttor24. Faktum är att förblindade användare från detta laboratorium som följde metodiken korrekt inte upplever några större hinder med datainsamling, motion tracking och dataanalys.
I det här dokumentet beskrivs en 3D motion capture-system för att samla in och analysera rörelsedata effektivt så att forskare kan samla in enorma mängder av djupgående rörelsedata snabbt från flera råttor. Vi arbetar för närvarande med att skapa en automatiserad dataanalys mall som kan byggas in i programvaran och bli kapabel att generera en rapport av förutbestämda utfall inom några sekunder för löpband förflyttning på gnagare, liknande vad som görs i mänskliga studier med motion capture och analyssystem6,25. Utvecklingen av denna mall kommer att tillåta prekliniska forskare att få detaljerade gnagare rörelsedata för att underlätta för några klick med musknappen. Förhoppningen är att de metoder som ges i detta arbete kommer att vara till nytta för prekliniska forskare att bedöma gnagare motoriska beteende mer objektivt. Vi är nu finjustering användningen av detta system för att samla in hög genomströmning 3D kinematiska data under gemensamma, skickliga forelimb beteenden såsom att nå och gripa. Viktigt, nyttan av denna metod kan utökas till råttor med en mängd olika neurotraumatiska och icke-neurotraumatiska skador.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vårt speciella tack till Pawan Sharma för hans hjälp med experimentell uppsättning för video och intellektuella bidrag till detta projekt. Vi tackar också Christopher Palacio för hans bidrag i hjälp med demonstration av video protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 camera Basler (Scout scA640-120gu) motion capture system. | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | Recording device for motion analytics. |
| Calibration Frame and Wand | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | L-shaped calibration defining the global coordinate sysetem, and the trident shape wand (100 mm) |
| Markers | Shah Lab | N/A | Recording device for motion analytics. Markers are Custom made in our lab from 0.5cm googly-eyes covered with reflective tape. |
| Matlab | Mathworks, Inc, Natic, Ca | N/A | Data analysis software |
| Rodent Cage | Custom Made within Stony Brook. | N/A | Clear plexiglass cage used to keep the rodent on the treadmill. |
| Simi Reality Motion Systems | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | 3D tracking Software. |
| Treadmill | Mk Automation Inc., Bloomfield, CT 06002 | N/A | Treadmill used for rodent locomotion. |
References
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Beare, J. E., et al. Gait analysis in normal and spinal contused mice using the TreadScan system. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2045-2056 (2009).
- Nakamura, A., et al. Low-cost three-dimensional gait analysis system for mice with an infrared depth sensor. Neuroscience Research. 100, 55-62 (2015).
- Pfister, A., West, A. M., Bronner, S., Noah, J. A. Comparative abilities of Microsoft Kinect and Vicon 3D motion capture for gait analysis. Journal of Medical Engineering & Technology. 38 (5), 274-280 (2014).
- Alt Murphy, M., Murphy, S., Persson, H. C., Bergstrom, U. B., Sunnerhagen, K. S. Kinematic Analysis Using 3D Motion Capture of Drinking Task in People With and Without Upper-extremity Impairments. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Karakostas, T., Hsiang, S., Boger, H., Middaugh, L., Granholm, A. C. Three-dimensional rodent motion analysis and neurodegenerative disorders. Journal of Neuroscience Methods. 231, 31-37 (2014).
- Madete, J. K., et al. Challenges facing quantification of rat locomotion along beams of varying widths. Journal of Engineering in Medicine. 224 (11), 1257-1265 (2010).
- Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
- Valdez, S. I., et al. Modeling hind-limb kinematics using a bio-inspired algorithm with a local search. Biomedical Engineering Online. 17, (2018).
- Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain: A Journal of Neurology. 136 (Pt 11), 3362-3377 (2013).
- Barros Filho, T. E., Molina, A. E. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo). 63 (1), 103-108 (2008).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of osteoarthritis). Currend Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Kloefkorn, H. E., et al. Automated Gait Analysis Through Hues and Areas (AGATHA): A Method to Characterize the Spatiotemporal Pattern of Rat Gait. Annals of Biomedical Engineering. 45 (3), 711-725 (2017).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a reliable gait evaluation method for rodent studies. Journal of Neuroscience Methods. 283, 92-100 (2017).
- Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nature Methods. 7 (9), 701-708 (2010).
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
- Fiander, M. D., Chedrawe, M. A., Lamport, A. C., Akay, T., Robertson, G. S. Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
- Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behavioural Brain Research. 317, 95-108 (2017).
- Bhimani, A. D., et al. Functional gait analysis in a spinal contusion rat model. Neuroscience Biobehavioral Reviews. 83, 540-546 (2017).
- Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nature Neuroscience. 12 (10), 1333-1167 (2009).
- Shah, P. K., et al. Unique Spatiotemporal Neuromodulation of the Lumbosacral Circuitry Shapes Locomotor Success after Spinal Cord Injury. Journal of Neurotrauma. 33 (18), 1709-1723 (2016).
- Fouad, K., Hurd, C., Magnuson, D. S. Functional testing in animal models of spinal cord injury: not as straight forward as one would think. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 85 (2013).
- Miller, E., et al. Mechanical testing for three-dimensional motion analysis reliability. Gait & Posture. 50, 116-119 (2016).
