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Engineering

Mise en œuvre d'un microscope non linéaire basé sur la diffusion stimulée de Raman

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59614
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

Summary

Dans ce manuscrit, la mise en œuvre d'un microscope à diffusion Raman (SRS) stimulé, obtenue par l'intégration d'un sER expérimental avec un microscope à balayage laser, est décrite. Le microscope SRS est basé sur deux sources laser femtoseconde (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) et un oscillateur paramétrique optique synchronisé (OPO).

Abstract

La microscopie de diffusion Raman stimulée (SRS) utilise la lumière d'excitation proche infrarouge; par conséquent, il partage de nombreuses propriétés d'imagerie microscopique multiphoton. La modalité d'imagerie SRS peut être obtenue à l'aide de microscopes à balayage laser commerciaux en équipant d'un détecteur avant non descanné avec des filtres de bande passet appropriés et un système de détection des amplificateurs de verrouillage (LIA). Une disposition schématique d'un microscope SRS typique comprend ce qui suit : deux faisceaux laser pulsés (c.-à-d., la pompe et la sonde dirigées dans un microscope à balayage), qui doivent être superposés dans l'espace et le temps au plan d'image, puis concentrés par un objectif de microscope dans l'échantillon à travers deux miroirs de balayage (SM), qui ratins la tache focale à travers un plan x-y. Après interaction avec l'échantillon, les impulsions de sortie transmises sont recueillies par un objectif supérieur et mesurées par un système de détection vers l'avant inséré dans un microscope inversé. Les impulsions de pompe sont enlevées par une pile de filtres optiques, tandis que les impulsions de sonde qui sont le résultat du processus de SRS se produisant dans le volume focal du spécimen sont mesurées par un photodiode (PD). La lecture de la DP est démoduée par la LIA pour extraire la profondeur de modulation. Une image bidimensionnelle (2D) est obtenue en synchronisant l'unité de détection avant avec l'unité de balayage au microscope. Dans cet article, la mise en œuvre d'un microscope SRS est décrite et démontrée avec succès, ainsi que la déclaration d'images sans étiquette de perles de polystyrène d'un diamètre de 3 m. Il est à noter que les microscopes SRS ne sont pas disponibles dans le commerce, donc afin de profiter de ces caractéristiques, la construction maison est la seule option. Étant donné que la microscopie SRS est de plus en plus populaire dans de nombreux domaines, on croit que cette description minutieuse de la mise en œuvre du microscope SRS peut être très utile pour la communauté scientifique.

Introduction

Dans les applications des sciences de la vie, la microscopie SRS est devenue un outil puissant pour l'imagerie sans étiquette. L'idée de base de la microscopie SRS est de combiner la force du contraste vibratoire et sa capacité à acquérir des images en quelques secondes.

SRS est un processus dans lequel la différence de fréquence entre deux fréquences de faisceaux laser (signal de pompe et signaux de stokes à différentes fréquences) correspond à la vibration moléculaire d'un échantillon étudié, provoquant une diffusion raman stimulée et une augmentation du signal Stokes. Contrairement à la spectroscopie linéaire de Raman, SRS présente une dépendance non linéaire aux champs lumineux entrants et produit un rayonnement cohérent. Le SRS présente deux avantages fondamentaux : 1) la vitesse, qui rend les images moins sensibles aux artefacts résultant du mouvement ou de la dégradation de l'échantillon, et 2) un excellent rapport signal-bruit (RsN). En outre, SRS présente un spectre identique à la spontanée Raman, et le signal SRS est linéairement proportionnelle à la concentration de la liaison chimique excitée1,2,3,4, 5.

Dans notre microscope, une mise en place expérimentale SRS femtoseconde (fs) est intégrée à un microscope optique inversé équipé d'une unité de balayage de miroirs rapides (Figure 1)6,7,8. Deux sources laser pulsées sont utilisées pour mettre en œuvre ce microscope. Le premier est un fs-Ti:Sa avec une durée d'impulsion d'environ 140 fs, un taux de répétition de 80 MHz, et des longueurs d'onde d'émission de l'ordre de 680-1080 nm. Le second, utilisé comme faisceau de sonde et pompé par Ti:Sa, est un oscillateur paramétrique optique synchronisé femtoseconde (SOPO), avec une durée d'impulsion d'environ 200 fs, un taux de répétition de 80 MHz et des longueurs d'onde d'émission de l'ordre de 1000-1600 nm. Il convient de noter que la différence minimale d'énergie du photon entre le faisceau Ti:Sa et SOPO est de 2500 cm-1. Par conséquent, en utilisant cette combinaison de systèmes laser, seule la région à haute fréquence C-H (2800-3200 cm-1) de spectres Raman peut être exploré6,7,8.

Afin de mettre en place un microscope SRS, il ya trois questions cruciales à considérer, qui sont décrits dans les paragraphes successifs. La première est la mise en œuvre d'une méthode de transfert de modulation à haute fréquence (voir la figure 2 et l'étape 2.1 du protocole pour une description). Dans une enquête expérimentale SRS, un paramètre crucial est la sensibilité du système. Un signal SRS est détecté comme un petit changement dans l'intensité des faisceaux d'excitation; par conséquent, il peut être corrompu par le bruit d'intensité laser et le bruit de tir. Ce problème peut être surmonté en intégrant ce système avec une méthode de transfert de modulation à haute fréquence (voir la figure 2 et l'étape 2.1 du protocole pour plus de détails). Dans cette méthode, un modulateur électro-optique (EOM) est utilisé pour moduler la pompe. La modulation transférée au faisceau de la sonde peut alors être détectée par un après avoir bloqué le faisceau de la pompe avec une pile de filtres optiques [mode de détection de gain Raman stimulé (SRG)]. La sortie est reliée par un filtre de passage bas à un amplificateur de verrouillage (LIA), qui démodule le signal mesuré. En augmentant la fréquence de modulation du faisceau à des fréquences supérieures à 1 MHz, la limite intrinsèque des peut être obtenue.

La deuxième question à considérer est l'installation d'une monture mécanique qui permet d'effectuer la détection vers l'avant et en même temps de préserver l'observation au microscope dans brightfield. En outre, il doit réduire le bruit dû aux vibrations mécaniques lors de la génération d'images et permettre le repositionnement précis du système de détection (voir la figure 3 et l'étape 2.2 du protocole).

Le troisième est la synchronisation du signal acquis par le système de détection sensible à la phase, le faisceau positionné sur l'échantillon surveillé par la tête de balayage du microscope. Afin de réaliser des images, les SM nécessitent trois signaux TTL qui sont mis à disposition par le contrôleur de microscope connecté à l'unité de tête de balayage: horloge de pixel, synchronisation de ligne, et synchronisation de cadre. La synchronisation est réalisée en contrôlant à l'aide d'une carte PCI, les trois signaux TTL, et l'acquisition d'un signal de tension au canal de sortie de LIA6,7,8. Un logiciel fait maison a été développé et décrit précédemment6,7,8, tandis que le matériel du système de synchronisation est rapporté dans la figure 4.

Une procédure fondamentale lors de l'exécution de l'imagerie SRS est l'alignement au microscope. Il est réalisé au cours de quatre étapes, qui sont décrites dans les paragraphes successifs. Le premier est le chevauchement spatial de deux faisceaux (voir l'étape 3.1 du protocole). Dans cette configuration expérimentale, les deux faisceaux ont été spatialement collinaux combinés par un miroir dichroïque. L'étape préliminaire est l'alignement de oPO et Ti:Sa de sorte que chacun atteint le microscope. Ensuite, considérant l'OPO comme un faisceau de référence et profitant d'un détecteur sensible à la position, le Ti:Sa est spatialement superposé à l'OPO.

Le deuxième aspect crucial est le chevauchement temporel de deux faisceaux (voir l'étape 3.2 du protocole). Même si la pompe et les faisceaux OPO sont parfaitement synchronisés9, puisqu'ils suivent des chemins de faisceau légèrement différents à l'intérieur du boîtier de l'OPO, à la sortie de l'OPO, ils ont un délai d'environ 5 ns et une différence spatiale de 5 cm. Par conséquent, Ti:Sa et OPO doivent être réchronométrés optiquement pour assurer un chevauchement temporel à l'échantillon. Ceci est généralement accompli avec une ligne de retard optique finement réglable, qui dans ce cas est insérée entre le Ti:Sa et le microscope (voir Figure 1). Afin d'obtenir le chevauchement temporel de deux faisceaux, deux techniques sont utilisées. Le premier est réalisé à l'aide d'un rapide et d'un oscilloscope, tandis que le second est basé sur des corrélations auto- et interoptiques. À l'aide de la première technique, un chevauchement approximatif de deux faisceaux est obtenu (incertitude de 10 ps), tandis qu'un chevauchement temporel précis de deux faisceaux est obtenu à l'aide d'un corrélateur croisé (résolution de 1 fs).

Le troisième aspect crucial est l'alignement des deux faisceaux à l'intérieur du microscope (voir l'étape 3.3 du protocole). Une observation préliminaire de la lumière blanche de l'échantillon permet d'individualiser le champ de vision souhaité (FOV). Ensuite, les faisceaux laser, entrant au microscope par un port latéral du microscope, sont alignés afin d'atteindre la montée sur la partie supérieure (Figure 3). Toutefois, pour une acquisition d'image correcte, la définition d'un certain nombre de paramètres est nécessaire (par exemple, la dimension pixel et le temps d'habiter le pixel). La fréquence d'échantillonnage doit respecter la contrainte imposée par le théorème de Nyquist afin de préserver toutes les informations dans une image, tandis que pour une correspondance correcte entre les coordonnées spatiales des pixels et la valeur SRS mesurée dans chaque pixel, le temps d'intégration de LIA doit être égal ou comparable au temps d'arrêt pixel.

Dans la dernière étape de l'alignement au microscope, de nombreux tests sont effectués pour optimiser l'alignement spatial et temporel (voir l'étape 3.4 du protocole). Un certain nombre d'images de transmission (TI) pour Ti:Sa et OPO sont acquises afin d'optimiser le chevauchement spatial. Dans un TI, un seul faisceau est utilisé, et l'intensité du faisceau transmis de l'échantillon est mesurée par un. Dans le cas de TI réalisé par OPO, le signal de sortie est directement connecté à la carte PCI, tandis que dans le cas de TI réalisé par Ti:Sa, le signal de sortie est connecté à LIA et la sortie analogique de LIA est connectée à la carte PCI. Les images de transmission sont très utiles pour optimiser le FOV, l'éclairage, la position focale des objectifs du microscope et pour vérifier si les deux faisceaux sont spatialement superposés6,7,8.

L'optimisation du chevauchement temporel de la pompe et du faisceau de la sonde est obtenue en scannant la ligne de retard à l'avance à l'avance à l'avance de 0,001 mm correspondant à un décalage temporel de 3,3 fs et en effectuant une mesure SRS en un seul point d'un échantillon de perles de polystyrène de 3 m de diamètre. L'amplitude d'un signal SRS mesure les valeurs de LA LIA, en fonction du retard de la pompe à sonde, et fournit un maximum correspondant à un chevauchement temporel exact des deux faisceaux6,7,8. Avant de conclure, il convient de noter que toutes les étapes discutées sont obligatoires pour obtenir une image de haute qualité.

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Protocol

1. Démarrage du système laser

  1. Vérifiez si la température des refroidisseurs est maintenue à 20 oC ou en dessous.
  2. Vérifiez si l'unité de contrôle de l'humidité fonctionne correctement et si l'humidité est maintenue à une valeur d'environ 40 %.
  3. Allumez le laser Ti:Sa, en suivant strictement les instructions dans le manuel.
  4. Définir la longueur d'onde à 810 nm.
  5. Allumez l'OPO et le mini-ordinateur connecté. Exécutez l'application qui contrôle le laser OPO.
  6. Sélectionnez la dérivale si 100 % de la sortie laser Ti:Sa est nécessaire à la sortie de la boîte OPO.
  7. Désélectionnez le contournement si 20 % de la sortie laser Ti:Sa et la sortie laser OPO sont nécessaires à la sortie de la boîte OPO.
  8. Ouvrez l'obturateur de Ti:Sa et relâchez le faisceau Ti:Sa à l'entrée oPO.
  9. Relâchez les deux faisceaux laser à la sortie de l'OPO en cliquant sur le signal et la pompe.
  10. Attendez que les deux lasers Ti:Sa et OPO soient stabilisés (environ 45 à 60 min).
  11. Vérifier la tache de faisceau à la sortie de la boîte oPO pour ti:Sa et OPO à l'aide d'une carte de détecteur de papier et vérifier la puissance à l'aide d'un compteur d'alimentation.
  12. Régler la longueur d'onde laser OPO à 1076 nm.
  13. Réduisez la puissance à 10 mW pour chaque faisceau laser pour effectuer l'alignement.

2. Mise en place du microscope

  1. Mise en œuvre d'une méthode de transfert de modulation à haute fréquence
    1. Effectuer la procédure d'alignement optique du modulateur de telle sorte que le faisceau Ti:Sa entre et sort sans aucune distorsion.
    2. Allumez le générateur de fonction et génèrez un signal TTL (onde carrée avec amplitude 5 V, décalage à 2,5 V, fréquence de 5 MHz).
    3. Diviser le signal TTL en deux parties à l'aide d'une jonction T; l'un pour l'EOM et l'autre pour l'amplificateur de verrouillage (LIA) (voir Figure 2).
    4. Vérifiez tous les niveaux de signal avec un oscilloscope.
    5. Allumez la LIA et connectez le canal de sortie du générateur au canal de référence de la LIA.
    6. Connectez le canal de sortie du générateur à l'amplificateur de puissance à haute tension de l'EOM.
    7. Allumez l'amplificateur et fixez la tension à presque le niveau maximum. Surveillez la puissance du faisceau à la sortie de l'EOM.
  2. Intégration du montage mécanique pour fixer et assigner le mouvement relatif x et y
    REMARQUE : Avec le microscope, une monture externe est introduite, équipée d'un micromètre qui a le contrôle de mouvement dans les directions x et y.
    1. Monter deux étapes de traduction de voyage pour permettre des mouvements le long des directions x et y (voir la figure 3).
    2. Fixer la scène sur un poteau de 1,5 po de hauteur appropriée.
    3. Montez la à une monture externe.
    4. Maximiser la puissance du faisceau à La, en ajustant les positions DeP (coordonnées x et y) à l'aide des micromètres attachés à la monture (voir Figure 3).

3. Alignement du microscope

  1. Chevauchement spatial des faisceaux
    REMARQUE : Considérant le faisceau de l'OPO comme une référence et profitant d'un détecteur sensible à la position, le Ti:Sa devrait être superposé à l'OPO selon la procédure suivante :
    1. Alignez les faisceaux laser OPO et Ti:Sa afin qu'ils atteignent tous les deux le microscope.
    2. Placez les détecteurs de capteurs de position de faisceau laser dans deux positions entre le miroir dichroic 1 et le miroir 6, la première position est située près du miroir dichroic 1 et la deuxième est proche du miroir 6. Pour chaque position, utilisez les capteurs pour détecter les coordonnées x et y du faisceau oPO (suivre la figure 1).
    3. Vérifier que les coordonnées x et y du faisceau laser Ti:Sa sont les mêmes OPO dans les deux positions des détecteurs de capteurs. Si, dans certaines positions, les coordonnées de Ti:Sa et de l'OPO ne coïncident pas, accordez l'inclinaison du miroir adjacent pour compenser la différence (suivre la figure 1).
    4. Suivre la même procédure pour aligner les positions de faisceau Ti:Sa en ce qui concerne oPO pour le chemin entre M6-M7 (suivre Figure 1).
  2. Synchronisation temporelle des faisceaux
    1. Utilisation du photodiode rapide plus oscilloscope:
      1. Arrêtez la propagation des faisceaux Ti:Sa et OPO et placez un détecteur rapide devant le faisceau OPO (entre M6 et M7).
      2. Connectez le signal de déclenchement fourni par la boîte laser Ti:Sa avec un oscilloscope dans le canal 2.
      3. Connectez le câble détecteur avec l'oscilloscope dans le canal 1 et visualisez le profil temporel de l'OPO.
      4. Enregistrez le temps (abscissa) mesuré par l'oscilloscope correspondant à sa valeur maximale, à savoir t1.
      5. Arrêtez le faisceau OPO et relâchez le faisceau Ti:Sa.
      6. Visualisez le profil temporel Ti:Sa et enregistrez le temps (abscissa) correspondant à sa valeur maximale, à savoir t2.
      7. Minimisez la différence entre t1-t2 en utilisant la ligne de retard pour chevaucher les deux faisceaux. Dans notre cas, la différence minimale mesurable est de 10 ps.
      8. Retirez le détecteur rapide entre M6 et M7.
    2. Utilisation de l'autocorrelator:
      REMARQUE : Dans le diagramme schématique illustré dans la figure 1, un autocorrélateur est installé sans interférer avec les trajectoires optiques des faisceaux. En outre, un miroir supplémentaire est introduit et monté sur une monture à tongs (appelée FFM/AM) entre M6 et M7 pour détourner le faisceau dans l'autocorrelator.
      1. Retournez le AM pour diriger le faisceau dans l'autocorrelator.
      2. Arrêtez le Ti:Sa et relâchez l'OPO.
      3. Placez le micromètre de réglage de la distance de faisceau de l'autocorrélateur à la position normale (8,35 mm).
      4. Puissance sur le contrôleur autocorrelator et démarrer l'application logicielle sur l'ordinateur personnel le contrôler.
      5. Projetez le faisceau OPO de FFM/AM au miroir d'entrée dans l'autocorrelator.
      6. Contrôlez la tache de réflexion (à l'aide d'une carte de détecteur de papier) du faisceau sur la fenêtre d'alignement de l'autocorrelator.
      7. Dans le cas d'une intensité sans faisceau ou d'intensité à faible faisceau, ajustez la position et l'orientation de FFM/AM dans la mesure optimale, et essayez d'ajuster le miroir d'entrée (monté sur l'autocorrelator) pour maximiser le signal d'impulsion laser. Le signal autocorrélateur est obtenu comme indiqué dans la figure 5a.
      8. Arrêtez l'OPO et le projet de la poutre Ti:Sa de FFM/AM pour entrer le miroir dans l'autocorrelator. Répétez les étapes 3.2.2.6 et 3.2.2.7. Le signal autocorrélateur est obtenu comme indiqué dans la figure 5b.
      9. Définir le micromètre de réglage de la distance du faisceau en position transversale (7,30 mm).
      10. Relâchez les deux faisceaux.
      11. Scanner la ligne de retard pour obtenir les deux poutres OPO et Ti:Sa chevauché. Le signal de la corrélateur croisé est obtenu comme le montre la figure 6.
      12. Retournez le miroir FFM/AM pour que les faisceaux puissent atteindre M7 et scanner la tête du microscope.
  3. Alignement de microscope
    1. Effectuer l'observation microscopique de lumière blanche :
      REMARQUE : Avant l'observation microscopique, assurez-vous que le microscope est correctement aligné.
      1. Préparer l'échantillon d'essai, qui consiste en une solution tampon de phosphate dans laquelle les perles de polystyrène d'un diamètre de 3 m sont dispersées. La solution est placée à l'intérieur d'un sandwich de deux lames de verre.
      2. Allumez le microscope et l'alimentation de la lumière blanche. Suivez le manuel d'observation sous la lumière blanche.
      3. Utilisez un condenseur pour éclairer l'échantillon. Utilisez l'objectif de 60x pour recueillir la lumière. Placez l'échantillon sur la scène. Optimisez la position focale de l'objectif du microscope 60x.
      4. Sélectionnez le FOV d'intérêt. Prenez une image CCD de l'échantillon (Figure 7).
      5. Éteignez l'alimentation de la lumière blanche.
    2. Alignement de microscope avec des faisceaux laser femtoseconde : OPO et Ti:Sa
      1. Retirez le condenseur à l'aide du bouton d'échappement pour rétracter temporairement la lentille objective du microscope 60x. Déplacez la lentille objective du microscope 60x hors de la voie optique, en tournant le nez.
      2. Montez le détecteur jusqu'à la partie supérieure du microscope à l'aide de la monture mécanique externe. Connectez la sortie du détecteur à l'intermédiaire d'un filtre à faible passage de 50 degrés à l'oscilloscope et surveillez le signal OPO.
      3. Allumez le processeur qui contrôle la tête du scanner. Projetez le faisceau oPO dans la tête du scanner du microscope.
      4. Vérifiez la position du faisceau à l'intérieur du microscope, assurez-vous que l'emplacement du faisceau est au centre ou près du centre.
      5. Vérifiez que la position du faisceau à l'intérieur de la tête de est au centre.
      6. Maximisez la puissance mesurée par le détecteur à l'aide d'un traducteur x-y.
      7. Passez le faisceau de OPO à Ti:Sa et vérifiez qu'un signal maximum est également obtenu pour le laser titane-saphir. THis indique que les deux faisceaux sont bien alignés.
      8. Finaliser l'alignement du faisceau, l'introduction de la lentille 60x microscope objectif et la rotation vers l'arrière de la pièce de nez.
      9. Utilisez le bouton de recentrage sur le microscope pour retrouver l'attention finalisée à l'objectif du microscope 60x objectif.
      10. Placez l'objectif avec un grossissement 40x à la place du condenseur sans toucher ou déranger l'échantillon.
  4. Optimisation des synchronisations spatiales et temporelles des faisceaux
    1. Synchronisation temporelle
      1. Définir la puissance de Ti:Sa et OPO mesurée saplace avant le microscope à 30 mW pour les deux faisceaux. Définir la longueur d'onde de l'OPO à une valeur différente par rapport à la précédente afin que la pompe et la sonde ne soient pas en résonance avec la fréquence vibratoire des perles.
      2. Relâchez les deux faisceaux (Ti:Sa et OPO) afin qu'ils pénètrent dans le microscope.
      3. Exécuter le traducteur informatisé de ligne de retard de numérisation et enregistrer l'intensité mesurée par LIA pour chaque position de la ligne de retard. Attendez que la numérisation de la ligne de retard soit terminée. Le profil temporel obtenu est visualisé dans la figure 8a.
      4. Redéfinir la longueur d'onde de l'OPO à 1076 nm de sorte que la pompe et la sonde soient en résonance avec la fréquence vibratoire des perles. Répéter l'étape 3.4.1.3 (le profil temporel obtenu est visualisé dans la figure 8b).
      5. Définir la position de faisceau de chevauchement obtenue dans la ligne de retard pour acquérir des images SRS.
    2. Synchronisation spatiale des faisceaux
      REMARQUE : Les images de transmission sont utiles pour optimiser le FOV, l'éclairage et la position focale des objectifs du microscope, et pour vérifier si les deux faisceaux sont spatialement superposés.
      1. Acquisition d'images de transmission de l'OPO
        1. Arrêtez le faisceau Ti:Sa et réduisez la puissance de l'OPO à 8 mW.
        2. Connectez la lecture du détecteur à la carte d'acquisition de données.
        3. Exécutez le programme d'acquisition de données avec la console de balayage au microscope.
        4. Enregistrez le fichier et traitez les données pour obtenir l'image. L'image brute apparaît comme indiqué dans la figure 9a.
      2. Acquisition d'images de transmission de Ti:Sa
        1. Arrêtez le faisceau OPO et réduisez la puissance Ti:Sa à 2,5 à 4,5 mW.
        2. Connectez le détecteur avec les lises LIA et LIA avec la carte d'acquisition de données.
        3. Répéter les étapes 3.4.2.1.3 et 3.4.2.1.4. L'image brute apparaît comme indiqué dans la figure 9b.

4. Acquisition d'images SRS

REMARQUE : Un algorithme dédié a été réalisé afin de stocker des données. Il prend en charge les formats d'image suivants: 512 px x 512 px et 256 px x 256 px, avec des temps d'acquisition de 16 s, 8 s, 4 s, et 2 s.

  1. Introduire une pile de filtres entre l'objectif 40x et pour enlever les impulsions de pompe (Ti:Sa) et acquérir uniquement le signal Stokes (OPO).
  2. Régler le signal de la pompe à 810 nm avec une puissance focalisée de 8 mW et le signal de la sonde à 1076 nm avec une puissance focalisée de 8 mW pour étudier une liaison C-H typique de polystyrène (déplacement raman de 3054 cmà 1).
  3. Connectez le détecteur avec la lecture LIA et LIA à la carte d'acquisition de données.
  4. Définir le format pixel d'acquisition d'image selon les besoins et définir le temps d'acquisition.
  5. Exécutez le programme qui contrôle le contrôleur de microscope.
  6. Exécuter le programme d'algorithme dédié qui agit comme une synchronisation entre le contrôleur de microscope, le système de détection et Le DAQ (voir Figure 4).
  7. Enregistrer le fichier de matrice une fois l'acquisition terminée.
  8. Importer le fichier de données brutes et enregistrer l'image dans le format requis (généralement enregistré en format .tif) à l'aide du logiciel ImageJ. L'image est montrée dans la figure 10.

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Representative Results

Un exemple de mesure du SRS (c.-à-d. mesure Du SRS dans un seul point de l'échantillon) est rapporté à la figure 7. Lorsque les faisceaux ne se chevauchent pas dans le temps ou l'espace, le résultat obtenu est rapporté à la figure 8a. En hors résonance, l'amplitude du signal mesurée par LIA est nulle, tandis que la phase de signal mesurée par LIA saute entre les valeurs négatives et positives. Considérant que, lorsque les faisceaux se chevauchent dans l'espace, le déplacement de la ligne de retard dans une plage appropriée, les résultats obtenus sont rapportés dans la figure 8b. Le signal mesuré par LIA augmente et atteint son maximum lorsque les faisceaux sont parfaitement superposés dans le temps, tandis que la phase commence à atteindre une valeur fixe pendant le temps où les faisceaux sont superposés dans le temps.

Les images d'absorption obtenues à l'aide d'un seul faisceau (Ti:Sa ou OPO) des mêmes perles de polystyrène sont représentées dans la figure 9a,b avec des barres d'échelle de 6 m. Afin d'acquérir les images SRS, la ligne de retard est fixée à la position atteinte dans la figure 7b, une image SRG typique est montrée dans la figure 10 avec une barre d'échelle de 6 m.

Figure 1
Figure 1 : Disposition schématique du système de microscope f-SRS. OPO - oscillateur paramétrique optique; Ti:Sa - Laser Titanium-Saphir; Miroirs à large bande M1-M7MD femtoseconde; FFM/AM - Flip-Flop Mirror/ Autocorrelator Mirror;  DM1, DM2 et miroirs dichroiques; DL - Ligne de retard; AC et autocorrelator; MoME - modulateur électro-optique; FG - générateur de fonctions; Miroir GM et Galvo; Obj1, Obj2 - objectifs de microscope; et photodiode; DAQ - système d'acquisition de données; PC et ordinateur personnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Schéma de méthode de transfert de modulation à haute fréquence. Dans la figure enset, les deux faisceaux lasers avant interaction à l'intérieur de l'échantillon et la sonde modifiée en raison des interactions de la sonde et de la pompe à l'intérieur de l'échantillon sont représentés. Le temps est représenté en ns. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Représentation de la monture de photodiode avec système de montage mécanique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Schéma du système d'acquisition de données. - photodiode, LIA - amplificateur de verrouillage, système de détection DS, MC - contrôle au microscope, système d'acquisition de données DAQ, PC et ordinateur personnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Fonction autocorrélative de l'OPO (a) et du Ti:SA (b). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Fonction de corrélation croisée de l'OPO et de Ti:Sa. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 7 : Image CCD de perles de polystyrène.

Figure 7
Figure 8 : Amplitude et phase du signal SRS mesuré s'il est fixé par l'amplificateur de verrouillage : hors résonance (à gauche) et en résonance (à droite) . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9
Figure 9 : Images de transmission de perles de polystyrène obtenues par OPO (a) et Ti:Sa (b). Barre d'échelle de 16 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 10
Figure 10 : Image SRS de perles de polystyrène. Barre d'échelle de 12 m.

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Discussion

La microscopie SRS a porté l'imagerie sans étiquette à de nouveaux sommets, en particulier dans les études de structures biologiques complexes telles que les lipides, qui sont fondamentales pour les cellules et l'architecture cellulaire. Les lipides sont impliqués dans de multiples voies physiologiques telles que la production de membranes biologiques, et ils servent de précurseurs biosynthétiques et de transducteurs de signaux10. Les lipides sont emballés dans des organites intracellulaires spécialisés, aussi appelés gouttelettes lipidiques (LD). Leurs diamètres varient de quelques dizaines de nanomètres à des dizaines de micromètres11,12. Les LD participent non seulement abondamment aux cellules adipeuses et stéroïdes- mais sont également présentes dans d'autres lignées cellulaires. Les LD coopèrent dans plusieurs processus physiologiques tels que le stockage de lipides. Ils sont en évidence dans les pathologies courantes (par exemple, le métabolisme altéré du cholestérol)13,14.

Traditionnellement, la visualisation des lipides est réalisée à l'aide de la microscopie à fluorescence et des cellules fixes neutres étiquetées par colorant silipidé10. Il convient de noter que comme les lipides sont de plus petite taille par rapport aux protéines et à l'ADN, des changements structurels et fonctionnels et des artefacts indésirables peuvent se produire lors de l'ajout de fluorophores15,16. SRS s'est avéré puissant pour étudier les structures riches en lipides. Les lipides sont abondants dans les groupes C-H2. Par conséquent, les pics relativement isolés associés aux états vibratoires de liaison C-H à 2845 cm-1 dans leurs spectres raman fournissent une signature unique pour les lipides à l'intérieur d'une cellule. Malheureusement, comme les signatures vibratoires différenciables sont limitées, il est assez difficile de distinguer une biomolécule cible des autres espèces apparentées à l'intérieur des cellules qui partagent des liaisons chimiques similaires. Cependant, il est possible d'ajouter de minuscules sondes vibratoires Raman-actives (par exemple, alkynes et isotopes stables) pour obtenir la spécificité pour l'imagerie de petites biomolécules17.

Pour les applications biologiques et biomédicales in vivo, la cartographie simultanée de diverses espèces chimiques dans un échantillon donné est nécessaire pour investir la co-distribution et les corrélations dynamiques entre les paires de biomolécules18,19. Par conséquent, de nombreux efforts ont été faits pour obtenir de multiples contrastes chimiques. Dans l'option la plus simple de l'imagerie multicolore, pour l'image de différents modes Raman d'un échantillon, la fréquence du faisceau de pompe ou de faisceau Stokes sont accordés dans les scans séquentiels18. Cependant, l'utilisation de l'approche de tuning de longueur d'onde peut causer la perte d'informations de co-localisation de différents modes Raman, en particulier lorsque l'échantillon est dans un environnement dynamique18.

En raison de l'excitation non linéaire, SRS offre des capacités intrinsèques de résolution 3D de la liaison chimique sélectionnée dans les échantillons biologiques20. La reconstruction en volume de la liaison chimique sélectionnée et de ses distributions spatiales peut être simplement réalisée en recueillant des images SRS à différents plans focaux le long de l'axe z. Étant donné que les images sont acquises avec des résolutions spatiales et temporelles élevées, d'autres éléments d'information clés (c.-à-d. structure 3D, composition chimique, etc.) sur l'échantillon biologique peuvent être obtenus.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Acknowledgments

Nous apprécions V. Tufano de l'IMM CNR pour sa précieuse assistance technique et Giacomo Cozzi, spécialiste des produits chez Nikon Instruments, pour des discussions utiles et un soutien continu. Ce travail a été partiellement soutenu par les programmes nationaux d'exploitation italiens PONa3 00025 (BIOforIU) et par le projet d'infrastructure de recherche paneuropéenne à grande échelle Euro-Bioimaging.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acquisation tool Nikon Nikon C2Tool Acquisation supported tool
APE Pulse link control software APE- APE Pulse link control software software control
Autocorrelator APE APE PulseCheck USB 50 Autocorrelator
Detector Thorlabs Thorlabs DET10A Photodiode
Detector card Thorlabs Thorlabs VRC IR detector Card
Dichroic mirror Semrock Semrock FF875-Di01-25X36 Dichroic mirror
Dichroic mirror Semrock FF875-Di01-25x36 Dichroic mirror
EOM Conoptics (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). Pockels cell
Fast detector Thorlabs Thorlabs DET025AL/M Photodiode
Fast mirror scanning unit Nikon C2 Microscpe scanning head
Femtosecond laser Ti:SA Coherent Coherent Chameleon Ultra II Chameleon Ultra II
Function generator TTi TG5011 AIM – TTi Function generator
Inverted optical microscope Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon
Lock-in Amplifier Standford Research System SR844-200 MHz dual phase A lock-in amplifier from Stanford Research Systems
Notch filter, Semrock NF03-808E-25 Notch filter
Optical delay line Newport Newport M-ILS200CC Tunable optical delay line
Optical Parametric Oscillator Coherent Coherent Compact OPO Coherent Compact OPO
Oscilloscope WaveRunner 640Zi 4GHz OSC/LeCroy Digital Oscilloscope
PCI Card National instrument NI PCIe 6363 Data acquisation card
Position Sensors Detectors Newport Newport Conex PSD9 Position detector sensor
Power meter head Coherent PowerMax PM10, Laser power detector
Translation Stages Thorlabs Thorlabs PT1/M Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer

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References

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Ingénierie Numéro 149 microscopie systèmes d'imagerie optique non linéaire diffusion raman stimulée optique ultrarapide imagerie sans étiquette bioimagerie
Mise en œuvre d'un microscope non linéaire basé sur la diffusion stimulée de Raman
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Ranjan, R., Indolfi, M., Ferrara, M. A., Sirleto, L. Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering. J. Vis. Exp. (149), e59614, doi:10.3791/59614 (2019).

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