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Engineering

उत्तेजित रमन तितर बितर के आधार पर एक गैर रेखीय माइक्रोस्कोप का कार्यान्वयन

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59614
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

Summary

इस पांडुलिपि में, एक प्रेरित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोप के कार्यान्वयन, एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ एक एसआरएस प्रयोगात्मक सेट अप के एकीकरण द्वारा प्राप्त, वर्णित है. एसआरएस माइक्रोस्कोप दो femtosecond (एफ एस) लेजर स्रोतों, एक Ti-Sapphire (Ti:Sa) और सिंक्रनाइज़ ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला (OPO) पर आधारित है।

Abstract

उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी के पास-इन्फ्रारेड उत्तेजना प्रकाश का उपयोग करता है; इसलिए, यह कई बहु-फोटोन सूक्ष्म इमेजिंग गुण साझा करता है। एसआरएस इमेजिंग मोडलिटी उचित bandpass फिल्टर और लॉक-इन एम्पलीफायर (LIA) का पता लगाने की योजना के साथ एक गैर-descanned आगे डिटेक्टर के साथ लैस द्वारा वाणिज्यिक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। एक ठेठ एसआरएस माइक्रोस्कोप के एक योजनाबद्ध लेआउट निम्नलिखित शामिल हैं: दो स्पंदित लेजर बीम, (यानी, पंप और जांच एक स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में निर्देशित), जो दोनों अंतरिक्ष और समय में छवि विमान में ओवरलैप किया जाना चाहिए, तो में एक माइक्रोस्कोप उद्देश्य से ध्यान केंद्रित दो स्कैनिंग दर्पण (एस एम) के माध्यम से नमूना है, जो एक x-y विमान भर में फोकल स्पॉट raster. नमूने के साथ बातचीत के बाद, प्रेषित उत्पादन दालों एक ऊपरी उद्देश्य द्वारा एकत्र कर रहे हैं और एक उलटा माइक्रोस्कोप में डाला एक आगे का पता लगाने प्रणाली द्वारा मापा. पंप दालों ऑप्टिकल फिल्टर के एक ढेर द्वारा हटा रहे हैं, जबकि जांच दालों कि एसआरएस नमूना के फोकल मात्रा में होने वाली प्रक्रिया का परिणाम हैं एक photodiod (पीडी) द्वारा मापा जाता है. पीडी के readout मॉडुलन गहराई निकालने के लिए LIA द्वारा demodulated है. एक द्वि-आयामी (2डी) छवि माइक्रोस्कोप स्कैनिंग इकाई के साथ आगे का पता लगाने इकाई तुल्यकालन द्वारा प्राप्त की है. इस पत्र में, एक एसआरएस माइक्रोस्कोप के कार्यान्वयन का वर्णन किया गया है और सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है, साथ ही 3 डिग्री मीटर के व्यास के साथ polystyrene मोती के लेबल मुक्त छवियों की रिपोर्टिंग. यह ध्यान देने योग्य है कि एसआरएस माइक्रोस्कोप व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं लायक है, इसलिए इन विशेषताओं का लाभ लेने के लिए, घर का निर्माण एकमात्र विकल्प है। चूंकि एसआरएस माइक्रोस्कोपी कई क्षेत्रों में लोकप्रिय हो रहा है, यह माना जाता है कि एसआरएस माइक्रोस्कोप कार्यान्वयन के इस सावधान विवरण वैज्ञानिक समुदाय के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है.

Introduction

जीवन विज्ञान अनुप्रयोगों में, एसआरएस माइक्रोस्कोपी लेबल मुक्त इमेजिंग के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है। एसआरएस माइक्रोस्कोपी का मूल विचार कंपन विपरीत की ताकत और कुछ ही सेकंड में छवियों को प्राप्त करने की क्षमता को संयोजित करने के लिए है।

एसआरएस एक प्रक्रिया है जिसमें दो लेजर बीम आवृत्तियों के बीच आवृत्ति अंतर (विभिन्न आवृत्तियों पर पंप संकेत और स्टोक्स संकेत) एक जांच नमूने के आणविक कंपन से मेल खाता है, जिससे रमन प्रकीर्णन और एक महत्वपूर्ण स्टोक्स संकेत में वृद्धि. रैखिक रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी के विपरीत, एसआरएस आने वाले प्रकाश क्षेत्रों पर एक nonlinear निर्भरता दर्शाती है और सुसंगत विकिरण पैदा करता है. एसआरएस के दो बुनियादी फायदे हैं: 1) गति, जो छवियों को नमूना आंदोलन या गिरावट से उत्पन्न होने वाली कलाकृतियों के प्रति कम संवेदनशील बनाती है, और 2) एक उत्कृष्ट संकेत-से-शोर अनुपात (एसआरएन)। इसके अलावा, एसआरएस सहज रमन के समान स्पेक्ट्रम दर्शाती है, और एसआरएस संकेत रैखिक रूप से रासायनिक बंधन की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है उत्साहित1,2,3,4, 5.

हमारे सूक्ष्मदर्शी में, एक फेमोसेकंड (एफएस) एसआरएस प्रायोगिक व्यवस्था को एक उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ एकीकृत किया जाता है जो एक तीव्र दर्पण स्कैनिंग इकाई से सुसज्जित होता है (चित्र 1)6,7,8. इस सूक्ष्मदर्शी को कार्यान्वित करने के लिए दो स्पंदित लेजर स्रोतों का उपयोग किया जाता है। पहले एक fs-Ti:Sa लगभग 140 fs की एक पल्स अवधि के साथ, 80 मेगाहर्ट्ज की पुनरावृत्ति दर, और 680-1080 एनएम की सीमा में उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य है. दूसरा, जांच बीम के रूप में इस्तेमाल किया और Ti:Sa द्वारा पंप, एक femtosecond सिंक्रनाइज़ ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला (SOPO), लगभग 200 fs की एक पल्स अवधि के साथ, 80 मेगाहर्ट्ज की पुनरावृत्ति दर, और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य की सीमा में 1000-1600 एनएम. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ती:सा और SOPO बीम के बीचन्यूनतम फोटॉन ऊर्जा अंतर 2500 से.मी. इसलिए, लेजर सिस्टम के इस संयोजन का उपयोग करते हुए, केवल उच्च आवृत्ति सी-एच क्षेत्र (2800-3200 सेमी-1)रमन स्पेक्ट्रम के6,7,8का पता लगाया जा सकता है।

आदेश में एक एसआरएस माइक्रोस्कोप स्थापित करने के लिए, वहाँ तीन महत्वपूर्ण मुद्दों पर विचार करने के लिए कर रहे हैं, जो क्रमिक पैराग्राफ में वर्णित हैं. पहले एक उच्च आवृत्ति मॉडुलन स्थानांतरण विधि का कार्यान्वयन है (एक विवरण के लिए प्रोटोकॉल के चित्र 2 और चरण 2.1 देखें).। एक एसआरएस प्रयोगात्मक जांच में, एक महत्वपूर्ण पैरामीटर प्रणाली की संवेदनशीलता है. एक एसआरएस संकेत उत्तेजना बीम की तीव्रता में एक छोटे से परिवर्तन के रूप में पता चला है; इसलिए, यह लेजर तीव्रता शोर और शॉट शोर से भ्रष्ट किया जा सकता है। इस समस्या को एक उच्च आवृत्ति मॉडुलन स्थानांतरण विधि के साथ इस प्रणाली को एकीकृत करके दूर किया जा सकता है (विवरण के लिए प्रोटोकॉल के चित्र 2 और चरण 2.1 देखें).। इस विधि में, पंप को व्यवस्थित करने के लिए इलेक्ट्रो-ऑप्टिक न्यूनाधिक (ईओएम) का उपयोग किया जाता है। जांच बीम करने के लिए स्थानांतरित मॉडुलन तो ऑप्टिकल फिल्टर के एक ढेर के साथ पंप बीम अवरुद्ध करने के बाद एक पीडी द्वारा पता लगाया जा सकता है [उत्तेजित रमन लाभ (एसआरजी) का पता लगाने मोड]. पीडी उत्पादन एक लॉक-इन एम्पलीफायर (एलआईए) के लिए एक कम पास फिल्टर से जुड़ा हुआ है, जो मापा संकेत demodulates. 1 मेगाहर्ट्ज से ऊपर आवृत्तियों के लिए बीम के मॉडुलन आवृत्ति में वृद्धि करके, PDs की आंतरिक सीमा प्राप्त किया जा सकता है.

विचार करने के लिए दूसरा मुद्दा एक यांत्रिक माउंट की स्थापना है जो आगे का पता लगाने के लिए और एक ही समय में उज्ज्वल क्षेत्र में माइक्रोस्कोप अवलोकन को बनाए रखने के लिए परमिट. इसके अतिरिक्त, छवियों के उत्पादन के दौरान यांत्रिक कंपन के कारण शोर को कम करना होगा और पता लगाने प्रणाली की सटीक स्थिति को अनुमति देनी होगी (चित्र 3 और प्रोटोकॉल के चरण 2-2 देखें)।

तीसरा चरण के प्रति संवेदनशील पता लगाने की योजना द्वारा प्राप्त संकेत का तुल्यकालन है, माइक्रोस्कोप के स्कैन सिर द्वारा निगरानी नमूने पर तैनात बीम के साथ। आदेश में छवियों का एहसास करने के लिए, एसएमएस तीन TTL संकेत है कि माइक्रोस्कोप नियंत्रक स्कैन सिर इकाई से जुड़े द्वारा उपलब्ध कराया जाता है की आवश्यकता होती है: पिक्सेल घड़ी, लाइन सिंक, और फ्रेम सिंक. तुल्यकालन एक PCI कार्ड का उपयोग कर नियंत्रित करने के द्वारा हासिल की है, तीन TTL संकेत, और LIA6,7,8के उत्पादन चैनल पर एक वोल्टेज संकेत के अधिग्रहण. एक घर का बना सॉफ्टवेयर विकसित किया गया है और पहले6,7,8का वर्णन किया गया है , जबकि तुल्यकालन प्रणाली के हार्डवेयर चित्र 4में रिपोर्ट किया गया है .

एसआरएस इमेजिंग करते समय एक मौलिक प्रक्रिया सूक्ष्मदर्शी संरेखण है। यह चार चरणों के पाठ्यक्रम पर महसूस किया जाता है, जो क्रमिक पैराग्राफ में वर्णित हैं। पहले दो बीम के स्थानिक ओवरलैप है (प्रोटोकॉल के चरण 3.1 देखें).। इस प्रयोगात्मक सेट-अप में, दो बीम एक द्विवर्णीय दर्पण द्वारा स्थानिक रूप से कोलिनी द्वारा संयोजित किए गए थे। प्रारंभिक कदम OPO और Ti:Sa का संरेखण है ताकि प्रत्येक माइक्रोस्कोप तक पहुँचता है. फिर, एक संदर्भ बीम के रूप में ओपीओ पर विचार और एक स्थिति संवेदनशील डिटेक्टर का लाभ लेने, ती:Sa स्थानिक रूप से OPO के लिए ओवरलैप है.

दूसरा महत्वपूर्ण पहलू दो बीम के अस्थायी ओवरलैप है (प्रोटोकॉल के चरण 3.2 देखें)। यहां तक कि अगर पंप और OPO बीम पूरी तरह से सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं9, क्योंकि वे OPO आवास के अंदर थोड़ा अलग बीम रास्तों का पालन करें, OPO निकास पर वे के बारे में 5 एन और 5 सेमी के स्थानिक अंतर का एक समय देरी है. इसलिए, Ti:Sa और OPO नमूना पर अस्थायी ओवरलैप सुनिश्चित करने के लिए ऑप्टिकली फिर से समय की आवश्यकता है. यह आम तौर पर एक पतले टूनाबल ऑप्टिकल विलंब लाइन के साथ पूरा किया जाता है, जो इस मामले में ती:सा और माइक्रोस्कोप के बीच डाला जाता है (चित्र 1देखें)। दो बीमों के अस्थायी अतिव्यापन को प्राप्त करने के लिए दो तकनीकों का उपयोग किया जाता है। पहला एक तेजी से पीडी और आस्टसीलस्कप का उपयोग कर के बाहर किया जाता है, जबकि दूसरा ऑटो और पार ऑप्टिकल सहसंबंध पर आधारित है. पहली तकनीक का उपयोग करना, दो बीम के किसी न किसी ओवरलैप प्राप्त किया है (10 ps की अनिश्चितता), जबकि दो बीम का एक सटीक अस्थायी ओवरलैप एक क्रॉस-कोरेलेटर का उपयोग कर प्राप्त किया जाता है (1 fs का संकल्प).

तीसरा महत्वपूर्ण पहलू माइक्रोस्कोप के अंदर दो बीम का संरेखण है (प्रोटोकॉल के चरण 3.3 देखें)। नमूने का एक प्रारंभिक सफेद प्रकाश अवलोकन देखने के वांछित क्षेत्र individuate करने के लिए अनुमति देता है (FOV). बाद में, माइक्रोस्कोप के एक किनारे के पोर्ट द्वारा माइक्रोस्कोप में प्रवेश करने वाले लेजर बीम, ऊपरी भाग पर लगे पीडी तक पहुंचने के लिए संरेखित होते हैं (चित्र3)। हालांकि, एक सही छवि प्राप्ति के लिए, कई पैरामीटर सेट करना आवश्यक है (उदाहरण के लिए, पिक्सेल आयाम और पिक्सेल रहने का समय). नमूना आवृत्ति एक छवि में सभी जानकारी की रक्षा के क्रम में NyQuist के प्रमेय द्वारा लगाए गए प्रतिबंध का सम्मान करना चाहिए, जबकि पिक्सल और एसआरएस प्रत्येक पिक्सेल में मापा मूल्य के स्थानिक निर्देशांक के बीच एक सही पत्राचार के लिए, एकीकरण समय LIA के बराबर या पिक्सेल रहने के समय के लिए तुलनीय होना चाहिए.

माइक्रोस्कोप संरेखण के अंतिम चरण में, स्थानिक और लौकिक संरेखण को अनुकूलित करने के लिए कई परीक्षण किए जाते हैं (प्रोटोकॉल के चरण 3.4 देखें)। दोनों Ti:Sa और OPO के लिए संचरण छवियों (TI) के एक नंबर स्थानिक ओवरलैप अनुकूलन करने के लिए अधिग्रहण कर रहे हैं. एक टीआई में, एक एकल बीम का उपयोग किया जाता है, और नमूने से संचारित बीम तीव्रता एक पीडी द्वारा मापा जाता है। OPO द्वारा महसूस की TI के मामले में, पीडी आउटपुट संकेत सीधे PCI कार्ड से जुड़ा है, जबकि Ti के मामले में TI:Sa द्वारा महसूस किया, पीडी आउटपुट संकेत LIA से जुड़ा है और LIA के अनुरूप उत्पादन PCI कार्ड से जुड़ा है. संचरण छवियों FOV, रोशनी, माइक्रोस्कोप उद्देश्यों की फोकल स्थिति का अनुकूलन करने के लिए और अगर दो बीम स्थानिक रूप से ओवरलैप6,7,8की जाँच करने के लिए बहुत उपयोगी होते हैं।

पंप और जांच बीम के अस्थायी ओवरलैप का अनुकूलन 0.001 मिमी के चरणों के साथ देरी लाइन स्कैनिंग द्वारा प्राप्त किया जाता है जो 3.3 एफएस समय-पारी के अनुरूप है और एक एसआरएस माप को एक पॉलीस्टाइरीन मनका नमूना के एक बिंदु में ले जा रहा है 3 मीटर व्यास में। एक एसआरएस संकेत के आयाम LIA से मूल्यों के उपाय, जांच पंप देरी के एक समारोह के रूप में,और दो बीम 6,7,8के सटीक लौकिक ओवरलैप के साथ एक अधिकतम इसी प्रदान करता है. समापन से पहले, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सभी चर्चा कदम एक उच्च गुणवत्ता छवि प्राप्त करने के लिए अनिवार्य हैं.

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Protocol

1. लेजर प्रणाली शुरू

  1. जाँच करें कि चिलर का तापमान 20 डिग्री सेल्सियस से कम या उससे कम पर रखा जाता है या नहीं।
  2. जाँच करें कि आर्द्रता नियंत्रण इकाई ठीक से काम कर रहा है और आर्द्रता 40% के आसपास एक मूल्य पर बनाए रखा है.
  3. Ti:Sa लेजर चालू करें, सख्ती से मैनुअल में निर्देशों का पालन.
  4. तरंगदैर्ध्य को 810 दउ तक सेट करें।
  5. OPO और कनेक्ट किए गए मिनी कंप्यूटर को चालू करें। OPO लेज़र को नियंत्रित करता है जो अनुप्रयोग चलाएँ।
  6. Ti:Sa लेज़र आउटपुट का 100% OPO बॉक्स के बाहर निकलने पर आवश्यक है, तो बायपास का चयन करें।
  7. 20% Ti:Sa लेज़र आउटपुट और OPO लेज़र आउटपुट OPO बॉक्स के बाहर निकलने पर आवश्यक हैं, तो बायपास का चयन करें।
  8. Ti:Sa के शटर खोलें और ओपीओ इनपुट के लिए ती:सा बीम जारी करें।
  9. संकेत-आउट और पंप-आउटपर क्लिक करके ओपीओ निकास पर दो लेजर बीम रिलीज करें।
  10. दोनों लेज़रों ती:सा और OPO स्थिर कर रहे हैं जब तक रुको (लगभग 45-60 मिनट).
  11. दोनों Ti:Sa और OPO एक कागज डिटेक्टर कार्ड का उपयोग कर के लिए OPO बॉक्स के बाहर निकलने पर बीम स्थान सत्यापित करें और एक बिजली मीटर का उपयोग कर बिजली की जाँच करें.
  12. ट्यून ओपीओ लेजर तरंगदैर्ध्य को 1076 एनएम तक ट्यून करें।
  13. संरेखण प्रदर्शन करने के लिए प्रत्येक लेजर बीम के लिए $ 10 mW करने के लिए शक्ति को कम करें।

2. माइक्रोस्कोप की स्थापना

  1. उच्च आवृत्ति मॉडुलन स्थानांतरण विधि का कार्यान्वयन
    1. ति:सा बीम में प्रवेश करती है और किसी भी विरूपण के बिना बाहर निकालता है कि इस तरह न्यूनाधिक के ऑप्टिकल संरेखण प्रक्रिया बाहर ले।
    2. समारोह जनरेटर चालू करें और एक TTL संकेत उत्पन्न (आयाम के साथ वर्ग लहर - 5 ट, ऑफसेट $ 2.5 ट, आवृत्ति - 5 मेगाहर्ट्ज).
    3. टी जंक्शन का उपयोग करके टीएल सिग्नल को दो भागों में विभाजित करें; एक EOM के लिए और दूसरा लॉक-इन एम्पलीफायर (LIA) के लिए (चित्र 2देखें )।
    4. एक आस्टसीलस्कप के साथ सभी संकेत स्तर की जाँच करें.
    5. LIA चालू करें और जनरेटर आउटपुट चैनल LIA के संदर्भ चैनल से कनेक्ट करें।
    6. EOM के उच्च वोल्टेज शक्ति एम्पलीफायर के लिए जनरेटर उत्पादन चैनल कनेक्ट.
    7. एम्पलीफायर पर बारी और लगभग अधिकतम स्तर के लिए वोल्टेज सेट. EOM के बाहर निकलने पर बीम शक्ति की निगरानी करें।
  2. पीडी को ठीक करने और एक्स और वाई सापेक्ष गति असाइन करने के लिए यांत्रिक बढ़ते का एकीकरण
    नोट: माइक्रोस्कोप के साथ, एक बाहरी माउंट शुरू की है, एक micrometer कि एक्स और वाई दिशाओं में गति नियंत्रण है के साथ सुसज्जित है.
    1. ग तथा ल् दिशाओं के साथ गतिको अनुमुखता की अनुमति देने के लिए दो यात्रा अनुवाद अवस्थाएँ माउंट करें (चित्र 3देखें).
    2. उपयुक्त ऊँचाई के $1.5" पद पर अवस्था को ठीक करें.
    3. पीडी को किसी बाहरी पर्वत पर माउंट करें.
    4. पीडी पर बीम शक्ति को अधिकतम, पीडी पदों का समायोजन (एक्स और वाई निर्देशांक) माउंट करने के लिए संलग्न micrometers का उपयोग कर (चित्र 3देखें).

3. माइक्रोस्कोप के संरेखण

  1. बीम के स्थानिक ओवरलैप
    नोट: एक संदर्भ के रूप में OPO बीम को ध्यान में रखते हुए और एक स्थिति संवेदनशील डिटेक्टर का लाभ लेने, Ti:Sa निम्न प्रक्रिया के अनुसार OPO के लिए ओवरलैप किया जाना चाहिए:
    1. OPO और Ti:Sa लेजर बीम संरेखित करें ताकि वे दोनों माइक्रोस्कोप तक पहुँचने.
    2. लेजर बीम स्थिति सेंसर डिटेक्टरों के बीच में दो पदों में रखें dichroic दर्पण 1 और दर्पण 6, पहली स्थिति dichroic दर्पण के करीब स्थित है 1 और दूसरा एक दर्पण के करीब है 6. प्रत्येक स्थिति के लिए, ओपीओ बीम के x और y निर्देशांकों का पता लगाने के लिए सेंसरों का उपयोग करें (चित्र 1का अनुसरण करें)।
    3. सत्यापित करें कि x और y टीआई के निर्देशांक:Sa लेजर बीम सेंसर डिटेक्टरों के दोनों पदों में एक ही OPO हैं. यदि कुछ स्थितियों में ती:सा और ओपीओ के निर्देशांक मेल नहीं खाते हैं, तो अंतर की क्षतिपूर्ति करने के लिए सन्निकट दर्पण के झुकाव को टांकित करें (चित्र 1का अनुसरण करें)।
    4. M6-M7 के बीच में पथ के लिए OPO के संबंध में Ti:Sa बीम पदों संरेखित करने के लिए एक ही प्रक्रिया का पालन करें (चित्र 1का पालन करें)।
  2. बीम के अस्थायी तुल्यकालन
    1. तेजी से फोटोडिओड प्लस आस्टसीलस्कप का उपयोग करें:
      1. तिवारी के प्रचार बंद करो और OPO बीम के सामने एक तेजी से डिटेक्टर जगह (M6 और M7 के बीच में).
      2. चैनल 2 में एक आस्टसीलस्कप के साथ ती:सा लेजर बॉक्स द्वारा प्रदान की ट्रिगर संकेत कनेक्ट करें।
      3. चैनल 1 में आस्टसीलस्कप के साथ डिटेक्टर केबल कनेक्ट और OPO अस्थायी प्रोफ़ाइल कल्पना.
      4. अपने अधिकतम मान के लिए इसी आस्टसीलस्कप द्वारा मापा गया समय (abscissa) रिकॉर्ड, अर्थात् t1.
      5. ओपीपीओ बीम बंद करो और ती:सा बीम जारी.
      6. ती:सा लौकिक प्रोफ़ाइल कल्पना और समय (abscissa) अपने अधिकतम मूल्य, अर्थात् t2 के लिए इसी रिकॉर्ड.
      7. दो बीम अधिव्याप्त करने के लिए विलंब रेखा का उपयोग करते हुए T1-t2 के बीच के अंतर को कम करें। हमारे मामले में, न्यूनतम औसत दर्जे का अंतर 10 ps है.
      8. M6 और M7 के बीच में तेजी से डिटेक्टर निकालें.
    2. ऑटोकोरेलेटर का उपयोग:
      नोट: चित्र 1 में दर्शाए गए योजनाबद्ध आरेख में, बीमों के ऑप्टिकल पथों में हस्तक्षेप किए बिना एक ऑटोकोरेलेटर स्थापित किया जाता है। इसके अलावा, एक अतिरिक्त दर्पण पेश किया है और एक फ्लिप फ्लॉप माउंट पर घुड़सवार (के रूप में FFM/AM के रूप में संदर्भित) M6 और M7 के बीच में बीम autocorrelator में हटाने के लिए.
      1. बीम को ऑटोकोरेलेटर में निर्देशित करने के लिए AM को पलटें।
      2. तिवारी बंद करो:सा और OPO जारी करें.
      3. ऑटोकोरेलेटर की बीम दूरी समायोजन पेंच माइक्रोमीटर को सामान्य स्थिति (8.35 मिमी) पर सेट करें।
      4. ऑटोकोरेलेटर नियंत्रक पर शक्ति और इसे नियंत्रित करने वाले व्यक्तिगत कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग शुरू करते हैं.
      5. ऑटोकोरेलेटर में इनपुट मिरर के लिए FFM/AM से OPO बीम परियोजना.
      6. autocorrelator के संरेखण खिड़की पर बीम के प्रतिबिंब स्थान (कागज डिटेक्टर कार्ड का उपयोग करके) को नियंत्रित करें।
      7. कोई बीम या कम बीम तीव्रता के मामले में, इष्टतम सीमा तक FFM/AM की स्थिति और अभिविन्यास को समायोजित, और लेजर पल्स संकेत को अधिकतम करने के लिए इनपुट दर्पण (ऑटोकोरेलेटर पर घुड़सवार) को समायोजित करने का प्रयास करें। स्वत: सहकार संकेत चित्र 5कमें दर्शाए अनुसार प्राप्त किया जाता है।
      8. OPO और Ti:Sa बीम FFM/AM से autocorrelator में इनपुट दर्पण के लिए की परियोजना बंद करो. चरणों को दोहराएँ 3.2.2.6 और 3.2.2.7. स्वत: सहकार संकेत चित्र 5खमें दर्शाए अनुसार प्राप्त किया जाता है।
      9. बीम दूरी समायोजन पेंच micrometer क्रॉस स्थिति (7.30 मिमी) के लिए सेट करें.
      10. दोनों बीम रिलीज.
      11. दो बीम OPO और Ti:Sa ओवरलैप प्राप्त करने के लिए देरी लाइन स्कैन करें। क्रॉस-कॉरिलेटर संकेत चित्र 6में दर्शाए अनुसार प्राप्त किया जाता है।
      12. दर्पण FFM/AM फ्लिप इतना है कि बीम M7 तक पहुँच सकते हैं और माइक्रोस्कोप के सिर स्कैन.
  3. माइक्रोस्कोप संरेखण
    1. सफेद प्रकाश सूक्ष्म अवलोकन प्रदर्शन:
      नोट: सूक्ष्म अवलोकन से पहले, सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप ठीक से गठबंधन किया है.
      1. परीक्षण नमूना तैयार करें, जिसमें फॉस्फेट बफर समाधान होता है जिसमें 3 डिग्री मीटर के व्यास वाले पॉलीस्टाइरीन मोती बिखरे होते हैं। समाधान दो गिलास स्लाइड के एक सैंडविच के अंदर रखा गया है.
      2. माइक्रोस्कोप और सफेद प्रकाश की बिजली की आपूर्ति चालू करें. सफेद प्रकाश के तहत अवलोकन के लिए मैनुअल का पालन करें.
      3. नमूना रोशन करने के लिए एक कंडेनसर का उपयोग करें। प्रकाश इकट्ठा करने के लिए 60x के उद्देश्य का उपयोग करें। नमूने को मंच पर रखें। 60x माइक्रोस्कोप उद्देश्य के फोकल स्थिति का अनुकूलन।
      4. ब्याज की FOV का चयन करें. नमूने की एक सीसीडी छवि लें (चित्र 7)।
      5. सफेद प्रकाश की बिजली की आपूर्ति बंद कर देते हैं.
    2. Femtosecond लेजर बीम के साथ माइक्रोस्कोप संरेखण: OPO और तिवारी:Sa
      1. भागने बटन का उपयोग कर कंडेनसर निकालें अस्थायी रूप से 60x माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस वापस लेने के लिए। ऑप्टिकल पथ से 60x माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस ले जाएँ, nosepiece घूर्णन.
      2. बाह्य यांत्रिक माउंट का उपयोग करमाइक्रोस्कोप के ऊपरी भाग के लिए डिटेक्टर माउंट. आस्टसीलस्कप के लिए 50 के एक कम पास फिल्टर के माध्यम से डिटेक्टर उत्पादन कनेक्ट और ओपीओ संकेत की निगरानी.
      3. स्कैनर शीर्ष को नियंत्रित करने वाले प्रोसेसर को चालू करें. ओपीओ बीम को सूक्ष्मदर्शी के स्कैनर शीर्ष में प्रक्षेपित करें।
      4. माइक्रोस्कोप के अंदर बीम की स्थिति की जाँच करें, सुनिश्चित करें कि बीम का स्थान केंद्र में या केंद्र के पास है।
      5. जाँच करें कि पीडी के सिर के अंदर बीम की स्थिति केंद्र में है.
      6. एक्स-वाई अनुवादक का उपयोग करके डिटेक्टर द्वारा मापी गई शक्ति को अधिकतम करें।
      7. बीम को ओपीओ से टीआई:सा पर स्विच करें और सत्यापित करें कि टाइटेनियम-सफायर लेजर के लिए अधिकतम संकेत भी प्राप्त किया जाता है। THis इंगित करता है कि दोनों बीम अच्छी तरह से संरेखित हैं.
      8. बीम संरेखण को अंतिम रूप दें, 60x माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस को शुरू करने और नाक के टुकड़े को वापस घुमाएं।
      9. 60x माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस को अंतिम रूप से ध्यान केंद्रित हासिल करने के लिए माइक्रोस्कोप पर refocus बटन का प्रयोग करें.
      10. नमूना को छूने या परेशान किए बिना संघनित्र के स्थान पर आवर्धन 40x के साथ उद्देश्य रखें।
  4. बीम के स्थानिक और लौकिक तुल्यकालन का अनुकूलन
    1. अस्थायी तुल्यकालन
      1. दोनों बीम के लिए 30 mW करने के लिए माइक्रोस्कोप से पहले मापा ती:सा और ओपीओ की शक्ति सेट करें। पिछले एक के संबंध में एक अलग मूल्य के लिए OPO की तरंगदैर्ध्य सेट इतना है कि पंप और जांच मोती के कंपन आवृत्ति के साथ गूंज में नहीं हैं.
      2. दोनों बीम रिलीज (Ti:Sa और OPO) इतना है कि वे माइक्रोस्कोप में प्रवेश.
      3. स्कैनिंग विलंब लाइन कम्प्यूटरीकृत अनुवादक चलाने के लिए और देरी लाइन के प्रत्येक स्थिति के लिए LIA द्वारा मापा तीव्रता रिकॉर्ड. विलंब लाइन स्कैनिंग पूर्ण होने तक प्रतीक्षा करें. प्राप् त अस् थानीय परिच्छेद चित्र 8कमें विरूपित है।
      4. 1076 एनएम के लिए ओपीओ की तरंगदैर्ध्य फिर से सेट करें ताकि पंप और जांच मोती की कंपन आवृत्ति के साथ गूंज में हैं। 3.4.1.3 (प्राप्त लौकिक परिच्छेदिका चित्र 8बमें कल्पना की गई है )।
      5. एसआरएस छवियों को प्राप्त करने के लिए देरी लाइन में प्राप्त ओवरलैप बीम स्थिति सेट करें।
    2. बीम के स्थानिक तुल्यकालन
      नोट: संचरण छवियों FOV, रोशनी, और माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के फोकल स्थिति का अनुकूलन करने के लिए उपयोगी होते हैं, और अगर दो बीम स्थानिक ओवरलैप कर रहे हैं की जाँच करने के लिए।
      1. ओपीओ का ट्रांसमिशन छवि अधिग्रहण
        1. ती:सा बीम बंद करो और 8 mW करने के लिए OPO शक्ति को कम.
        2. डेटा अधिग्रहण कार्ड के लिए डिटेक्टर readout कनेक्ट करें.
        3. माइक्रोस्कोप स्कैनिंग कंसोल के साथ डेटा अधिग्रहण कार्यक्रम चलाएँ।
        4. फ़ाइल सहेजें और छवि प्राप्त करने के लिए डेटा संसाधित करें. कच्ची छवि चित्र 9कमें दर्शाए अनुसार दिखाई देती है.
      2. तिवारी के संचरण छवि अधिग्रहण:Sa
        1. OPO बीम बंद करो और ti:Sa शक्ति को कम करने के लिए 2.5-4.5 mW.
        2. डेटा प्राप्ति कार्ड के साथ LIA और LIA readouts के साथ डिटेक्टर कनेक्ट करें।
        3. चरणों को दोहराएँ 3.4.2.1.3 और 3.4.2.1.4. कच्चा प्रतिबिंब चित्र 9खमें दर्शाए अनुसार दिखाई देता है।

4. एसआरएस छवि अधिग्रहण

नोट: डेटा संग्रहीत करने के लिए एक समर्पित एल्गोरिथ्म महसूस किया गया है। यह निम्नलिखित छवि प्रारूपों का समर्थन करता है: 512 px x 512 पिक्स और 256 पिक्सx x 256 पिक्स, 16 s, 8 s, 4 s, और 2 s के अधिग्रहण के समय के साथ।

  1. पंप दालों (Ti:Sa) को हटाने और केवल Stokes संकेत (OPO) प्राप्त करने के लिए 40x उद्देश्य और पीडी के बीच में फिल्टर का एक ढेर परिचय.
  2. 8 mW की एक केंद्रित शक्ति के साथ 810 एनएम के लिए पंप संकेत सेट और 8 mW की एक केंद्रित शक्ति के साथ 1076 एनएम के लिए जांच संकेत polystyrene के एक ठेठ सी-एच बांड की जांच करने के लिए (रमन शिफ्ट 3054 सेमी$1)।
  3. डेटा प्राप्ति कार्ड के लिए LIA और LIA readout के साथ डिटेक्टर कनेक्ट करें।
  4. आवश्यकता के अनुसार छवि प्राप्ति पिक्सेल फ़ॉर्मेट सेट करें और प्राप्ति समय सेट करें.
  5. माइक्रोस्कोप नियंत्रक को नियंत्रित करता है कि प्रोग्राम चलाएँ.
  6. माइक्रोस्कोप नियंत्रक, डिटेक्शन सिस्टम, और DAQ के बीच तुल्यकालन के रूप में कार्य करता है जो समर्पित एल्गोरिथ्म प्रोग्राम चलाएँ (चित्र 4देखें).।
  7. प्राप्ति पूर्ण होने के बाद मैट्रिक्स फ़ाइल सहेजें।
  8. अपरिष्कृत डेटा फ़ाइल आयात करें और छवि J software का उपयोग करके छवि को आवश्यक स्वरूप (आमतौर पर .tif स्वरूप में सहेजा गया) में सहेजें. प्रतिबिंब चित्र 10में दिखाया गया है।

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Representative Results

एसआरएस मापन का एक उदाहरण (अर्थात नमूने के एक ही बिंदु में एसआरएस मापन) चित्र 7में बताया गया है। जब बीम समय या स्थान में अधिलापित नहीं होते हैं, तो प्राप् त परिणाम चित्र 8कमें सूचित किया जाता है। ऑफ-अनुनाद में, LIA द्वारा मापा संकेत का आयाम शून्य है, जबकि LIA द्वारा मापा संकेत के चरण नकारात्मक और सकारात्मक मूल्यों के बीच कूदता है. जबकि, जबकि जब बीम अंतरिक्ष में अधिलापित होते हैं, तो विलंब रेखा को एक उपयुक्त श्रेणी में ले जाते हैं, प्राप्त परिणामों को चित्र 8खमें सूचित किया जाता है। LIA द्वारा मापा संकेत बढ़ जाती है और अपनी अधिकतम तक पहुँच जाता है जब बीम पूरी तरह से समय में ओवरलैप कर रहे हैं, जबकि चरण समय जिस पर बीम समय में ओवरलैप कर रहे हैं के दौरान एक निश्चित मूल्य प्राप्त करने के लिए शुरू होता है.

एक ही polystyrene मोती के एक एकल बीम (Ti:Sa या OPO) का उपयोग कर प्राप्त अवशोषण छवियों चित्र 9a, 6 m के पैमाने सलाखों के साथ खत9a में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. एसआरएस छवियों को प्राप्त करने के लिए, विलंब रेखा चित्र 7खमें प्राप्त स्थिति पर सेट की गई है, एक विशिष्ट SRG छवि चित्र 10 में 6 डिग्री उ के स्केल बार के साथ दिखाई गई है।

Figure 1
चित्र 1: एफ-एसआरएस माइक्रोस्कोप सिस्टम का योजनाबद्ध लेआउट। ओपीओ - ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला; ती:सा ] टाइटेनियम-सफायर लेजर; M1-M7] femtosecond ब्रॉडबैंड दर्पण; FFM/AM ] फ्लिप फ्लॉप मिरर / ऑटोकोरेलेटर मिरर;  DM1, DM2 ] dichroic दर्पण; डीएल - देरी लाइन; एसी ] ऑटोकोरेलेटर ; ईओएम - इलेक्ट्रो-ऑप्टिक न्यूनाधिक; FG - समारोह जनरेटर; जीएम - Galvo दर्पण; ओबज1, ओबज2 ] सूक्ष्मदर्शी उद्देश्य; पीडी - फोटो डिओड; DAQ [ डेटा अधिग्रहण प्रणाली; पीसी - व्यक्तिगत कंप्यूटर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: उच्च आवृत्ति मॉडुलन स्थानांतरण विधि की योजना। इनसेट आंकड़ा में, जांच और नमूने के अंदर पंप की बातचीत के कारण नमूना और संशोधित जांच के अंदर बातचीत से पहले दो लेज़रों बीम प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. समय एन एस में प्रतिनिधित्व किया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: यांत्रिक बढ़ते प्रणाली के साथ photodiode माउंट का प्रतिनिधित्व. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: डेटा अधिग्रहण प्रणाली के Schematic| पीडी - photodiode, LIA - लॉक में एम्पलीफायर, डी एस - पता लगाने प्रणाली, एम सी जेड माइक्रोस्कोप नियंत्रण, DAQ] डेटा अधिग्रहण प्रणाली, पीसी - व्यक्तिगत कंप्यूटर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: ओपीओ (क) और ती:एसए (इ) का स्वत: सहकारफलफल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: OPO और Ti:Sa के क्रॉस सहसंबंध समारोह. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 7: polystyrene मोती की सीसीडी छवि.

Figure 7
चित्रा 8: एम्पलीशन और एसआरएस संकेत के चरण लॉक-इन एम्पलीफायर द्वारा मापा: अनुनाद बंद (बाएं पर) और अनुनाद में (दाएं) . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: ओपीओ (क) और ती:सा (ख) द्वारा प्राप्त पॉलीस्टाइरीन मोतियों की पारेषण छवियां। स्केल बार ] 16 $m. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्र 10: polystyrene मोती के एसआरएस छवि. स्केल बार ] 12 डिग्री मी.

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Discussion

एसआरएस माइक्रोस्कोपी ने लेबल-मुक्त इमेजिंग को नई ऊंचाइयों पर ले लिया है, विशेष रूप से लिपिड जैसे जटिल जैविक संरचनाओं के अध्ययन में, जो कोशिकाओं और सेलुलर वास्तुकला के लिए मौलिक हैं। लिपिड कई शारीरिक रास्ते जैसे जैविक झिल्ली के उत्पादन में शामिल होते हैं, और वे जैव संश्लेषी अग्रदूतों और सिग्नल ट्रांसड्यूसर10के रूप में काम करते हैं। लिपिड को विशेष इंट्रासेल्यूलर ऑर्गेनेल्स में पैक किया जाता है, जिसे लिपिड बूंदें (एलडी) भी कहा जाता है। उनके व्यास कुछ दसियों नैनोमीटरसे लेकर माइक्रोमीटर11,12तक भिन्न होते हैं . LDs न केवल वसा में बहुतायत से भाग लेते हैं- और स्टेरॉयड उत्पादक कोशिकाओं लेकिन यह भी अन्य सेल लाइनों में मौजूद हैं. एलडी लिपिड भंडारण जैसे कई शारीरिक प्रक्रियाओं में सहयोग करते हैं। वे आम रोगों में प्रमुखता से चित्रित कर रहे हैं (जैसे, बदल कोलेस्ट्रॉल चयापचय)13,14.

परंपरागत रूप से, लिपिड का दृश्य फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और तटस्थ लिपिड-विशिष्ट डाई-लेबल स्थिर कोशिकाओं10का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि चूंकि लिपिड प्रोटीन और डीएनए की तुलना में छोटे आकार के होते हैं , इसलिए फ्लोरोफोर्स15,16को जोड़ते समय संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन और अवांछित कलाकृतियां हो सकती हैं . एसआरएस लिपिड समृद्ध संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली होना दिखाया गया है. लिपिड सी-एच2 समूहों में प्रचुर मात्रा में होते हैं। इसलिए, उनके रमन स्पेक्ट्रम में 2845 सेमी-1 पर सी-एच बांड कंपन राज्यों के साथ जुड़े अपेक्षाकृत अलग चोटियों एक सेल के अंदर लिपिड के लिए एक अद्वितीय हस्ताक्षर प्रदान करते हैं। दुर्भाग्य से, के बाद से विभिन्न कंपन हस्ताक्षर सीमित हैं, यह बल्कि कोशिकाओं है कि इसी तरह के रासायनिक बांड का हिस्सा अंदर अन्य संबंधित प्रजातियों से एक लक्ष्य जैव अणु भेद मुश्किल है. हालांकि, छोटे जैव अणुओं की इमेजिंग के लिए विशिष्टता प्राप्त करने के लिए छोटे रमन-सक्रिय कंपन जांच (उदाहरणके लिए, ऐल्किनेऔर स्थिर आइसोटोप) जोड़ना संभव है।

जीवाणू अनुप्रयोगों में जैविक और जैव चिकित्सा के लिए, किसी दिए गए नमूने में विभिन्न रासायनिक प्रजातियों का एक साथ मानचित्रण जैव अणुओं के युग्मों के बीच सह-वितरण और गतिशील सहसंबंध ों का निवेश करने के लिए आवश्यक है18,19. इसलिए, कई रासायनिक विरोधाभासों को प्राप्त करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं। बहुरंगा इमेजिंग के सरलतम विकल्प में, एक नमूने के विभिन्न रमन मोड छवि के लिए, पंप बीम या स्टोक्स बीम की आवृत्ति अनुक्रमिक स्कैन18में देखते हैं। हालांकि, तरंगदैर्ध्य ट्यूनिंग दृष्टिकोण का उपयोग कर विभिन्न रमन मोड के सह स्थानीयकरण जानकारी के नुकसान का कारण हो सकता है, खासकर जब नमूना एक गतिशील वातावरण में है18.

गैर रेखीय उत्तेजना का एक परिणाम के रूप में, एसआरएस जैविक नमूनों के भीतर चयनित रासायनिक बंधन की आंतरिक 3 डी समाधान क्षमताओं प्रदान करता है20. चयनित रासायनिक बंधन और इसके स्थानिक वितरण की मात्रा पुनर्निर्माण बस z-अक्ष के साथ विभिन्न फोकल विमान में एसआरएस छवियों को इकट्ठा करके प्राप्त किया जा सकता है। चूंकि छवियों उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ प्राप्त कर रहे हैं, जैविक नमूना के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी (यानी, 3 डी संरचना, रासायनिक संरचना, आदि) के अन्य टुकड़े प्राप्त किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम अपने मूल्यवान तकनीकी सहायता और Giacomo Cozzi, Nikon उपकरण से उत्पाद विशेषज्ञ, उपयोगी विचार विमर्श और निरंतर समर्थन के लिए के लिए आई एम एम सीएनआर से वी Tufano की सराहना करते हैं. यह काम आंशिक रूप से इतालवी राष्ट्रीय ऑपरेटिव कार्यक्रम PONa3 00025 (BIOforIU) और यूरो द्वारा बड़े पैमाने पर panEuropean अनुसंधान बुनियादी ढांचा परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acquisation tool Nikon Nikon C2Tool Acquisation supported tool
APE Pulse link control software APE- APE Pulse link control software software control
Autocorrelator APE APE PulseCheck USB 50 Autocorrelator
Detector Thorlabs Thorlabs DET10A Photodiode
Detector card Thorlabs Thorlabs VRC IR detector Card
Dichroic mirror Semrock Semrock FF875-Di01-25X36 Dichroic mirror
Dichroic mirror Semrock FF875-Di01-25x36 Dichroic mirror
EOM Conoptics (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). Pockels cell
Fast detector Thorlabs Thorlabs DET025AL/M Photodiode
Fast mirror scanning unit Nikon C2 Microscpe scanning head
Femtosecond laser Ti:SA Coherent Coherent Chameleon Ultra II Chameleon Ultra II
Function generator TTi TG5011 AIM – TTi Function generator
Inverted optical microscope Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon
Lock-in Amplifier Standford Research System SR844-200 MHz dual phase A lock-in amplifier from Stanford Research Systems
Notch filter, Semrock NF03-808E-25 Notch filter
Optical delay line Newport Newport M-ILS200CC Tunable optical delay line
Optical Parametric Oscillator Coherent Coherent Compact OPO Coherent Compact OPO
Oscilloscope WaveRunner 640Zi 4GHz OSC/LeCroy Digital Oscilloscope
PCI Card National instrument NI PCIe 6363 Data acquisation card
Position Sensors Detectors Newport Newport Conex PSD9 Position detector sensor
Power meter head Coherent PowerMax PM10, Laser power detector
Translation Stages Thorlabs Thorlabs PT1/M Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer

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References

  1. Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  2. Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
  3. Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
  4. Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
  5. Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
  6. D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
  7. D'Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
  8. Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
  9. Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
  10. Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
  11. Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
  12. Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
  13. Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
  14. Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
  15. Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
  16. Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
  17. Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
  18. Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
  19. Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
  20. Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
  21. Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).

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Ranjan, R., Indolfi, M., Ferrara, M. A., Sirleto, L. Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering. J. Vis. Exp. (149), e59614, doi:10.3791/59614 (2019).

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