Summary
I detta manuskript beskrivs implementeringen av en stimulerad Raman spridning (SRS) Mikroskop, som erhållits genom integration av en SRS experimentell uppsättning med ett Laser scanning Mikroskop. SRS-mikroskopet är baserat på två femtosecondlaser (FS) laserkällor, en TI-Sapphire (TI: sa) och synkroniserad optisk parametrisk oscillator (OPO).
Abstract
Stimulerad Raman spridning (SRS) mikroskopi använder nästan infraröd excitation ljus; Därför, det delar många multi-Photon mikroskopiska Imaging egenskaper. SRS Imaging modalitet kan erhållas med kommersiella laserscanning Mikroskop genom att utrusta med en icke-avskurna framåt detektor med rätt bandpass filter och lock-in förstärkare (Lia) detekterings schema. En Schematisk layout av ett typiskt SRS Mikroskop omfattar följande: två pulsade laserstrålar, (dvs. pumpen och sonden riktad i ett scanning Mikroskop), som måste överlappas i både tid och rum på bildplanet, sedan fokuserat med ett Mikroskop mål i provet genom två scanning speglar (SMs), som raster brännpunkten över ett x-y-plan. Efter interaktion med provet samlas överförda utflödes pulser upp av ett övre mål och mäts med ett framåtdetekterings system insatt i ett inverterat Mikroskop. Pump pulser avlägsnas med en bunt optiska filter, medan sonden pulser som är resultatet av SRS-processen som inträffar i brännvidden av preparatet mäts med en fotodiod (PD). Den avläsning av PD är demodulerade av Lia att extrahera moduleringsdjupet. En tvådimensionell (2D) bild erhålls genom att synkronisera den främre detekterings enheten med Mikroskop skannings enheten. I det här dokumentet beskrivs och demonstreras implementeringen av ett SRS-Mikroskop, liksom rapporteringen av etikettfria bilder av polystyren-pärlor med en diameter på 3 μm. Det är värt att notera att SRS Mikroskop inte är kommersiellt tillgängliga, så för att kunna dra nytta av dessa egenskaper, är den hemgjorda konstruktionen det enda alternativet. Eftersom SRS mikroskopi blir populär på många områden, man tror att denna noggranna Beskrivning av SRS Mikroskop genomförandet kan vara mycket användbart för det vetenskapliga samfundet.
Introduction
I Life Science-tillämpningar har SRS mikroskopi vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för etikettfri avbildning. Den grundläggande idén om SRS mikroskopi är att kombinera styrkan i vibrations kontrast och dess förmåga att förvärva bilder på några sekunder.
SRS är en process där frekvens skillnaden mellan två laserstrålar frekvenser (pump signal och Stokes signal vid olika frekvenser) matchar molekylära vibrationer i ett undersökt prov, orsakar stimulerad Raman spridning och en betydande ökning av Stokes-signalen. Till skillnad från linjär Raman-spektroskopi uppvisar SRS ett ickelinjär beroende av de inkommande ljus fälten och producerar sammanhängande strålning. SRS har två grundläggande fördelar: 1) hastighet, vilket gör bilder mindre känsliga för artefakter som härrör från provet rörelse eller nedbrytning, och 2) en utmärkt signal-brus-förhållande (SNR). Dessutom uppvisar SRS ett spektrum som är identisk med den spontana Raman, och SRS signalen är linjärt proportionell mot koncentrationen av den kemiska Bond upphetsad1,2,3,4, 5.
I vårt Mikroskop, en femtosecondlaser (FS) SRS experimentella set-up är integrerat med ett inverterat optiskt mikroskop utrustad med en snabb speglar skanning enhet (figur 1)6,7,8. Två pulsade laserkällor används för att implementera detta Mikroskop. Den första är en FS-TI: sa med en puls varaktighet på cirka 140 FS, repetitionshastighet på 80 MHz, och emissions våglängder i intervallet 680-1080 nm. Den andra, som används som sond balk och pumpas av TI: sa, är en femtosecondlaser synkroniserad optisk parametriska oscillator (SOPO), med en puls varaktighet på cirka 200 FS, repetitionshastighet på 80 MHz, och utsläpp våglängder i intervallet 1000-1600 nm. Det bör noteras att minsta fotons energi skillnad mellan TI: sa och SOPO beam är 2500 cm-1. Därför, med hjälp av denna kombination av lasersystem, endast den höga frekvensen C-H-regionen (2800-3200 cm-1) av Raman spectra kan utforskas6,7,8.
För att inrätta ett SRS-Mikroskop finns det tre viktiga frågor att beakta, vilka beskrivs i de efterföljande styckena. Den första är genomförandet av en hög frekvensmodulering överföringsmetod (se figur 2 och steg 2,1 i protokollet för en beskrivning). I en SRS experimentell undersökning, är en avgörande parameter känsligheten i systemet. En SRS signal detekteras som en liten förändring i intensiteten av excitation balkar; Därför kan det skadas av laser intensitet buller och skott buller. Denna fråga kan lösas genom att integrera detta system med en hög frekvensmodulering överföringsmetod (se figur 2 och steg 2,1 i protokollet för mer information). I denna metod används en elektrooptisk modulator (EOM) för att modulera pumpen. Den modulering som överförs till sond strålen kan sedan detekteras av en PD efter att ha blockerat pump strålen med en bunt optiska filter [stimulerad Raman Gain (SRG) detektions läge]. PD-utgången ansluts med ett lågpassfilter till en lock-in-förstärkare (LIA), som demodulerar den uppmätta signalen. Genom att öka strålens modulerings frekvens till frekvenser över 1 MHz kan den inneboende gränsen för PDs erhållas.
Den andra frågan att ta hänsyn till är installationen av ett mekaniskt fäste som medger att man utför framåtriktad detektering och samtidigt bevarar Mikroskop observation i brightfield. Dessutom måste det minska bullret på grund av mekaniska vibrationer under generering av bilder och för att möjliggöra exakt omplacering av detekterings systemet (se figur 3 och steg 2,2 i protokollet).
Den tredje är synkroniseringen av den signal som förvärvas av fas-känsligt detektions schema, med strålen placerad på provet övervakas av Scan huvudet av mikroskopet. För att förverkliga bilder kräver SMs tre TTL-signaler som görs tillgängliga av Mikroskop styrenheten ansluten till Scan Head enhet: Pixel Clock, Line Sync och Frame Sync. Synkroniseringen uppnås genom att kontrollera med hjälp av ett PCI-kort, de tre TTL-signalerna, och förvärvet av en spänningssignal på utgångskanalen av Lia6,7,8. En hemlagad programvara har utvecklats och beskrivits tidigare6,7,8, medan hårdvaran i synkroniseringssystemet rapporteras i figur 4.
En grundläggande procedur vid utförandet av SRS Imaging är Mikroskop justering. Det realiseras under loppet av fyra steg, som beskrivs i de efterföljande styckena. Den första är den rumsliga överlappningen av två balkar (se steg 3,1 i protokollet). I denna experimentella uppsättning, de två balkar var rumsligt collinearly kombineras med en Dichroic spegel. Det preliminära steget är anpassningen av OPO och TI: sa så att varje når mikroskopet. Sedan, med tanke på OPO som referens balk och dra nytta av en position känslig detektor, TI: sa är rumsligt överlappade till OPO.
Den andra avgörande aspekten är den temporala överlappningen av två balkar (se steg 3,2 i protokollet). Även om pumpen och OPO balkar är perfekt synkroniserade9, eftersom de följer något olika balk stigar inne i OPO bostäder, vid OPO Exit de har en tidsfördröjning på ca 5 ns och rumslig skillnad på 5 cm. Därför, TI: sa och OPO kräver att tidsinställda optiskt för att säkerställa temporala överlappning på provet. Detta är vanligtvis åstadkommas med en fint avstämbara optisk fördröjning linje, som i detta fall infogas mellan TI: sa och Mikroskop (se figur 1). För att erhålla den temporal överlappningen av två strålar, används två tekniker. Den första utförs med hjälp av en snabb PD och oscilloskop, medan den andra är baserad på Auto-och Cross-optiska korrelationer. Med den första tekniken erhålls en grov överlappning av två balkar (osäkerhet på 10 PS), medan en exakt temporala överlappning av två balkar erhålls med hjälp av en cross-correlator (upplösning av 1 FS).
Den tredje avgörande aspekten är anpassningen av de två strålarna inuti mikroskopet (se steg 3,3 i protokollet). Ett preliminärt vitt ljus observation av provet gör det möjligt att individuera önskat synfält (FOV). Efteråt, laserstrålar, in i mikroskopet med en sido port av Mikroskop, är inriktade för att nå PD monterad på den övre delen (figur 3). För en korrekt Bildinsamling krävs dock att ange ett antal parametrar (till exempel pixel dimension och pixel Dwell Time). Provtagningsfrekvensen måste respektera den begränsning som införts av Nyquists sats för att bevara all information i en bild, medan för en korrekt korrespondens mellan de rumsliga koordinaterna för pixlar och SRS-värde mätt i varje pixel, integrationstiden av LIA bör vara lika med eller jämförbar med pixel Dwell-tiden.
I det sista steget av Mikroskop anpassningen, många tester utförs för att optimera den rumsliga och tidsmässiga anpassningen (se steg 3,4 i protokollet). Ett antal transmissions bilder (TI) för både TI: sa och OPO förvärvas för att optimera rumslig överlappning. I en TI används en enda stråle och den överförda strålens intensitet från provet mäts med en PD. När det gäller TI realiseras av OPO, PD utsignalen är direkt ansluten till PCI-kort, medan det i fallet med TI realiseras av TI: sa, är PD utsignalen ansluten till LIA och analog utgång av LIA är ansluten till PCI-kort. Överföringen bilder är mycket användbara för att optimera FOV, belysningen, fokuspositionen för Mikroskop mål och att kontrollera om de två balkar är rumsligt överlappade6,7,8.
Optimeringen av pumpen och sond strålens temporala överlappning erhålls genom att skanna fördröjningen linje med steg om 0,001 mm som motsvarar en 3,3 FS tidsförskjutning och utföra en SRS mätning i en enda punkt i en polystyren pärla prov 3 μm i diameter. Amplituden av en SRS signal mäter värden från Lia, som en funktion av sonden-pump fördröjning, och ger en maximal motsvarande med exakt temporala överlappning av de två balkar6,7,8. Innan du avslutar bör det noteras att alla diskuterade steg är obligatoriska för att få en bild av hög kvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Starta Lasersystemet
- Kontrollera om temperaturen på kylaggregat bibehålls vid eller under 20 ° c.
- Kontrollera om fuktkontroll enheten fungerar korrekt och luftfuktigheten bibehålls till ett värde runt 40%.
- Slå på TI: sa laser, strikt följa instruktionerna i manualen.
- Ställ in våglängden till 810 nm.
- Slå på OPO och den anslutna minidatorn. Kör programmet som styr OPO-lasern.
- Välj bypass om 100% av TI: sa-laserutdata krävs vid utloppet från OPO-boxen.
- Avmarkera bypass om 20% av TI: sa-laserutdata och OPO-laserutdata krävs vid utloppet från OPO-boxen.
- Öppna avtryckaren på TI: sa och släpp TI: sa beam till OPO input.
- Släpp de två laserstrålar vid OPO Exit genom att klicka på signal-out och pump-out.
- Vänta tills båda lasrar TI: sa och OPO stabiliseras (ca 45 – 60 min).
- Kontrollera Strålpunkten vid utloppet från OPO box för både TI: sa och OPO med hjälp av ett papper detektor kort och kontrollera strömmen med hjälp av en kraftmätare.
- Trimma OPO laser våglängd till 1076 nm.
- Minska kraften till ~ 10 mW för varje laserstråle för att utföra justeringen.
2. ställa in mikroskopet
-
Implementering av hög frekvensmodulering överföringsmetod
- Utför den optiska justerings proceduren för modulatorn så att TI: sa-strålen går in och ut utan distorsion.
- Slå på funktions generatorn och generera en TTL-signal (kvadratvåg med amplitud = 5 V, offset = 2,5 V, frekvens = 5 MHz).
- Dela upp TTL-signalen i två delar med en T-korsning; en för EOM och den andra för lock-in-förstärkaren (LIA) (se figur 2).
- Kontrollera alla signalnivåer med ett oscilloskop.
- Slå på LIA och Anslut generatorn utgångskanal till referens kanalen för LIA.
- Anslut generatorns utgångskanal till högspännings förstärkaren på EOM.
- Slå på förstärkaren och ställa in spänningen till nästan den maximala nivån. Övervaka strålen strömmen vid utloppet av EOM.
-
Integration av mekanisk montering för att fixera PD och tilldela x och y relativ rörelse
Obs: med mikroskopet introduceras en extern montering, utrustad med en mikrometer som har rörelsekontroll i x-och y-riktningar.- Montera två rese översättningssteg för att tillåta rörelser längs x-och y-riktningarna (se figur 3).
- Fixera scenen på en Ø 1,5 "stolpe med lämplig höjd.
- Montera PD-värdet på en extern montering.
- Maximera ljusstyrkan vid PD, justera PD-positionerna (x-och y-koordinater) med hjälp av mikrometrarna fästa på fästet (se figur 3).
3. anpassning av Mikroskop
- Rumslig överlappning av balkar
Anmärkning: med tanke på OPO beam som referens och dra nytta av en positions känslig detektor, bör TI: sa överlappas till OPO enligt följande procedur:- Justera OPO och TI: sa laserstrålar så att de båda når mikroskopet.
- Placera laserstrålen position sensorer detektorer i två lägen mellan Dichroic Mirror 1 och Mirror 6, är den första positionen ligger nära Dichroic Mirror 1 och den andra är nära att spegla 6. För varje position, Använd sensorerna för att detektera x-och y-koordinaterna för OPO beam (Följ figur 1).
- Kontrollera att x-och y-koordinaterna för TI: sa-laserstrålen är samma OPO i båda positionerna för sensordetektorerna. Om i vissa lägen koordinaterna för TI: sa och OPO inte sammanfaller, Justera lutningen på den intilliggande spegeln för att kompensera skillnaden (Följ figur 1).
- Följ samma procedur för att justera TI: sa beam positioner med avseende på OPO för vägen mellan M6-M7 (Följ figur 1).
- Tidsmässig synkronisering av balkar
- Användning av fast fotodiod plus oscilloskop:
- Stoppa spridningen av TI: sa och OPO balkar och placera en snabb detektor framför OPO beam (mellan M6 och M7).
- Anslut den utlösande signalen som tillhandahålls av TI: sa-laserboxen med ett oscilloskop i kanal 2.
- Anslut detektor kabeln med oscilloskopet i kanal 1 och visualisera den tidsmässiga profilen OPO.
- Anteckna tiden (Abscissa) mätt med oscilloskopet som motsvarar dess maximivärde, nämligen T1.
- Stoppa OPO beam och släpp TI: sa beam.
- Visualisera TI: sa temporal profil och registrera tiden (Abscissa) som motsvarar dess högsta värde, nämligen T2.
- Minimera skillnaden mellan T1-T2 med hjälp av fördröjnings linjen för att överlappa de två strålarna. I vårt fall är den minsta mätbara skillnaden 10 PS.
- Ta bort den snabba detektorn mellan M6 och M7.
- Användning av autocorrelator:
Anmärkning: i det schematiska diagrammet som visas i figur 1, en autocorrelator installeras utan att störa optiska banor av balkar. Dessutom införs en extra spegel och monteras på en flip-flop Mount (kallad FFM/AM) mellan M6 och M7 för att vidarekoppla strålen till autocorrelator.- Vänd på AM att rikta strålen i autocorrelator.
- Stoppa TI: sa och släpp OPO.
- Ställ in justeringsskruven för beam-distansen på autokorrelatorn till normal läge (8,35 mm).
- Slå på autocorrelatorstyrenheten och starta programmet på den persondator som styr den.
- Projektet OPO beam från FFM/AM till ingången spegeln i autocorrelator.
- Kontrollera reflektions punkten (med hjälp av ett pappers detektor kort) på balken i justeringsfönstret på autocorrelatorn.
- I fråga om No-beam eller låg-beam intensitet, justera position och orientering av FFM/AM i optimal utsträckning, och försöka justera input Mirror (monterad på autocorrelator) för att maximera laserpuls signalen. Autokorrelatorsignalen erhålls på det sätt som visas i figur 5a.
- Stoppa OPO och projekt av TI: sa beam från FFM/AM för att mata in spegeln i autocorrelator. Upprepa steg 3.2.2.6 och 3.2.2.7. Autokorrelatorsignalen erhålls på det sätt som visas i Figur 5b.
- Ställ in justeringsskruven för beam-avstånd för att korsa positionen (7,30 mm).
- Lossa båda strålarna.
- Skanna förseningen linje för att få de två balkar OPO och TI: sa överlappade. Korrelatatorsignalen erhålls enligt figur 6.
- Vänd spegeln FFM/AM så att balkarna kan nå M7 och skanna huvudet av mikroskopet.
- Användning av fast fotodiod plus oscilloskop:
- Mikroskop justering
- Utför vitt ljus mikroskopisk observation:
Anmärkning: innan mikroskopisk observation, se till att mikroskopet är korrekt justerad.- Bered provet, som består av en fosfatbuffertlösning där polystyren-pärlor med en diameter på 3 μm sprids. Lösningen är placerad i en smörgås av två glas rutschbanor.
- Slå på mikroskopet och strömtillförseln av vitt ljus. Följ bruksanvisningen för observation under vitt ljus.
- Använd en kondensator för att belysa provet. Använd målet 60x för att samla in ljus. Placera provet på scenen. Optimera fokuspositionen för 60x Mikroskop mål.
- Välj den FOV av intresse. Ta en CCD-bild av provet (figur 7).
- Stäng av strömtillförseln till vitt ljus.
-
Mikroskop justering med femtosecondlaser laserstrålar: OPO och TI: sa
- Ta bort kondensorn genom att använda Escape -knappen för att tillfälligt dra in 60x objektiv med Mikroskop objektiv. Flytta 60x mikroskopet objektiv från den optiska vägen, rotera nosepiece.
- Montera detektorn på den övre delen av mikroskopet med hjälp av det externa mekaniska fästet. Anslut detektor utgången genom ett lågpassfilter på 50 Ω till oscilloskop och övervaka OPO-signalen.
- Slå på processorn som styr skanner huvudet. Projicera OPO beam i skanner huvudet på mikroskopet.
- Kontrollera placeringen av balken inuti mikroskopet, se till att placeringen av balken är i centrum eller nära centrum.
- Kontrollera att placeringen av balken inne i huvudet på PD är i centrum.
- Maximera den effekt som mäts av detektorn med hjälp av en x-y översättare.
- Växla strålen från OPO till TI: sa och kontrollera att en maximal signal också erhålls för Titan-Sapphire lasern. Detta indikerar att båda strålarna är välanpassade.
- Slutföra strålen anpassningen, införa 60x Mikroskop objektiv objektivet och rotera tillbaka nosepiece.
- Använd omfokuserings knappen på mikroskopet för att återfå det slutförda fokuset på objektivet 60x Mikroskop objektiv.
- Placera målet med förstoring 40x i stället för kondensorn utan att röra eller störa provet.
- Utför vitt ljus mikroskopisk observation:
- Optimering av rumsliga och temporala synkroniseringar av balkar
- Temporala synkroniseringen
- Ställ in kraften i TI: sa och OPO mätt före mikroskopet till 30 mW för båda strålarna. Ställ våglängden av OPO till ett annat värde med avseende på den tidigare så att pumpen och sonden inte är i resonans med vibrationsfrekvens av pärlorna.
- Släpp båda strålarna (TI: sa och OPO) så att de går in i mikroskopet.
- Kör skanning fördröjning linje datoriserad översättare och registrera den uppmätta intensiteten av LIA för varje position av förseningen linjen. Vänta tills avläsningen av fördröjnings linjen är slutförd. Den erhållna temporala profilen visualiseras i figur 8a.
- Ställ våglängden av OPO till 1076 nm igen så att pumpen och sonden är i resonans med vibrationsfrekvens av pärlorna. Upprepa steg 3.4.1.3 (den erhållna temporala profilen visualiseras i figur 8b).
- Ställ in den erhållna överlappnings balk positionen i Delay-linjen för att hämta SRS-bilder.
- Rumslig synkronisering av bjälkarna
Obs: överföringen bilder är användbara för att optimera FOV, belysning, och brännpunkten av mikroskopet mål, och för att kontrollera om de två balkar är rumsligt överlappade.- Överföring bild förvärv av OPO
- Stoppa TI: sa beam och minska OPO makt till 8 mW.
- Anslut detektor avläsning till datainsamlings kortet.
- Kör datainsamlingsprogrammet tillsammans med Mikroskop skanning konsol.
- Spara filen och bearbeta data för att hämta avbildningen. RAW-bilden visas på det sätt som visas i figur 9a.
- Överföring bild förvärv av TI: sa
- Stoppa OPO beam och minska TI: sa effekt till 2.5-4.5 mW.
- Anslut detektorn med LIA-och LIA-avläsning med datainsamlings kortet.
- Upprepa steg 3.4.2.1.3 och 3.4.2.1.4. RAW-bilden visas på det sätt som visas i figur 9b.
- Överföring bild förvärv av OPO
- Temporala synkroniseringen
4. SRS bild förvärv
Anmärkning: en dedikerad algoritm har realiserats för att lagra data. Den stöder följande bildformat: 512 px x 512 px och 256 px x 256 px, med förvärvs tider på 16 s, 8 s, 4 s och 2 s.
- Introducera en bunt av filter i mellan 40x mål och PD för att ta bort pumpen pulser (TI: sa) och förvärva endast Stokes signalen (OPO).
- Ställ in pump signalen på 810 nm med en fokuserad effekt på 8 mW och sond signalen till 1076 nm med en fokuserad effekt på 8 mW för att undersöka en typisk C-H-bindning av polystyren (Raman-förskjutning på 3054 cm− 1).
- Anslut detektorn med LIA och LIA avläsning till datainsamlings kortet.
- Ställ in bild insamlings pixelformatet enligt behov och ange anskaffnings tiden.
- Kör programmet som styr Mikroskop styrenheten.
- Kör det dedikerade algoritmprogrammet som fungerar som synkronisering mellan Mikroskop styrenheten, detekterings systemet och DAQ (se figur 4).
- Spara Matrix-filen när förvärvet är slutfört.
- Importera rådatafilen och spara bilden i det format som krävs (vanligtvis sparas i. TIF-format) med ImageJ programvara. Bilden visas i figur 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på SRS-mätning (dvs. SRS-mätning i en enda punkt i provet) rapporteras i figur 7. När balkarna inte överlappar varandra i tid eller rum rapporteras det erhållna resultatet i figur 8a. I off-resonans, amplituden av signalen mätt med LIA är noll, medan fasen av signalen mätt med LIA hoppar mellan negativa och positiva värden. När balkarna överlappar varandra i rymden och flyttar fördröjnings linjen i ett lämpligt område rapporteras de erhållna resultaten i figur 8b. Den signal som mäts av LIA ökar och når sin maximala när balkarna är perfekt överlappade i tid, medan fasen börjar att uppnå ett fast värde under den tid då balkar överlappas i tid.
De absorptionsbilder som erhålls med en enda stråle (TI: sa eller OPO) av samma polystyren pärlor finns representerade i figur 9a, b med skalstreck på 6 μm. För att kunna förvärva SRS-bilderna ställs fördröjnings linjen in på den position som uppnåtts i figur 7b, en typisk SRG-bild visas i figur 10 med en skalstapel på 6 μm.
Bild 1: Schematisk utformning av f-SRS Mikroskop system. OPO = optisk parametrisk oscillator; TI: sa = Titan-safir laser; M1-M7 = femtosecondlaser bredbands speglar; FFM/AM = flip-flop Mirror/Autocorrelator spegel; DM1, DM2 = Dichroic avspeglar; DL = fördröjning linje; AC = autocorrelator; EOM = elektrooptisk modulator; FG = funktionsgenerator; GM = galvo spegel; Obj1, Obj2 = mikroskopet mål; PD = fotodiod; DAQ = datainsamlingssystem; PC = persondator. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: system med hög frekvensmodulering överföringsmetod. I den infällbara figuren, de två lasrar balkar före interaktion inuti provet och modifierad sond på grund av interaktioner av sonden och pumpen inuti provet representeras. Tid representeras i ns. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: återgivning av fotodiodfäste med mekaniskt monteringssystem. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: schematiskt datainsamlingssystem. PD = fotodiod, LIA = lock-in förstärkare, DS = detekteringssystem, MC = Mikroskop kontroll, DAQ = data insamlingssystem, PC = persondator. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Autokorrelatorfunktionen i OPO (a) och TI: sa (b). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Cross korrelation funktion av OPO och TI: sa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: CCD-bild av polystyren pärlor.
Figur 8: amplitud och fas av SRS-signal mätt med lock-in-förstärkare: av resonans (till vänster) och i resonans (till höger) . Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: transmissions bilder av polystyren pärlor som uppnås genom OPO (a) och TI: sa (b). Scale bar = 16 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: SRS bild av polystyren pärlor. Skalstapel = 12 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SRS mikroskopi har tagit etikett-fri avbildning till nya höjder, särskilt i studier av komplexa biologiska strukturer såsom lipider, som är grundläggande för celler och cellulära arkitektur. Lipider är involverade i flera fysiologiska vägar såsom produktion av biologiska membran, och de fungerar som biosyntetiska prekursorer och signaltransducers10. Lipider är förpackade i specialiserade intracellulära organeller, även kallad lipid droppar (LDs). Deras diameter varierar från några tiotals nanometrar till tiotals mikrometrar11,12. LDs inte bara delta rikligt i fett-och steroid-producerande celler, men är också närvarande i andra cellinjer. LDs samarbetar i flera fysiologiska processer såsom lipid lagring. De är framträdande i vanliga patologier (t. ex. förändrad kolesterol metabolism)13,14.
Traditionellt, visualisering av lipider uppnås med fluorescens mikroskopi och neutrala lipidspecifika Dye-märkta fasta celler10. Det bör noteras att eftersom lipider är mindre storlek i jämförelse med proteiner och DNA, strukturella och funktionella förändringar och oönskade artefakter kan uppstå när du lägger till fluoroforer15,16. SRS har visat sig vara kraftfull för att studera lipid-rika strukturer. Lipider är rikligt förekommande i C-H2 grupper. Därför, de relativt isolerade toppar i samband med C-H Bond vibrations stater på 2845 cm-1 i deras Raman spectra ger en unik signatur för lipider inuti en cell. Eftersom de differentierbara vibrations signaturerna är ändliga är det tyvärr ganska svårt att urskilja en mål-biomolekyl från andra besläktade arter inuti celler som delar liknande kemiska bindningar. Det är dock möjligt att lägga till små Raman-aktiva vibrationella sonder (t. ex. alkyler och stabila isotoper) för att erhålla specificitet för avbildning av små biomolekyler17.
För biologiska och biomedicinska in vivo-tillämpningar är samtidig kartläggning av olika kemiska arter i ett givet prov nödvändigt för att investera samdistributionen och de dynamiska korrelationerna mellan par av biomolekyler18,19. Därför har många ansträngningar gjorts för att få fram flera kemiska kontraster. I det enklaste alternativet för Multicolor Imaging, till bild olika Raman lägen av ett prov, är frekvensen av pumpen strålen eller Stokes balk stämda i sekventiella skanningar18. Men med hjälp av våglängd tuning metoden kan orsaka förlust av co-lokalisering information av olika Raman lägen, särskilt när provet är i en dynamisk miljö18.
Som en konsekvens av ickelinjär excitation, SRS erbjuder inneboende 3D lösa kapacitet av den valda kemiska bindningen inom biologiska prover20. Volym rekonstruktion av den valda kemiska bindningen och dess rumsliga distributioner kan enkelt uppnås genom att samla in SRS-bilder på olika fokalplan längs z-axeln. Eftersom bilderna förvärvas med höga rumsliga och temporala resolutioner, kan andra delar av viktig information (dvs., 3D-struktur, kemisk sammansättning, etc.) om det biologiska provet erhållas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi uppskattar V. Tufano från IMM CNR för hans värdefulla teknisk assistans och Giacomo Cozzi, produktspecialist från Nikon Instruments, för användbara diskussioner och kontinuerligt stöd. Detta arbete stöddes delvis av italienska nationella operativa program PONa3 00025 (BIOforIU) och av euro-bioimaging storskaliga paneuropeiska forskningsinfrastruktur projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25x36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D'Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
