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Biochemistry

आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रोटीन की विशेषता मल्टी-एंगल लाइट स्कैटरिंग (एसईसी-मेल्स) के लिए जोड़ा गया

doi: 10.3791/59615 Published: June 20, 2019

Summary

यह प्रोटोकॉल समाधान में प्रोटीन और परिसरों की पूर्ण विशेषता के लिए बहु कोण प्रकाश प्रकीर्णन (एसईसी-MALS) के साथ आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के संयोजन का वर्णन करता है। एसईसी-MALS आणविक वजन और शुद्ध प्रोटीन, देशी oligomers, विषमपरिसरों और ग्लाइकोप्रोटीन के रूप में संशोधित प्रोटीन के आकार को निर्धारित करता है।

Abstract

विश्लेषणात्मक आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), आमतौर पर समाधान में प्रोटीन और प्रोटीन-प्रोटीन परिसरों के आणविक वजन के निर्धारण के लिए उपयोग किया जाता है, एक सापेक्ष तकनीक है जो आणविक अनुमान लगाने के लिए एनेलाइट की एल्यूशन मात्रा पर निर्भर करती है वजन. जब प्रोटीन गोलाकार नहीं है या गैर-आदर्श स्तंभ बातचीत से गुजरता है, प्रोटीन मानकों के आधार पर अंशांकन वक्र अमान्य है, और elution मात्रा से निर्धारित आणविक वजन गलत है. बहु-कोण प्रकाश प्रकीर्णन (MALS) एक निरपेक्ष तकनीक है जो मूल भौतिक समीकरणों से विलयन में एनालाइट के आण्विक भार को निर्धारित करती है। विश्लेषण के लिए MALS के साथ जुदाई के लिए एसईसी का संयोजन मोनोमर, देशी ओलिगोमर्स या समुच्चय, और विषमपरिसरों सहित एक या अधिक प्रोटीन प्रजातियों के समाधान की विशेषता के लिए एक बहुमुखी, विश्वसनीय साधन का गठन करता है। चूंकि माप प्रत्येक elution मात्रा में किया जाता है, एसईसी-MALS निर्धारित कर सकते हैं अगर एक eluting चोटी सजातीय या विषम है और गतिशील संतुलन बनाम एक निश्चित आणविक वजन वितरण के बीच अंतर. ग्लाइकोप्रोटीन या लिपोप्रोटीन जैसे संशोधित प्रोटीन का विश्लेषण, या डिटर्जेंट-सोलुबिलाइज्ड झिल्ली प्रोटीन जैसे संयुग्मी का विश्लेषण भी संभव है। इसलिए, एसईसी-MALS प्रोटीन केमिस्ट के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है जो जैविक या जैव-प्रौद्योगिकी अनुसंधान के लिए उत्पादित अणुओं के जैवभौतिक गुणों और समाधान व्यवहार की पुष्टि करनी चाहिए। एसईसी-MALS के लिए यह प्रोटोकॉल आणविक वजन और शुद्ध प्रोटीन monomers और समुच्चय के आकार का विश्लेषण करती है। प्राप्त डेटा आगे एसईसी-MALS विश्लेषण के लिए एक नींव के रूप में सेवा करता है जिसमें परिसर, ग्लाइकोप्रोटीन और सर्फैक्टेंट-बाउंड झिल्ली प्रोटीन शामिल हैं।

Introduction

जैव-अणुक अनुसंधान1,2,3,4के लिए प्रोटीनों के आण्विक भार (एमडब्ल्यू) का विश्वसनीय विश्लेषण आवश्यक है . मेगावाट विश्लेषण वैज्ञानिक को सूचित करता है कि यदि सही प्रोटीन का उत्पादन किया गया है और यदि यह आगे प्रयोग5,6में उपयोग के लिए उपयुक्त है . के रूप में प्रोटीन अनुसंधान नेटवर्क P4EU7 और ARBRE-Mobieu8की वेब साइटों पर वर्णित है, प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण न केवल अंतिम उत्पाद की शुद्धता की विशेषता चाहिए, लेकिन यह भी अपने oligomeric राज्य, एकरूपता, पहचान, conformation, संरचना, बाद अनुवाद संशोधनों और अन्य गुणों.

गैर-दानकरने वाले समाधान में मेगावाट माप उस प्रोटीन के रूप की पहचान करता है जो जलीय वातावरण में मौजूद होता है, चाहे एकैमेरिक हो या अल्पगोलिक। जबकि कई प्रोटीनों के लिए एकाक्षरी रूप का उत्पादन करने का लक्ष्य है , दूसरों के लिए एक विशिष्ट देशी ओलिगोमर जैविक गतिविधि9,10,11,12की कुंजी है . अन्य अल्पजीवी और गैर देशी समुच्चय अवांछनीय हैं और क्रिस्टलोग्राफी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) या छोटे कोण एक्स-रे प्रकीर्णन, साथ ही कार्यात्मक परख में कलाकृतियों या inaccuracies द्वारा संरचनात्मक निर्धारण में खामियों को जन्म देगा समतापीय अनुमापन कैलोरी या सतह प्लाज्मन अनुनाद2,13द्वारा परिमाणात्मक बंधन .

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) जैसे जैव चिकित्सा के मामले में, समाधान-आधारित मेगावाट विश्लेषण गुणवत्ता नियंत्रण और उत्पाद विशेषता के समान उद्देश्य को पूरा करता है। अत्यधिक समुच्चय और टुकड़े एक अस्थिर उत्पाद है कि मानव उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं है का संकेत कर रहे हैं. विनियामक एजेंसियों को न केवल चिकित्सीय अणु की सावधानीपूर्वक विशेषता की आवश्यकता होती है बल्कि उन संभावित निम्नवर्गों की भी आवश्यकता होती है जो अंतिम उत्पाद14,15,16,17में उपस्थित हो सकते हैं .

प्रोटीन मेगावाट का विश्लेषण करने के लिए सबसे व्यापक तरीकों में से कुछ सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस-पेज), केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस (सीई), देशी पेज, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) और विश्लेषणात्मक हैं अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन (एयूसी)। इनमें से, एसडीएस-पेज, सीई और एमएस मूल राज्य में प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं और आम तौर पर oligomers और समुच्चय के वियोजन के लिए नेतृत्व, इसलिए देशी oligomer या परिमाणात्मक समुच्चय का निर्धारण करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं. हालांकि देशी पृष्ठ करता है, सैद्धांतिक रूप से, मूल राज्य को बनाए रखने, हमारे अनुभव में यह कई प्रोटीन के लिए अनुकूलित करने के लिए मुश्किल है, और परिणाम बहुत विश्वसनीय नहीं हैं. AUC, चाहे अवसादन वेग या अवसादन संतुलन द्वारा, मात्रात्मक है और पहले सिद्धांतों से मेगावाट निर्धारित कर सकते हैं, लेकिन यह काफी बोझिल है, बहुत मैनुअल श्रम और डेटा व्याख्या में महत्वपूर्ण विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है, लंबे प्रयोग समय और एक बहुत महंगा साधन.

विश्लेषणात्मक एसईसी एक मात्रात्मक और अपेक्षाकृत मजबूत, सरल तरीका है जो एक पैक किए गए कॉलम के माध्यम से प्रवाह के दौरान अणुअणुओं को अलग करता है। एसईसी के सिद्धांतों और अनुप्रयोगों को कई समीक्षाओं में अच्छी तरह से प्रस्तुत किया गयाहै 18,19,20 और पुस्तिका में "आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी: सिद्धांतों और तरीके"21. प्रतिधारण में अंतर कॉलम के अंत से eluting से पहले स्थिर चरण में pores में और बाहर diffusing समय की विभिन्न मात्रा के कारण कर रहे हैं. 22 अणुओं के सापेक्ष आकारों और विसरण गुणांकों सेअंतर (नामक रूप से) उत्पन्न होता है। एक अंशांकन वक्र संदर्भ अणुओं की एक श्रृंखला का उपयोग कर निर्माण किया है, अणु के मेगावाट से संबंधित elution मात्रा. प्रोटीन के लिए, संदर्भ अणुओं आम तौर पर अच्छी तरह से व्यवहार कर रहे हैं, गोलाकार प्रोटीन है कि प्रभारी या हाइड्रोफोबिक सतह अवशेषों के माध्यम से स्तंभ के साथ बातचीत नहीं करते. Elution मात्रा एक पराबैंगनी (यूवी) अवशोषण डिटेक्टर के साथ मापा जाता है. यदि यूवी विलुप्त होने गुणांक जाना जाता है अक्सर अनुक्रम से गणना की- प्रोटीन चोटी कुल द्रव्यमान भी मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.

विशेष रूप से, एसईसी द्वारा मेगावाट का विश्लेषण प्रोटीन की विशेषता के बारे में दो प्रमुख मान्यताओं पर निर्भर करता है: 1) वे संदर्भ मानकों के साथ साझा एक ही रचना और विशिष्ट मात्रा (दूसरे शब्दों में, प्रसार गुणों के बीच एक ही संबंध और मेगावाट) और 2) संदर्भ मानकों की तरह, वे steric गुणों को छोड़कर स्तंभ के साथ बातचीत नहीं करते हैं, वे प्रभारी या हाइड्रोफोबिक बातचीत द्वारा स्तंभ पैकिंग का पालन नहीं करते. इन मान्यताओं से विचलन अंशांकन वक्र अमान्य और गलत मेगावाट निर्धारण करने के लिए नेतृत्व. यह आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीनों के लिए मामला है जिनके व्यापक असंरचित क्षेत्रों के कारण बड़े स्टोक्स त्रिज्याएं हैं, 23,24 या गैर-गोलाकार/रेखीय ओलिगोमेरिक असेंबली10. Glycosylated प्रोटीन आम तौर पर गैर glycosylated रूप की तुलना में एक बड़ा Stokes त्रिज्या होगा, तब भी जब जोड़ा कार्बोहाइड्रेट द्रव्यमान खाते में लिया जाता है19. डिटर्जेंट-सोलुबिलाइज्ड झिल्ली प्रोटीन अंशांकन प्रोटीन की तुलना में अलग ढंग से elute क्योंकि एसईसी से उनके elution polypeptide-डिटर्जेंट-लिपिड जटिल के कुल आकार पर निर्भर करता है बजाय ओलिगोमेरिक राज्य और प्रोटीन के मोलर द्रव्यमान25 ,26. कॉलम रसायन, पीएच और नमक की स्थिति सभी चार्ज या हाइड्रोफोबिक सतह अवशेषों के साथ प्रोटीन के elution मात्रा को प्रभावित27,28.

एसईसी बहु कोण प्रकाश प्रकीर्णन (MALS) और अंतर अपवर्तक सूचकांक (डीआरआई) डिटेक्टरों3,4,11,29के साथ संयुक्त जब मेगावाट निर्धारण के लिए और अधिक बहुमुखी और विश्वसनीय हो जाता है, 30,31,32. एक dRI डिटेक्टर analyte की उपस्थिति के कारण समाधान अपवर्तक सूचकांक में परिवर्तन के आधार पर एकाग्रता निर्धारित करता है. एक MALS डिटेक्टर घटना लेजर बीम के सापेक्ष कई कोणों में एक analyte द्वारा बिखरे हुए प्रकाश के अनुपात के उपाय. सामूहिक रूप से एसईसी-MALS के रूप में जाना जाता है, इस इंस्ट्रूमेंटेशन मेगावाट elution समय से स्वतंत्र रूप से निर्धारित करता है के बाद से मेगावाट समीकरण 1 का उपयोग कर पहले सिद्धांतों से सीधे गणना की जा सकती है,

Equation 1

जहां एम एनेलाइट का आण्विक भार है, आर(0) कम रेले अनुपात (अर्थात्, लेजर तीव्रता के सापेक्ष एनेलाइट द्वारा बिखरे हुए प्रकाश की मात्रा) MALS डिटेक्टर द्वारा निर्धारित किया जाता है और शून्य कोण के लिए extrapolated, यूवी या डीआरआई डिटेक्टर द्वारा निर्धारित वजन एकाग्रता, डी एन/डीसी एनालाइट के अपवर्तक सूचकांक वृद्धि (आवश्यक रूप से एनेलाइट और बफर के अपवर्तक सूचकांक के बीच का अंतर), और K एक ऑप्टिकल स्थिरांक जो पर निर्भर करता है विकर्षण तथा विलायक अपवर्तक सूचकांक29जैसे तंत्र गुण।

एसईसी-मेल्स में, एसईसी कॉलम का उपयोग केवल समाधान में विभिन्न प्रजातियों को अलग करने के लिए किया जाता है ताकि वे व्यक्तिगत रूप से MALS और एकाग्रता डिटेक्टर कोशिकाओं में प्रवेश कर सकें। वास्तविक प्रतिधारण समय के रूप में दूर के रूप में कितनी अच्छी तरह यह प्रोटीन प्रजातियों को हल को छोड़कर विश्लेषण के लिए कोई महत्व नहीं है. उपकरणों स्तंभ से स्वतंत्र रूप से calibrated रहे हैं और संदर्भ मानकों पर भरोसा नहीं करते। अतः एसईसी-माल्स को मूल भौतिक समीकरणों से मेगावाट निर्धारण के लिए एक निरपेक्ष विधि माना जाता है। यदि नमूना विषम है और कॉलम द्वारा पूरी तरह से अलग नहीं है, तो प्रत्येक elution मात्रा पर प्रदान किया गया मान प्रत्येक elution मात्रा में अणुओं का एक वजन औसत है कि समय टुकड़ा प्रति प्रवाह सेल के माध्यम से बहती है, लगभग 75 $L होगा.

प्रकीर्णन तीव्रता के कोणीय विभिन्नता के विश्लेषण से, MALS भी लगभग 12.5 दउ29से अधिक ज्यामितीय त्रिज्या वाले मैक्रो अणुओं के आकार (रूट-मीन-वर्ग त्रिज्या, आरजी) का निर्धारण कर सकता है। एक्मिक प्रोटीन और अल्पगोमर जैसी छोटी प्रजातियों के लिए, 0.5 एनएम औरऊपर 33से हाइड्रोडायनामिक रेडी को मापने के लिए एक गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) मॉड्यूल को MALS उपकरण में जोड़ा जा सकता है।

जबकि या तो यूवी या डीआरआई एकाग्रता विश्लेषण में सी का मूल्य प्रदान कर सकते हैं 1, dRI का उपयोग दो कारणों के लिए पसंद किया जाता है: 1) dRI एक सार्वभौमिक एकाग्रता डिटेक्टर है, शर्करा या polysaccharides कि एक यूवी शामिल नहीं है जैसे अणुओं का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त क्रोमोफोर34; और 2) जलीय बफर में लगभग सभी शुद्ध प्रोटीनों की सांद्रता अनुक्रिया dn/dc एक या दो प्रतिशत (0ण्185 एमएल/g)35के भीतर समान है, इसलिए यूवी विलुप्त होने गुणांक को जानने की कोई आवश्यकता नहीं है।

प्रोटीन अनुसंधान में एसईसी-माल का उपयोग काफी व्यापक है। अब तक सबसे आम अनुप्रयोगों की स्थापना कर रहे हैं कि क्या एक शुद्ध प्रोटीन monomeric या अल्पजीवी और अल्पीकरण की डिग्री है , और समुच्चयकाआकलन 3 ,10,11,17, 31,36,37,38. डिटर्जेंट-सोलुबिलाइज़्ड झिल्ली प्रोटीन के लिए ऐसा करने की क्षमता जिसे पारंपरिक साधनों से विशेषता नहीं दी जा सकती है, विशेष रूप से बेशकीमती है, और इसके लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गएहैं 31,39,40 , 41 , 42 , 43अन्य सामान्य अनुप्रयोगों में पोस्ट-अनुवादसंशोधन की डिग्री और ग्लाइकोप्रोटीन, लिपोप्रोटीन और इसी तरह के संयुग्मी4,31,44 की बहुपरिक्षेपता की स्थापना शामिल है . , 45 , 46 , 47; प्रोटीन-प्रोटीन, प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन-पॉलीसैकराइड परिसरों सहित विषमसंकुल के गठन (या उसके अभाव) और निरपेक्ष स्टोइकियोमेट्री (स्टोइकियोमेट्रिक अनुपात के विपरीत) 24,46, 48,49,50,51,52; एकमर-डिमर संतुलन वियोजन स्थिरांक49,53,54; और प्रोटीन रचना55,56का मूल्यांकन . प्रोटीन से परे, एसईसी-MALS पेप्टाइड्स57,58, मोटे तौर पर विषम प्राकृतिक बहुलक जैसे कि हेपारिन59 और chitosans60,61,छोटे की विशेषता के लिए अमूल्य है विषाणु62 तथा अधिकांश प्रकार के संश्लेषित या प्रसंस्कृत बहुलक63,64,65,66. एक व्यापक ग्रंथ सूची साहित्य67 और ऑनलाइन में पाया जा सकता है (http://www.wyatt.com/bibliography पर).

यहाँ, हम एक एसईसी-MALS प्रयोग चलाने और विश्लेषण के लिए एक मानक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) जुदाई और प्रोटीन monomers और oligomers की विशेषता के लिए एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया है. बीएसए प्रोटोकॉल कुछ सिस्टम स्थिरांकों को निर्धारित करता है जो आगे एसईसी-MALS विश्लेषण ों के लिए एक नींव के रूप में काम करते हैं, जिसमें परिसर, ग्लाइकोप्रोटीन और सर्फैक्टेंट-बाउंड झिल्ली प्रोटीन शामिल हैं।

हम ध्यान दें कि एसईसी-MALS मानक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) या तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) उपकरण कई विक्रेताओं से का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में एफपीएलसी प्रणाली के प्रयोग का वर्णन किया गया है जो आमतौर पर प्रयोगशालाओं में पाई जाती है जो अनुसंधान और विकास के लिए प्रोटीन का उत्पादन करती है (सामग्री तालिकादेखें ) । प्रोटोकॉल चलाने से पहले, FPLC प्रणाली, MALS और DRI डिटेक्टरों स्थापित किया जाना चाहिए, नियंत्रण के लिए उनके संबंधित सॉफ्टवेयर संकुल के साथ, डेटा अधिग्रहण और निर्माताओं के निर्देशों और किसी भी अपेक्षित अंशांकन स्थिरांक प्रति विश्लेषण या अन्य सेटिंग्स सॉफ्टवेयर में प्रवेश किया. एक इनलाइन फिल्टर पंप और एक हाइड्रोफिलिक के साथ इंजेक्टर के बीच रखा जाना चाहिए, 0.1 m pores झिल्ली स्थापित.

Protocol

1. प्रणाली की तैयारी

  1. FPLC के यूवी डिटेक्टर के नीचे MALS और dRI डिटेक्टरों कनेक्ट. वे यूवी और MALS डिटेक्टरों के बीच महत्वपूर्ण इंटरडिटेक्टर मात्रा जोड़ देगा के बाद से पीएच और चालकता डिटेक्टरों बाईपास. करने के लिए और डिटेक्टरों के बीच स्तंभ से 0.25 मिमी यानी की केशिका टयूबिंग का प्रयोग करें, और 0.75 मिमी आईडी केशिका टयूबिंग डिटेक्टरों के उत्पादन पर बर्बाद या अंश कलेक्टर.
  2. सुनिश्चित करें कि FPLC और डिटेक्टरों के बीच आवश्यक संकेत कनेक्शन स्थापित किया गया है, यूवी डिटेक्टर से MALS एनालॉग इनपुट करने के लिए एनालॉग उत्पादन सहित, और डिजिटल उत्पादन FPLC से MALS Autoect करने के लिए, FPLC के I/O बॉक्स के माध्यम से.
  3. कम से कम 20 केडीए से 500 केडीए तक की एक अंशीकरण रेंज को कवर करने के लिए एक उपयुक्त विश्लेषणात्मक एसईसी कॉलम स्थापित करें। स्तंभ मेगावाट, पीएच और नमूना और मोबाइल चरण के अन्य गुणों की सीमा के लिए उपयुक्त है, तो यह निर्धारित करने के लिए उत्पाद जानकारी की जाँच करें।

2. बफर की तैयारी, रात भर प्रणाली को भरना और सफाई की जांच करना

  1. HPLC ग्रेड अभिकर्मकों का उपयोग करना, 50 - 100 m NaCl के साथ फॉस्फेट-बफर नमकीन के 1 एल तैयार करते हैं। एक बोतल-टॉप polyether sulfone फिल्टर या इसी तरह का उपयोग कर 0.1 डिग्री के लिए बफर फ़िल्टर। एक बेकार की बोतल और डिस्कार्ड के लिए बफर के पहले 50-100 एमएल फ़िल्टर, आदेश में सूखी फिल्टर से कण को खत्म करने के लिए, और फिर एक साफ करने के लिए शेष फिल्टर, बाँझ बोतल है कि फ़िल्टर के साथ अच्छी तरह से धोया गया है, de-ionized पानी और को रोकने के लिए छाया हुआ प्रवेश करने से धूल.
    नोट: इस तरह के एक Tris बफर के रूप में अन्य मोबाइल चरण सॉल्वैंट्स इस्तेमाल किया जा सकता है अगर अतिरिक्त प्रोटीन है कि वरीयता उन सॉल्वैंट्स में भंग कर रहे हैं विश्लेषण किया जा करने के लिए कर रहे हैं।
  2. 0.5 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर रात भर फ्लश करें, या जैसा कि स्तंभ निर्माता द्वारा अनुशंसित किया गया है, बफर में कॉलम को बराबर करने और कणों को हटाने के लिए। FPLC के सतत प्रवाह मोड का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि प्रवाह तब तक नहीं रुकता जब तक कि सभी एसईसी-MALS रन पूरे नहीं हो जाते हैं।
    1. रात भर फ्लश के दौरान डीआरआई फ्लो सेल को पर्ज मोड में रखें। नमूना चलता प्रारंभ करने से पहले पर्ज करें बंद करें।
    2. फ्लश की शुरुआत करते समय, कॉलम में अचानक दबाव के अचानक परिवर्तन के कारण "स्तंभ बहा" प्रभाव (या कणों की रिहाई) को रोकने के लिए प्रवाह दर को धीरे-धीरे रैंप करें।
    3. यदि प्रणाली काफी स्थिर और कण मुक्त होने के लिए जाना जाता है, और वांछित मोबाइल चरण के साथ संतुलन में, एक छोटे, 2-3 एच फ्लश के साथ रात भर फ्लश की जगह.
  3. हल्के से कॉलम के ट्यूबिंग बहाव दोहन द्वारा की जाँच करें संचित कणों को रिहा करने और MALS साधन के सामने पैनल प्रदर्शन पर 90 डिग्री डिटेक्टर में संकेत देख. सत्यापित करें कि पीक-टू-पीक शोर 50 -100 $V से अधिक नहीं है।
  4. इंजेक्टर कणों से साफ है कि यह सत्यापित करने के लिए एक 'रिक्त' इंजेक्शन निष्पादित करें। एक 'रिक्त' बस चल बफर, एक ताजा, बाँझ शीशी में तैयार है.
    1. यदि कण शिखर मात्रा में 1 एमएल से अधिक नहीं है और आधार रेखा से ऊपर 5 एमवी से अधिक नहीं है, तो सिस्टम नमूनों के लिए तैयार है। अन्यथा, अतिरिक्त रिक्त इंजेक्शन साफ़ करें, या इंजेक्टर को साफ करने के लिए रखरखाव निष्पादित करें।

3. तैयारी और नमूना लोड हो रहा है

  1. एसईसी बफर में 1-2 मिलीग्राम/एमएल पर बीएसए के कम से कम 200 डिग्री सेल्सियस तैयार करें।
    नोट: वर्षा को रोकने के लिए, बीएसए को शुद्ध पानी में कभी भी भंग नहीं किया जाना चाहिए।
  2. एक सिरिंज-टिप फिल्टर का उपयोग कर 0.02 डिग्री मीटर के लिए प्रोटीन फ़िल्टर करें।
  3. सूखे फिल्टर से कणों को खत्म करने के क्रम में छानना के पहले कुछ बूँदें छोड़ें।
  4. वैकल्पिक रूप से, 15 मिनट के लिए 10,000 x g पर नमूना अपकेंद्रण गैर घुलनशील समुच्चय और अन्य बड़े कणों की वर्षा सक्षम करने के लिए।
  5. बीएसए समाधान के 100 $L को लूप में इंजेक्ट करें।
    नोट: यह सामग्री की सिफारिश की राशि है, और अधिक या कम इस तरह की स्थिरता या उपलब्धता के रूप में नमूना की परिस्थितियों के अनुसार इंजेक्ट किया जा सकता है. इंजेक्शन प्रति आवश्यक प्रोटीन की मात्रा आणविक वजन के साथ व्युत्क्रम भिन्न होती है - आणविक वजन 33 kDa, या आधा है कि बीएसए के रूप में दो बार के रूप में ज्यादा प्रोटीन द्रव्यमान की जरूरत है।

4. MALS सॉफ्टवेयर की तैयारी

  1. नया खोलें ] MALS सॉफ़्टवेयर मेनू में विधि से प्रयोग करें और लाइट स्कैटरिंग सिस्टम विधियों फ़ोल्डर से ऑनलाइन विधि का चयन करें. यदि कोई DLS डिटेक्टर मौजूद है, तो लाइट स्कैटरिंग से ऑनलाइन विधि का चयन करें | QELS फ़ोल्डर के साथ।
  2. कॉन्फ़िगरेशन अनुभाग में, नमूना और मोबाइल चरण के पैरामीटर सेट करें.
    1. जेनेरिक पम्प दृश्य में, प्रवाह दर FPLC में उपयोग किया गया करने के लिए सेट करें।
    2. जेनेरिक पम्प दृश्य, सॉल्वेंट शाखा, नाम फ़ील्ड में, PBSका चयन करें।
    3. इंजेक्शन दृश्य में, नमूना शाखा, बीएसएके रूप में नाम दर्ज करें, और सेट dn/dc - 0.185 (असंशोधित प्रोटीन के लिए मानक मूल्य), A2 $ 0, और यूवी विलुप्त होने गुणांक - 0.667 एमएल /mg-cm)
      नोट: अन्य प्रोटीन के लिए, यूवी280 एनएम विलुप्त होने गुणांक साहित्य में पाया जा सकता है या विभिन्न सार्वजनिक डोमेन सॉफ्टवेयर उपकरणों का उपयोग कर अपने अनुक्रम से गणना की.
  3. कार्यविधियाँ अनुभाग में, मूल संग्रह दृश्य, स्वत: प्रवेश पर चेकबॉक्स ट्रिगर का चयन करें और 70 मिनट के लिए चलाने की अवधि सेट करें ताकि एसईसी की कुल permeation मात्रा तक डेटा पूरे elution के लिए एकत्र किए जाते हैं स्तंभ तक पहुँच गया है।
    नोट: समय की आवश्यक राशि कॉलम और प्रवाह दर के साथ भिन्न हो सकती है - 35 मिनट के संग्रह के लिए एक मानक 7.8 मिमी x 300 मिमी HPLC-एसईसी कॉलम 0.5 एमएल/मिनट पर आवश्यक हैं।
  4. चलाएँ बटन पर क्लिक करके MALS सॉफ़्टवेयर में प्रयोग प्रारंभ करें. यह MALS डिटेक्टर के माध्यम से FPLC साधन से पल्स संकेत प्राप्त करने के बाद डेटा पढ़ना शुरू कर देंगे.
  5. साधन के सामने पैनल पर Autozero बटन पर क्लिक करके डीआरआई संकेत शून्य.

5. FPLC सॉफ्टवेयर की तैयारी

  1. प्रोटीन का नाम डालें और FPLC सॉफ्टवेयर में चलाने के मैनुअल में | मैन्युअल निर्देश निष्पादित करें ] चिह्न सेटकरें.
  2. प्रवाह पथ के तहत इंजेक्शन इंजेक्शन वाल्व को मैनुअल लोड से इंजेक्शन लगाने के लिए स्विच करें | इंजेक्शन वाल्व|
  3. i/o बॉक्स के अंतर्गत 0.5 s पल्स सम्मिलित करके पल्स संकेत शामिल करें | पल्स डिजिटल बाहर| यह MALS सॉफ़्टवेयर में डेटा संग्रह को ट्रिगर करेगा।

6. पाश में नमूना इंजेक्शन. प्रयोग चलाने के लिए FPLC सॉफ़्टवेयर में निष्पादित करें पर क्लिक करें.

7. एसईसी-मालबीएसए डेटा का विश्लेषण

  1. MALS सॉफ़्टवेयर में कार्यविधियाँ अनुभाग के अंतर्गत विश्लेषण, चरण-दर-चरण निष्पादित करें.
    1. सत्यापित करें कि चोटियों यूवी, MALS और आरआई में लगभग एक ही elution मात्रा पर, मूल संग्रह दृश्य की जाँच करके दिखाई देते हैं।
    2. आधार रेखा दृश्य में, सभी संकेतों के लिए आधार रेखा निर्धारित (सभी LS डिटेक्टरों, यूवी और dRI). आधार रेखा शुद्ध विलायक के स्तर को इंगित करने के लिए परिभाषित किया जाना चाहिए, दूसरे के लिए नमूना चोटियों के एक तरफ से खींच बेहतर.
    3. चोटियों दृश्य में, क्लिक करें और माउस खींचकर विश्लेषण किया जा करने के लिए चोटियों को परिभाषित. प्रत्येक चोटी के केंद्रीय 50% का चयन करें. पहले मोनोमर पीक ('पीक 1') और फिर डिमर पीक ('पीक 2') का चयन करें। dn/dc के सही मान की पुष्टि करें 0.185 और यूवी 280 एनएम विलुप्त होने गुणांक ] 0.667 प्रत्येक चोटी के तहत बीएसए के लिए.
  2. चोटी संरेखण, बैंड-ब्रॉडिंग सुधार और सामान्यीकरण प्रक्रियाओं को निष्पादित करें।
    नोट: आम तौर पर एसईसी-MALS विधि समय-समय पर शिखर संरेखण के लिए calibrated है, बैंड व्यापक बनाने और 90 डिग्री डिटेक्टर के लिए कोणीय डिटेक्टरों के सामान्यीकरण gyration आरजी और lt के त्रिज्या के साथ एक मोनोडिफिकेशन प्रोटीन का उपयोग कर; 10 एनएम ऐसे बीएसए के रूप में मोनोमर. इस उदाहरण में, बीएसए दोनों अंशांकन अणु के रूप में कार्य करता है और अपने आप में मेगावाट विश्लेषण का विषय है.
    1. प्रक्रियाओं में | संरेखण दृश्य, क्लिक करके और माउस खींच कर चोटियों के केंद्रीय क्षेत्र का चयन करें, संरेखित सिग्नल क्लिक करें और फिर ठीकहै.
    2. प्रक्रियाओं में | बैंड ब्रॉडिंग दृश्य, मोनोमर चोटी के केंद्रीय 50% का चयन करें। सुनिश्चित करें कि आरआई डिटेक्टर संदर्भ साधनके रूप में निर्दिष्ट है, फिर फ़िट करें क्लिक करें और आरआई सिग्नल से यूवी और एलएस संकेतों से मेल करने के लिए लागू करें।
      1. वे केंद्रीय 50-70% के भीतर बहुत बारीकी से ओवरलैप सत्यापित करने के लिए चोटियों में ज़ूम इन करें, फिर ठीकक्लिक करें।
      2. ओवरलैप सही नहीं है, (यह करने के लिए आवश्यक हो सकता है) फिट प्रदर्शन और "लागू करें" एक या दो बार जब तक ओवरलैप उत्कृष्ट है.
    3. प्रक्रियाओं में | सामान्य दृश्य, पीक 1 का चयन करें, आरजी मान के रूप में 3.0 एनएम दर्ज करें, फिर सामान्य क्लिक करें ठीकहै।
    4. प्रक्रियाओं में | MALS दृश्य से मोलर मास और Rg, डेटा की समीक्षा करने के लिए निर्धारित करने के लिए जो, यदि कोई हो, पता लगाने के कोण अत्यधिक शोर के कारण विश्लेषण से deselected किया जाना चाहिए. आमतौर पर, ये निम्न कोण होंगे जिसमें धूल के कण अपेक्षाकृत उच्च तीव्रता को तितर-बितर कर देते हैं। दाईं ओर ग्राफ से चोटियों के भीतर अलग-अलग स्लाइस का चयन करें और बाईं ओर ग्राफ में व्युत्क्रम कम रेले अनुपात की कोणीय निर्भरता देखें। यदि सबसे कम (और कभी-कभी उच्चतम) कोण लगातार फिट से बहुत विचलित हो जाते हैं, तो उन्हें दृश्य के निचले भाग में सूची से अचयनित करें।
  3. EASI ग्राफ़ दृश्य में परिणामों का ग्राफ़ देखें. विंडो के शीर्ष पर प्रदर्शन ड्रॉप-डाउन से मोलर मास का चयन करें. पीक क्षेत्र पर ज़ूम इन करने के लिए Ctrl + क्लिक करें और खींचें का उपयोग करें.
  4. परिणाम में मोनोमर और डिमर चोटियों के लिए अंतिम सारणीबद्ध भार-औसत मोलर द्रव्यमान परिणाम देखें | पीक परिणामों के अंतर्गत रिपोर्ट (summary) दृश्य | मोलर द्रव्यमान क्षण (g/ एमडब्ल्यू| शुद्धता पीक परिणाम के तहत सूचित किया जाता है | मास अंश(%)|
    नोट: अन्य मोलर द्रव्यमान क्षण भी दिखाए जाते हैं; ये आमतौर पर विषम बहुलकों के लिए प्रासंगिक हैं, लेकिन असतत आकार के साथ प्रोटीन के लिए नहीं. सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पादित कई अन्य परिणामों को इस तरह के प्रतिशत बड़े पैमाने पर वसूली के रूप में रिपोर्ट में शामिल किया जा सकता है (प्रोटीन का अंश है कि इंजेक्शन राशि के सापेक्ष एकाग्रता डिटेक्टर के माध्यम से eluted), चोटी के आँकड़े, polydispersity, आरजी और आरएच क्षणों, आदि जब प्रदान की, अनिश्चितता के उपाय माप श्रृंखला के भीतर शोर के आधार पर उद्धृत मूल्य की शुद्धता को प्रतिबिंबित और सटीकता का प्रतिनिधित्व करने के लिए विचार नहीं किया जाना चाहिए. रिपोर्ट किए गए मूल्यों की सही सटीकता विभिन्न कारकों पर निर्भर करती है जैसे प्रदान किए गए डीएन/डीसी की सटीकता और विलुप्त होने गुणांक मान, साधन अंशांकन आदि।
  5. फ़ाइल मेनू से, विधि के रूप में सहेजें का चयन करें और विश्लेषण बीएसए डेटा प्रोटीन के सभी प्रकार के भविष्य के माप के लिए एक मानक विधि के रूप में सहेजें. बीएसए के लिए निर्धारित सामान्यीकरण और बैंड-ब्रॉडिंग पैरामीटर विश्लेषण में किए जाएंगे।

Representative Results

चित्र 1क, बी से पता चलता है कि बीएसए के तीन अल्पगोलक रूप: मोनोमर, डिमर और ट्रिमर, मोनोमर और डाइमर के आधारभूत संकल्प के साथ 200 ] छिद्र स्तंभ पर अच्छी तरह से अलग थे, जबकि चित्र 2क से पता चलता है कि 75 ] छिद्र स्तंभ पर पृथक्करण नहीं था अच्छा मोनोमर-डिमर संकल्प प्राप्त करना। बाद के उदाहरण के लिए एक "गरीब" परिणाम वर्णन शामिल किया गया था; दो कॉलम के लिए जुदाई में इन मतभेदों, वास्तव में, निर्माता की कहा जुदाई पर्वतमाला के अनुसार उम्मीद की जा सकती है. ट्रिमर डिमर से पूरी तरह से अलग नहीं है और उच्च ओलिगोमर ट्रिमर और एक दूसरे से अलग नहीं हैं। चित्रा 2ख क्रोमेटोग्राम भर में मौजूद कणों के साथ शोर प्रकाश प्रकीर्णन संकेत का एक उदाहरण है, जो सटीक मेगावाट निर्धारण को रोकता है।

इसके बाद हम चित्र 1खपर ध्यान केंद्रित करते हैं। मोनोमर, जो 13.8 एमएल पर पेश किया गया है, में 64.1 के भार-औसत मोलर द्रव्यमान ड को दर्शाता है - 0.4 केडीए का निर्धारण MALS तथा हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या Rh द्वारा 3.54 - 0.01 nm. ये परिणाम बीएसए के अनुक्रम द्रव्यमान और ज्ञात हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या, 66.4 केडीए और 3.5 एनएम क्रमशः68के साथ अनुबंध कर रहे हैं, एसईसी-मेल्स की सामान्य सटीकता के भीतर, 5%3,69. डिमर, जो 12 एमएल पर लगाया गया था, ने 127 के एमडब्ल्यू मूल्य का प्रदर्शन किया - 1 केडीए ने MALS द्वारा निर्धारित किया गया था-जैसा कि अपेक्षित था, दो बार मोनोमर की जो प्रयोगात्मक परिशुद्धता के भीतर और 5.68 के आरएच के भीतर निर्धारित किया गया था । Trimer चोटी भी 11 एमएल पर मनाया गया था एमडब्ल्यू के साथ 194 - 9 kDa MALS द्वारा निर्धारित, तीन बार है कि मोनोमर के प्रयोगात्मक परिशुद्धता के भीतर करने के लिए, के रूप में की उम्मीद है. आर डीएलएस सिग्नल की कम तीव्रता के कारण ट्रिमर का निर्धारित नहीं किया जा सका।

मोनोमर शिखर पर परिकलित मोलर द्रव्यमान बिंदु 2-5% के भीतर एक समान होते हैं, जो एकरूपता को दर्शाते हैं। यह 38-50 केडीए की सीमा में मोलर द्रव्यमान के साथ एक पीछे कंधे खोजने के लिए असामान्य नहीं है, बीएसए टुकड़े70के लिए इसी . द्वि-अंगी तथा त्रिमकी शिखरों पर मोलर द्रव्यमान बिंदु एक समान नहीं होते हैं, जो विषमता का सूचक होते हैं। डिमर पीक डिमर पीक के निशान के कारण कुछ विषम है जो डिमर पीक में खून बह रहा है, और ट्रिमर पीक खराब-समाधान उच्च ओलिगोमर के सह-एल्यूशन के कारण विषम है।

मोनोमर चोटी के सिग्नल-टू-शोर स्तर सभी तीन संकेतों में काफी स्वीकार्य है, 100:1 से अधिक, के रूप में संकेत करने के लिए शोर के साथ dimer चोटी है 40:1. प्रोटीन चोटियों से परे क्रोमैटोग्राम क्षेत्रों फ्लैट हैं, एलएस ट्रेस में कुल बहिष्करण (void) मात्रा के पास कण के कारण एक चोटी के अपवाद के साथ और एक (नकारात्मक) नमक चोटी और एक (नकारात्मक) dRI ट्रेस में हवा चोटी भंग, कुल permeation के पास आयतन. चित्र 1कमें इन बातों का उल्लेख किया गया है .

शुद्धता के स्तर की गणना एसईसी-MALS प्रयोग में भी की जा सकती है: रिपोर्ट में एकमेरिक शिखर का द्रव्यमान अंश एकात्मक रूप की शुद्धता के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। बीएसए मोनोमर के लिए, परिकलित शुद्धता 88% है।

Figure 1
चित्र 1 : एक 200 pores आकार बहिष्कार स्तंभ का उपयोग कर गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) के एसईसी-MALS विश्लेषण. क्रोमैटोग्राम निशान मोनोमर चोटी के लिए सामान्यीकृत और स्पष्टता के लिए ऑफसेट कर रहे हैं। (ए) सामान्य कलाकृतियों, जिनकी उपेक्षा की जा सकती है, उनकी ओर संकेत दिया जाता है, जिसमें प्रकाश प्रकीर्णन संकेत की शुरुआत के निकट एक कण शिखर तथा अपवर्तक सूचकांक संकेत में कुल परमीशन आयतन के निकट लवण तथा भंग वायु चोटियों शामिल हैं। (बी) क्रोमैटोग्राम उत्कृष्ट मोनोमर-डिमर-ट्रिमर पृथक्करण और प्रकाश प्रकीर्णन संकेत उच्च संकेत-से-शोर दर्शाती है। मोनोमर और डाइमर मेगावाट मूल्य उच्च एकरूपता प्रदर्शित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : कम गुणवत्ता वाले एसईसी-MALS विश्लेषण के उदाहरण। क्रोमैटोग्राम निशान मोनोमर चोटी के लिए सामान्यीकृत और स्पष्टता के लिए ऑफसेट कर रहे हैं। (क) 75 ] छिद्र आकार बहिष्करण स्तंभ पर अपर्याप्त पृथक्करण; 8 - 9 मिनट के बीच एक कण चोटी अच्छी तरह से प्रोटीन से अलग नहीं है। (ख) अपर्याप्त संकेत-से-शोर अनुपात और प्रोटीन के निकट व्यापक कण प्रकाश प्रकीर्णन (एलएस) संकेत में स्पष्ट होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एसईसी-एमएल्स प्रयोग ने प्रत्येक चोटी के मोलर द्रव्यमान और हाइड्रोडायनामिक आकारों के लिए मोनोमर, डाइमर और ट्रिमर का अच्छा पृथक्करण और मात्रात्मक परिणाम प्रदान किए हैं। यह बारी में स्पष्ट रूप से दिखाता है और प्रत्येक प्रजातियों वर्तमान की विशेषता है, साथ ही शुद्धता की मात्रा निर्धारित. आमतौर पर प्राप्त परिणाम 5% के भीतर करने के लिए सटीक और repeatable के भीतर कर रहे हैं 1-2%3,69. परिशुद्धता और repeatability के इस स्तर को आत्मविश्वास से मेगावाट में बंद हो सकता है कि प्रजातियों के बीच अंतर करने के लिए संभव बनाता है, जब तक वे एसईसी द्वारा अलग कर रहे हैं (एक ही चोटी के भीतर आंशिक रूप से ओवरलैप हो सकता है). प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण और मौलिक जैव भौतिक लक्षण के लिए लाभ स्पष्ट कर रहे हैं.

कणों की अनुपस्थिति का सत्यापन संवेदनशील, दोहराने योग्य एसईसी-माल माप के लिए काफी महत्वपूर्ण है। कण चोटियों आम तौर पर तुलनीय यूवी या आरआई संकेतों के साथ संगत बड़े MALS संकेतों के रूप में दिखाई देते हैं। मोबाइल चरण और नमूना ध्यान से इस तरह के कणों को खत्म करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए। HPLC ग्रेड अभिकर्मकों या बेहतर का उपयोग करें, मोबाइल चरण के निस्पंदन और कमजोर पड़ने बफर करने के लिए 0.1 - 0.2 m (पूर्व धोने फिल्टर कणों कि हमेशा सूखी झिल्ली पर मौजूद हैं को खत्म करने के लिए), अतिरिक्त स्वच्छ मोबाइल चरण की बोतलों और अन्य कांच के बर्तन के रखरखाव के लिए SEC-MALS और विस्तारित स्तंभ संतुलन प्रवाह के तहत (कणों और समुच्चय को हटाने के लिए जो प्रवाह बंद कर दिया गया था या एक स्तंभ उपयोग में नहीं था, जमा हो सकता है) सभी की सिफारिश की जाती है। नमूना सबसे छोटी pores आकार है कि ब्याज की सामग्री को दूर नहीं करता है, आमतौर पर 0.1 डिग्री से बड़ा नहीं है और, यदि संभव हो तो, 0.02 डिग्री करने के लिए फ़िल्टर किया जाना चाहिए। यदि फिल्टर जल्दी से रोकना, नमूना centrifuged हो सकता है, अवरोही pores आकार के चरणों में फ़िल्टर, और / जब सिस्टम लगातार उच्च गुणवत्ता, ताजा और फ़िल्टर किए गए मोबाइल चरण के साथ बनाए रखा जाता है, स्तंभ झटके रोका जाता है, नमूने साफ कर रहे हैं और स्तंभ का पालन नहीं करते, माप ऊपर उल्लिखित कण शोर प्रदर्शन नहीं होगा और प्रदान करेगा उच्च गुणवत्ता वाले डेटा.

MALS प्रोटीन के लिए ठेठ एसईसी बफ़र्स के लिए नास्तिक है; पीबीएस के अलावा कई अन्य बफर सिस्टम जुदाई और स्थिरता का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, excipients71की एक किस्म सहित. MALS भी विशिष्ट स्तंभ है, जो इष्टतम जुदाई और वसूली के लिए चुना जाना चाहिए करने के लिए नास्तिक है. विश्लेषण के बारे में excipients के लिए प्राथमिक चिंताओं अपवर्तक सूचकांक में महत्वपूर्ण परिवर्तन कर रहे हैं, विशिष्ट अपवर्तक सूचकांक वृद्धि dn/dcके संशोधन के लिए अग्रणी, और excipients कि 280 एनएम अवशोषित जब यूवी विश्लेषण की जरूरत है. उदाहरण के लिए, arginine एक आम एकत्रीकरण कम excipient है कि नाटकीय रूप से एक ठेठ प्रोटीन के dn/dc को प्रभावित कर सकते हैं, यहां तक कि यह नकारात्मक शासन में लाने (नकारात्मक dn/dc के साथ एक प्रोटीन अभी भी एसईसी-MALS द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है अगर dn / डीसी अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाता है, लेकिन यदि dn/dc - 0 प्रोटीन द्वारा बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता शून्य हो जाएगा और मेगावाट विश्लेषण असंभव हो जाएगा). प्रोटीन के लिए dn/dc मूल्यों के विषय पर बड़े पैमाने पर चर्चा की है झाओ एट अल.35 जहां यह दिखाया गया है कि मानक जलीय बफ़र्स के लिए, असंशोधित प्रोटीन के विशाल बहुमत मानक मूल्य के 2-3% के भीतर गिर (0.185 या 0.186 एमएल/g पर $ 660 एनएम) यद्यपि 10 केडी से नीचे के प्रोटीन अधिक परिवर्तनशील होते हैं और कुछ प्रजातियां ऐसी प्रजातियां होती हैं जो 0ण्21 एमएल/ग्राम तक बढ़ सकती हैं।

प्रस्तुत डेटा में बीएसए मोनोमर और डिमर चोटियों भर में मेगावाट प्रोफाइल 2% या उससे कम के भीतर करने के लिए काफी सजातीय थे, मोनोdisperse प्रजातियों का संकेत. एक चोटी भर में गैर-यूनिफ़ॉर्म मेगावाट मूल्यों विषमता या अनुचित विश्लेषण से उत्पन्न हो सकता है। विशेष रूप से, एक बीएसए मेगावाट प्रोफ़ाइल है कि अवतल है ('मुस्कान') या उत्तल ('grimace') सही ढंग से बैंड-ब्रॉडिंग सुधार लागू नहीं करने से परिणाम हो सकता है. अन्य प्रोटीन के लिए, एक उत्तल प्रोफ़ाइल भी monomers और oligomers के बीच गतिशील संतुलन से उत्पन्न हो सकता है, जहां monomer के अनुपात oligomer के लिए और इसलिए स्पष्ट मेगावाट मूल्य चोटी एकाग्रता पर निर्भर करता है (BSA इस व्यवहार का प्रदर्शन नहीं करता है और अक्सर प्रयोग किया जाता है सही बैंड व्यापक मापदंडों को सत्यापित करने के लिए एक नियंत्रण नमूने के रूप में). एक मेगावाट प्रोफ़ाइल जो अग्रणी से पीछे के किनारे तक भिन्न होती है और नमूना सांद्रता के साथ परिवर्तित नहीं होती है, आणविक वजन प्रजातियों के वितरण की विशिष्ट है जो एसईसी द्वारा आंशिक रूप से हल की जाती हैं। गतिशील संतुलन आसानी से दूसरे से अलग है प्रोटीन की विभिन्न कुल मात्राओं का इंजेक्शन लगाकर जाहिरा तौर पर असमांग वितरण के स्रोत- वितरण गतिशील संतुलन के साथ भिन्न होगा, लेकिन एक निश्चित वितरण या गलत बैंड-ब्रॉडिंग सुधार के साथ नहीं।

ऊपर वर्णित बाधाओं को देखते हुए, एसईसी-माल ्स विभिन्न कार्यों के लिए उपयुक्त नहीं है। यह कच्चे तेल के नमूनों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है; नमूने मानक आत्मीयता और चमकाने के तरीकों से अच्छी तरह से शुद्ध किया जाना चाहिए. यह पर्याप्त सटीकता या म्यूटेंट और एक ही या बहुत करीब जन के साथ एक प्रोटीन या maAb के वेरिएंट की पहचान करने के लिए शक्ति को हल करने की शक्ति नहीं है, और analytes कि से या एक एसईसी स्तंभ पर अलग नहीं है के साथ इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, हालांकि हाल ही में यह दिखाया गया है कि आयन-exchang ई या रिवर्स चरण क्रोमैटोग्राफी को MALS के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि वे प्रजातियों को अलग और विशेषता में शामिल किया जा सके जो एसईसी72,73,74द्वारा हल नहीं की गई हैं . जहां प्रोटीन की मात्रा गंभीर रूप से विवश कर रहे हैं, एसईसी-MALS संभव नहीं हो सकता है क्योंकि यह आम तौर पर की आवश्यकता होती है 10 - 200 $g3 और भी अधिक एक FPLC प्रणाली द्वारा आवश्यक हो सकता है ट्यूबिंग आंतरिक व्यास से अधिक के साथ 0.25 मिमी; हालांकि, छोटी मात्रा UHPLC-SEC-MALS द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. मोबाइल चरण के परिचय पर समग्र अत्यधिक अस्थिर प्रोटीन एसईसी-MALS विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं, हालांकि ऑफ-लाइन गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन का उपयोग करके बफर अनुकूलन इस समस्याकोदूर कर सकता है।

अतिरिक्त प्रयास है कि एसईसी-MALS जरूरत पर जोर देता है के बावजूद, यह प्रोटीन अनुसंधान के लिए अमूल्य है और बड़े पैमाने पर शैक्षिक और biopharmaceutical समुदायों द्वारा प्रयोग किया जाता है. ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित मोनोमर, ओलिगोमर और समुच्चय की विशेषता के अलावा, एसईसी-मेल्स ग्लाइकोप्रोटीन जैसे संशोधित प्रोटीन की विशेषता की विशेषता कर सकते हैं (प्रोटीन और ग्लिकन घटकों के मेगावाट को व्यक्तिगत रूप से निर्धारित करना), सर्फैक्टेंट- या लिपिड-सोलुबिलाइज़्ड झिल्ली प्रोटीन (व्यक्तिगत रूप से प्रोटीन और solubilizer घटकों के मेगावाट का निर्धारण), प्रोटीन विधानसभाओं जैसे वायरस जैसे कण, प्रोटीन प्रोटीन और प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड कॉम्प्लेक्स, पॉलीसैकेराइड्स, प्रोटीन-पॉलीसैकराइड संयुग्मी, पेप्टाइड्स और कई अन्य जैव मैक्रो अणु।

Disclosures

डी एस Wyatt प्रौद्योगिकी निगम, जिसका MALS उत्पादों इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है के एक कर्मचारी है. एटी Danyel बायोटेक, Wyatt MALS और AKTA FPLC उपकरणों के एक वितरक के एक कर्मचारी है.

Acknowledgments

हम सलाह और सहयोग के लिए डॉ Tsafi डेनिएली (Wolfson सेंटर एप्लाइड स्ट्रक्चरल बायोलॉजी, हिब्रू विश्वविद्यालय के लिए धन्यवाद। हम भी सहायता और विश्लेषणात्मक FPLC-MALS इस अध्ययन में उपयोग की प्रणाली की स्थापना के लिए डैनियल बायोटेक लिमिटेड (Rehovot, इसराइल) धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AKTA pure GE Healthcare 29-0182-26 fast protein liquid chromatograph (FPLC) 
AKTA UNICORN GE Healthcare FPLC control software
ASTRA Wyatt Technology MALS data acquisition and analysis software
Bovine serum albumine (purity >97%) Sigma  A1900 analyte
DAWN or miniDAWN Wyatt Technology WH2 or WTREOS multi-angle light scattering (MALS) detector
Increase 200 10/300 GE Healthcare size exclusion column, 200 Å pores, 10 mm i.d., 300 mm length
Optilab Wyatt Technology WTREX differential refractive index (RI) detector
Sodium chloride NaCl Sigma  71382 HPLC grade NaCl
Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 µm 1000 mL  Millipore SCVPU11RE mobile phase filter
Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 µm GE Healthcare 6809-1002 sample filter
Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 µm pore, 10 mm diameter GE Healthcare 6809-1012 sample filter
Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 µm GE Healthcare 6809-2012 mobile phase filter
WyattQELS Wyatt Technology WIQ dynamic light scattering detector

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आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रोटीन की विशेषता मल्टी-एंगल लाइट स्कैटरिंग (एसईसी-मेल्स) के लिए जोड़ा गया
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Some, D., Amartely, H., Tsadok, A., Lebendiker, M. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (148), e59615, doi:10.3791/59615 (2019).

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