Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Karakterisering av proteiner av storlek-uteslutning kromatografi kopplad till multi-Angle ljus spridning (SEC-MALS)

doi: 10.3791/59615 Published: June 20, 2019

Summary

Detta protokoll beskriver kombinationen av storlek uteslutningskromatografi med flera vinklar ljus spridning (SEC-MALS) för absolut karakterisering av proteiner och komplex i lösning. SEC-MALS bestämmer molekyl vikt och storlek på rena proteiner, infödda oligomerer, heterokomplex och modifierade proteiner som glykoproteiner.

Abstract

Analytisk storlek-uteslutningskromatografi (SEC), som vanligen används för bestämning av molekyl vikten hos proteiner och protein komplex i lösning, är en relativ teknik som förlitar sig på analyternas elutionsvolym för att uppskatta molekyl ära Vikt. När proteinet inte är globulärt eller genomgår icke-ideala kolonninteraktioner är kalibrerings kurvan baserad på protein standarderna ogiltig, och den molekyl vikt som bestäms av elutionsvolymen är felaktig. Flervinkelljus spridning (MALS) är en absolut teknik som bestämmer molekyl vikten för en analyt i lösning från grundläggande fysikaliska ekvationer. Kombinationen av SEC för separation med MALS för analys utgör en mångsidig, pålitlig metod för att karakterisera lösningar av en eller flera protein arter inklusive monomerer, infödda oligomerer eller aggregat, och heterokomplex. Eftersom mätningen utförs vid varje elutionsvolym kan SEC-MALS avgöra om en elueringstopp är homogen eller heterogen och skiljer mellan en fast molekyl viktfördelning kontra dynamisk jämvikt. Det är också möjligt att analysera modifierade proteiner som glykoproteiner eller lipoproteiner, eller konjugat som lösnings medels lösliga membran proteiner. Därför är SEC-MALS ett kritiskt verktyg för proteinkemisten som måste bekräfta de biofysiska egenskaperna och lösnings beteendet hos molekyler som produceras för biologisk eller bioteknologisk forskning. Detta protokoll för SEC-MALS analyserar molekyl vikt och storlek av rena proteinmonomerer och aggregat. De data som förvärvas fungerar som en grund för ytterligare SEC-MALS analyser inklusive de av komplex, glykoproteiner och tensider-bundna membran proteiner.

Introduction

Tillförlitlig analys av molekyl vikten (MW) av proteiner i lösning är avgörande för biomolekylär forskning1,2,3,4. MW analys informerar forskaren om rätt protein har producerats och om det är lämpligt för användning i ytterligare experiment5,6. Som beskrivs på webbplatserna för protein forsknings nätverk P4EU7 och Arbre-mobieu8, måste kontroll av protein kvaliteten inte bara karakterisera produktens renhet utan även dess oligomeriska tillstånd, homogenitet, identitet, kon formation, struktur, ändringar efter översättningen och andra egenskaper.

MW-mätning i icke-denaturering lösning identifierar formen av proteinet som finns i en vatten miljö, vare sig monomer eller oligomeric. Medan det för många proteiner målet är att producera monomer form, för andra en specifik infödd Oligomer är nyckeln till biologisk aktivitet9,10,11,12. Andra Oligomerer och icke-infödda aggregat är oönskade och kommer att leda till brister i strukturell bestämning av kristallografi, nukleär magnetisk resonans (NMR) eller liten vinkel röntgen spridning, samt artefakter eller felaktigheter i funktionella analyser för att kvantifiera bindning genom Isotermisk titrering calorimetri eller ytplasmon resonans2,13.

När det gäller bio terapier som monoklonala anti kroppar (mAbs), har lösningsbaserad MW-analys ett liknande syfte med kvalitets kontroll och produktkaraktärisering. Överdriven ballast och fragment är ett tecken på en instabil produkt som inte är lämplig för humant bruk. Tillsynsmyndigheter kräver noggrann karakterisering, inte bara av den terapeutiska molekylen utan även potentiella nedbrytnings medel som kan förekomma i produkten14,15,16,17.

Några av de mest utbredda metoderna för att analysera protein MW är natriumdodecylsulfat polyakrylamidelektrofores (SDS-PAGE), kapillärelektrofores (CE), Ursprunglig sida, masspektrometri (MS), storlek-uteslutningskromatografi (SEC) och analytisk och ultracentrifugering (AUC). Av dessa, SDS-PAGE, CE och MS utförs inte i det ursprungliga tillståndet och typiskt leder till dissociation av Oligomerer och aggregat, därför är inte lämpliga för att bestämma den infödda Oligomer eller kvantifiera aggregat. Även om infödda PAGE gör, teoretiskt, behålla den infödda staten, i vår erfarenhet är det svårt att optimera för många proteiner, och resultaten är inte särskilt tillförlitliga. AUC, antingen genom sedimenteringshastighet eller sedimenteringsjämvikt, är kvantitativ och kan bestämma MW från första principer, men det är ganska besvärligt, kräver mycket manuellt arbete och betydande expertis inom data tolkning, lång experiment tid och en mycket dyrt instrument.

Analytical SEC är en kvantitativ och relativt robust, enkel metod som separerar makro molekyler under flödet genom en packad kolonn. De principer och tillämpningar av SEC är väl presenterade i flera recensioner18,19,20 och i hand boken "storlek uteslutning kromatografi: principer och metoder"21. Skillnaderna i retention beror på olika mängder av tid sprids in och ut ur porerna i den Station ära fasen innan avgivande från slutet av kolonnen. Skillnaderna uppstår (nominally) från släktingen storleksanpassar och diffusions koefficienterna av molekylerna22. En kalibrerings kurva konstrueras med hjälp av en serie referens molekyler, som hänför sig till molekyl-MW av molekylen till elutionsvolymen. För proteiner är referens molekylerna i allmänhet väluppförda, klotformiga proteiner som inte interagerar med kolonnen via laddning eller hydrofoba ytrester. Elutionsvolymen mäts med en ultraviolett (UV) absorbansdetektor. Om UV-utdöpningskoefficienten är känd-ofta beräknad från sekvensen-kan den totala protein massan också kvantifieras.

I synnerhet förlitar sig analysen av MW av SEC på två viktiga antaganden om de proteiner som skall karakteriseras: 1) de delar med referens standarderna samma kon formation och specifik volym (med andra ord samma förhållande mellan diffusions egenskaper och MW) och 2) som referens standarder, interagerar de inte med kolonnen utom av Sterisk egenskaper-de inte följer Kolonnpackning av laddning eller hydrofoba interaktioner. Avvikelser från dessa antaganden upphäver kalibrerings kurvan och leder till felaktiga MW-bestämningar. Detta är fallet för naturligt oordnade proteiner som har stora Stokes radier på grund av deras omfattande ostrukturerade regioner23,24 eller icke-sfäriska/linjära oligomeriska sammansättningar10. Glykosylerade proteiner kommer i allmänhet att ha en större Stokes radie än den icke-glykosylerade formen, även när den tillagda kolhydrat massan tas i beaktande19. Tvätt medel-solubilized membran proteiner eluera annorlunda än kalibrerings proteiner eftersom deras eluering från SEC beror på den totala storleken av polypeptid-rengörings medel-lipider komplex snarare än oligomeriska staten och molar massan av proteinet25 ,26. Kolonnens kemi, pH-och saltförhållanden påverkar alla elutionsvolymer av proteiner med laddade eller hydrofoba ytrester27,28.

SEC blir mycket mer mångsidig och pålitlig för MW bestämning i kombination med flera vinklar ljus spridning (mals) och differential brytnings index (dRI) detektorer3,4,11,29, 30,31,32. En dRI-detektor bestämmer koncentrationen baserat på förändringen i lösningens brytnings index på grund av närvaron av analyten. En MALS detektor mäter andelen ljus som sprids av en analyt i flera vinklar i förhållande till den infallande laser strålen. Tillsammans kallas SEC-MALS, denna instrumentering bestämmer MW oberoende av eluering tid eftersom MW kan beräknas direkt från första principer med hjälp av ekvation 1,

Equation 11

där M är analyternas molekyl vikt, R (0) det reducerade Rayleigh-förhållandet (dvs. mängden ljus som sprids av analyten i förhållande till laserintensiteten) som bestäms av en mals-detektor och extrapoleras till vinkel noll, c vikt koncentration som bestäms av UV-eller dRI-detektorn, DN/DC den brytnings index ökning av analyten (i huvudsak skillnaden mellan brytnings index för analyten och bufferten), och K en optisk konstant som beror på system egenskaper som våglängd och lösnings medels brytnings index29.

I SEC-MALS används SEC-kolumnen endast för att separera de olika arterna i lösningen så att de går in i MALS och koncentrations detektorns celler individuellt. Den faktiska retentions tiden har ingen betydelse för analysen utom så långt som hur väl den löser protein arterna. Instrumenten kalibreras oberoende av kolonnen och förlitar sig inte på referens standarder. Därför anses SEC-MALS som en "absolut" metod för MW-bestämning från grundläggande fysikaliska ekvationer. Om provet är heterogent och inte helt separeras av kolonnen, kommer det värde som anges vid varje elutionsvolym att vara ett viktmedelvärde av molekylerna i varje elutionvolym som flödar genom flödes cellen per tids segment, cirka 75 μL.

Genom analys av den kantiga variationen av spridningen intensitet, MALS kan också bestämma storleken (rot-Mean-kvadrat radie, Rg) av makro molekyler och nanopartiklar med geometrisk radie större än ca 12,5 NM29. För mindre arter som monomer proteiner och oligomerer, kan en dynamisk ljus spridnings (DLS) modul läggas till i MALS instrumentet för att mäta hydrodynamiska radier från 0,5 nm och upp33.

Medan antingen UV eller dRI koncentrations analys kan ge värdet av c i EQ. 1, användning av dRI föredras av två skäl: 1) dri är en universell koncentrations detektor, lämplig för att analysera molekyler som socker eller polysackarider som inte innehåller en UV- kromophore34; och 2) koncentrationen svar DN/DC av nästan alla rena proteiner i vatten buffert är densamma att inom en eller två procent (0,185 ml/g)35, så det finns ingen anledning att känna till UV-utdömningskoefficienten.

Användningen av SEC-MALS i protein forskning är ganska omfattande. I särklass de vanligaste tillämpningarna är att fastställa om ett renat protein är monomer eller Oligomer och graden av oligomerisering, och bedöma aggregat3,10,11,17, 31,36,37,38. Förmågan att göra det för rengörings medel-solubilized membran proteiner som inte kan karakteriseras av traditionella medel är särskilt uppskattad, och detaljerade protokoll för detta har publicerats31,39,40 , 41 , 42 , 43. andra vanliga användnings områden är att fastställa graden av post-translationell modifiering och polydispersitet av glykoprotein, lipoproteiner och liknande konjugat4,31,44 , 45 , 46 , 47, och bildandet (eller brist därav) och absolut stökiometri (i motsats till stökiometriskt förhållande) av heterokomplex inklusive protein-protein, protein-nukleinsyra och protein-polysackokomplexen24,46, 48,49,50,51,52; bestämning av monomer-dimer equilibrium dissociationskonstant49,53,54; och utvärdering av protein kon formation55,56. Bortom proteiner, SEC-mals är ovärderlig för karakterisering av peptider57,58, brett heterogena naturliga polymerer såsom hepariner59 och kitosaner60,61, små virus62 och de flesta typer av syntetiska eller bearbetadepolymerer 63,64,65,66. En omfattande bibliografi kan hittas i litteraturen67 och online (på http://www.Wyatt.com/bibliography).

Här presenterar vi ett standard protokoll för att köra och analysera ett SEC-MALS experiment. Bovint serumalbumin (BSA) presenteras som ett exempel för separation och karakterisering av proteinmonomerer och oligomerer. BSA-protokollet bestämmer vissa systemkonstanter som fungerar som en grund för ytterligare SEC-MALS analyser, inklusive de av komplex, glykoproteiner och tensider-bundna membran proteiner.

Vi noterar att SEC-MALS kan utföras med hjälp av standard högeffektiv vätskekromatografi (HPLC) eller snabb proteinvätskekromatografi (FPLC) utrustning från många leverantörer. Detta protokoll beskriver användningen av ett FPLC-system som vanligt vis finns i laboratorier som producerar proteiner för forskning och utveckling (se tabell över material). Innan protokollet kördes bör FPLC-systemet, MALS-och dRI-detektorer ha installerats, tillsammans med sina respektive mjukvaru paket för kontroll, data insamling och analys per tillverkares instruktioner och eventuella erforderliga kalibreringskonstanter eller andra inställningar som anges i program varan. Ett inline-filter ska placeras mellan pumpen och injektorn med en hydrofil, 0,1 μm pormembran installerat.

Protocol

1. beredning av systemet

  1. Anslut MALS-och dRI-detektorerna nedströms FPLC: s UV-detektor. Bypass pH och konduktivitet detektorer eftersom de kommer att lägga betydande interdetector volym mellan UV-och MALS detektorer. Använd kapillärrör av 0,25 mm i.d. från kolonnen till och mellan detektorerna, och 0,75 mm i.d. kapillärslangar på utgången av detektorerna att slösa eller fraktion samlare.
  2. Se till att nödvändiga signal anslutningar mellan FPLC och detektorer har upprättats, inklusive analog utgång från UV-detektorn till den analoga ingången MALS och digital utgång från FPLC till MALS Autoinjicera, via FPLC: s I/O-Box.
  3. Installera en lämplig analytisk SEC-kolumn som täcker ett fraktioneringsintervall på minst 20 kDa till 500 kDa. Kontrol lera produkt informationen för att avgöra om kolumnen är lämplig för intervallet MW, pH och andra egenskaper i provet och mobil fas.

2. beredning av buffert, f lushing systemet över natten och kontroll renlighet

  1. Bered 1 L fosfatbuffrad saltlösning med 50-100 mM NaCl med HPLC-klassreagenser. Filtrera bufferten till 0,1 μm med hjälp av ett Flask topp-polyetersulfon-filter eller liknande. Filtrera den första 50-100 mL buffert till en avfalls flaska och kassera, för att eliminera partiklar från torra filter, och sedan filtrera resten till en ren, steril flaska som har tvättats grundligt med filtrerat, avjoniserat vatten och utjämnat för att förhindra damm tränger in.
    Anmärkning: andra mobila fas lösnings medel som en tris buffert kan användas om ytterligare proteiner som företrädes vis löses i dessa lösnings medel ska analyseras.
  2. Spola över natten med en flödes hastighet på 0,5 mL/min, eller som på annat sätt rekommenderas av kolonntillverkaren, för att jämnta kolonnen i bufferten och avlägsna partiklar. Använd FPLC: s kontinuerliga flödes läge och se till att flödet inte stannar förrän alla SEC-mals körs är kompletta.
    1. Placera dRI-flödescellen i rensnings läge under natten. Stäng av avrensningen innan du påbörjar prov körningar.
    2. När du börjar spola, gradvis ramp flödet för att förhindra "kolumn shedding" effekt (eller frisättning av partiklar) som orsakas av en plötslig förändring av trycket i kolonnen.
    3. Om systemet är känt för att vara ganska stabilt och partikel fritt, och i jämvikt med den önskade mobila fasen, Ersätt natten spola med en kortare, 2-3 h Flush.
  3. Kontrol lera systemets renhet genom att knacka lätt på slangen nedströms i kolonnen för att frigöra ackumulerade partiklar och observera signalen i 90 °-detektorn på front panelens display på MALS-instrumentet. Kontrol lera att Peak-to-Peak buller är högst 50-100 μV.
  4. Utför en "blind" injektion för att kontrol lera att injektorn är ren från partiklar. En "blank" är helt enkelt löpbufferten, beredd i en fräsch, steril injektions flaska.
    1. Om partikel toppen är högst 1 mL i volym och inte mer än 5 mV över bas linjen, är systemet klart för prover. Annars, utföra ytterligare tomma injektioner tills ren, eller utföra underhåll för att rengöra injektorn.

3. förberedelse och lastning av provet

  1. Bered minst 200 μL BSA vid 1-2 mg/mL i SEC-bufferten.
    Anmärkning: för att förhindra utfällning ska BSA aldrig lösas upp i rent vatten.
  2. Filtrera proteinet till 0,02 μm med hjälp av ett sprutspets filter.
  3. Kassera de första dropparna av filtratet för att eliminera partiklar från de torra filtren.
  4. Alternativt Centrifugera provet vid 10 000 x g i 15 minuter för att möjliggöra utfällning av olösliga aggregat och andra stora partiklar.
  5. Injicera 100 μL av BSA-lösningen i slingan.
    Anmärkning: detta är den rekommenderade mängden material, och mer eller mindre kan injiceras i enlighet med omständigheterna i provet, såsom stabilitet eller tillgänglighet. Mängden protein som krävs per injektion varierar omvänt med molekyl vikt-dubbelt så mycket protein massa behövs om molekyl vikten är 33 kDa, eller hälften av BSA.

4. förberedelse av program varan MALS

  1. Öppna nytt | Experimentera från metod i program menyn mals och välj online -metoden från mappen Light scattering system metoder. Om en DLS-detektor är närvarande, Välj online -metoden från ljus spridningen | Med QELS -mappen.
  2. Ange parametrar för provet och mobil fasen i avsnittet konfiguration .
    1. I den allmänna pumpvyn anger du den flödes hastighet som används i FPLC.
    2. I den generiska pumpvyn , solvent Branch, namn fältet, Välj PBS.
    3. I Injektorvyn , exempel grenen, ange namnet som BSAoch ange DN/DC = 0,185 (STANDARDVÄRDET för oförändrade proteiner), a2 = 0 och UV-utdöningskoefficient = 0,667 ml/(mg-cm).
      Anmärkning: för andra proteiner, UV280 nm utdöningskoefficient kan hittas i litteraturen eller beräknas från dess sekvens med hjälp av olika offentliga-domän mjukvaru verktyg.
  3. I avsnittet procedurer , grundläggande uppsamlingsvy , markerar du kryss rutan utlösare på autoinjicera och anger varaktigheten för körningen till 70 min så att data samlas in för hela elueringen tills den totala permeationsvolymen för SEC kolumnen har nåtts.
    Obs: den tid som krävs kan variera med kolonn och flödes hastighet-35 min av uppsamling krävs för en standard 7,8 mm x 300 mm HPLC-SEC kolumn vid 0,5 mL/min.
  4. Starta experimentet i program varan MALS genom att klicka på Run -knappen. Det kommer att börja läsa data efter att ha fått puls signalen från FPLC instrumentet via MALS detektorn.
  5. Nollstyr dRI-signalen genom att klicka på Autozero -knappen på instrumentets front panel.

5. beredning av FPLC-programvaran

  1. Sätt in namnet på proteinet och springa i FPLC-programvaran, i manual | Utför manuella instruktioner | Ange markering.
  2. Byt insprutnings ventil från manuell belastning till injicering under flödes väg | Insprutnings ventil.
  3. Inkludera en puls signal genom att föra in en 0,5 puls under i/O-boxen | Pulse Digital ut. Detta kommer att utlösa data insamling i MALS program vara.

6. injicera provet i slingan. Klicka på kör i FPLC-programvaran för att starta experiment körningen.

7. analys av SEC-MALS BSA-data

  1. Utför analys, steg för steg, under avsnittet procedurer i mals program vara.
    1. Kontrol lera att topparna visas vid ungefär samma elutionsvolym i UV-, MALS-och RI-läge genom att kontrol lera den grundläggande samlingen .
    2. I baslinjevyn definierar du bas linjen för alla signaler (alla ls-detektorer, UV-och dRI). Bas linjerna bör definieras för att indikera nivån av rent lösnings medel, vilket är att föredra att sträcka sig från ena sidan av prov topparna till den andra.
    3. I Peaks -vyn definierar du de toppar som ska analyseras genom att klicka och dra musen. Välj den centrala 50% av varje topp. Välj först monomer Peak ("Peak 1") och sedan dimertoppen ("Peak 2"). Kontrol lera korrekta värden för DN/DC = 0,185 och UV 280 nm utdöningskoefficient = 0,667 för BSA under varje topp.
  2. Utför topp justering, korrigering av band breddning och normaliserings procedurer.
    Anmärkning: normalt SEC-MALS metoden kalibreras regelbundet för Peak Alignment, band breddning och normalisering av vinkel detektorer till 90 ° detektor med ett monodisperse protein med radie av Gyration Rg < 10 nm såsom BSA Monomer. I det här exemplet fungerar BSA både som kalibrerings molekyl och är själv föremål för MW-analys.
    1. I förfarandena | Justerings läge, Välj det centrala området i topparna genom att klicka och dra med musen, klicka på Justera signaler och sedan på OK.
    2. I förfarandena | Band bredda View, Välj den centrala 50% av monomer topp. Se till att RI-detektorn är specificerad som referens instrumentoch klicka sedan på utför pass form och applicera för att matcha UV-och ls-signalerna mot RI-signalen.
      1. Zooma in i topparna för att kontrol lera att de överlappar mycket nära varandra i det centrala 50-70% och klicka sedan på OK.
      2. Om överlappningen inte är perfekt, (det kan vara nödvändigt att) utföra pass form och "tillämpa" en eller två gånger tills överlappningen är utmärkt.
    3. I förfarandena | Normaliserings läge, Välj topp 1, ange 3,0 nm som Rg -värde, klicka på normalisera och sedan på OK.
    4. I förfarandena | Molar Mass och rg från MALS Visa, granska data för att avgöra vilka, om någon, detekterings vinklar bör avmarkeras från analysen på grund av överdrivet brus. Typiskt, dessa kommer att vara de lägre vinklar som damm partiklar skingra en relativt hög intensitet. Välj enskilda sektorer inom topparna från grafen till höger och Visa det kantiga beroendet av det omvända reducerade Rayleigh-förhållandet i grafen till vänster. Om de lägsta (och ibland de högsta) vinklarna konsekvent avviker kraftigt från pass formen, avmarkerar du dem i listan längst ned i vyn.
  3. Visa diagrammets resultat i EASI Graph -vyn. Välj molar Mass från rullgardinsmenyn som visas överst i fönstret. Använd Ctrl + klicka och dra för att zooma in på topp regionen.
  4. Visa den slutliga tabellerade vikt-genomsnittliga molar massa resultat för monomer och dimer toppar i resultaten | Rapport (Sammanfattning) Visa under Peak resultat | Molar massa stunder (g/mol) | Och MW. Renhet rapporteras under Peak resultat | Mass fraktion (%).
    Obs: andra molar massa stunder visas också; dessa är vanligt vis relevanta för heterogena polymerer, men inte för proteiner med diskreta storlekar. Många andra resultat som produceras av program varan kan ingå i rapporten såsom procentuell Mass återhämtning (den del av protein som elueras via koncentrations detektorn i förhållande till den injicerade mängden), Peak statistik, polydispersitet, Rg och Rh stunder, etc. När de tillhandahålls, återspeglar mät osäkerheten precisionen hos det värde som anges på grund val av bullret inom mätnings serien och bör inte anses representera noggrannheten. Den sanna noggrannheten hos de redovisade värdena beror på olika faktorer såsom noggrannheten hos de tillhandahållna DN/DC -och annulleringskoefficienten, instrument kalibrering etc.
  5. Välj Spara som metodArkiv -menyn och spara de analyserade BSA-data som en standard metod för framtida mätningar av alla typer av proteiner. Normaliserings-och band breddning parametrarna som fastställts för BSA kommer att föras över i analysen.

Representative Results

Figur 1a, b visar att tre oligomeriska former av BSA: monomer, dimer och trimer var väl åtskilda på 200 å porkolonn med bas upplösning av monomer och dimer, medan figur 2A visar att separation på en porkolonn 75 å inte uppnå god monomer-dimer upplösning. Det sistnämnda exemplet ingick för att illustrera ett "dåligt" resultat. dessa skillnader i separation för de två kolumnerna kan i själva verket förväntas enligt tillverkarens angivna separations intervall. Den trimer är inte helt skild från dimer och högre oligomerer är inte väl åtskilda från trimer och varandra. Figur 2b är ett exempel på bullrig ljus spridnings signal med partiklar som finns i kromatogrammet, vilket utesluter noggrann MW-bestämning.

Hädanefter fokuserar vi på figur 1b. Monomeren, som elueras på 13,8 mL, uppvisar en vikt-genomsnittlig molar massa Mw på 64,1 ± 0,4 KDA fastställd med mals och hydrodynamisk radie Rh på 3,54 ± 0,01 nm. Dessa resultat är i överensstämmelse med sekvensen massa och känd hydrodynamisk radie BSA, 66,4 kDa och 3,5 NM respektive68, att inom den vanliga noggrannheten av SEC-mals, 5%3,69. Dimeren, som eluerade på 12 mL, uppvisade ett Mw -värde på 127 ± 1 KDA fastställd av mals-som förväntat, dubbelt så mycket som monomeren till inom experimentell precision-och Rh på 5,68 ± 0,06 nm. Den trimertopp observerades också vid 11 mL med Mw av 194 ± 9 KDA bestäms av mals, tre gånger så mycket som monomeren till inom experimentell precision, som förväntat. R h av trimeren kunde inte bestämmas på grund av låg intensitet av DLS-signalen.

De molara Mass poäng som beräknats över monomertoppen är enhetliga till 2-5%, vilket indikerar homogenitet. Det är inte ovanligt att hitta en avslutande axel med molar massa i intervallet 38-50 kDa, motsvarande BSA fragment70. Den molara massan punkter över dimeriskt och trimeric toppar är inte enhetliga, vilket tyder på heterogenitet. Den dimertopp är något heterogen på grund av spår av trimer som blöder in i dimer topp, och trimer toppen är heterogen på grund av samtidig eluering av dåligt lösta högre oligomerer.

Signal-till-brus-nivå av monomer toppen är helt acceptabelt i alla tre signaler, över 100:1, som är dimer topp med signal-till-brus av 40:1. Kromatogramregioner bortom protein topparna är plana, med undantag för en topp på grund av partiklar nära den totala uteslutnings volymen (void) i LS-spåret och en (positiv) salttopp och en (negativ) upplöst luft topp i dRI-spåret, nära den totala permeationen Volym. Dessa påpekades i figur 1a.

Renhets grad kan också beräknas i ett SEC-MALS experiment: Mass fraktion av den monomeriska toppen i rapporten representerar procent av renhet av den monomer formen. För BSA monomer är den beräknade renheten 88%.

Figure 1
Figur 1 : SEC-mals analys av bovint serumalbumin (BSA) med hjälp av en 200 Å porstorlek-uteslutning kolumn. Kromatogramspårningar normaliseras till monomertoppen och förskjuts för tydlighetens skull. (A) vanliga artefakter som kan ignoreras är påpekade, inklusive en partikel topp nära början av ljus spridnings signalen samt salt och upplöst luft toppar nära den totala genomträngning volymen i brytnings index signalen. B kromatogrammet uppvisar utmärkt separering av monomer-dimer-trimer och ljus spridnings signalen uppvisar hög signal-till-brus. Monomeren och Dimeren MW värderar uppvisar hög homogenitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Exempel på låg kvalitet SEC-mals analyser. Kromatogramspårningar normaliseras till monomertoppen och förskjuts för tydlighetens skull. (A) otillräcklig separation på en porstorlek på 75 Å. en partikel topp mellan 8-9 min är inte väl skild från proteinerna. (B) otillräckligt signal-brus-förhållande och omfattande partiklar intill proteinerna är uppenbara i ljus spridningen (ls) signalen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den SEC-MALS experiment har gett god separation av monomer, dimer och trimer, och kvantitativa resultat för molar massorna och Hydro dynamiska storlekar av varje topp. Detta i sin tur tydligt identifierar och karakteriserar varje art närvarande, samt kvantifiera renhet. Vanligt vis de erhållna resultaten är korrekta till inom 5%, och exakt och repeterbara till inom 1-2%3,69. Denna nivå av precision och repeterbarhet gör det möjligt att tryggt skilja mellan arter som kan vara nära i MW, så länge de skiljs åt av SEC (kan delvis överlappa inom samma topp). Fördelarna för protein kvalitets kontroll och grundläggande biofysisk karaktärisering är uppenbara.

Verifiering av frånvaron av partiklar är ganska viktigt för känsliga, repeterbara SEC-MALS mätningar. Partikel toppar visas i allmänhet som stora MALS signaler utan sällskap av jämförbara UV-eller RI-signaler. Den mobila fasen och provet bör förberedas noggrant för att eliminera sådana partiklar. Användning av HPLC-grade reagenser eller bättre, filtrering av Rörlig fas och utspädnings buffert till 0,1-0,2 μm (för tvättning av filtret för att eliminera partiklar som alltid finns på torra membran), underhåll av extra rena mobila fas flaskor och andra glas varor för SEC-MALS och utökad kolumn jämvikt under flöde (för att ta bort partiklar och aggregat som kan ha samlats när flödet stoppades eller en kolumn som inte används) rekommenderas. Provet ska filtreras till den minsta porstorlek som inte tar bort det material som är av intresse, vanligt vis inte större än 0,1 μm och, om möjligt, 0,02 μm. Om filtret snabbt träskor, kan provet centrifugeras, filtreras i etapper av fallande porstorlek, och/eller re-renas. När system konsekvent upprätthålls med hög kvalitet, fräsch och filtrerad mobil fas, är spalt chocker förhindras, proverna är rena och inte hålla sig till kolonnen, kommer mätningarna inte uppvisar de ovan nämnda partikel buller och kommer att ge högkvalitativa data.

MALS är agnostiker till typiska SEC buffertar för proteiner; många andra buffertsystem förutom PBS kan användas för att optimera separation och stabilitet, inklusive en mängd hjälp ämnen71. MALS är också agnostiker till den specifika kolumnen, som bör väljas för optimal separation och återhämtning. Den primära oro för hjälp ämnen om analys är betydande förändringar i brytnings index, vilket leder till modifiering av den specifika brytnings index ökning DN/DC, och hjälp ämnen som absorberar 280 nm när UV-analys behövs. Till exempel, arginin är en vanlig agg regering-reducerande hjälp ämne som dramatiskt kan påverka DN/DC av ett typiskt protein, även föra in den i den negativa regimen (ett protein med negativ DN/DC kan fortfarande analyseras av SEC-mals om DN/ DC bestäms empiriskt, men om DN/DC = 0 intensiteten av ljuset sprids av proteinet kommer att vara null och MW analys kommer att vara omöjligt). Ämnet för DN/DC -värden för proteiner diskuteras utförligt av Zhao et al.35 där det visas att för vanliga vattenbuffertar, den stora majoriteten av oförändrade proteiner faller inom 2-3% av normalvärdet (0,185 eller 0,186 ml/g vid = 660 nm) , även om proteiner under ~ 10 kDa är mer varierande, och det finns några arter som kan gå så högt som 0,21 mL/g.

MW-profilerna över BSA monomer och dimer toppar i de presenterade uppgifterna var både ganska homogena till inom 2% eller mindre, vilket tyder på monodisperse arter. Icke-enhetliga MW-värden över en topp kan uppstå av heterogenitet eller felaktig analys. I synnerhet kan en BSA MW-profil som är konkav ("leende") eller konvex ("grimace") resultera från att inte korrekt tillämpa korrigering av band breddning. För andra proteiner kan en konvex profil också uppstå från dynamisk jämvikt mellan monomerer och oligomerer, där förhållandet mellan monomer till Oligomer-och därav det uppenbara MW-värdet-beror på maximal koncentration (BSA uppvisar inte detta beteende och används ofta som ett kontroll prov för att kontrol lera korrekta band breddning parametrar). En MW-profil som skiljer sig från den som leder till den bakre kanten och inte ändras med prov koncentrationen är typisk för en fördelning av molekyl vikt arter som delvis löses av SEC. dynamisk jämvikt skiljer sig lätt från den andra källor till synes ohomogena distributioner genom att injicera olika totala mängder protein-distributionen kommer att variera med dynamisk jämvikt men inte med en fast fördelning eller felaktig band breddning korrigering.

Med tanke på de begränsningar som beskrivs ovan är SEC-MALS inte lämplig för olika uppgifter. Det lämpar sig inte för analys av råprover; proverna bör vara väl renade med standard affinitet och poler metoder. Den har inte tillräcklig noggrannhet eller upplösnings förmåga för att identifiera mutanter och varianter av ett protein eller mAb med samma eller mycket nära vikt, och kan inte användas med analyter som inte eluera från eller separat på en SEC-kolumn, men nyligen har det visats att Jon-exchang e eller omvänd fas kromatografi kan kombineras med mals för att separera och karakterisera arter som inte löses av SEC72,73,74. Om proteinkvantiteterna är kraftigt begränsade kan det hända att SEC-MALS inte är genomförbart, eftersom det vanligt vis krävs 10-200 μg3 och ännu mer kan krävas av ett FPLC-system med en innerdiameter på slangen som är större än 0,25 mm. mindre kvantiteter kan dock analyseras med UHPLC-SEC-MALS. Mycket instabila proteiner som aggregeras vid introduktion till den mobila fasen är inte lämpliga för SEC-MALS analys, men buffert optimering med off-line dynamisk ljus spridning kan övervinna detta problem75.

Trots den extra ansträngning som SEC-MALS innebär, är det ovärderligt för protein forskning och används flitigt av den akademiska och bio farmaceutiska grupper. Förutom karakterisering av monomerer, Oligomerer och aggregat som beskrivs i protokollet ovan, kan SEC-mals karakterisera modifierade proteiner såsom glykoproteiner (bestämning av MW av proteinet och glykananalys komponenter individuellt), tensiden-eller membran proteiner (bestämning av MW av proteiner och solubilizer komponenter individuellt), protein sammansättningar såsom virusliknande partiklar, protein-protein-och protein-nukleinsyrakomplex, polysackarider, protein-Polysaccharide konjugat, peptider och många andra biomakromolecules.

Disclosures

DS är anställd av Wyatt Technology Corporation, vars MALS produkter används i detta protokoll. AT är anställd i Danyel Biotech, en distributör av Wyatt MALS och AKTA FPLC instrument.

Acknowledgments

Vi tackar Dr Tsafi Danieli (Wolfson centrum för tillämpad struktur bio logi, hebreiska universitetet) för rådgivning och samarbeten. Vi tackar också Daniel Biotech Ltd (Rehovot, Israel) för att hjälpa och etablera det analytiska FPLC-MALS system som används i denna studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AKTA pure GE Healthcare 29-0182-26 fast protein liquid chromatograph (FPLC) 
AKTA UNICORN GE Healthcare FPLC control software
ASTRA Wyatt Technology MALS data acquisition and analysis software
Bovine serum albumine (purity >97%) Sigma  A1900 analyte
DAWN or miniDAWN Wyatt Technology WH2 or WTREOS multi-angle light scattering (MALS) detector
Increase 200 10/300 GE Healthcare size exclusion column, 200 Å pores, 10 mm i.d., 300 mm length
Optilab Wyatt Technology WTREX differential refractive index (RI) detector
Sodium chloride NaCl Sigma  71382 HPLC grade NaCl
Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 µm 1000 mL  Millipore SCVPU11RE mobile phase filter
Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 µm GE Healthcare 6809-1002 sample filter
Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 µm pore, 10 mm diameter GE Healthcare 6809-1012 sample filter
Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 µm GE Healthcare 6809-2012 mobile phase filter
WyattQELS Wyatt Technology WIQ dynamic light scattering detector

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Acton, T. B., et al. Robotic cloning and Protein Production Platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Methods in Enzymology. 394, 210-243 (2005).
  2. Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 493, 21-60 (2011).
  3. Folta-Stogniew, E., Williams, K. R. Determination of molecular masses of proteins in solution: Implementation of an HPLC size exclusion chromatography and laser light scattering service in a core laboratory. Journal of Biomolecular Technology. 10, (2), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19499008 51-63 (1999).
  4. Kendrick, B. S., Kerwin, B. A., Chang, B. S., Philo, J. S. Online size-exclusion high-performance liquid chromatography light scattering and differential refractometry methods to determine degree of polymer conjugation to proteins and protein-protein or protein-ligand association states. Analytical Biochemistry. 299, (2), 136-146 (2001).
  5. Hughes, C. S., Longo, E., Phillips-Jones, M. K., Hussain, R. Quality control and biophysical characterisation data of. Data Brief. 14, 41-47 (2017).
  6. Muthurajan, U., et al. In Vitro Chromatin Assembly: Strategies and Quality Control. Methods in Enzymology. 573, 3-41 (2016).
  7. P4EU. Protein Quality Standard PQS. https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs (2019).
  8. Arbre Mobieu. Guidelines on Protein Quality Control. https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control/ (2019).
  9. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42, (9), 6038-6051 (2014).
  10. Bowman, G. R., et al. Oligomerization and higher-order assembly contribute to sub-cellular localization of a bacterial scaffold. Molecular Microbiology. 90, (4), 776-795 (2013).
  11. Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods in Molecular Biology. 328, 97-112 (2006).
  12. Vieux, E. F., Wohlever, M. L., Chen, J. Z., Sauer, R. T., Baker, T. A. Distinct quaternary structures of the AAA+ Lon protease control substrate degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (22), E2002-E2008 (2013).
  13. Group, N.S.. use of SEC-MALS in crystallization QC. http://www.nesg.org/documents/protein_aggregation_screening.pdf (2018).
  14. Ahrer, K., Buchacher, A., Iberer, G., Josic, D., Jungbauer, A. Analysis of aggregates of human immunoglobulin G using size-exclusion chromatography, static and dynamic light scattering. Journal of Chromatography A. 1009, (1-2), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13677648 89-96 (2003).
  15. Narhi, L. O., Schmit, J., Bechtold-Peters, K., Sharma, D. Classification of protein aggregates. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101, (2), 493-498 (2012).
  16. Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31, (8), 753-758 (2013).
  17. Philo, J. S. A critical review of methods for size characterization of non-particulate protein aggregates. Current Pharmaceutical Biotechnology. 10, (4), 359-372 (2009).
  18. Stellwagen, E. Gel filtration. Methods in Enzymology. 463, 373-385 (2009).
  19. Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).
  20. Striegel, A. M., Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography. John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ, USA. (2009).
  21. GE Healthcare. Size Exclusion Chromatography: Principles and Methods. https://cdn.gelifesciences.com/dmm3bwsv3/AssetStream.aspx?mediaformatid=10061&destinationid=10016&assetid=11639 (2014).
  22. Uliyanchenko, E. Size-exclusion chromatography-from high-performance to ultra-performance. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406, (25), 6087-6094 (2014).
  23. Dunker, A. K., Silman, I., Uversky, V. N., Sussman, J. L. Function and structure of inherently disordered proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18, (6), 756-764 (2008).
  24. Hsiao, H. H., Nath, A., Lin, C. Y., Folta-Stogniew, E. J., Rhoades, E., Braddock, D. T. Quantitative characterization of the interactions among c-myc transcriptional regulators FUSE, FBP, and FIR. Biochemistry. 49, (22), 4620-4634 (2010).
  25. Hayashi, Y., Takagi, T., Maezawa, S., Matsui, H. Molecular weights of alpha beta-protomeric and oligomeric units of soluble (Na+, K+)-ATPase determined by low-angle laser light scattering after high-performance gel chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 748, (2), 153-167 (1983).
  26. Folta-Stogniew, E. J. Macromolecular Interactions: Light Scattering. Encyclopedia of Life Sciences. (2009).
  27. Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography and Related Technology. 35, (20), 2923-2950 (2012).
  28. Chakrabarti, A. Separation of Monoclonal Antibodies by Analytical Size Exclusion Chromatography. Antibody Engineering. (2018).
  29. Wyatt, P. J. Light scattering and the absolute characterization of macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272, (1993).
  30. Takagi, T. Application of low-angle laser light scattering detection in the field of biochemistry: review of recent progress. Journal of Chromatography A. 506, 51-63 (1990).
  31. Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Analytical Biochemistry. 240, (2), 155-166 (1996).
  32. Mogridge, J. Using light scattering to determine the stoichiometry of protein complexes. Methods in Molecular Biology. 1278, 233-238 (2015).
  33. Larkin, M., Wyatt, P. J. Light-Scattering Techniques and their Application to Formulation and Aggregation Concerns. Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing Biopharmaceuticals. (2010).
  34. Wolfender, J. L. HPLC in Natural Product Analysis: The Detection Issue. Planta Medica. 75, (07), 719-734 (2009).
  35. Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. On the distribution of protein refractive index increments. Biophysical Journal. 100, (2011).
  36. Serebryany, E., Folta-Stogniew, E., Liu, J., Yan, E. C. Homodimerization enhances both sensitivity and dynamic range of the ligand-binding domain of type 1 metabotropic glutamate receptor. FEBS Letters. 590, (23), 4308-4317 (2016).
  37. Arakawa, T., Wen, J. Size-exclusion chromatography with on-line light scattering. Current Protocols in Protein Science. Chapter 20, Unit 20.6 (2001).
  38. Müller, R., et al. High-resolution structures of the IgM Fc domains reveal principles of its hexamer formation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, (25), 10183-10188 (2013).
  39. Slotboom, D. J., Duurkens, R. H., Olieman, K., Erkens, G. B. Static light scattering to characterize membrane proteins in detergent solution. Methods. 46, (2), 73-82 (2008).
  40. Miercke, L. J., Robbins, R. A., Stroud, R. M. Tetra detector analysis of membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 77, 1-30 (2014).
  41. Gimpl, K., Klement, J., Keller, S. Characterising protein/detergent complexes by triple-detection size-exclusion chromatography. Biological Procedures Online. 18, (1), 4 (2016).
  42. Korepanova, A., Matayoshi, E. D. HPLC-SEC characterization of membrane protein-detergent complexes. Current Protocols in Protein Science. Chapter 29, 1-12 (2012).
  43. Roy, A., Breyton, C., Ebel, C. Analytical Ultracentrifugation and Size-Exclusion Chromatography Coupled with Light Scattering for Characterization of Membrane Proteins in Solution. Membrane Proteins Production for Structural Analysis. (2014).
  44. Hastie, K. M., et al. Crystal structure of the prefusion surface glycoprotein of the prototypic arenavirus LCMV. Nature Structural & Molecular Biology. 23, (6), 513-521 (2016).
  45. Pallesen, J., et al. Structures of Ebola virus GP and sGP in complex with therapeutic antibodies. Nature Microbiology. 1, (9), 16128 (2016).
  46. Micoli, F., Adamo, R., Costantino, P. Protein Carriers for Glycoconjugate Vaccines: History, Selection Criteria, Characterization and New Trends. Molecules. 23, (6), (2018).
  47. Li, J., et al. Characterizing the Size and Composition of Saposin A Lipoprotein Picodiscs. Analytical Chemistry. 88, (19), 9524-9531 (2016).
  48. Crichlow, G. V., et al. Dimerization of FIR upon FUSE DNA binding suggests a mechanism of c-myc inhibition. EMBO Journal. 27, (1), 277-289 (2008).
  49. Kapoor, N., Gupta, R., Menon, S. T., Folta-Stogniew, E., Raleigh, D. P., Sakmar, T. P. Nucleobindin 1 is a calcium-regulated guanine nucleotide dissociation inhibitor of G{alpha}i1. Journal of Biological Chemistry. 285, (41), 31647-31660 (2010).
  50. Pirruccello, M., Swan, L. E., Folta-Stogniew, E., De Camilli, P. Recognition of the F&H motif by the Lowe syndrome protein OCRL. Nature Structural & Molecular Biology. 18, (7), 789-795 (2011).
  51. Lockyer, K., Gao, F., Derrick, J. P., Bolgiano, B. Structural correlates of carrier protein recognition in tetanus toxoid-conjugated bacterial polysaccharide vaccines. Vaccine. 33, (11), 1345-1352 (2015).
  52. Steinbach, T., Wurm, F. R. Degradable Polyphosphoester-Protein Conjugates: "PPEylation" of Proteins. Biomacromolecules. 17, (10), 3338-3346 (2016).
  53. Das, S., Stivison, E., Folta-Stogniew, E., Oliver, D. Reexamination of the role of the amino terminus of SecA in promoting its dimerization and functional state. Journal of Bacteriology. 190, (21), 7302-7307 (2008).
  54. Reshetnyak, A. V., et al. The strength and cooperativity of KIT ectodomain contacts determine normal ligand-dependent stimulation or oncogenic activation in cancer. Molecular Cell. 57, (1), 191-201 (2015).
  55. Zambelli, B., et al. a Chaperone in the Urease Assembly Process, Is an Intrinsically Unstructured GTPase That Specifically Binds Zn2+. Journal of Biological Chemistry. 280, (6), 4684-4695 (2005).
  56. Ren, X., et al. Hybrid Structural Model of the Complete Human ESCRT-0 Complex. Structure. 17, (3), 406-416 (2009).
  57. Moriarty, D. F., Fiorillo, C., Miller, C., Colón, W. A truncated peptide model of the mutant P61A FIS forms a stable dimer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774, (1), 78-85 (2007).
  58. la Garza, C. E., Miranda-Hernández, M. P., Acosta-Flores, L., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Analysis of therapeutic proteins and peptides using multiangle light scattering coupled to ultra high performance liquid chromatography. Journal of Separation Science. 38, (9), 1537-1543 (2015).
  59. Beirne, J., Truchan, H., Rao, L. Development and qualification of a size exclusion chromatography coupled with multiangle light scattering method for molecular weight determination of unfractionated heparin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399, (2), 717-725 (2011).
  60. Wang, W., et al. A new green technology for direct production of low molecular weight chitosan. Carbohydrate Polymers. 74, (1), 127-132 (2018).
  61. Kaderli, S., et al. A novel biocompatible hyaluronic acid-chitosan hybrid hydrogel for osteoarthrosis therapy. International Journal of Pharmaceutics. 483, (1-2), 158-168 (2015).
  62. Porterfield, J. Z., Zlotnick, A. A Simple and General Method for Determining the Protein and Nucleic Acid Content of Viruses by UV Absorbance. Virology. 407, (2), 281-288 (2010).
  63. Podzimek, S. The use of GPC coupled with a multiangle laser light scattering photometer for the characterization of polymers. On the determination of molecular weight, size and branching. Journal of Applied Polymer Science. 54, (1), 91-103 (1994).
  64. Podzimek, S., Vlcek, T., Johann, C. Characterization of branched polymers by size exclusion chromatography coupled with multiangle light scattering detector. I. Size exclusion chromatography elution behavior of branched polymers. Journal of Applied Polymer Science. 81, (7), 1588-1594 (2001).
  65. Podzimek, S. Importance of Multi-Angle Light Scattering in Polyolefin Characterization. Macromolecular Symposia. 330, (1), 81-91 (2013).
  66. Tarazona, M. P., Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56, (1), 95-116 (2003).
  67. Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
  68. Hirayama, K., Akashi, S., Furuya, M., Fukuhara, K. Rapid confirmation and revision of the primary structure of bovine serum albumin by ESIMS and frit-FAB LC/MS. Biochemical and Biophysical Research Communications. 173, (2), 639-646 (1990).
  69. Zhu, H., Ownby, D. W., Riggs, C. K., Nolasco, N. J., Stoops, J. K., Riggs, A. F. Assembly of the gigantic hemoglobin of the earthworm Lumbricus terrestris. Roles of subunit equilibria, non-globin linker chains, and valence of the heme iron. The Journal of biological chemistry. 271, (47), 30007-30021 (1996).
  70. Peters, T., Feldhoff, R. C. Fragments of bovine serum albumin produced by limited proteolysis. Isolation and characterization of tryptic fragments. Biochemistry. 14, (15), 3384-3391 (1975).
  71. Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588, (2), 236-246 (2014).
  72. Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8, (1), 6907 (2018).
  73. Astafieva, I. V., Eberlein, G. A., John Wang, Y. Absolute on-line molecular mass analysis of basic fibroblast growth factor and its multimers by reversed-phase liquid chromatography with multi-angle laser light scattering detection. Journal of Chromatography A. 740, (2), 215-229 (1996).
  74. Onsberg, M., Øgendal, L. H., Jensen, M. L., Howells, L. B., Andersen, B., Bjerrum, M. J. Light scattering coupled with reversed phase chromatography to study protein self-association under separating conditions. Journal of Chromatography B. 938, 60-64 (2013).
  75. Kim, Y., et al. High-throughput protein purification and quality assessment for crystallization. Methods. 55, (1), 12-28 (2011).
Karakterisering av proteiner av storlek-uteslutning kromatografi kopplad till multi-Angle ljus spridning (SEC-MALS)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Some, D., Amartely, H., Tsadok, A., Lebendiker, M. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (148), e59615, doi:10.3791/59615 (2019).More

Some, D., Amartely, H., Tsadok, A., Lebendiker, M. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (148), e59615, doi:10.3791/59615 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter