Summary
Этот протокол детализирует хирургические шаги мышиной модели васкуляризированной трансплантации гетеротопической селезенки, технически сложной модели, которая может служить мощным инструментом в изучении судьбы и долговечности клеток селезенки, механизмов различных селезенки популяций клеток в прогрессировании заболевания и трансплантации иммунитета.
Abstract
Селезенка является уникальным лимфоидным органом, который играет важную роль в гомеостазе иммунной и гематопойетической систем. Пациенты, которые подверглись спленэктомии, независимо от осаждения причин склонны к развитию подавляющего пост-спленэктомии инфекции и опыт повышенный риск глубокого венозного тромбоза и злокачественных новообразований. Недавно эпидемиологические исследования показали, что спленэктомия может быть связана с возникновением сердечно-сосудистых заболеваний, что свидетельствует о том, что физиологические функции селезенки еще не полностью признаны. Здесь мы представляем модель вылагостающих гетеротопических трансплантаций селезенки, которая не только может быть использована для изучения функции и поведенческой активности подмножеств селезенки иммунной клетки в различных биологических процессах, но и может быть мощным инструментом для тестирования терапевтический потенциал трансплантации селезенки при определенных заболеваниях. Основные хирургические шаги этой модели включают сбор донорской селезенки, удаление реципиента родной селезенки, и реваскуляризации селезенки трансплантата. Используя конгенические штаммы мыши (например, мыши с CD45.1/CD45.2 фонами), мы заметили, что после сингенной трансплантации, как донорские селезенки лимфоцитов и миелоидные клетки мигрировали из трансплантата уже после операционный день 1, в соответствии с приток нескольких типов клеток-реципиентов, тем самым генерируя уникальную химеру. Несмотря на относительно сложные методы, эта процедура может быть выполнена с коэффициентом успеха 90%. Эта модель позволяет отслеживать судьбу, долговечность и функцию спленоцитов во время устойчивого состояния и в условиях болезни после трансплантации селезенки, тем самым предлагая прекрасную возможность открыть для себя определенную роль для селезенки полученных иммунных клеток в различных процессов заболевания.
Introduction
Селезенка является крупнейшим вторичным лимфоидным органом в организме и имеет решающее значение в иммунной и гематопойетической систем. Его функции в основном выполняются двумя морфологически отдельными отсеками, красной мякотью и белой мякотью1. Красная мякоть представляет собой трехмерную сетку из венозных пазух и селезенки, которые состоят из ретикулярных волокон, ретикулярных клеток и связанных с ними макрофагов. Эта уникальная структура позволяет красной мякоти выступать в качестве эффективного фильтра крови, который удаляет посторонние материалы и старые или поврежденные эритроциты. Белая мякоть включает в себя фолликулы, маргинальные зоны, и периартериолярных лимфоидных оболочек (PALS) и является важным местом для антигена захвата и обработки, лимфоцитов самонаведения, преобразования, распространения и созревания2. Тем не менее, селезенка обычно рассматривается как незаменимый орган, потому что другие лимфатические органы, такие как лимфатические узлы, также могут выполнять некоторые из своих функций и потеря селезенки обычно не приводит к смерти. Поэтому спленэктомия широко выполняется в качестве терапевтического метода для пациентовс селезенкой или доброкачественными гематологическими заболеваниями 3. Однако пациенты с спленэктомией сталкиваются с рядом длительных осложнений. Бактериальные инфекции являются наиболее признанными осложнениями спленэктомии4,5. В последнее время подавляющее пост-спленэктомии сепсис был признан интенсивным осложнением спленэктомии, связанные с высокой смертностью6. Кроме того, последние эпидемиологические исследования показывают, что спленэктомия может быть связана с возникновением сердечно-сосудистых заболеваний, предполагая, что дальнейшие физиологические функции селезенки еще предстоит изучить7,8.
В клинике были использованы аутотрансплантация селезенки и аллотрансплантация селезенки. В настоящее время аутотрансплантация селезенки путем имплантации секций селезенки в мешки, созданные в большей области, рассматривается как единственная возможность для сохранения селезенки после травматической спленэктомии9,10. Тем не менее, эффективность этой операции является спорным, как послеоперационные осложнения, как асептический некроз селезенки и мелкой непроходимости кишечника из-за послеоперационных спаек может произойти11. Аллотрансплантация селезенки участвует в многовисцеральной трансплантации12. Клинические данные от многовисцеральной трансплантации предполагает, что аллотрансплантация селезенки может играть защитную роль в отторжении аллотрансплантата тонкой кишки, не вызывая трансплантата против хозяина болезни (GVHD)12. Однако литература о благотворном воздействии аллотрансплантации селезенки как компонента многовисцеральной трансплантации по-прежнему ограничена, и основные механизмы еще предстоит определить. В 2006 году Яир Райснер и др. сообщили, что пересадка ткани эмбриональной селезенки свиньи, которая не имеет Т-клеток для мышей, может вылечить гемофилию А, генетическое заболевание, не вызывая GVHD13, поддерживая, что трансплантация селезенки имеет терапевтические перспективы в определенных заболеваний. Поэтому необходимо провести дальнейшие исследования терапевтического потенциала трансплантации селезенки.
Модели трансплантации селезенки животных являются ценными для изучения недооцененной функции иммунных клеток селезенки при прогрессировании заболевания, а также для проверки потенциального терапевтического эффекта трансплантации селезенки. Экспериментальные модели пересадки цельной селезенки были задокументированы с начала 1900-х годов, как было рассмотрено Коэном14. В 1969 году Коберн Ричард J. и Ли и др. подробно техники трансплантации селезенки у крыс15,16. Совсем недавно, Swirski FK et al. описал модель мыши трансплантации селезенки17. По сравнению с крысиными моделями, мышиные модели трансплантации селезенки более привлекательны из-за ряда присущих ей преимуществ. Например, используя модель мыши, мы можем получить доступ к обширному разнообразию реагентов, недоступных для моделей крыс. Кроме того, с помощью конгенических мышей (например, мышей с CD45.1/CD45.2 фоне), сингенной трансплантации селезенки позволяет отслеживать судьбу, долговечность, и функции спленоцитов18. На основе работы Swirski FK et al.17, мы дополнительно установили этот упрощенный и расширенный протокол трансплантации селезенки у мышей. Описанный ниже протокол сочетает в себе как надежность, так и осуществимость в стандартизированном порядке и может быть использован в качестве инструмента для изучения биологии селезенки и иммунитета к трансплантации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры и использование животных в этом исследовании были выполнены в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Северо-Западного университета (IACUC). В этом исследовании, от 8 до 10 недель мужчин CD45.2 и CD45.1 мышей (как на BALB/c фон, из лаборатории Джексона) были использованы в качестве доноров селезенки и получателей, соответственно, для создания сингенных моделей трансплантации селезенки. Все животные были размещены в стерильной среде в животноводческой среде Северо-Западного университета. Глазная смазка была применена ко всем мышам после анестезии для предотвращения сухости.
1. Хирургическая подготовка, анестезия и режим обезболивании
- Поместите стерильную одноразовую драпировку (45,7 см х 66 см) на хирургическую платформу. Аккуратно возьмите мышь, введите кетамин (50 мг/кг) и ксилазин (10 мг/кг) интраперитонеально (ивр) для анестезии, и введите 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно для обезболивания.
- Обеспечьте глубину анестезии занозой, побрить волосы во всей области живота бритвой и поместить мышь на стерильной хирургической платформе под операционным микроскопом при 6-10x увеличении.
2. Урожай селезенки донора
- Стерилизовать живот с алкоголем подготовительной площадки, закрепите конечности хирургической лентой, и сделать 3-4 см средней линии вертикального разреза кожи от лобка к процессу xiphoid с ножницами.
- Утилищать брюшную стенку стерильными ретракторами из скрепок. Переместите кишечник на правый фланг живота (левый) стороны хирурга с стерильным ватным тампоном, чтобы разоблачить селезенку. Катеризизировать короткую желудочное вену, прикрепленную к селезенке, стерильной низкотемпературной каутерией(рисунок 1A). Поместите кусок стерильной марли, пропитанной солевым раствором 37 градусов по Цельсию над селезенкой, чтобы она была влажной(рисунок 1B).
- Отделить и мобилизовать портальную вену из ткани поджелудочной железы(рисунок 1С)путем отливания ветвей венпортала (превосходная панкреатикодуоденальная вена и правая желудочная вена); поместите шов вокруг портала вены distal из селеблии(рисунок 1D).
- Переверните селезенку на правую сторону, чтобы разоблачить ствол аорты и целиакии с селезенкой артерии(рисунок 1E). Вскрыть и мобилизовать аорта-целиакию-селеник артерии путем отливания печеночной артерии и желудочной артерии; поместите шов вокруг проксимальной аорты к целиакии артерии(рисунок 1F-G).
- Введите 100 международных единиц (IU) гепарина в нижней полывены вены (IVC), чтобы гепаринизировать все тело и ждать 3 мин, чтобы обеспечить гепарин принимать эффекты. Ligate аорты проксимальной к целиакии артерии, трансектировать портальную вену, а затем пронизать все тело с помощью 10 мл гепаринизированного холода (4 кВ) сольника (10 мл/20 с) от брюшной аорты дистальной до целиакии ствола(рисунок 1H).
- Соберите трансплантатселей для селезенки с соответствующим аортальным селезенко-селенным сегментом и портальной веной вместе с сегментом селезенки и небольшой порцией ткани поджелудочной железы. Сохранить трансплантат в 5 мл 4 градусов по Цельсию сольный раствор перед пересадкой. Эвтаназия мышь шейки матки дислокации.
3. Имплантация спленэктомии и селезенки трансплантата
- Поместите грелку на хирургическую платформу и отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию. Поместите стерильную драпировку (45,7 см х 66 см) на верхней части грелки, чтобы создать стерильную хирургическую платформу. Повторите шаги 2.1 и 2.2 для хирургической подготовки и анестезии. Сделайте разрез средней линии 3-4 см и урепровите брюшную стенку, как описано в шаге 2.1 и шаге 2.2.
- Тщательно переместите кишечник на правую сторону мыши стерильным ватным тампоном, чтобы разоблачить селезенку получателя. Свайство селезенки вены и артерии и удалить селезенку.
- Аккуратно переместите кишечник в левую сторону мыши и накройте кишечник влажной марлей (пропитанной стерильным солевым раствором 37 градусов Цельсия). Вскрыть и сваить поясничные ветви инфрагенной аорты и IVC; перекрестный зажим инфрачной аорты и IVC с помощью двух 4 мм микрососудистых зажимов.
- Поместите 11-0 нейлоновый шов через инфрагенную аорту (полная толщина) и вмагистрайте для создания эллиптической аортомии одним разрезом с микросцисорами (длина должна соответствовать диаметру донорской аорты, рисунок 2А). Пирс IVC с помощью 30 G иглы для создания эллиптической венотомии и расширить открытие донорского портала вены соответствует длина с помощью микроскисаторов(рисунок 2A).
- Очистить внутрилюмиевную кровь или сгусток крови (в аорте и IVC) с 500 зл игеля гепаринизированного солинового раствора (10 единиц/мл).
- Поместите трансплантат селезенки в правом фланге живота мыши получателя; тщательно определить аортальные манжеты донора и портал вены донора. Убедившись, что сосуды не скручиваются, накройте пересадку селезенки марлей, пропитанной холодным (4 кВС) солевым раствором.
- Соедините аортальную манжету донора к проксимальной и дистальной вершине аортаотомии реципиента с двумя швами пребывания (11-0 нейлоновых швов, так же, как ниже)(Рисунок 2B,C). Сделать анастомоз с 2-3 укусов непрерывного 11-0 нейлоновых швов между аорты манжеты донора и аортаотомии реципиента (передняя стенка) (Рисунок 2D). Переверните пересадку селезенки на левую сторону получателя; сделать анастомоз между аорты манжеты донора и аортотомии реципиента (задняя стенка) (Рисунок 2E).
- Выполните анастомоз для подключения вены портала донора к задней стенке IVC получателя, используя от 4 до 5 укусов непрерывных швов на внутренней стороне IVC, а затем закрыть шов на внешней стороне IVC(Рисунок 2F,G).
- Отпустите зажимы сосуда и используйте стерильный ватный тампонад, чтобы кровотечение тампонады, пока цвет селезенки не будет восстановлен(рисунок 2H).
- Закройте брюшную полость с 5-0 синтетический абсорбируемый шов vicryl в непрерывном рисунке. Закройте слой кожи 5-0 нейлоновым швом в прерванном рисунке.
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Для шагов 4.7-4.8, в качестве альтернативы, сделать анастомоз между портала вены донора и IVC реципиента первый (шаг 4.8); затем сделать анастомоз между аорты манжеты донора и задней стенки аортоми реципиента, используя от 2 до 3 непрерывных швов внутри аорты и закрыть шов на внешней стороне аорты.
4. Восстановление животных
- Вводят 1 мл теплого сосудистого подкожного через 4 отдельных места (0,25 мл/локации) после закрытия брюшной полости.
- Держите мышь в контролируемом температурой инкубаторе (30 градусов по Цельсию) в течение первых нескольких часов после операции, следите за мышью до тех пор, пока она не придет в себя достаточное сознание, а затем перенесите мышь в новую чистую клетку с обычной пищей и водой, с грелкой (30 градусов по Цельсию) ) под клеткой. Держите мышь после операции в отдельной клетке.
5. Послеоперационное управление болью
- Вводят 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно 24 ч и 48 ч после операции для поддержания режима анальгезии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вся процедура пересадки мышечной селезенки может быть завершена в течение 90 минут опытными микрохирургами. Наша лаборатория провела более 100 пересадок селезенки у мышей. Коэффициент успеха составляет более 90%, как это определено выживанием мыши получателя и пересадки селезенки до послеоперационного дня (POD) 1 или POD 7 (наша конечная точка исследования). Выживание пересадки селезенки было подтверждено макроскопическим внешним видом и анализом цитометрии спленоцитов. Основываясь на нашем опыте, анализ цитометрии потока (LIVE/DEAD Cell Viability Assays) очень чувствителен, чтобы определить, выжил ли трансплантат селезенки, так как большинство клеток селезенки были бы мертвы, если бы трансплантаты селезенки были некротическими. Технические проблемы этой процедуры, общие осложнения и их устранение неполадок приведены в таблице1.
Для проверки трансплантологии морфологии после трансплантации, гемотоксилин и Эозин (H и E) окрашивание было выполнено в селезенки изотрансажных БАТБ / с мышей на POD 1 и POD 7. Репрезентативные фотографии показаны на рисунке 3. Архитектура изотранстатов селезенки оставалась нетронутой в течение первой послеоперационной недели. Красная мякоть, белая мякоть и маргинальная зона по-прежнему были ясны и различимы. Для исследования миграции клеток после трансплантации селезенки, цитометрия потока была выполнена в POD 1 и POD 7 для изучения фенотипов лейкоцитов в изотранстранстатах селезенки, лимфатических узлах, крови и костном мозге. Как показано на рисунке 4A, на POD 1, 51 и 7% (средний SD, так же, как ниже) из клеток селезенки были получены донорами и 46 и 3% были получателями, полученными. На POD 7 лейкоциты, полученные из донора, составляли 32 и 10% от общего числа клеток селезенки, а клетки-реципиенты составляли до 56 и 13%. Мы также отметили, что селезенки лейкоцитов мигрировали в лимфатические узлы, кровь и костный мозг, как рано в день 1 и поддерживается в день 7 (Рисунок 4B), генерации уникальной химеры ценно для исследования торговли спленоцитами.
Таблица 1. Методы устранения неполадок.
Рисунок 1. Урожай донорской селезенки. (A) Катеризировать короткую желудочной вены прилагается к селезенке. (B) Поместите небольшой кусочек стерильной теплой влажной марли над селезенкой, чтобы держать его влажным. (C) Вскрыть и изолировать вену портала за поджелудочной железой. (D) Лигейт боковых ветвей вены портала и поместите шов вокруг портальной вены distal к селезенке вены. Разбитые линии представляют местоположение, трансектируя сьюэнк для анастомоза с получателем IVC. (E) Переверните селезенку к правой стороне живота (слева хирурга), чтобы разоблачить ствол аорты и целиакии с его ветвями, включая селезенку артерии. (F) Вскрыть и мобилизовать аорты -целиакия -селеническая артерия путем лигатации двух других ветвей. (G) Поместите шов вокруг аорты проксимальной к целиакии артерии. Разбитые линии представляют расположение transecting позже используется для анастомоза с получателем брюшной аорты. (H) После лигатинга аорты и transecting вены портала, пронизать селезенку трансплантата с 10 мл гепаринизированного солина через аорту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Имплантация прививки от селезенки. (A) После изоляции и перекрестного зажима аорты и IVC, сделать продольную аортотомию и венотомию в аорте и IVC, соответственно. (B-D) Поместите трансплантат селезенки на правую сторону живота (левая сторона хирурга). Сделайте сквозной анастомоз между донорской аортной манжетой и передней стенкой аортотомии реципиента, используя 2-3 укуса непрерывного шва. (E) Поверните трансплантат селезенки к левому флангу получателя; повторить предыдущую процедуру между донорской аорты манжеты и задней стенки аортомия реципиента и закрыть шов на внешней стороне аорты. (F-G) Сделайте сквозной анастомоз между веной портала донора и задней стенкой IVC реципиента, используя от 4 до 5 укусов непрерывного 11-0 нейлонового шва внутри IVC, а затем закройте шов на внешней стороне IVC. (H) После завершения анастомоза, отпустите зажимы судна и поместите несколько ватных тампонов, чтобы помочь остановить кровотечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Представитель гистологии изотрансатизмов селезенки на 1-й день и 7 день после операции. Сингенные трансплантации селезенки были выполнены с использованием BALB/c мышей. Изотрансплантаты селезенки были собраны в день 1 и 7 день после трансплантации и фиксированной в 10% формалин для 48 ч. Н И E окрашивание было выполнено с помощью парафин-встроенных тканей разделе. Представительгия гистологии показывает, что изотрансплантаты селезенки остаются нетронутыми на 1 неделю после трансплантации. Шкала бар 250 мкм. POD, послеоперационный день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 Химера, созданная сингенной трансплантацией селезенки. Три сингенных трансплантации селезенки были выполнены с использованием BALB/c CD45.2 мышей в качестве доноров и BALB/c CD45.1 мышей в качестве получателей. Прививки селезенки, кровь, лимфатический узло (LN) и костный мозг (БМ) у мышей-реципиентов были собраны в первый день и 7 день после трансплантации. Для анализа фенотипа клеток был проведен анализ одноклеточной изоляции и цитометрии потока. (A) Представитель точка участков (gating от живых синглетов), показывая проценты доноров или получателей - производные лейкоцитов в указанных образцах. (B) Проценты (средние - SEM) указанных популяций в донорских клетках в указанных образцах в день 1 и 7-й день. POD - послеоперационный день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная диаграмма 1. Представительные участки (n no 3), показывающие проценты полученных донорами по сравнению с реципиенцией лимфоцитов в пересаженной селезенке, лимфатических узлах, крови и костном мозге. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная диаграмма 2. Представительные участки (n no 3), показывающие проценты донорских по сравнению с получателем CD11b-Ly6C-моноцитов в пересаженной селезенке, лимфатических узлах, крови и костном мозге. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Убедительные данные свидетельствуют о том, что моноциты селезенки играют важную роль в стерильных воспалительных процессах, таких как атеросклероз19, острый ишемический мозг20 или травмы легких18, а также травмы имиокарда I /R и реконструкция21,22,23. В этих докладах подчеркивается недопознавающая роль селезенки во многих хронических заболеваниях, сердечно-сосудистые заболевания которых являются важными (особенно с учетом того, что это убийца номер один во всем мире). Мышь модель трансплантации селезенки предлагает прекрасную возможность открыть для себя роль селезенки полученных иммунных клеток в различных заболеваний, а также, как они загрунтования в селезенке. Например, используя мышиные модели трансплантации селезенки, Swirski et al. обнаружили, что в ответ на ишемическую травму миокарда моноциты селезенки повышают подвижность, мигрируют из селезенки, придерживаются поврежденных тканей и способствуют раны заживления17. Кроме того, эта модель полезна для решения проблемы долголетия зрелых иммунных клеток в селезенке и основных механизмах и для изучения терапевтических потенциалов трансплантации селезенки.
Для повышения успеха этого протокола следует принять во внимание ряд аспектов. Во-первых, очень важно выбрать правильный экспериментальных животных в процессе проектирования, поскольку вес мыши, напряжение, и состояние здоровья может повлиять на сложность хирургических шагов и экспериментальных результатов. Наша лаборатория рекомендует использовать от 8 до 12 недель старых мышей с весом более 25 г, чтобы уменьшить смертность, которая может быть вызвана кровотечением. Во-вторых, во время процедуры сбора селезенки, слишком много манипуляций селезенки сосудов может легко привести к размножению или вазоспазм и потенциально привести к микротромбозу в селезенки трансплантата. Знакомство с анатомией живота мыши перед операцией было бы полезно ускорить процесс обучения. В-третьих, во время операции реципиента трансплантат селезенки должен всегда поддерживаться влажным и прохладным. Надлежащая защита трансплантатов селезенки может уменьшить трансплантативную ишемию/реперфузию (I/R) и предотвратить отказ трансплантата после трансплантации. Кроме того, учитывая, что донорские сосуды для анастомоза являются относительно длинными, позиционирование пересадок селезенки должным образом до анастомоза имеет решающее значение для предотвращения скручивания сосудов. Кроме того, диаметры аортомиии и венотомии мгновения ИВК должны всегда быть сопоставимы с диаметрами донорской аорты и портальной вены для обеспечения надлежащего кровотока и профилактики тромбоза.
Среднее время хранения трансплантатов селезенки в сольном 4 градусов по Цельсию составляет около 10 мин. Общее ишемическое время должно быть ограничено менее чем 50 минут, чтобы обеспечить минимальную неудачу трансплантации. Мы рекомендуем использовать раствор холодного хранения Университета Висконсина (UW) для сохранения трансплантата селезенки, если в исследованиях требуется более 1 ч холода ишемическое время. Следует отметить, что небольшая часть поджелудочной железы тесно прикрепляется с селезенкой, и попытка удалить все из пересадок селезенки легко приведет к пересадке или сосудистым осложнениям и заметно увеличит время операции. Мы заметили, что ткани поджелудочной железы прилагается к пересадке селезенки будет проходить атрофию на POD 7, хотя некоторые остались жизнеспособными с селезенки трансплантатов. Удалить ткань поджелудочной железы, прикрепленную с помощью трансплантатов селезенки, зависит от целей исследования.
Наличие конгенических мышей позволило отследить происхождение клеток селезенки, донора против реципиента после трансплантации. В этом исследовании мы использовали BALB/c CD45.2 и BALB/c CD45.1 конгенных мышей в качестве доноров и реципиентов селезенки для создания сингенной модели трансплантации селезенки. Трансплантация органов или тканей между этими конгеничными штаммами мыши широко используется для отслеживания происхождения и развития иммунной системы. Несмотря на недавний доклад о точке мутации, связанной с CD45.1, что влияет на ОТВЕТ NK клеток24, не отторжение трансплантации было сообщено между этими комбинациями штамма. Мы наблюдали значительный приток клеток-реципиентов в пересадку селезенки, которая произошла сразу же, как и в POD 1. Вполне вероятно, что клетки-реципиенты ответили на травму I/R, так как большинство клеток-реципиентов были гранулоцитами. Наши результаты показали, что относительно высокий процент элепленических лимфоцитов остается донорского происхождения. Что еще более интересно, эти лимфоциты мигрировали в (заселенные) в другие лимфоидные отсеки (лимфатический узла, костного мозга и кровообращения). Эти выводы побуждают нас предположить, что лимфоциты, которые возникли из селезенки очень важны в адаптивном иммунитете. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования, чтобы разграничить различные роли селезенки лимфоцитов в адаптивном и врожденном иммунитете(Рисунок 4, Дополнительная фигура 1 и дополнительная диаграмма 2).
Основным ограничением этого протокола является то, что он требует обширной микрохирургической подготовки для лиц с ограниченным микрохирургическим опытом, чтобы освоить эту технику. Основываясь на нашем опыте в общих моделях пересадки твердых органов мыши (например, мышечное сердце, легкое или пересадка почки), это может занять 6-10 месяцев для вновь обученного человека (без какой-либо экспериментальной микрохирургической техники), чтобы умело овладеть этим техники. По сравнению с мышонками сердца или трансплантации почек, эта модель может быть более сложной, поскольку она включает в себя дополнительные шаги вскрытия тканей, чтобы изолировать трансплантат селезенки во время донорских процедур. Кроме того, диаметр вены донорского портала (около 0,6 мм) меньше, чем УВК, что затрудняет анастомоз. Другим ограничением является то, что не ясно, будет ли привитселена селезенка массово захвачена клетками реципиента на более поздней стадии трансплантации (например, POD 60). Тем не менее, эта модель также очень привлекательна для своих нескольких присущих преимуществ. Во-первых, мыши и люди имеют значительный спектр аналогичных геномов, что позволяет относительно точное представление реалистичного применения. Кроме того, по сравнению с мышиной моделью неваскулярной аутотрансплантации селезенки с использованием участков селезенки, эта васкуляризированная модель трансплантации селезенки с меньшей вероятностью развивает осложнения, такие как асептический некроз селезенки и затруднение тонкой кишки из-за послеоперационных спаек.
Мышонок модель трансплантации селезенки ранее сообщалось Swirski FK и др. Однако подробная информация не была описана. Наше исследование обеспечивает всеобъемлющий пошаговой протокол трансплантации селезенки мыши для заинтересованных исследователей следовать и mater этой техники. Кроме того, этот протокол устраняет несколько ненужных шагов, описанных в докладе Swirski FK et al. (например, перевязка желчных протоков) и вводит 11-0 шов для анастомоза, который поможет сократить хирургическое время и предотвратить кровотечение.
В заключение, эта модель может быть мощным инструментом для изучения механизмов популяции селезенки в ответ на патогенные микроорганизмы, травмы, воспаление или отторжение трансплантата и является ценным для проверки терапевтического потенциала селезенки трансплантации. При надлежащей подготовки и практики, эта процедура может быть выполнена с успехом в 90%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодаря Северо-Западного университета Всеобъемлющий центр трансплантации и Фейнберг школы медицины исследований программы для ресурсов и финансирования поддержки. В частности, поток Цитометрии и гистологии услуги были предоставлены Северо-Западного университета потока цитометрии основных средств и мышь гистологии и фенотипирования лаборатории, соответственно, оба из которых поддерживаются NCI P30-CA060553 награжден Роберт H Лурье Всеобъемлющий онкологический центр. Мы благодарим мистера Нейта Эспарсу за коррективы этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Wyeth | 206205-01 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | |
| Heparin solution | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Injection grade normal saline | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-20 | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc. | 111000140 | |
| ThermoCare Small Animal ICU System | Thermocare, Inc. | ||
| Adson Forceps | Roboz Surgical Instruments | RS-5230 | |
| Derf Needle Holder | Roboz Surgical Instruments | RS-7822 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instruments | RS-5881 | |
| Micro-clip | Roboz Surgical Instruments | RS-5420 | |
| 7-0 silk | Braintree Scientific | SUT-S 103 | |
| 11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle | Sharpoint DR4 | AK-2119 | |
| Ms CD45.2 antibody | BD Bioscience | 553772 | |
| Ms CD45.1 antibody | BD Bioscience | 553776 | |
| Ms CD11b antibody | BD Bioscience | 557657 | |
| Ms B220 antibody | BD Bioscience | 553089 | |
| Ms Ly6C antibody | eBioscience | 48-5932-80 | |
| Ms Ly6G antibody | BD Bioscience | 561236 | |
| Ms F4/80 antibody | BD Bioscience | 565614 | |
| Ms CD11c antibody | BD Bioscience | 558079 | |
| Ms CD3 antibody | eBioscience | 48-0032-82 | |
| Ms CD4 antibody | BD Bioscience | 552051 | |
| Ms CD8 antibody | BD Bioscience | 563786 | |
| LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L34955 |
References
- Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34 (5), 455-465 (2006).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9 (9), 428-437 (2017).
- Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99 (2), 392-398 (2014).
- Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95 (48), e5098 (2016).
- Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome - review study. International Journal of Surgery. 12 (12), 1314-1316 (2014).
- Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy - a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102 (8), 1333-1341 (2017).
- Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114 (14), 2861-2868 (2009).
- Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19 (2), 156-161 (2012).
- Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78 (3), 270-278 (1991).
- Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73 (2), 83-86 (1991).
- Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246 (3), discussion 445-436 436-444 (2007).
- Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (50), 19075-19080 (2006).
- Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69 (6), 777-784 (1954).
- Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8 (1), 86-88 (1969).
- Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65 (3), 436-439 (1969).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325 (5940), 612-616 (2009).
- Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2833-2847 (2018).
- Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).
- Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), 1411-1419 (2014).
- Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39 (5), 806-818 (2013).
- Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18 (2), 1470320317706653 (2017).
- Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 62 (2016).
- Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200 (6), 1982-1987 (2018).
