תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo
Summary
אנו מציגים גישה כדי לטהר את הריבוכמה מאוגד-mRNA מתאי כלי הדם (ECs) ישירות במוח העכבר, הריאות ורקמות הלב באמצעות התגית הגנטית ספציפית EC של חלבון פלואורסצנטית ירוק משופר (EGFP) ב ריבוזומים בשילוב עם טיהור RNA .
Abstract
מחקרים רבים הוגבלה להשתמש באספלי הסלולר מבחנה ורקמות שלמות או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מבעלי חיים עבור ניתוח מבחנה של טרנס וביטוי גנטי על ידי qPCR ו-RNA רצפי. ביטוי מקיף לניתוח והבעה גנים של סוגי תאים ספציפיים ברקמות מורכבות ואיברים יהיה קריטי להבין מנגנונים סלולריים ומולקולריים שבהם גנים מוסדרים והקשר שלהם עם הומאוסטזיס רקמות ואיבר פונקציות. במאמר זה, אנו מדגימים את המתודולוגיה עבור בידוד של הריבוכמה-RNA מאוגד ישירות בvivo ב אנדותאליה כלי הדם של הריאות בעלי חיים כדוגמה. החומרים וההליכים הספציפיים לעיבוד רקמות ו-RNA טיהור יהיה מתואר, כולל הערכה של איכות RNA ותשואה כמו גם qPCR בזמן אמת עבור גן העורקים העורקי. גישה זו, המכונה תרגום ריבוכמה אהדה (מלכודת) הטכניקה, יכול להיות מנוצל לאפיון של ביטוי גנים וניתוח הטרנססקריפט של סוגי תאים מסוימים ישירות בvivo בכל סוג ספציפי ברקמות מורכבות.
Introduction
ברקמות מורכבות כגון מוח היונקים, הלב והריאות, הרמות הגבוהות של טרוגניות הסלולר מסבכים את הניתוח של נתוני ביטוי הגנים הנגזרים מדגימות שלמות של רקמות. כדי להתבונן בפרופילי גנים ביטוי סוג תא מסוים ב vivo, מתודולוגיה חדשה פותחה לאחרונה, אשר מאפשר את החקירה של משלים mRNA המתורגם כולו של כל סוג תא מוגדר גנטית. מתודולוגיה זו ידועה בתור הריבוקכמה הזיקה לטיהור (מלכודת) בטכניקה1,2. זהו כלי שימושי לחקור ביולוגיה של תא אנדותל ואנגיוגנזה כאשר משולבים עם גנטית מניפולציה של גנים אחרים הקשורים לאנגיוגנזה בבעלי חיים.
הצגנו את העובדה ש-אנגיוגנטי pkd-1 מאותת ותמלול הCD36 של גנים מבוססי-אנגיוגנטית הם קריטיים עבור תא אנדותל (EC) בידול ואנגיוגנזה פונקציונלי3,4,5,6. כדי לקבוע מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנטי ו איתות מטבולית בתמלול הגנים ובידול EC, יצרנו מהונדסים גנטית עכברים מלכודת עם גנים שנמחקו במיוחד אנגיוגנטי על בסיס של טכניקה מלכודת1 , 2. יתר על כן, בחיות המלכודת שלנו, לא רק שיש להם pkd-1 או cd36 gene חוסר בכלי הדם אנדותאליה או מחיקה גלובלית של cd36 gene, אבל חלבון משופר ירוק פלואורסצנטית (egfp) הוא גם מתויג גנטית על . EC מתרגם ריבוזומים המלכודת מאפשרת טיהור של אהדה של הריבוכמה מאוגד-mRNA ישירות מתוך כלי הדם של רקמות ממוקדות, המאפשר ניתוח של ביטוי גנים זיהוי של הטרנססקריפט החדש הקשורים בידול EC ו אנגיוגנזה ישירות תחת התנאים vivo. בנינו בהצלחה RNA ריבוכמה מאוגד מתוך אנדותליה בבעלי חיים אלה מהונדסים גנטית. ה-RNA הטהור יכול לשמש לאפיון נוסף של גנים של אנגיוגנטי או הריוגניים בוויסות הבידול והפונקציות של EC. פרוטוקול זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי ליישם את גישת המלכודת לבידוד של mRNA ב-ECs ישירות ב-vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנגיוגנזה הוא תהליך רב-שלבים מורכב, בו תמלול וביטוי של גנים בעלי מפרט EC-אנגיוגנטי ממלאים תפקיד חיוני ב-EC בידול ו-אנגיוגנטי מתכנות3,4. כדי להתגבר על המחסומים מן הגיוון הסלולר והמורכבות האדריכלית להבנת טוב יותר את התפקוד של מערכת כלי הדם של היונקים ברמה המולקו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודתו של ד ר רן נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקני (13SDG14800019; BR), קרן התקווה של אן (FP00011709; BR), האגודה האמריקנית לסרטן (86-004-26; מרכז הסרטן MCW ל BR), ואת המכון הלאומי לבריאות (HL136423; BR); ירדן פאלמר נתמך על ידי 2018 MCW CTSI 500 תוכנית ההתמחות כוכבים; פ. מורן נתמך על ידי מענק להכשרת מחקר מוסדיים מ-NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?. Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
