Summary
ביופסיה blastocyst ו ויטריפיקציה נדרשים ביעילות לבצע בדיקה גנטית מראש השרשה. גישה הדורשת את הפתיחה הרציפה של הסונה והחזרת התאים ה7-8 של תאי העור ביום 5-7 שלאחר ההפריה מגבילה גם את מספר המניפולציות הנדרשות ואת חשיפת העובר לתנאי הסביבה האופטימליים.
Abstract
ביופסיה blastocyst מבוצעת כדי לקבל אבחנה גנטית אמינה במהלך מחזורי IVF עם השרשה גנטית בדיקות. אז, זרימת העבודה האידיאלית כרוך פרוטוקול ויטריפיקציה בטוח ויעיל, בשל זמן הטיפול של טכניקות אבחון ולהעביר את העובר הנבחר (של) על רירית המין הפיזיולוגי במחזור הטבעי הבא. גישה ביופסיה המקיף את הפתיחה רציפים של הסונה pellucida ושליפה של 5-10 תאי עור trophectoderm באופן אידיאלי 7-8) מגביל הן מספר המניפולציות הנדרשות ואת החשיפה של העובר לתנאים סביבתיים תת אופטימלית. לאחר אימון נאות, הטכניקה היתה להיות מיויית על פני מפעילי שונים במונחים של עיתוי של ביופסיה (~ 8 דקות, החל 3-22 דקות מבוסס על מספר העוברים ביופסיה לכל מנה), אבחנות מכרעת שהתקבלו (~ 97.5%) ושיעורי לידה חיים לאחר העברת-העברה שחומם-אאופואיד-בליילויד (> 40%). שיעור ההישרדות לאחר ביופסיה, ויטריפיקציה והתחממות היה גבוה כמו 99.8%. שיעור ההתרחבות מחדש ב 1.5 h מהתחממות היה גבוה כמו 97%, תלוי בעיקר בעיתוי בין ביופסיה ו ויטריפיקציה (באופן אידיאלי ≤ 30 דקות), בלסטוציסט באיכות וביום של ביופסיה. באופן כללי, עדיף להתקשות לכווץ בלסטוציסטה; לכן, במחזורים שאינם PGT, לייזר בסיוע מלאכותי הצטמקות עשוי להתבצע כדי לגרום לקריסה העובר לפני הקפאת ההזמנה. הפרספקטיבה העתידית המבטיחה ביותר היא ניתוח לא פולשני של התקשורת התרבותית IVF לאחר התרבות בלסטוציסט כמקור פיוטי של דנ א עובריים. עם זאת, האוונגרד הפוטנציאלי הזה עדיין תחת חקירה ופרוטוקול אמין עדיין צריך להיות מוגדר ומאומת.
Introduction
המטרה העיקרית של אמבריולוגיה האנושי המודרני היא למקסם את המספר לידות חי לכל מחזור מגורה ולהפחית עלויות, זמן ומאמצים כדי להשיג הריון. כדי להשיג מטרה זו, גישות מאומתות עבור בחירת העובר צריך להיות מועסק כדי לזהות עוברים מוכשרים מחדש בתוך מפרק שהושג במהלך מחזור IVF. על פי העדויות האחרונות, התרבות בלסטוציסט1 בשילוב עם בדיקות כרומוזומלית מקיפה-העברת העובר התחמם העברה (ET) היא המסגרת היעילה ביותר כדי להגדיל את יעילות IVF2. ברור, בדיקות אנאפלואידיה דורש דגימה עובריים, אשר בשלב זה מיוצג בעיקר מתאים מעטים שאוחזרו מן הטרופטועור (TE), כלומר, את הקטע של הבלסטוציסטה המעניקה מקור לספח העובר (למשל, השליה) במהלך ההריון . מעבר ניתוח קריוטיפ, גם מוטציות גן יחיד עשוי להיות מוערך מתוך ביופסיה TE כחלק אסטרטגיה קלינית המכונה השתלת מראש בדיקות גנטיות (pgt;-a עבור aneuploidies,-SR עבור הסדרים מבניים כרומוקטיביות,-M עבור מחלות מונוגניים). אחרים oocyte/העובר ביופסיה שיטות כבר תיאוריה ואימץ קלינית לאורך העשורים האחרונים, כלומר גופים קוטביים ביופסיה ו blastomere ביופסיה. עם זאת, השימוש שלהם מופחת כיום מאז החסרונות הפרוצדורליים שלהם (למשל, עומס עבודה גבוה יותר וסיכון להשפעה הרבייה) ומגבלות אבחון (g., ניתוח תא בודד בעיות) לעכב במרומז איזון מספיק בין עלויות, סיכונים יתרונות (עבור סקירה ראה3).
במאמר זה, אחד הפרוטוקולים העיקריים של TE ביופסיה מתוארת ביסודיות יחד עם ויטריפיקציה הבאים, מחמם והעברת הליכים נדרשים. זרימת העבודה כאן מחולקת היא אידיאלית עבור יחידת PGT עמוסה.
כפי שתואר כבר בעבר על ידי הקבוצה שלנו4,5, ההליך כרוך פתיחה רציפה של הסונה pellucida של לחלוטין מורחב בלסטוציסטות והסרה של תאים TE מעטים (בממוצע 7-8). בהשוואה ליום 3 לייזר בסיוע בקיעה מבוסס ביופסיה שיטה6, הליך זה עשוי להקל על לוח הזמנים היומי של יחידת IVF שבו הליכים עדינים, כגון ביופסיה בלסטוציסט ו ויטריפיקציה, חייב להתבצע בעיתוי. ברגע שהציסטה הבלסטובה מגיעה להתרחבות המלאה שלה, הביופסיה יכולה להתבצע על ידי בחירת תאי ה-TE כדי להסיר, ובכך למנוע את הסיכון לפריצת המסה של התא הפנימי (ICM), אשר אחרת להפוך את ההליך מאתגר. בספרות, פרוטוקול שלישי של ביופסיה בלסטוציסט תוארה גם, אשר כרוכה הבקיעה בסיוע לייזר להתבצע פעם העובר כבר הגיע לשלב בלסטוציסט, כמה שעות לפני ההליך5,7. עם זאת, גישה זו היא יותר זמן רב ובעיקר חליפות IVF כי הם ביצוע ביופסיה TE בידיים של מגבילים מנוסים מנוסה ולאור עומס עבודה יומי מתון נמוך.
הזרקת זרע תאיים (ICSI)8 צריכה להיות טכניקה מאוחדת אם מכוון לביצוע ניתוחים גנטיים בהפריה חוץ גופית. באופן דומה, מערכת התרבות הנכונה לקצור בבטחה עוברים לשלב בלסטוציסט הוא חיוני ליישום של האסטרטגיה ביופסיה TE. מספר הולם של אינקובטורים, כמו גם השימוש במתח חמצן נמוך הם תנאי מפתח למטרה זו, לא להתפשר על שיעור בלסטוציסטה9. באותו זמן, תוכנית הקריוגנית יעילה נדרשת כדי לנהל בבטחה מחזור PGT. בעשור האחרון, יישום ויטריפיקציה יש שיפרה העובר שיעורי ההישרדות אפילו עד > 99%10,11. זה סיפק זמן מספיק כדי לבצע בדיקות גנטיות ולדחות העברת העובר אל המחזור הווסת הבא, על לא מגורה וכנראה יותר רירית האנדויום12.
הן ביופסיה ו-ויטריפיקציה הם תובעניים משימות הדורשות מיומנויות קפדניות והאפקטיביות שלהם עשוי להשתנות בין אופרטורים לא מנוסים. תקופת הכשרה מסוימת היא לפיכך מאפשרת לכל מפעיל לבצע הליכים אלה קלינית; יתר על כן, התחזוקה של מיומנויות המפעילים צריך להיות מוערך מעת לעת על ידי ניטור מחוונים ביצועים מפתח (KPI) עבור הקפאת הזמנות ונוהלי ביופסיה. כל מרפאת IVF צריך להגדיר מחווני Kpi פנימיים למטרה זו, אשר חייב להיות מקורב אלה שפורסמו על ידי קונסורציומים הבינלאומי ו/או את התוצאות שפורסמו על ידי מעבדות התייחסות.
TE ביופסיה, הליכים ויטריפיקציה-התחממות ועדים הם טכניקות מאומת ביחידה שלנו, כי כבר מתוקננת על פני כל המפעילים מעורבים כדיווח בשלוש פרסומים קודמים11,13,14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול עבור ביופסיה של האדם בלסטוציסטה, כאן תיאר, עוקב אחר ההנחיות של הוועדה האנושית E.R.A. המחקר האנושי.
הערה: עיין בטבלת חומרים לחומרים הנדרשים. חומר נוסף נדרש כרוך הנעלה מעבדה התלבושת, מסכת מסיכה כירורגית, כיסוי שיער, כפפות כירורגי, סמן קבוע לא רעיל, מלקחיים וחיטוי. השימוש בחלוק כירורגי, כפפות ניתוח חד פעמיות, facemask, כיסוי שיער הוא הכרחי כדי למנוע סיכון של זיהום. כל תחומי העבודה, כמו גם את הציוד המעורב בתהליך, יש לנקות ביסודיות עם חיטוי מעבדה (g., Oosafe) לפני הפעלת כל הליך. כל החומרים והמדיה המשמשים צריך להיות סטרילי, ארוז או מצוטט בנפרד. הוא הציע להשתמש בתחנת עבודה ייעודית לביופסיה ואבובים ולהגביל את הגישה של האזור רק למפעילים המעורבים בהליך (embryologist ועדה).
1. הכנה ליום לפני הליך הביופסיה
-
הכינו את הצלחת תרבות פוסט ביופסיה.
- מקום 6 טיפות של 20 μL תרבות IVF בינונית (טבלה של חומרים) בצלחת תרבות IVF וכיסוי עם 6 מ ל של שמן מינרלים prewarmed לתרבות העובר (טבלת חומרים).
- הוסף עוד 10 μL של מדיום תרבות IVF לכל טיפה. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c באווירה מבוקרת (5% O2, 6% CO2).
-
להכין מאכל IVF 4-צלחת לשטוף את בלסטוציסט לאחר ביופסיה.
- מקום 600 μL של מדיום תרבות IVF בשתי הבארות הראשונות ושכבת הכיסוי עם 300 μL של שמן מינרלים טרום שחומם לתרבות העובר.
- המלון משלב בין לילה ב-37 ° c באווירה מבוקרת (5% O2, 6% CO2).
- לחלק 1.5 μL של טעינת פתרון (טבלת חומרים) בכל צינור PCR לשמש צינורות תאים TE, לסובב אותו ולשמור אותו ב 4 ° c.
2. הכנה ביום הליך הביופסיה
-
. הכן את צלחת הביופסיה
- מקום 3 טיפות של 10 μL HEPES-באגירה מדיום (שיושלם עם אלבומין סרום אנושי) (טבלת חומרים) ברציפות בצלחת תרבות IVF.
- חזור על השלב 1.1.1 לפי מספר בלסטוציסטות זמין (עד 4 blastocysts לכל מנה) ושכבת עם 6 מ ל של שמן מינרלים טרום מחומם לתרבות העובר.
- דגירה את הצלחת ב 37 ° c עבור לפחות 1 h לפני ביצוע הליך ביופסיה.
3. בחירת בלסטוציסטה וציון
-
כיתה the בלסטוציסט על פי התרחבות שלה מראה מורפולוגית של ICM ו-TE (איור 1).
הערה: הקריטריונים לציון הותאמו מגארדנר ומכלי השיט15 ובעבר תיארו את קאלמבו ואח '. וסימדומו ואח '4,11.- להגדיר את גודל וכיתה הרחבה כמו: a עבור באופן מלא מקווקו בלסטוציסט, B עבור הבקיעה בלסטוציסט, C עבור בלסטוציסטה המורחבת במלואו, ו-D עבור מורחב לא בלסטוציסטה (העוברים האלה הם ביופסיה רק אם הם לא להרחיב יותר עד יום 7).
- להגדיר כיתה ICM: 1 עבור ICM בולט עם מספר תאים ארוזים בקפדנות; 2 להבחין עם מספר תאים אך בעלי ערך מלא; 3 קשה להבחין עם מעט מאוד תאים באיכות נמוכה.
- להגדיר כיתה TE כדלקמן: 1 עבור אפיתל מאורגן היטב עם מספר תאים; 2 עבור האפיתל רופף עם כמה תאים; 3 עבור מספר תאים ו/או גדולים באיכות נמוכה.
4. ביופסיה של הטרופטועור
- לבצע ביופסיה על כל קיימא לחלוטין מורחבת blastocysts (רצוי C כיתה עבור גודל והרחבה).
- הערכה החזקה וביופסיה של כל הליך ביופסיה. ההמלצות של הפיפטה ביופסיה הם הבאים: 30 יקרומטר קוטר פנימי, 35 ° זווית עיקול, 0.75 מ"מ טיפ מרחק להתכופף.
- התווית את צלחת הביופסיה עם פרטי המטופל (שם האישה ושם המשפחה, תאריך לידה ותעודת זהות) ולאחר מכן מספר כל טיפה עם מזהי העובר ומחזור. השתמש בסמן קבוע שאינו רעיל.
- להעביר את בלסטוציסט עם הצינורות 300 יקרומטר להתפשט לירידה הראשונה של צלחת ביופסיה ולשטוף אותו כדי להסיר את עודפי בינוני התרבות. ואז להעביר את הבלסטוציסטה בטיפה השנייה של צלחת הביופסיה.
- הזז את הצלחת אל המיקרוסקופ הפוך, הממשלה את הפיפטה ביופסיה משכילות כמה בינוני מהטיפה השלישית של צלחת הביופסיה.
- בהגדלה של 20x, האוריינט הבלסטוציסטה כדי לקבל תצוגה ברורה של ICM. כאשר הוא מדמיין בשעה 7 (מול האזור שיהיה מיועד להסיר את התאים TE), לאבטח את העובר על הצנרת האוחזת (איור 2a).
- להתמקד על הסונה pellucida ולוודא כי הן הפיפטות ואת הבלסטוציסטה נמצאים על אותו מטוס מוקד.
- לעבור למטרת לייזר (זמן הדופק 0.3 ms, 6.5 μm) ולמקם את מצביע הלייזר על הסונה pellucida בצד הנגדי של ICM. לקדוח את הסונה באמצעות 2 ל 3 פולסים בלייזר (איור 2b).
- לחץ בעדינות על הפיפטה ביופסיה נגד הסונה pellucida ולפוצץ כמה בינוני באמצעות הפרה לנתק את התאים TE מהמשטח הפנימי שלה ולזרז התמוטטות בלסטוציסט (איור 2 ג).
- לאחר TE מנותקת (איור 2d), להיכנס דרך החור (אם נדרש, לעשות את זה רחב יותר עם פולס לייזר האחרון) ומרוקן כמה תאים TE (באופן אידיאלי 7 על 8 שמונה13,16) לתוך הפיפטה ביופסיה עם יניקה עדינה (איור 2d).
- הזיזו מעט את הפיפטה ביופסיה לאחור תוך החלת יניקה מתונה כדי למתוח את תאי היעד (איור 2f).
- לכוון את הלייזר לעבר החלק הדק של התאים מתים ולירות 2-5 פולסים לייזר בצמתים בין התאים כדי להפריד את תאי היעד מהגוף של העובר (איור 2g). העיתוי של פולסים בלייזר ואת מספר פולסים ניתן לכוונן בהתאם לאיכות של הבלסטוציסטה; עם זאת, נסה למזער אותם כדי להימנע מפירוק תאים.
- לאחר ההפרדה של קטע TE מן הבלסטוציסטה (איור 2h), לשחרר אותו לתוך ביופסיה באותו טיפה הרחק מתוך בלסטוציסט. זה נחוץ כדי למנוע מהם להישאב שוב לתוך הפיפטה ביופסיה (איור 2i).
- שחררו את בלסטוציסטה מהפיפטה האוחז והרימו מיד את שני הפיפטות כדי למנוע מרסיס לדבוק בהם.
- צלם תמונה של קטע הביוביופסיה למטרת בקרת איכות (איור 3).
הערה: אם יותר מאשר בלורית אחת היא להיות ביופסיה לכל הליך (עד ארבע לכל צלחת ביופסיה), לשנות את הפיפטה ביופסיה עם אחד חדש כדי למנוע זיהום צולב בין העוברים. - חזור על שלבים 4.1 ל4.13.
- להעביר את צלחת הביופסיה. חזרה למכסה הזרימה
- תייג את קערת התרבות שלאחר הביופסיה עם מזהה הזוג, וכל טיפה עם העובר ומזהה המחזור.
- בנוכחות של עד, לשטוף את בלסטוציסטה נקי IVF בינוני, ולבסוף להעביר אותו לירידה המקבילה שלה לאחר הביופסיה צלחת.
- להעביר את הצלחת פוסט ביופסיה לחממה באווירה מבוקרת (37 ° c, 6% CO2, 5% O2) עד ויטריפיקציה. מומלץ לבצע ויטריפיקציה בתוך 30 דקות מהליך הביופסיה, כדי למנוע התרחבות מחדש בלסטוציסט.
5. אבובים
הערה: כל ההליך חייב להתבצע בנוכחות עד ובתוך כיסוי הזרימה הבינארי בטמפרטורת החדר. במהלך התהליך, שמרו את צינורות ה-PCR במתלה שפופרת קר על הקרח (איור משלים 1).
- תייג את צינורות ה-PCR. עם סמן קבוע שאינו רעיל
הערה: יש לבצע את התיוג כפי שהתבקש על ידי המעבדה הגנטית. באופן כללי, שם החולה ומשם המשפחה (ראשי תיבות), מזהה הזוג, מזהה העובר ומחזור (למשל: JD 12345 1.2 עבור העובר N .1 של מחזור 2 שייך לפלונית אלמונית שמספר הזיהוי שלהם הוא 12345). מזהה העובר יש לדווח גם באותיות על גוף השפופרת. - התווית את המכסה של 60 מ"מ x 15 מ"מ ממנה התרבות (צלחת אבובים) עם מזהי ביופסיה (איור המשלים 1) ולהכין 2 10 μl טיפות של פתרון כביסה הביופסיה (טבלת חומרים) בו.
- הממשלה 140 יקרומטר בנוכחות הפיפטה (איור משלים 1) עם פתרון כביסה כמה ביופסיה מן הטיפה השנייה של צלחת אבובים.
- מניחים את הצלחת ביופסיה תחת stereomicroscope כדי להמחיש בקלות את הרסיס TE (s).
- שחררו בעדינות את הפתרון לשטיפת ביופסיה על מקטע ה-TE; אז, לטעון אותו לתוך הפיפטה החשפנות.
- הזז את קטע ה-TE לירידה השנייה של פתרון כביסה ביופסיה בצלחת אבובים ושטוף בזהירות את זה 2-3 פעמים.
- העבר את מקטע ה-TE לחלק התחתון של צינור ה-PCR (המסומן בעבר לאחר מכן) עם פתרון העמסה, שים לב כדי להימנע מלגעת בקירותיו בקצה של הפיפטה ההתפשט.
- חזור על ההליך משלב 5.3 לשלב 5.7 עבור כל מקטע TE, שם לב להשתמש בקפילר חדש עבור כל מקטע TE.
- בסוף ההליך אבובים, לשים את כל צינורות ה-PCR בצנטריפוגה מיני, ולסובב אותם כמה שניות.
- אחסן את הדגימות ב-20 ° c עד שילוח המעבדה הגנטית המפנה לבדיקות.
6. בלסטוציסטה ויטריפיקציה
- Vitrify התמוטט blastocysts בתוך 30 דקות מ-TE ביופסיה כדי למנוע התרחבות מחדש שלהם.
- סמן את הלוחית הויטריפיקציה עם פרטי האישה ואת המזהים של הבלסטיציסטות שחייבות להיות מיושמות.
- סמן את התמיכה הויטריפיקציה (ים) עם שם האישה ושם המשפחה, מזהה הזוג, מזהה העובר שייטען על זה, כמו גם תאריך של ההליך. הקריואלים מיוחדים משמשים אשר שומרים על שלמות שלהם גם בטמפרטורה נמוכה מאוד (-196 ° c).
- בטמפרטורת החדר, לחלק 0.3 מ ל של פתרון שיווציה (ES) (טבלת חומרים) עבור כל בלסטוציסטה כי יהיה מתכלה.
- בנוכחות של עד, להזיז את הבלסטוציסטה ES באמצעות הפיפטה 300 יקרומטר להתפשט.
- להשאיר את הבלסטוציסטה ב-ES במשך 13-15 דקות. לאחר הצטמקות הראשונית של הכרך, התרחבות מחדש הדרגתית תהיה נצפתה.
- ממלאים ארון קירור קטן עם חנקן נוזלי (LN2) ומניחים אותו מתחת למכסה הזרימה הבינארי.
- לוותר 300 μL של פתרון ויטריפיקציה (VS) (טבלת חומרים) בבאר השנייה. לאחר התפשטות בלסטוציסט להשלים הרחבה מחדש, להעביר אותו בפתרון VS עבור 1 דקות ולשטוף אותו כדי לדלל את ES.
- בנוכחות של עד, לטעון את בלסטוציסטה על התמיכה ויטריפיקציה ולטפל הסרת עודף של VS. סרט עדין של הפתרון צריך להקיף את הבלסטוציסטה.
- לצלול את התמיכה ויטריפיקציה לתוך LN2 ולהעביר אותו במרץ כדי להפחית את הסיכון של היווצרות בועה קרוב הדגימה.
- הניחו את כובע המגן תוך שמירה על התמיכה הויטריפיקציה הנמצאת מתחת ל-LN 2.
- בנוכחות עד, הזיזו את התמיכה הויטריפיקציה במיכל אחסון בטווח הארוך LN2 .
7. הצטמקות מלאכותית של הביו-ביוסטוציסטות
-
אם לא מתנהל ביופסיה TE, לכווץ באופן מלאכותי את blastocysts מיד לפני ויטריפיקציה (איור 4).
- הזיזו את המנה התרבותית מהאינקובטור למיקרוסקופ ההפוך והתרכזו בעובר הנבחר.
- מעבר למטרת לייזר (פולס טרום להגדיר: 0.3 ms, 6.5 μm), המטרה את הסונה pellucida בצד הנגדי של ICM, ואז ישיר 1 – 2 פולסים לייזר לצמתים בין תאים TE במרחק בטוח מ-ICM. הציסטות הבלסטוכי אמורות להתמוטט בתוך פחות מ -5 דקות.
- המשך עם הויטריפיקציה של בלסטוציסטה המכווצת כמתואר בסעיף 6.
8. להעברה בלסטוציסטה התחממות
- ביום של ET, להכין את הצלחת ET 4-הבאר על ידי הצבת 600 μL של מדיום בינוני התרבות IVF עבור כל טוב. מודטה ב 37 ° c באווירה מבוקרת (5% O2, 6% CO2), תוך ביצוע התחממות בלסטוציסטה.
- סמן את המנה המחמם עם שם האישה ושם המשפחה, מזהה הזוג, מזהה העובר שיהיה מחומם בו.
- חלק 1 מ ל של הפתרון הפשרה (TS) (טבלה של חומרים) בתבשיל IVF-באר אחת (איור משלים 1) ולחמם אותו 37 ° c בתרמוסטט עבור לפחות 1 h לפני תחילת ההליך.
- ממלאים תמיכה בצינון קטן עם LN2 ומניחים אותו במכסה הזרימה הלבינארי בקרבת אזור העבודה.
- לפני תחילת השגרה, בדוק את מידע הבלסטוציסטה המדווח בתמיכה הויטריפיקציה. כל המזהים צריך להתאים את הדוח הגנטי ואת בלסטוציסט להתחמם חייב להיבחר בין אלה הניתנים להעברה. . העד נדרש במהלך הניתוח
- קח את המנה האחת המכילה TS מחומם מתוך התרמוסטט ומניחים אותו על הבמה מחומם תחת stereomicroscope.
- משוך מעל כובע מגן בתוך LN2 באמצעות מלקחיים.
- לצלול במהירות את קצה התמיכה הויטריפיקציה לתוך 37 TS מעלות צלזיוס.
- תחת התבוננות מיקרוסקופית, להעביר בעדינות את התמיכה ויטריפיקציה עד הבלסטוציסטה שוחרר מהקצה.
- להשאיר את הבלסטוציסטה עבור סך של 1 דקות ב-TS, לשים לב כדי לשמור אותו בתחתית של TS.
- בטמפרטורת החדר לוותר 200 μL של תמיסת דילול (DS) (טבלת חומרים) על הבאר הראשונה של צלחת ויטריפיקציה.
- להעביר את בלסטוציסט ל DS ולמקם אותו בתחתית הבאר תוך שחרור כמה TS על החלק העליון של זה כדי ליצור מעין הדרגתי. . תשאיר את זה למשך 3 דקות
- לחלק 200 μL של פתרון כביסה (WS) ב 2 בארות שונות (WS1 ו WS2).
- להעביר את בלסטוציסט כדי WS1 ולמקם אותו על החלק התחתון של הבאר תוך שחרור כמה מדיום DS על החלק העליון של זה. ואז להעביר את הבלסטוציסטה כדי WS2 ולהשאיר אותו ללא הפרעה עבור 1 דקות.
- התווית את הצלחת לאחר ההתחממות עם שם האישה ושם המשפחה, מזהה הזוג, מזהה העובר כי יהיה תרבותי בו.
- בנוכחות עד, להעביר את בלסטוציסטה החמם למדיום התרבות הקדם ביותר בלוח ET שלאחר ההתחממות.
- לשטוף את בלסטוציסטה בבאר הראשונה של הצלחת ET ומניחים אותו בבאר השנייה.
- העבר את קערת התרבות שלאחר ההתחממות לחממה באווירה מבוקרת (37 ° c, 6% CO2, 5% O2) ואת התרבות הבלסטוציסטה עבור לפחות 1.5 h לפני בדיקת ההישרדות שלה מחדש התרחבות.
הערה: איור 5 מראה דוגמאות של מנוונת, ששרדו, אך לא מורחב מחדש, שרדו לגמרי והתרחבה במלואה.
9. EmbryoTransfer
- כדי לבצע ET, הניחו את המנה על הבמה המחוממת של כיסוי הזרימה המבינארי, כך שהעובר גלוי מתחת למיקרוסקופ בהגדלה נמוכה.
- קח כ 0.4 מ ל של מדיום תרבות הפריה חוץ גופית. אבטח את קצה המזרק בחוזקה לתוך הקצה המקבל של הצנתר הפנימי ולאחר מכן שחרר את המדיום עד 0.1 mL.
- כמות מזערית של התרבות עד שהוא צופה בעוברים הנכנסים לצנתר (סכום מינימלי של מדיה: 10 עד 15 μL).
- מניחים את הקטטר לתוך אריזת פלסטיק וללכת לחדר הניתוח ומניחים את הקטטר הפנימי לתוך המדריך החיצוני.
- פעם הגיע הרחם, לדחוף את המזרק כדי לשחרר את העובר (ים). שחררו לאט מאוד את המדיום עד שהמבוכנה קוראת 0.1 mL.
- קח את הקטטר חזרה למעבדה ותבדוק. מתחת למיקרוסקופ שהעובר הועבר
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 6 מייצג ערכה של כל התוצאות של הליך ביופסיה שניתן לאמץ כדי לתקנן את הפרוטוקול ולנטר את הביצועים של כל אופרטור. התוצאה הפרוצדורלית העיקרית היא העיתוי להשלמת ביופסיה/ביופסיות; התוצאה הטכנית העיקרית היא האיכות של העלילה המיוצר לאחר בדיקות גנטיות שעשוי לגרום לאבחנה מכרעת או לא מחד-משמעית, האחרון אשר דורש מחדש ביופסיה של בלאי אובחן; התוצאה הביולוגית העיקרית היא שיעור ההישרדות והתרחבות מחדש לעומת ניוון לאחר ההתחממות; לבסוף, התוצאה הקלינית העיקרית היא שיעור הלידה החיה לאחר העברת הדלק התחמם-מחומם. בשלושה מחקרים קודמים דיווחו על מחווני ה-kpi המוגדרים במרכז (s) עבור התוצאות הטכניות, הביולוגי והקליני11,13,16. להלן, במקום זאת אנו מדווחים כיצד ה-KPI לתזמון הביופסיה הוגדר. יתר על כן, ההשפעה הפוטיבית של העיתוי בין ביופסיה לויטריפיקציה על התנהגות שלאחר ההתחממות של אאופואיד בלטוציסטות נחקרו גם.
בתקופה של 2 שנים, סך של 1,544 הליכי ביופסיה של trophectoderm עור נערכו על ידי 7 אופרטורים (שולחן 1). לאחר מכן, חזרו לחממה לכלי תרבות שלאחר הביופסיה עד לויטריפיקציה. כל הנתונים הרלוונטיים נאספו במסד נתונים יחסי. כל התזמונים של ביופסיה, בין ביופסיה ויטריפיקציה היו שהתקבלו באופן מיוחד מהתוכנה של מערכת העדים האלקטרונית IVF. הנתונים יוצאו לאחר מכן ונותחו עבור סטטיסטיקות.
שיעור ההישרדות של אאופלויד בלייסטיציסטות לאחר ביופסיה של trophectoderm היה N = 571/572, 99.8%. שיעור ההתרחבות מחדש ב 1.5 h לאחר ההתחממות היה N = 556/571, 97.4%. בין 15 לא מורחבת מחדש בלסטוציסטות, אחד הביא ללידה חיה לאחר שהועבר ברחם. שיעור הלידה החיה לאחר ליטן-העברה מחומם למחצה של העברת ציסטה בודד היה N = 227/572, 39.7%.
הגדרת העיתוי האידיאלי של ביופסיה
טבלה 1 מסכמת את הנתונים הרלוונטיים של נוהלי הביופסיה שנערכו. בסך הכל, 1.89 ± 1.03 (טווח 1-4) blastocysts היו ביופסיה לכל הליך ב 8.24 ± 4.23 min (טווח 3-22). העיתוי מרושע של ביופסיה מגוונת בגלל הן מספר ביופסיה blastocysts לכל הליך, מינימום של 5.78 ± 2.94 דקות (טווח 3-16) כאשר רק עובר אחד הונחו בצלחת למקסימום של 12.93 ± 4.43 min (טווח 6-22) כאשר העוברים באופן רציף ביופסיה אנחנו מחדש 4. פרמטר רלוונטי נוסף היה המפעיל מעורב בהליך: המומחה ביותר (N = 443 הליכים) היה המהיר ביותר (7.41 ± 3.6 min, טווח 3-22), ואילו הפחות מנוסה (N = 42) היה האיטי ביותר (14.19 ± 4.24 min, טווח 6-22). אכן, מודל לינארי כללי הכולל הן את "מספר ביופסיה ביולוגיות לכל שגרה" ומשתני "המפעיל" מוסבר בצורה מושלמת את "עיתוי הביופסיה" עם R2 = 0.48 וכוח = 1. ניתוח זה היה שימושי כדי להגדיר כי באופן אידיאלי ~ 6 דקות הוא מספיק עבור הליך ביופסיה בלסטוציסט כאשר רק העובר הוא הניח את המנה, בעוד ~ 9 דקות, ~ 12 דקות ו ~ 13 דקות עבור 2, 3 ו 4 בלסטוציסט, בהתאמה. ברור, ההליך כולו כרוך גם הזזת העוברים מן התרבות לצלחת ביופסיה, מן האחרון את קערת התרבות פוסט ביופסיה לאחר ההליך, כמו גם לשנות את הצנרת ביופסיה בין ביופסיות רציפים.
איור 7 מתווה את התזמון הממוצע של ביופסיה לכל מפעיל לאורך הטרימסטרס (מתוך 1עד 8). הקו האדום המנוקד מזהה את הערך הכולל הממוצע של 8.24 דקות. גרף שכזה שימושי לניטור הביצועים המורעים של כל אחד מהמטפחים. לדוגמה, האופרטורים המומחים ביותר (1 ו-2) הראו ירידה מתמדת בעיתוי זה, המציעה מגמה טיפוסית לעקומת למידה. כל המפעילים מ-3 עד 6 היו במקום קבוע מספיק בביצועים שלהם סביב הערך הכולל הממוצע על פני הטרימסטרס. בכל פעם שהם הראו שיא בערך ממוצע של בשליש נתון (למשל, מפעיל 3 בשלישה 7, מפעיל 4 ב 6 בשליש, מפעיל 5 בשליש השלישי), הם הזהירו על מנת לשנות את הביצועים שלהם. מפעיל 7 (כלומר, הפחות מנוסה) הראה תזמונים אופייני של embryologist שבדיוק סיים את ההכשרה שלו/שלה. ייתכן שהוא יפגוש את הסטנדרטים הפנימיים למעבדה בעוד המומחיות תגבר.
חשוב מכך, הזמן של ביופסיה היה דומה על פני מורחב מחדש ולא הרחיב מחדש אאופואיד בללויד ב 1.5 h מהתחממות (9.52 ± 4.23 min, טווח 3-22 לעומת 10.5 ± 5.68 min, טווח 4-22; t-test = 0.37). כנראה, מושתל (N = 229) ולא מושתל (N = 343) מחומם-מחמם בלואיד בלייסטיציסטות גם הראה תזמוני ביופסיה דומים (9.77 ± 4.15 min, טווח 3-22 לעומת 9.41 ± 4.36 min, טווח 3-22; t-test = 0.39). אולי אז, עיתוי ≤ 22 דקות כדי ביופסיה עד 4 blastocysts אינו משפיע על התנהגות העובר לאחר ההתחממות. לכן, הגדרתי ערך זה כהסף המירבי.
באופן דומה, לא הוצגה הבדל במונחים של שיעור לידה חי באמצעות מפעילי ביופסיה שונים, כפי שדווח כבר בעבר13 (טבלה משלימה 1).
פרמטר חשוב נוסף לניטור הביצועים של כל אופרטור הוא הקצב של תוצאות לא משמעיות לאחר האבחון, שאמורות להיות קרובות ככל האפשר לביצועים הכלליים של כל מעבדה. באופן אידיאלי שיעור זה לא יעלה על 2.5% ועלול להצטמצם עם הזמן בשל מומחיות גוברת ביופסיה והליכי אבובים16. מספר היעד של תאים TE לאחזור הם 7-8 על פי שני מחקרים קודמים13,16. לשם כך, מוצע לצלם תמונה של המקטע הביו, למטרת בקרת איכות (ראה מספר דוגמאות באיור 3). ניתן לבדוק תמונה כזאת במקרה של אבחנות לא משמעיות כדי להעריך אם הגורם היה השלכה על הממד/איכות של הקטע (כלומר, איכות נמוכה של הניתוח המולקולרי), על אבובים (כלומר, כשל הגברה DNA) או בעיות מסוימות ב העיבוד של המדגם במעבדה הגנטית.
הגדרת העיתוי האידיאלי בין ביופסיה לויטריפיקציה
בתקופת המחקר, 572 אאופואיד בלייסטיציסטות היה מחומם לעבור העברה העובר אחרי האבחנה של אאופולויידי. איור 8A מראה כל בלטיות מחומם כמעגל שחור מופץ על פני העיתוי הולך וגובר בין ביופסיה ו ויטריפיקציה מקובצים בשתי קבוצות על פי התוצאה תחת חקירה: מורחבת מחדש או לא מחדש מורחב בתוך 1.5 h מ התחממות. כל הבלסטציסטות (N = 117/117) מתוקצבים בתוך 30 דקות, 97.6% (N = 245/251) של הבלסטיציסטות המסיביות 31-90 בין העשרה לדקה, ו-95.1% (N = 194/204) של הבלסטוציסטות מעבר ל-90 דקות מורחבת מחדש, בהתאמה (אין שיעורי הרחבה מחדש: 0%, 2.4% לכן, אנו מוגדרים 30 דקות ו 90 דקות כמו סף מוקדם ומאוחר של זמן בין ביופסיה ו ויטריפיקציה.
איור 8B מציג את שיעור ההתרחבות מחדש בשלוש הקבוצות (≤ 30 דקות, 31-90 דקות, > 90 דקות) עוד משנה sub-באשכולות בהתאם לאיכות בלסטוציסטה וליום של פיתוח טרום השרשה. במיוחד עבור איכות ירודה ו/או יום 7 blastocysts, העיתוי בין ביופסיה ויטריפיקציה נראה חיוני כדי להשיג התרחבות מחדש לאחר ההתחממות. באופן ספציפי, את הסיכויים-יחס של התרחבות מחדש לאחר התחממות לאיכות שניהם בלסטוציסט וביום של ביופסיה ב בלסטוציסט ומלא בתוך 30 דקות מ ביופסיה לעומת בלסטוציסט מעבר 90 דקות היה 3.05 (95% CI 1.01-9.4, p = 0.05). במקום זאת, התקופה בין שתי הדקות האלה (31-90 min) ייצגה אזור אפור שעשוי להיות או לא להשפיע עליו.
רק 1 מתוך 15 לא מורחבת מחדש blastocysts הביא לידה חיה לאחר ההעברה. לכן, אנו חקרו לבסוף את שיעור הלידה חי מושגת לאחר העברה התחממות בודד מחומם למחצה באשכולות בשלוש קבוצות על פי העיתוי בין ביופסיה ו ויטריפיקציה. שיעור הלידה הגבוהה ביותר לחיות הושגה על ידי העברת מ≤ הביופסיה של אאופואיד (N = 56/117, 47.9%). עם זאת, תוצאה זו לא להגיע משמעות סטטיסטית כאשר בהשוואה לתוצאה זהה שהושג או עם בלסטוציסטות מושוות בין 31 ו 90 דקות (N = 92/251, 36.7%; המבחן המדויק של פישר = 0.06), או עם בלסטוציסטות > 90 דקות מן הביופסיה (N = 81/204, 39.7%; המבחן המדויק של פישר = 0.16). לכן, או השפעה שלילית על יכולת הרבייה בלסטוציסט הוא זניח או גודל לדוגמה בערכת נתונים זו (N = 572) לא היה מספיק כדי להגיע למשמעות סטטיסטית.
איור 1: פרמטרים עבור הדירוג בלסטוציסט. הרחבה: (א) בקעה מלאה, (ב) בבקיעה, (ג) מורחבת לחלוטין, ו-(ד) לא הורחב. השלב האידיאלי הוא C, בעוד בלסטוציסטה D צריך להינתן יותר זמן כדי להשיג התרחבות מלאה, אלא אם השלב הזה הוא הגיע ביום 7; מסת תא פנימית (ICM) איכות מורפולוגית: 1 (בולט עם מספר תאים ארוזים בלבד), 2 (הניכרת בתאים מועטים אך ארוזים) ו-3 (קשה להבחין עם מספר תאים באיכות נמוכה); טרופטועור (טה) איכות מורפולוגית: 1 (האפיתל מאורגן היטב עם מספר תאים), 2 (האפיתל רופף עם כמה תאים) ו 3 (כמה ו/או גדול תאים באיכות נמוכה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סיכום הסונה הסדרתית (ZP) פתיחה והטרוטועור (TE) הגישה אחזור התאים עבור ביופסיה בלסטוציסט. (א) אוריינט the בלסטוציסט עם מסה התא הפנימי (ICM) קרוב לפיפטה האוחז והרחק מן המקום שבו תאים TE שנבחרו יאוחזרו. לאבטח את הבלסטוציסטה על הצנרת האוחזת; (ב) לפתוח את zp דרך 2-3 לייזר יריות; (ג) לפוצץ מדיות תרבות דרך החור; (ד) בלייסטוציסטה תנתק מ-zp; (ה) להזין את zp ולמצוץ 5-10 TE תאים בתוך הפיפטה ביופסיה; (ו) לנוע אחורנית עם הפיפטה הביופסית כדי למתוח את השבר הנבחר ולחשוף את הצמתים בין התאים; (g) אש על הצמתים בין התאים ולהמשיך למתוח את השבר עד התאים TE משתחררים מהגוף של הבלסטוציסטה; (ח) הבלסטוציסטה לאחר TE ביופסיה מכווצת; (i) צלם תמונה של קטע הביופסיה לבקרת איכות והעבר אותו לצינור ה-PCR שיישלח למעבדה הגנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דוגמאות לקטעי ביופסיה: (א-ג) קטעים רצויים; (ד) רסיס לילא; (ה) קטע קטן עם תאים מנוונת; (ו) קטע קטן, מצומצם ומנוון בחלקו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הצטמקות מלאכותית. (a) להתמצא the בלסטוציסט כך מסת התא הפנימי (ICM) הוא רחוק מקטע היעד של הטרופטועור (TE); (ב) אש 2-3 לייזר יריות ברציפות בצמתים בין תאים מתקדמים ומנע החוצה; (ג) לחכות הבלסטוציסטה להתמוטט לפני שמתחילים ויטריפיקציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דוגמאות של ניוון בלסטוציסטה (א), הישרדות ההקפאה אבל לא מחדש התרחבות (ב) ו הקפאה-הישרדות מלא re-התרחבות (ג) 1.5 h לאחר ההתחממות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: סיכום התוצאות השונות של ביופסיה של trophectoderm אשר עשוי לשמש כדי לנטר את ביצועי המפעיל ולהגדיר את מחווני הביצועים המרכזיים הפנימיים לכל מעבדה. התוצאה הפרוצדורלית העיקרית היא העיתוי של ביופסיה. התוצאה הטכנית העיקרית היא שיעור של מכריע (אאופואיד או aneuploid) ו אבחנות לא חד-משמעית (ביופסיה מחדש נדרש) התקבל; האחרון עשוי להיגרם על ידי הגברה DNA או נתונים מולקולריים באיכות נמוכה, שניהם כתוצאה מכך לא מתרגם כרומוזום שולחן מספר מגרשים פרופיל. התוצאה הביולוגית העיקרית היא שיעור ההישרדות, התפשטות מחדש או ניוון לאחר ביופסיה, ויטריפיקציה והתחממות. התוצאה הקלינית העיקרית היא שיעור לידות חי או תוצאות ההריון שליליות שהושגו לאחר העברת העברה התחמם-בלסטוציסטה. של הערה, בעוד התוצאה הפרוצדורלית תלוי באופן בלעדי על המפעיל ואת מספר בלסטוציסטות לביופסיה לכל פרוצדורה, כל התוצאות האחרות עשויות להיות מושפעות מהמייסדים אחרים עצמאית ממפעיל ביופסיה (למשל, השלבים והאופרטורים מעורב בניתוח מולקולרי, האיכות מורפולוגית של הבלסטוציסטה, היום של ביופסיה) כי יש להתייחס כראוי את הביצועים שלו/שלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תזמון ממוצע של ביופסיה לכל אופרטור על פני 8 מחקר המחקר. הטבלה מסכמת את המספר הקשור של הליכים ואת מספר ממוצע של ביופסיה ביוסטוציסטות לכל שגרה על ידי כל אופרטור ב 8 המחקר. הקו האדום המנוקד בתוך כל גרף מייצג את התזמון הממוצע הכולל של ביופסיה (8.24 דקות). קווי השגיאה הם הסטיות הסטנדרטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: התרחבות מחדש לאחר התחממות לעומת העיתוי בין ביופסיה לויטריפיקציה. (א) מראה לא מורחב מחדש והרחיב מחדש blastocysts 1.5 hr לאחר ההתחממות. כל בלסטוציסטה מיוצגת על-ידי עיגול שחור על פני התזמונים הגדלים. הקווים הישרים האנכיים הרציפים מייצגים 30 דקות שנקבעו כמסף מוקדם ו-90 מינימום מוגדרים כ-הסף המאוחר. (ב) מציג את שיעורי ההרחבה מחדש בשלוש קבוצות (העיתוי בין ביופסיה ו ויטריפיקציה: ≤ 30 דקות, 31-90 דקות, > 90 דקות) נוסף באשכולות על פי איכות בלסטוציסט ויום של ביופסיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| N ההליכים | ביוסטוציסטות ביופסיה לכל הליך | עיתוי מרושע של ביופסיה ± SD, טווח (דקות) | |
| מפעיל 1 | 443 | 2.01 ± 1.09, 1-4 | 7.41 ± 3.6, 3-22 |
| 195 | 1 | 4.75 ± 1.96, 3-16 | |
| 111 | 2 | 7.83 ± 2.45, 3-18 | |
| 71 | 3 | 10.27 ± 2.41, 4-16 | |
| 66 | 4 | 11.48 ± 3.81, 6-22 | |
| מפעיל 2 | 290 | 1.81 ± 0.98, 1-4 | 7.87 ± 4.13, 3-22 |
| 142 | 1 | 5.69 ± 3.32, 3-16 | |
| 89 | 2 | 8.48 ± 2.79, 3-18 | |
| 30 | 3 | 11.37 ± 3.72, 4-20 | |
| 29 | 4 | 13.1 ± 3.89, 9-22 | |
| מפעיל 3 | 287 | 1.98 ± 1.05, 1-4 | 9.10 ± 4.65, 3-22 |
| 121 | 1 | 6 ± 2.19, 3-15 | |
| 89 | 2 | 9.6 ± 3.87, 3-22 | |
| 38 | 3 | 12.66 ± 4.55, 4-22 | |
| 39 | 4 | 14.13 ± 4.8, 6-22 | |
| מפעיל 4 | 217 | 1.66 ± 0.87, 1-4 | 7.58 ± 3.45, 3-22 |
| 118 | 1 | 5.58 ± 1.96, 3-14 | |
| 66 | 2 | 8.92 ± 2.91, 4-22 | |
| 21 | 3 | 11.48 ± 2.34, 5-16 | |
| 12 | 4 | 13 ± 4.26, 6-19 | |
| מפעיל 5 | 144 | 2.03 ± 1.08, 1-4 | 9.43 ± 4.24, 3-22 |
| 59 | 1 | 6.15 ± 2.5, 3-16 | |
| 43 | 2 | 10.07 ± 2.73, 6-16 | |
| 20 | 3 | 12.6 ± 2.89, 9-18 | |
| 22 | 4 | 14.09 ± 4.43, 6-22 | |
| מפעיל 6 | 121 | 1.67 ± 0.94, 1-4 | 7.79 ± 3.93, 3-22 |
| 70 | 1 | 6.19 ± 2.95, 3-16 | |
| 32 | 2 | 8.12 ± 1.72, 3-11 | |
| 9 | 3 | 12.78 ± 3.31, 9-18 | |
| 10 | 4 | 13.5 ± 6.19, 6-22 | |
| מפעיל 7 | 42 | 1.62 ± 0.94, 1-4 | 14.19 ± 4.24, 6-22 |
| 27 | 1 | 11.85 ± 5.53, 6-16 | |
| 6 | 2 | 16.5 ± 3.73, 11-22 | |
| 7 | 3 | 19.86 ± 3.34, 13-22 | |
| 2 | 4 | 19 ± 4.24, 16-22 | |
| כולל | 1544 | 1.89 ± 1.03, 1-4 | 8.24 ± 4.23, 3-22 |
| 732 | 1 | 5.78 ± 2.94, 3-16 | |
| 436 | 2 | 8.85 ± 3.14, 3-22 | |
| 196 | 3 | 11.72 ± 3.70, 4-22 | |
| 180 | 4 | 12.93 ± 4.43, 6-22 |
טבלה 1: עיתוי ממוצע מוחלט של ביופסיה מספר ממוצע של ביופסיה blastocysts בכל הליך על פי אופרטור ביופסיה. העיתוי מרושע של ביופסיה הוצגה גם על פי כל מספר רציף של ביופסיה בלסטוציסטות לכל פרוצדורה. מודל ליניארי כללית הכולל הן את "אופרטור ביופסיה" ו-"מספר ביופסיה ביוסטוציסטות לכל שגרה" משתנים באופן מושלם עם "עיתוי של ביופסיה" (R2 = 0.48, כוח = 1).
איור משלים 1: התקנים העיקריים והתמיכות הנדרשות לפרוצדורה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: ניתוח רגרסיה לוגיסטית אינו מראה שום קשר משמעותי בין מפעיל הביופסיה ולידה חיה לאחר העברת העברה לאחר הלידה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רק embryologists מיומנים מנוסים שסיימו את תקופת ההכשרה שלהם צריך לבצע הן TE ביופסיה ו בלסטוציסט ויטריפיקציה. יתרה מזאת, על העד לפקח על ההליכים ולהבטיח שעקיבות יעילה במהלך הזמן שאני מבצע את התנועות של ביופסיה מצלחת הביופסיה (איור משלים 1) לצלחת הפוסט-ביופסיה (איור משלים 1) ), ואז לצלחת הויטריפיקציה (איור משלים 1) ולבסוף לתמיכה הויטריפיקציה (איור משלים 1); ii) העברת תאי הביופסיה מצלחת הביופסה לצינור ה-PCR (איור משלים 1); iii) ההתחממות וצעדי המעבר שלאחר האבחון. לקבלת תיאור מפורט של כל שלבי העדים מתייחסים למצבי כשל וניתוח אפקטים (FMEA) שפורסמו בעבר14.
כל השיטות המתוארות במאמר זה מכבדות את הרגולציה המקומית (החוק האיטלקי 40/2004). על פי החוק, למעשה, הזוג יכול לבקש להיות מעודכן על מעמד הבריאות של העוברים הם הפיק במהלך מחזור IVF. בהקשר זה, הסכמה מפורטת מושכלת של PGT חייב להיות חתום משני השותפים.
במאמר זה תיארנו כיצד ליישם ביופסיה בלסטוציסט עבור pgt בשגרת מעבדה עסוק. היישום של גישה ביופסיה בלסטוציסט כבר התקדמות חשובה בעשור האחרון IVF. דווח לראשונה על ידי דה הבורים ועמיתיו ב 200417, זה כבר מזוהה במהרה הליך יעיל יותר אינפורמטיבי לעומת בשלב המחשוף וביופסיה הגוף הקוטבי גישות3. הערך של הליך זה שוכן בעיקר בהפחתת הנטל הטכני, אך גם בשכיחות נמוכה יותר של פסיפס כרומוזום בשלב זה של פיתוח18,19. יתר על כן, הסרת תאים TE מעטים מתוך בלסטוציסטה הוצע כהליך בטוח יותר מאשר הסרת בלסטורה אחד מתוך העובר בשלב המחשוף. אכן, במחקר אקראי שאינו מבחר הגישה הקודמת לא התוצאה השפעה על פוטנציאל השרשה העובר, בעוד האחרון היה משמעותי ~ 20% הפחתה20.
הפרוטוקול המשמש בעיקר ברחבי העולם כרוך בפתיחת סונה בסיוע לייזר ביום השלישי שלאחר ההפריה. משפט לא מבוקר אקראי נערך עד כה כדי להשוות את שונה ביופסיה ביוסטוציסטה גישות. עם זאת, סביר כי הנמוך מספר מניפולציות וחשיפות של העוברים הגוברת לתנאים סביבתיים מיטביים, הנמוך ביותר את ההליך הפוטנציאלי של הפרוטוקול. יתר על כן, הנוכחות של חור של הסונה pellucida מיום 3 של הפיתוח עשוי להשפיע על הרחבת בלסטוציסטה ולגרום לפריצת תאים ICM יחד עם תאים TE. מסיבות אלה, אנו להגדיר וליישם את הפרוטוקול המתואר כאן הכרוך את הפריצה באמצעות לייזר בסיוע הסונה ו-TE תאים לאחזור ברגע שהציסטה הבלסטופה מגיעה להתרחבות מלאה. כמו כן קיים פרוטוקול שונה הכרוך ביום 5 או 6 בקיעהבתוך 5,7. באופן ספציפי, הקידוח של הסונה מבוצע ביום 5 או 6 של פיתוח טרום ההשתלה בצד הנגדי ביחס ל-ICM; בלסטוציסטה היא לאחר מכן חזרה לחממה מחכה הפריצת הספונטנית של תאים TE. ברור, ניטור תקופתי של בלסטוציסטה חייב להינתן בשעות הבאות, כדי לבצע ביופסיה ברגע TE יתחיל בקע, כמו גם כדי למנוע את העובר מתוך הבקיעה לחלוטין. אם מצד אחד מתרגלים מיומנים יכולים בקלות ליישם את אסטרטגיית הביופסיה החלופית, מצד שני הוא אינו מתאים למעבדה עמוסה ביצוע כמה הליכים ביום. פתיחת הסונה הסדרתית ופרוטוקול הביופסיה ביופסיה המתואר כאן הוא במקום פחות זמן לגזול ומאפשר לזמן קצר יותר על הידיים וגמישות גבוהה יותר לתזמן את הפעילות היומית במעבדה כדי לתאם את מסגרות הזמן המוקדש ל ביופסיה ולהליכים ויטריפיקציה.
באיכות ירודה בלסטוציסטות עשוי להיות מורכב יותר ביופסיה מאז תאים TE יכול להיות דביק, אבל יריות לייזר יותר מתואם עם מתיחה של הרסיס כדי לחשוף את הצמתים בין התאים מספיקים כדי להסיר אותו מהגוף של blastocysts. באופן מלא מקווקו בלסטיציסטה יכול להיות ביופסיה כמו בלסטוציסט המוקף הסונה pellucida, אבל הם עשויים להיות מסובך כדי vitrify וחמים. במקרה של אבחנות לא משמעיות לאחר ביופסיה, הנתונים שדווחו עד היום הם concordant כי לא נראה נזק שנובע מביופסיה מחדש ומחזור ויטריפיקציה התחממות הבאים16,21.
ויטריפיקציה משמש כיום במרכז לבצע הקפאה קריוגנית הקפאה מאז הוא דיווח בעקביות בטוח, יעיל יותר ופחות זמן רב יותר מאשר פרוטוקול הקפאה איטית מבדיקה מטא ניתוח של הספרות העדכנית ביותר . בסדר, עשר
לאחר ההליך היה מבוסס היטב מפעילי התאמן כראוי, ביצעת ניתוח רטרוספקטיבי כדי להגדיר את התזמונים הפרוצדורליים אידיאלי הן ביופסיה לבלסטוציסטה והן הליכים ויטריפיקציה (מסוכם כאן בתוצאות הנציג). כמו התוצאות הסופיות, הערכנו את שיעור ההרחבה מחדש של הערכה בלואיד של אאופלויד הוערך ב 1.5 h לאחר ההתחממות ואת שיעור הלידה לחיות שהושגו לאחר העברה לאחר העברת העובר היחיד התחמם. לא מקרה של ניוון בלסטוציסט נצפתה לאחר ביופסיה, ורק 0.2% (N = 1/572) של שיעור ניוון דווח לאחר התחממות, המאשרת את האמינות של ביופסיה וגישות ויטריפיקציה אימצה. על פי הניתוח, את העיתוי הנדרש לבצע ביופסיה בלסטוציסט אינו משפיע על הכדאיות של אאופלויד בלסטוציסט לאחר שההתחממות הוגדרה כקצב התרחבות מחדש, או פוטנציאל הרבייה המוגדר כשיעור לידה חי. למרות תזמונים שונים ניתן לראות על פני מפעילי עם מומחיות שונה, אנו עשויים לשקול בלסטוציסט ביופסיה בטוח כאשר ההליך הושלם כ 8 דקות, בטווח של 3 עד 22 דקות בהתאם למספר העוברים לשגרה (עם זאת, אין נתונים זמין להליכי ביופסיה המבוצעים במרווחי זמן ארוכים יותר). הזמן הממוצע בילה עבור ביופסיה בלסטוציסט מכל מפעיל אחד צריך להיות מדי פעם (לפחות כל שלושה חודשים) מנוטרים כמו KPI. לצד, שיעור של אבחנה לא חד-משמעית ואת שיעור הלידה חי לאחר העברה התחמם-העברת בלטוואיד התחממות בליילויד צריך גם להיות ממוען. לבסוף, אנו מתווה את העיתוי האידיאלי בין ביופסיה לויטריפיקציה. מאחר שצפינו בקצב ההתרחבות הגבוה ביותר לאחר ההתחממות כאשר הציסטות הללו היו מיובחנות בתוך 30 דקות מהביופסיה, אנו מציעים ערך זה כהסף האידיאלי. באופן ספציפי, ככל שהזמן שבין ביופסיה לויטריפיקציה, ככל שהביוטויום ביופסיה מחדש יהיה להתרחב שוב לפני הקפאת שמורות. זה עלול להזיק להישרדות ההקפאה, במיוחד כאשר התמודדות עם באיכות ירודה ו/או יום 7 blastocysts11. עם זאת, אין השפעה משמעותית על התוצאות הקליניות נצפתה גם אם ויטריפיקציה התעכב מעבר 90 דקות. לכן, בהזדמנויות שונות, ייתכן שתזמונים כאלה יורשו.
השיטה שנבחרה לאחזר דגימה עבור PGT לא צריך להשפיע על הכדאיות העובר, צריך לכלול תוצאות אמין אינפורמטיבי, צריך להיות יעיל קלינית צריך להיות קל ליישם ובכך לצמצם את העלויות ואת עומס העבודה במעבדה. ביופסיה בלייסטוציסטה ממלאת את כל הדרישות המוקדמות. עם זאת, זה עדיין הליך פולשני כי יש לבצע על ידי מפעילים מיומנים במעבדה מצויד היטב. כיום, האוונגרד של הגישה הבלתי פולשנית PGT (niPGT) נמצא תחת חקירה. אולי, בעתיד, התקשורת המושקע בתרבות לאחר הפריה חוץ גופית עשויה להיות מנותח כדי לבצע בדיקות כרומוזומלית ו/או גנטית. זוהי פרספקטיבה מרתקת בעתיד מאז העלויות עבור המרפאה IVF יהיה נמוך כל עומס העבודה כרוך על ידי העובר ביופסיה יהיה צדדי. עם זאת, את האמינות ואת היכולת המסיסות של ניתוח מדיה בילה לבדיקות גנטיות עדיין להעריך22,23,24, ולכן מאמצים נוספים יש להשקיע כדי להגדיר ולאמת פרוטוקול שיכול ל חליפה כל מרפאות IVF ביצוע PGT ברחבי העולם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
AG ו-RM אספו את הנתונים וניסחו את כתב היד. DC ניתח את הנתונים, ניסח את תוצאות הנציגים, ביצע את הסטטיסטיקות ושינו את כתב היד. FMU ו-LR סיפקו דיון קריטי בתוצאות ובכל כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B. Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. Jansen, R., Mortimer, D. , Parthenon Press. 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
