Summary
Blastozystenbiopsie und Vitrifikation sind erforderlich, um Präimplantations-Gentests effizient durchzuführen. Ein Ansatz, der die sequenzielle Öffnung der Zona pellucida und die Rückgewinnung von 7-8 Trophektodermzellen in Tag 5-7 nach der Besamung einschließt, begrenzt sowohl die Anzahl der erforderlichen Manipulationen als auch die Exposition des Embryos gegenüber suboptimalen Umweltbedingungen.
Abstract
Blastozysten-Biopsie wird durchgeführt, um eine zuverlässige genetische Diagnose während IVF-Zyklen mit Präimplantations-Gentests zu erhalten. Dann beinhaltet der ideale Arbeitsablauf ein sicheres und effizientes Verglasungsprotokoll, aufgrund der Durchlaufzeit der Diagnostischen Techniken und die Übertragung der ausgewählten Embryonen auf ein physiologisches Endometrium in einem folgenden natürlichen Zyklus. Ein Biopsieansatz, der die sequenzielle Öffnung der Zona pellucida und die Rückgewinnung von 5-10 Trophektodermzellen (idealerweise 7-8) umfasst, begrenzt sowohl die Anzahl der erforderlichen Manipulationen als auch die Exposition des Embryos gegenüber suboptimalen Umgebungsbedingungen. Nach der richtigen Schulung war die Technik bei verschiedenen Bedienern reproduzierbar in Bezug auf den Zeitpunkt der Biopsie (8 min, 3-22 min basierend auf der Anzahl der Embryonen bis zur Biopsie pro Schale), schlüssige Diagnosen erhalten (97,5%) und Lebendgeburten nach verglast-gewärmerwärmener euploiden Blastozystenübertragung (>40%). Die Überlebensrate nach Biopsie, Verglasung und Erwärmung lag bei 99,8%. Die Re-Expansionsrate bei 1,5 h aus der Erwärmung betrug bis zu 97%, weitgehend abhängig vom Zeitpunkt zwischen Biopsie und Vitrifikation (idealerweise 30 min), blastozystmorphologischeR Qualität und Tag der Biopsie. Im Allgemeinen ist es besser, eine zusammengebrochene Blastozyste zu vitrify; Daher kann in Nicht-PGT-Zyklen laserunterstützte künstliche Schrumpfung durchgeführt werden, um den Embryokollaps vor der Kryokonservierung zu induzieren. Die vielversprechendste Zukunftsperspektive ist die nicht-invasive Analyse der IVF-Kulturmedien nach Blastozystenkultur als vermeintliche Quelle embryonaler DNA. Diese potenzielle Avantgarde wird jedoch noch untersucht, und ein zuverlässiges Protokoll muss noch definiert und validiert werden.
Introduction
Das Hauptziel der modernen menschlichen Embryologie ist es, die Anzahl der Lebendgeburten pro stimulierten Zyklus zu maximieren und Kosten, Zeit und Anstrengungen zu reduzieren, um eine Schwangerschaft zu erreichen. Um dieses Ziel zu erreichen, sollten validierte Ansätze für die Embryonenauswahl verwendet werden, um reproduktiv kompetente Embryonen innerhalb einer Kohorte zu identifizieren, die während eines IVF-Zyklus erhalten wurde. Nach den neuesten Erkenntnissen ist Blastozystenkultur1 in Kombination mit umfassenden Chromosomentests und verglast-gewärmtem euploiden Embryotransfer (ET) der effizienteste Rahmen zur Steigerung der IVF-Effizienz2. Natürlich erfordert ein Aneuploidie-Test eine embryonale Probe, die derzeit meist aus wenigen Zellen aus dem Trophektoderm (TE) dargestellt wird, d. h. dem Abschnitt der Blastozyste, der während der Schwangerschaft den Ursprung von Embryoanhängen (z. B. der Plazenta) gibt. . Neben der Karyotyp-Analyse könnten auch einzelne Genmutationen aus einer TE-Biopsie als Teil einer klinischen Strategie bewertet werden, die als Präimplantationsgenztest bekannt ist (PGT; -A für Aneuploidies, -SR für strukturelle chromosomale Umlagerungen, -M für monogene Krankheiten). Andere Eizellen-/Embryo-Biopsiemethoden wurden in den letzten Jahrzehnten klinisch theoretisiert und übernommen, nämlich Polarkörperbiopsie und Blastomerbiopsie. Ihre Verwendung ist heutzutage jedoch geringer, da ihre verfahrenstechnischen Nachteile (z. B. höhere Arbeitsbelastung und Risiko für reproduktive Auswirkungen) und diagnostische Einschränkungen (z. B. Einzelzellanalyseprobleme) implizit ein ausreichendes Gleichgewicht zwischen Kosten, Risiken und Vorteile (für eine Überprüfung siehe3).
In diesem Beitrag wird eines der wichtigsten Protokolle für die TE-Biopsie zusammen mit den nachfolgenden Verglasungs-, Erwärmungs- und Transferverfahren ausführlich beschrieben. Der hier beschriebene Workflow ist ideal für eine ausgelastete PGT-Einheit.
Wie bereits von unserer Gruppe4,5beschrieben, beinhaltet das Verfahren die sequenzielle Öffnung der Zona pellucida von voll expandierten Blastozysten und die Entfernung von wenigen TE-Zellen (im Durchschnitt 7-8). Im Vergleich zum Tag 3 laserunterstützte Brut-basierte Blastozysten-Biopsie-Methode6, könnte dieses Verfahren den täglichen Zeitplan einer IVF-Einheit erleichtern, wo empfindliche Verfahren, wie Blastozystenbiopsie und Vitrifikation, rechtzeitig durchgeführt werden müssen. Sobald die Blastozyste ihre volle Ausdehnung erreicht, kann die Biopsie durchgeführt werden, indem die zu entfernenden TE-Zellen ausgewählt werden, wodurch das Risiko eines Abreihens der inneren Zellmasse (ICM) verhindert wird, was das Verfahren sonst schwierig machen würde. In der Literatur wurde auch ein drittes Protokoll der Blastozystenbiopsie beschrieben, das lasergestütztes Schlüpfen beinhaltet, sobald der Embryo das Blastozystenstadium bereits erreicht hat, wenige Stunden vor dem Eingriff5,7. Dieser Ansatz ist jedoch zeitaufwändiger und eignet sich vor allem für IVF-Einheiten, die die TE-Biopsie in den Händen von begrenzt erfahrenen Bedienern und angesichts einer mäßig niedrigen täglichen Arbeitsbelastung implementieren.
Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)8 sollte eine konsolidierte Technik sein, wenn genetische Analysen in IVF durchgeführt werden sollen. Ebenso ist ein geeignetes Kultursystem zur sicheren Ernte von Embryonen in das Blastozystenstadium von entscheidender Bedeutung für die Umsetzung der TE-Biopsiestrategie. Eine ausreichende Anzahl von Inkubatoren sowie die Verwendung von geringer Sauerstoffspannung sind wichtige Voraussetzungen dafür, um die Blastozystenrate9nicht zu gefährden. Gleichzeitig wird ein effizientes Kryokonservierungsprogramm benötigt, um einen PGT-Zyklus sicher zu verwalten. In den letzten zehn Jahren hat die Umsetzung der Vitrifizierung die Kryoüberlebensraten in Embryonen sogar auf >99%10,11erhöht. Dies bot genügend Zeit, um genetische Tests durchzuführen und den Embryotransfer auf den folgenden Menstruationszyklus auf ein nicht stimuliertes und wahrscheinlich empfänglicheres Endometrium zu verschieben12.
Sowohl die TE-Biopsie als auch die Verglasung sind anspruchsvolle Aufgaben, die strenge Fähigkeiten erfordern, und ihre Wirksamkeit kann von unerfahrenen Bedienern unterschiedlich sein. Daher wird eine spezifische Ausbildungszeit empfohlen, bevor es jedem Bediener gestattet wird, diese Verfahren klinisch durchzuführen; Darüber hinaus sollte die Aufrechterhaltung der Fähigkeiten der Betreiber regelmäßig durch die Überwachung der Leistungskennzahlen (KPI) für Kryokonservierungs- und Biopsieverfahren bewertet werden. Jede IVF-Klinik sollte zu diesem Zweck interne KPIs festlegen, die sich den von internationalen Konsortien veröffentlichten KPIs und/oder den von Referenzlaboratorien veröffentlichten Ergebnissen annähern müssen.
TE-Biopsie-, Verglasungs-Erwärmungs- und Zeugenverfahren sind validierte Techniken in unserer Einheit, die auf alle beteiligten Akteure standardisiert wurden, wie in drei früheren Veröffentlichungen berichtet11,13,14 .
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Protocol
Das Protokoll für die biozystische Biopsie des Menschen, hier beschrieben, folgt den Richtlinien des G.EN.E.R.A. Human Research Ethic Committee.
HINWEIS: Siehe Materialtabelle für benötigte Materialien. Weiteres Material erforderlich sind Laborschuhe und -outfit, chirurgische Gesichtsmaske, Haarschutz, chirurgische Handschuhe, ein permanenter ungiftiger Marker, Zangen und Desinfektionsmittel. Die Verwendung von chirurgischen Kleid, Einweg-CHIRURGIE-Handschuhe, Gesichtsmaske, Haarschutz ist obligatorisch, um das Risiko einer Kontamination zu verhindern. Alle Arbeitsbereiche sowie die am Prozess beteiligten Geräte müssen vor Beginn eines Verfahrens gründlich mit Labordesinfektionsmittel (z. B. Oosafe) gereinigt werden. Alle verwendeten Verbrauchsmaterialien und Medien sollten steril und einzeln verpackt oder aliquoted sein. Es wird vorgeschlagen, einen speziellen Arbeitsplatz für Biopsie und Schläuche zu verwenden und den Zugang des Bereichs nur auf die am Verfahren beteiligten Akteure (Embryologen und Zeugen) zu beschränken.
1. Vorbereitung am Tag vor dem Biopsieverfahren
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Bereiten Sie das Postbiopsie-Kulturgericht vor.
- Legen Sie 6 Tropfen von 20 L IVF Kulturmedium (Tabelle der Materialien) in eine IVF-Kulturschale und Overlay mit 6 ml vorgewärmten Mineralöl für embryokultur ( Tabelle derMaterialien).
- Fügen Sie jedem Tropfen weitere 10 L IVF-Kulturmedium hinzu. Über Nacht bei 37 °C in kontrollierterAtmosphäre inkubieren (5% O2 , 6% CO2 ).
-
Bereiten Sie eine IVF-Platte 4-Well-Platte zum Spülen der Blastozyste nach der Biopsie vor.
- Legen Sie 600 l IVF-Kulturmedium in die ersten beiden Brunnen und überlagern Sie mit 300 l vorgewärmten Mineralölfür die Embryokultur.
- Über Nacht bei 37 °C in kontrollierterAtmosphäre inkubieren (5% O2 , 6% CO2 ).
- Geben Sie in jedem PCR-Rohr 1,5 l der Ladelösung (Materialtabelle) für TE-Zellenrohre auf, drehen Sie es und halten Sie es bei 4 °C.
2. Vorbereitung am Tag des Biopsieverfahrens
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Bereiten Sie das Biopsiegericht vor.
- Legen Sie 3 Tropfen von 10 L HEPES-gepufferten Medium (ergänzt mit humans Serumalbumin) (Tabelle der Materialien) in einer Reihe in einem IVF-Kulturgericht.
- Wiederholen Sie Schritt 1.1.1 entsprechend der Anzahl der blastozysten verfügbaren Blastozysten (bis zu 4 Blastozysten pro Schale) und Überlagerung mit 6 ml vorgewärmten Mineralöl für die Embryokultur.
- Inkubieren Sie die Schale bei 37 °C für mindestens 1 h vor der Durchführung der Biopsie.
3. Blastozystenauswahl und -benotung
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Gradieren Sie die Blastozyste nach ihrer Ausdehnung und dem morphologischen Erscheinungsbild von ICM und TE (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Einstufungskriterien wurden von Gardner und Schoolcraft15 angepasst und zuvor von Capalbo et al. und Cimadomo et al.4,11beschrieben.- Definieren Sie die Größe und die Expansionsgrad als: A für eine voll geschlüpfte Blastozyste, B für eine schraffierte Blastozyste, C für eine vollständig erweiterte Blastozyste und D für eine nicht expandierte Blastozyste (diese Embryonen werden nur dann biopsiet, wenn sie sich bis Zum Tag 7 nicht weiter ausdehnen).
- Definieren Sie ICM-Grade: 1 für auffällige ICM mit mehreren streng verpackten Zellen; 2 für erkennbar mit mehreren, aber grob verpackten Zellen; 3 für schwer zu unterscheiden mit sehr wenigen minderwertigen Zellen.
- Definieren Sie die TE-Klasse wie folgt: 1 für gut organisiertes Epithel mit mehreren Zellen; 2 für loses Epithel mit wenigen Zellen; 3 für wenige und/oder große Zellen niedriger Qualität.
4. Trophectoderm Biopsie
- Führen Sie te Biopsie auf allen lebensfähigen voll expandierten Blastozysten (vorzugsweise C-Grad für Größe und Expansion) durch.
- Stellen Sie Halte- und Biopsiepipetten für jeden Biopsievorgang ein. Die Empfehlungen für die Biopsiepipette lauten wie folgt: 30 m Innendurchmesser, 35° Biegewinkel, 0,75 mm Abstandsspitze zum Biegen.
- Etikettieren Sie die Biopsieschale mit den Daten des Patienten (Name und Nachname der Frau, Geburtsdatum und ID) und nummerieren Sie dann jeden Tropfen mit Embryo- und Zyklus-IDs. Verwenden Sie einen dauerhaften ungiftigen Marker.
- Übertragen Sie die Blastozyste mit einer 300 m abisolierenden Pipette auf den ersten Tropfen der Biopsieschale und spülen Sie sie ab, um den Überschuss des Kulturmediums zu entfernen. Dann bewegen Sie die Blastozyste in den zweiten Tropfen der Biopsieschale.
- Bewegen Sie die Schale auf das invertierte Mikroskop und grundieren Sie die Biopsiepipette, die ein Medium aus dem dritten Tropfen der Biopsieschale ansaugt.
- Bei 20-facher Vergrößerung die Blastozyste so ausrichten, dass sie einen klaren Blick auf das ICM hat. Wenn es bei 7 Uhr visualisiert wird (gegenüber dem Bereich, der gezielt die TE-Zellen entfernen soll), sichern Sie den Embryo auf der haltepipette (Abbildung 2a).
- Konzentrieren Sie sich auf die Zona pellucida und stellen Sie fest, dass sich sowohl die Pipetten als auch die Blastozyste auf derselben Brennebene befinden.
- Wechseln Sie zum Laserobjektiv (Pulszeit 0,3 ms, 6,5 m) und positionieren Sie den Laserpointer auf der Zona pellucida auf der gegenüberliegenden Seite des ICM. Bohren Sie die Zona pellucida durch 2-3 Laserpulse (Abbildung 2b).
- Drücken Sie vorsichtig die Biopsiepipette gegen die Zona pellucida und blasen Sie ein Medium durch die Bresche, um die TE-Zellen von ihrer inneren Oberfläche zu lösen und den Zusammenbruch der Blastozysten zu beschleunigen (Abbildung 2c).
- Sobald das TE abgetrennt ist (Abbildung 2d), betreten Sie durch das Loch (falls erforderlich, machen Sie es mit einem letzten Laserpuls breiter) und aspirieren Sie einige TE-Zellen (idealerweise 7-813,16) in die Biopsiepipette mit sanfter Absaugung (Abbildung2e).
- Bewegen Sie die Biopsiepipette leicht nach hinten, während Sie eine moderate Absaugung anwenden, um die Zielzellen zu dehnen (Abbildung 2f).
- Richten Sie den Laser auf den dünnsten Teil der angesaugten Zellen und feuern Sie 2-5 Laserpulse an den Knoten zwischen den Zellen ab, um die Zielzellen vom Körper des Embryos zu trennen (Abbildung 2g). Das Timing von Laserpulsen und die Anzahl der Impulse können entsprechend der Qualität der Blastozyste eingestellt werden; Versuchen Sie jedoch, sie zu minimieren, um eine Zelllyse zu vermeiden.
- Nach der Trennung des TE-Fragments von der Blastozyste (Abbildung 2h) geben Sie es in den gleichen Biopsietropfen weit weg von der Blastozyste frei. Dies ist notwendig, um zu verhindern, dass sie wieder in die Biopsiepipette gesaugt werden (Abbildung 2i).
- Lösen Sie die Blastozyste aus der Haltepipette und heben Sie beide Pipetten sofort an, um zu verhindern, dass das Fragment an ihnen klebt.
- Nehmen Sie ein Bild des biopsied Fragment für Die Qualitätskontrolle Zweck (Abbildung 3).
HINWEIS: Wenn mehr als eine einzige Blastozyste pro Verfahren biopsied (bis zu vier pro Biopsieschale) biopsien soll, ändern Sie die Biopsiepipette mit einer neuen, um kreuzkontaminationen zwischen Embryonen zu verhindern. - Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.13.
- Bewegen Sie die Biopsieschale zurück auf die laminare Fließhaube.
- Beschriften Sie das Kulturgericht nach der Biopsie mit der Paar-ID und jeden Tropfen mit dem Embryo und der Zyklus-ID.
- In Anwesenheit eines Zeugen, spülen Sie die Blastozyste in sauberen IVF-Medium, und schließlich bewegen Sie es auf den entsprechenden Tropfen der Post-Biopsie-Schale.
- Die Nachbiopsieschale in kontrollierter Atmosphäre (37 °C, 6%CO2 , 5% O2 ) bis zur Vitrifizierung in den Inkubator bringen. Es ist ratsam, die Vitrifizierung innerhalb von 30 min nach dem Biopsieverfahren durchzuführen, um eine erneute Ausbreitung der Blastozysten zu verhindern.
5. Schläuche
HINWEIS: Das gesamte Verfahren muss in Anwesenheit eines Zeugen und in der laminaren Strömungshaube bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Während des Verfahrens die PCR-Rohre in einem Kaltrohrträger auf Eis halten(Zusatzabbildung 1).
- Beschriften Sie die PCR-Rohre mit einem dauerhaften ungiftigen Marker.
HINWEIS: Die Etikettierung sollte nach Bedarf des genetischen Labors erfolgen. Im Allgemeinen sind der Vor- und Nachname des Patienten (Initialen), die Paar-ID, der Embryo und die Zyklus-ID (z. B. JD 12345 1.2 für den Embryo N.1 des 2. Zyklus, der Jane Doe gehört, deren Paar-ID 12345) ist. Embryo-ID sollte auch in Buchstaben auf dem Körper des Rohres gemeldet werden. - Beschriften Sie den Deckel einer 60 mm x 15 mm Kulturschale (Schlauchschale) mit den IDs der biopsied embryonierten Embryonen (Zusatzabbildung 1) und bereiten Sie darin zwei 10 L Tropfen Biopsiewaschlösung (TabellederMaterialien) vor.
- Die 140 m Abisolierpipette (Zusatzabbildung 1) mit einer Biopsie-Waschlösung aus dem zweiten Tropfen der Schlauchschale grundieren.
- Legen Sie die Biopsieschale unter das Stereomikroskop, um die TE-Fragmente einfach zu visualisieren.
- Lösen Sie vorsichtig eine Biopsie-Waschlösung auf dem TE-Fragment; dann in die Abisolierpipette laden.
- Bewegen Sie das TE-Fragment auf den zweiten Tropfen Biopsie-Waschlösung in der Schlauchschale und spülen Sie es sorgfältig 2-3 Mal ab.
- Übertragen Sie das TE-Fragment mit Ladelösung auf den Boden des PCR-Rohrs (zuvor danach beschriftet), wobei Sie darauf achten, dass die Wände nicht mit der Spitze der Abisolierleitung berührt werden.
- Wiederholen Sie den Vorgang von Schritt 5.3 bis Schritt 5.7 für jedes TE-Fragment, wobei Sie darauf achten, für jedes TE-Fragment eine neue Kapillare zu verwenden.
- Am Ende des Schlauchvorgangs alle PCR-Röhren in eine Minizentrifuge geben und für einige Sekunden drehen.
- Bewahren Sie die Proben bei -20 °C auf, bis sie zur Prüfung an das verweisende genetische Labor versandt werden.
6. Blastozysten-Vitrifikation
- Vitrify kollabierte Blastozysten innerhalb von 30 min von te Biopsie, um ihre erneute Expansion zu verhindern.
- Beschriften Sie die Verglasungsplatte mit den Details der Frau und den Ausleinen der Blastozysten, die verglast werden müssen.
- Kennzeichnen Sie die Verglasungsunterstützung(en) mit dem Vor- und Nachnamen der Frau, der Paar-ID, der ID des embryonalen Embryos, der auf sie geladen wird, sowie dem Datum des Verfahrens. Es werden spezielle Kryoetiketten verwendet, die ihre Integrität auch bei sehr niedrigen Temperaturen (-196 °C) bewahren.
- Bei Raumtemperatur 0,3 ml Ausgleichslösung (ES)(Materialtabelle) für jede Blastozyste, die verglast wird, dosieren.
- Bewegen Sie in Anwesenheit eines Zeugen die Blastozyste in ES mit der 300 m Abisolierpipette.
- Lassen Sie die Blastozyste in der ES für 13-15 min. Nach einer anfänglichen Schrumpfung des Volumens wird eine allmähliche Reexpansion beobachtet.
- Füllen Sie ein kleines Kühlregal mit flüssigem Stickstoff (LN2) und legen Sie es unter die laminare Durchflusshaube.
- Geben Sie 300 l Verglasungslösung (VS) (Materialtabelle) im zweiten Brunnen. Nach der Blastozyste vollständige Re-Expansion, übertragen Sie es in der VS-Lösung für 1 min und spülen Sie es, um die ES zu verdünnen.
- Laden Sie in Anwesenheit eines Zeugen die Blastozyste auf die Verglasungsstütze und kümmern Sie sich um die Entfernung des Vs-Überschusses. Ein subtiler Lösungsfilm sollte die Blastozyste umgeben.
- Tauchen Sie die Verglasungsunterstützung in LN2 ein und bewegen Sie sie energetisch, um das Risiko einer Blasenbildung in der Nähe der Probe zu reduzieren.
- Legen Sie die Schutzkappe, während Sie die Verglasungsunterstützung in der LN2 unter Wasser halten.
- In Anwesenheit eines Zeugen, bewegen Sie die Verglasung Unterstützung in einem langfristigen LN2 Lagertank.
7. Künstliche Schrumpfung von nicht biopsied Blastozysten
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Wenn keine TE-Biopsie durchgeführt wird, kollabieren die Blastozysten unmittelbar vor der Vitrifizierung künstlich (Abbildung 4).
- Bewegen Sie die Kulturschale vom Inkubator zum invertierten Mikroskop und konzentrieren Sie sich auf den ausgewählten Embryo.
- Wechseln Sie zum Laserobjektiv (voreingestellter Puls: 0,3 ms, 6,5 m), zielen Sie auf die Zona pellucida auf der gegenüberliegenden Seite des ICM und leiten Sie dann 1–2 Laserpulse in einem sicheren Abstand vom ICM zu den Knotenpunkten zwischen TE-Zellen. Die Blastozysten sollten in weniger als 5 min zusammenbrechen.
- Fahren Sie mit der Verglasung der zusammengebrochenen Blastozyste fort, wie in Abschnitt 6 beschrieben.
8. Übertragbare BlastozystenErwärmung
- Bereiten Sie am Tag der ET die ET 4-Well-Platte vor, indem Sie für jeden Brunnen 600 L vorausgeglichenes IVF-Kulturmedium platzieren. Inkubieren Sie bei 37 °C ineiner kontrollierten Atmosphäre (5% O2 , 6% CO2 ), während Blastozystenerwärmung durchgeführt wird.
- Etikettieren Sie die wärmende Schale mit dem Namen und Nachnamen der Frau, der Paar-ID, der ID des Embryos, der darin erwärmt wird.
- 1 ml der Auftaulösung (TS) (Materialtabelle) in eine IVF-Einbrunnenschale geben (Zusatzabbildung 1) und in einem Thermostat mindestens 1 h auf 37 °C erwärmen, bevor Sie mit dem Verfahren beginnen.
- Füllen Sie eine kleine Kühlstütze mit LN2 und legen Sie sie in die laminare Durchflusshaube in unmittelbarer Nähe des Arbeitsbereichs.
- Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, überprüfen Sie die Blastozysteninformationen, die über die Verglasungsunterstützung berichtet werden. Alle IDs sollten dem genetischen Bericht entsprechen und die Blastozyste zu warm muss unter den übertragbaren gewählt werden. Während des Verfahrens wird ein Zeuge geladen.
- Nehmen Sie die einwellige Schale mit erwärmtem TS aus dem Thermostat und legen Sie sie auf eine beheizte Bühne unter dem Stereomikroskop.
- Ziehen Sie die Schutzkappe innerhalb der LN2 mit Zangen.
- Die Spitze der Verglasungsstütze schnell in das 37 °C TS eintauchen.
- Unter mikroskopischer Beobachtung bewegen Sie die Verglasungsstütze vorsichtig, bis die Blastozyste von der Spitze gelöst wird.
- Lassen Sie die Blastozyste für insgesamt 1 min in der TS, achten Sie darauf, es am unteren Rand des TS zu halten.
- Bei Raumtemperatur 200 l Verdünnungslösung (DS)(Materialtabelle) auf den ersten Brunnen der Verglasungsplatte geben.
- Übertragen Sie die Blastozyste auf DS und platzieren Sie sie an der Unterseite des Brunnens, während Sie einige TS oben loslassen, um eine Art Gradient zu erstellen. Lassen Sie es für 3 min.
- Geben Sie 200 L Waschlösung (WS) in 2 verschiedenen Brunnen (WS1 und WS2).
- Übertragen Sie die Blastozyste auf WS1 und legen Sie sie auf die Unterseite des Brunnens, während Sie ein DS-Medium auf der Oberseite davon loslassen. Dann übertragen Sie die Blastozyste auf WS2 und lassen Sie sie ungestört für 1 min.
- Beschriften Sie die ET-Platte nach der Erwärmung mit dem Vor- und Nachnamen der Frau, der Paar-ID, der ID des Embryos, der darin kultiviert wird.
- Übertragen Sie in Anwesenheit eines Zeugen die erwärmte Blastozyste in das vorausgeglichene Kulturmedium in der post-warmen ET-Platte.
- Spülen Sie die Blastozyste im ersten Brunnen der ET-Platte und legen Sie sie in den zweiten Brunnen.
- Übertragen Sie das Kulturgericht nach der Erwärmung in kontrollierter Atmosphäre (37°C, 6% CO2 , 5% O2) auf den Brutkasten und bekulturen Sie die Blastozyste mindestens 1,5 h, bevor sie ihr Überleben und ihre Erneute Expansion überprüft.
HINWEIS: Abbildung 5 zeigt Beispiele für degenerierte, kryo-überlebte, aber nicht wieder erweiterte und kryo-survived und vollständig erweiterte Blastozysten.
9. EmbryoTransfer
- Um ET durchzuführen, legen Sie die Schale auf die beheizte Stufe der laminaren Strömungshaube, so dass der Embryo unter dem Mikroskop bei geringer Vergrößerung sichtbar ist.
- Nehmen Sie ca. 0,4 ml IVF-Kulturmedium. Befestle die Spritzenspitze fest in das Empfangsende des Innenkatheters und lassen Sie dann das Medium bis zu 0,1 ml los.
- Das Kulturmedium der Spiratkultur bis zur Beobachtung der Embryonen, die in den Katheter gelangen (minimale Medienmenge: 10 bis 15 L).
- Legen Sie den Katheter in das Kunststoffgehäuse und gehen Sie in den Operationssaal und legen Sie den internen Katheter in die externe Führung.
- Sobald Sie die Gebärmutter erreicht haben, drücken Sie den Spritzenkolben, um den/die Embryo(n) freizugeben. Lassen Sie das Medium sehr langsam los, bis der Kolben 0,1 ml liest.
- Nehmen Sie den Katheter zurück ins Labor und überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob der Embryo übertragen wurde.
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Representative Results
Abbildung 6 stellt ein Schema aller Ergebnisse eines Biopsieverfahrens dar, das zur Standardisierung des Protokolls und zur Überwachung der Leistung jedes Betreibers angenommen werden kann. Das wichtigste Verfahrensergebnis ist der Zeitpunkt für die Fertigstellung der Biopsien/Biopsien; das wichtigste technische Ergebnis ist die Qualität der nach genetischen Tests erzeugten Handlung, die entweder zu einer schlüssigen oder nicht schlüssigen Diagnose führen könnte, von denen letztere eine Rebiopsie der nicht diagnostizierten Blastozyste erfordert; das wichtigste biologische Ergebnis ist die Rate des Kryo-Überlebens und der Erneutexpansion versus Degeneration nach der Erwärmung; Schließlich ist das wichtigste klinische Ergebnis die Lebendgeburtsrate nach verglast-gewärmtem Blastozystentransfer. In drei früheren Studien berichteten wir die KPIs, die in den Zentren für die technischen, biologischen und klinischen Ergebnisse definiert wurden11,13,16. Im Folgenden berichten wir stattdessen, wie der KPI für den Zeitpunkt der Biopsie definiert wurde. Darüber hinaus wurde auch der vermeintliche Einfluss des Timings zwischen Biopsie und Vitrifizierung auf das Verhalten der euploiden Blastozysten untersucht.
In einem Zeitraum von 2 Jahren wurden insgesamt 1.544 Trophectoderm-Biopsieverfahren von 7 Operatoren durchgeführt (Tabelle 1). Alle biopsied Blastozysten wurden dann bis zur Verglasung wieder in den Brutkasten in ein Postbiopsiekulturgericht gebracht. Alle relevanten Daten wurden in einer relationalen Datenbank gesammelt. Alle Zeitpunkte der Biopsie und zwischen Biopsie und Vitrifizierung wurden nachträglich aus der Software des elektronischen Bezeugensystems IVF gewonnen. Die Daten wurden dann exportiert und für Statistiken analysiert.
Die Kryo-Überlebensrate von euploiden Blastozysten nach Trophektoderm-Biopsie und Vitrifizierungserwärmung betrug N = 571/572, 99,8%. Die Re-Expansionsrate bei 1,5 h nach Erwärmung betrug N = 556/571, 97,4%. Unter den 15 nicht wieder ausgedehnten Blastozysten führte eine zu einer Lebendgeburt, nachdem sie in utero übertragen worden war. Die Lebendgeburtsrate nach verglast-gewärmtem euploiden Einzel-Blastozystentransfer betrug N=227/572, 39,7%.
Definition des idealen Zeitpunkts der Biopsie
Tabelle 1 fasst die relevanten Daten der durchgeführten Biopsieverfahren zusammen. Insgesamt wurden 1,89 x 1,03 (Bereich 1-4) Blastozysten pro Verfahren in 8,24 x 4,23 min (Bereich 3-22) biopsiet. Der mittlere Zeitpunkt der Biopsie variierte sowohl aufgrund der Anzahl der Blastozysten, die pro Verfahren biopsied sind, von einem Minimum von 5,78 x 2,94 min (Bereich 3-16), wenn nur ein Embryo in der Schale gelegt wurde, bis zu einem Maximum von 12,93 x 4,43 min (Bereich 6-22), wenn die Embryonen sequenziell biopsied wir re 4. Ein weiterer relevanter Parameter war der am Verfahren beteiligte Bediener: Der expertete (N = 443 Verfahren) war der schnellste (7,41 x 3,6 min, Bereich 3-22), während der am wenigsten erfahrene (N = 42) der langsamste war (14,19 x 4,24 min, Bereich 6-22). Tatsächlich erklärt ein generalisiertes lineares Modell, das sowohl die "Anzahl der Blastozysten, die pro Verfahren biopsied sind" als auch die "Operator"-Variablen enthalten, perfekt das "Timing der Biopsie" mit einem R2 = 0,48 und einer Leistung = 1. Diese Analyse war nützlich, um zu definieren, dass idealerweise 6 min für ein Blastozysten-Biopsieverfahren ausreichen, wenn nur ein Embryo in der Schale gelegt wird, während 9 min, 12 min und 13 min für 2, 3 bzw. 4 Blastozysten. Das ganze Verfahren beinhaltet natürlich auch die Verlagerung der Embryonen von der Kultur in die Biopsieschale und von der nachder Biopsie nach dem Eingriff in die Kulturschale nach der Biopsie sowie die Änderung der Biopsiepipette zwischen sequenziellen Biopsien.
Abbildung 7 zeigt den mittleren Zeitpunkt der Biopsie für jeden Bediener entlang der Studientrimester (von der 1.bis zur 8.). Die gepunktete rote Linie identifiziert den mittleren Gesamtwert von 8,24 min. Ein solches Diagramm ist nützlich, um die durchschnittliche Leistung jedes Praktizierenden zu überwachen. Zum Beispiel zeigten die expertenreichsten Operatoren (1 und 2) eine konstante Abnahme dieses Timings, was auf einen für eine Lernkurve typischen Trend hindeutet. Alle Operatoren von 3 bis 6 waren stattdessen ausreichend konstant in ihrer Leistung um den mittleren Gesamtwert über die Quartale herum. Jedes Mal, wenn sie einen Spitzenwert im Mittelwert eines bestimmten Trimesters zeigten (z.B. Operator 3 im 7. Trimester, Operator 4 im 6. Trimester, Operator 5 im 3. Trimester), wurden sie gewarnt, um ihre Leistung zu überarbeiten. Operator 7 (d.h. der am wenigsten erfahrene) zeigte die für einen Embryologen typischen Timings, der gerade seine Ausbildung beendet hat. Möglicherweise wird er/sie die internen Standards des Labors erfüllen, da das Know-how zunehmen würde.
Wichtig ist, dass die Zeit der Biopsie bei re-expanded und nicht re-expanded euploide Blastozysten bei 1,5 h von Erwärmung (9,52 x 4,23 min, Bereich 3-22 versus 10,5 x 5,68 min, Bereich 4-22; t-Test = 0,37). Wahrscheinlich zeigten implantierte (N = 229) und nicht implantierte (N = 343) verglaste-gewärmte euploide Blastozysten auch vergleichbare Biopsie-Timings (9,77 x 4,15 min, Bereich 3-22 versus 9,41 x 4,36 min, Bereich 3-22; t-Test = 0,39). Möglicherweise hat dann ein Timing von 22 min zur Biopsie von bis zu 4 Blastozysten keinen Einfluss auf das Embryoverhalten nach der Erwärmung. Daher haben wir diesen Wert als maximalen Schwellenwert definiert.
Ebenso wurde kein Unterschied in Bezug auf die Lebendgeburtenrate zwischen den verschiedenen Biopsie-Betreibern gezeigt, wie bereits berichtet13 (Ergänzende Tabelle 1).
Ein weiterer wichtiger Parameter zur Überwachung der Leistung jedes Bedieners ist die Rate der nicht schlüssigen Ergebnisse nach der Diagnose, die so nah wie möglich an der allgemeinen Leistung jedes Labors liegen sollte. Idealerweise sollte diese Rate 2,5% nicht überschreiten und könnte mit der Zeitaufgrund einer zunehmenden Expertise in Biopsie und Schläuche Verfahren 16 abnehmen. Die Zielzahl der abzurufenden TE-Zellen ist laut zwei früheren Studien 7-813,16. Zu diesem Zweck wird vorgeschlagen, ein Bild des biopsied Fragments für Zwecke der Qualitätskontrolle zu machen (siehe einige Beispiele in Abbildung 3). Ein solches Bild könnte bei nicht schlüssigen Diagnosen überprüft werden, um zu beurteilen, ob die Ursache der Dimension/Qualität des Fragments (d. h. der geringen Qualität der molekularen Analyse), den Schläuchen (d. h. dem Versagen der DNA-Amplifikation) oder einigen Problemen bei der die Verarbeitung der Probe im genetischen Labor.
Definition des idealen Zeitpunkts zwischen Biopsie und Vitrifizierung
Im Studienzeitraum wurden 572 euploide Blastozysten erwärmt, um sich nach einer Diagnose von Euploidie einer Embryoübertragung zu unterziehen. Abbildung 8A zeigt jede erwärmte Blastozyste als einen schwarzen Kreis, der über das zunehmende Timing zwischen Biopsie und Vitrifikation verteilt und in zwei Gruppen nach dem untersuchten Ergebnis gruppiert ist: re-expanded oder nicht innerhalb von 1,5 h von Erwärmung. Alle Blastozysten (N = 117/117) innerhalb von 30 min verglast, 97,6% (N = 245/251) der Blastozysten verglast zwischen 31-90 min und 95,1% (N = 194/204) der Blastozysten verglast über 90 min verlängert ( keine Re-Expansion-Raten: 0%, 2,4% und 4,9%). Daher setzen wir 30 min und 90 min als die frühen und späten Schwellen der Zeit zwischen Biopsie und Vitrifizierung.
Abbildung 8B zeigt die Re-Expansionsrate in den drei Gruppen (30 min, 31-90 min, >90 min), die je nach Blastozystenqualität und Tag der Präimplantationsentwicklung weiter unterteilt ist. Besonders bei schlechter Qualität und/oder Tag 7 Blastozysten scheint der Zeitpunkt zwischen Biopsie und Vitrifizierung entscheidend, um eine erneute Expansion nach der Erwärmung zu erreichen. Insbesondere betrug das Odds-Ratio der Erneutexpansion nach Erwärmung, korrigiert sowohl für die Blastozystenqualität als auch für den Tag der Biopsie in Blastozysten, die innerhalb von 30 min von der Biopsie verglast waren, gegenüber Blastozysten, die über 90 min verglast waren, 3,05 (95% CI 1,01-9,4, p=0,05). Stattdessen stellte der Zeitraum zwischen diesen beiden Schwellenwerten (31-90 min) eine Grauzone dar, die sich auswirken könnte oder auch nicht.
Nur 1 von 15 nicht neu erweiterten Blastozysten führte zu einer Lebendgeburt nach dem Transfer. Daher untersuchten wir schließlich die Lebendgeburtsrate, die nach erwärmtem euploiden Einzelblastozystentransfer erreicht wurde, der in den drei Gruppen nach dem Zeitpunkt zwischen Biopsie und Vitrifikation gruppiert wurde. Die höchste Lebendgeburtsrate wurde erreicht, indem euploide Blastozysten 30 min aus der Trophectoderm-Biopsie übertragen wurden (N = 56/117, 47,9%). Dieses Ergebnis erreichte jedoch keine statistische Signifikanz im Vergleich zu dem gleichen Ergebnis, das entweder mit Blastozysten erzielt wurde, die zwischen 31 und 90 min verglast waren (N = 92/251, 36,7%; Fishers genauer Test = 0,06) oder mit Blastozysten verglast >90 min von der Biopsie (N=81/204, 39,7%; Fishers exakter Test = 0,16). Daher ist entweder ein negativer Effekt auf die Reproduktionskompetenz der Blastozysten vernachlässigbar oder der Stichprobenumfang in diesem Datensatz (N = 572) reichte nicht aus, um eine statistische Signifikanz zu erreichen.
Abbildung 1: Parameter für die Blastozystenabstufung. Erweiterung: (A) voll geschlüpft, (B) im Schraffur, (C) vollständig erweitert und (D) nicht erweitert. Die ideale Stufe ist C, während eine Blastozyste D mehr Zeit erhalten sollte, um eine vollständige Expansion zu erreichen, es sei denn, diese Stufe wird in Tag 7 erreicht; Innere Zellmasse (ICM) morphologische Qualität: 1 (auffällig mit mehreren streng verpackten Zellen), 2 (erkennbar mit mehreren, aber grob verpackten Zellen) und 3 (schwierig zu unterscheiden mit sehr wenigen minderwertigen Zellen); trophectoderm (TE) morphologische Qualität: 1 (gut organisiertes Epithel mit mehreren Zellen), 2 (loses Epithel mit wenigen Zellen) und 3 (wenige und/oder große zellenarme Zellen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zusammenfassung der sequenziellen Zona pellucida (ZP) Öffnung und Trophectoderm (TE) Zellen-Retrieval-Ansatz für Blastozysten-Biopsie. (a) Richten Sie die Blastozyste mit der inneren Zellmasse (ICM) in der Nähe der Haltepipette und weit von der Stelle aus, an der die ausgewählten TE-Zellen abgerufen werden. Sichern Sie die Blastozyste auf der Haltepipette; (b) öffnen Sie das ZP durch 2-3 Laseraufnahmen; (c) einige Kulturmedien durch das Loch blasen; (d) die Blastozyste wird sich vom ZP lösen; (e) in das ZP eindringen und 5-10 TE-Zellen in der Biopsiepipette saugen; (f) sich mit der Biopsiepipette rückwärts bewegen, um das ausgewählte Fragment zu dehnen und die Knoten zwischen den Zellen freizulegen; (g) Feuer an den Knoten zwischen den Zellen und weiter dehnen das Fragment, bis die TE-Zellen aus dem Körper der Blastozyste freigesetzt werden; (h) die Blastozyste nach der TE-Biopsie zusammengebrochen ist; (i) nehmen Sie ein Bild des Biopsiefragments zur Qualitätskontrolle auf und übertragen Sie es in die PCR-Röhre, die an das genetische Labor gesendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beispiele für Biopsiefragmente: (a-c) wünschenswerte Fragmente; (d) lysiertes Fragment; (e) kleines Fragment mit degenerierten Zellen; (f) kleines, teilweise lysiertes und degeneriertes Fragment. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Künstliche Schrumpfung. (a) Richten Sie die Blastozyste so aus, dass die innere Zellmasse (ICM) weit vom Zielabschnitt des Trophektoderms (TE) entfernt ist; (b) Feuer 2-3 Laseraufnahmen in einer Reihe an den Kreuzungen zwischen TE-Zellen und bewegungsweise nach außen; (c) Warten Sie, bis die Blastozyste zusammenbricht, bevor Sie mit der Vitrifizierung beginnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Beispiele für Blastozystendegeneration (a), Kryo-Überleben, aber keine Re-Expansion (b) und Kryo-Überleben und vollständige Re-Expansion (c) 1,5 h nach der Erwärmung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Zusammenfassung der verschiedenen Ergebnisse der Trophectoderm-Biopsie, die verwendet werden könnte, um die Leistung eines Bedieners zu überwachen und die wichtigsten Leistungsindikatoren zu definieren, die für jedes Labor intern sind. Das wichtigste Verfahrensergebnis ist der Zeitpunkt der Biopsie. Das wichtigste technische Ergebnis ist die Rate der erhaltenen schlüssigen (euploiden oder aneuploiden) und nicht schlüssigen Diagnosen (Rebiopsie erforderlich); Letztere s. können durch DNA-Verstärkung oder minderwertige molekulare Daten verursacht werden, die beide zu nicht interpretierbaren Chromosomen-Kopiernummernprofildiagrammen führen. Das wichtigste biologische Ergebnis ist die Rate der Kryo-Überleben und Re-Expansion oder Degeneration nach Biopsie, Vitrifizierung und Erwärmung. Das wichtigste klinische Ergebnis ist die Rate der Lebendgeburten oder negativen Schwangerschaftsergebnisse, die nach verglast-gewärmtem Blastozystentransfer erzielt wurden. Es ist festzustellen, dass das Verfahrensergebnis zwar ausschließlich vom Bediener und der Anzahl der Blastozysten für die Biopsie pro Verfahren abhängt, aber alle anderen Ergebnisse könnten von anderen Vom Biopsie-Betreiber unabhängigen Faktoren (z. B. den Schritten und Operatoren) beeinflusst werden. an der molekularen Analyse beteiligt, die morphologische Qualität der Blastozyste, der Tag der Biopsie), die berücksichtigt werden sollte, um seine/ihre Leistung richtig zu bewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Mittleres Timing der Biopsie pro Bediener in den 8 Studientrimestern. Die Tabelle fasst die damit verbundene Anzahl von Verfahren und die durchschnittliche Anzahl der Blastozysten, die pro Verfahren von jedem Bediener in den 8 Studientrimestern biopsiet werden. Die gepunktete rote Linie in jedem Diagramm stellt den gesamtmittleren Zeitpunkt der Biopsie dar (8,24 min). Die Fehlerbalken sind die Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Re-Expansion nach Erwärmung versus Timing zwischen Biopsie und Vitrifizierung. (A) zeigt nicht re-expanded und re-expanded Blastozysten 1,5 stunden nach der Erwärmung. Jede Blastozyste wird durch einen schwarzen Kreis über den zunehmenden Timings dargestellt. Die vertikalen kontinuierlichen schwarzen Linien stellen 30 min als Frühschwelle und 90 min als Spätschwelle dar. (B) zeigt die Re-Expansionsraten in den drei Gruppen (Zeitpunkt zwischen Biopsie und Vitrifikation: 30 min, 31-90 min, >90 min) weiter gruppiert nach Blastozystenqualität und Tag der Biopsie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| N der Verfahren | N blastozysten biopsied pro Verfahren | Mittleres Timing der Biopsie bei SD, Bereich (min) | |
| Operator 1 | 443 | 2,01 x 1,09, 1-4 | 7,41 x 3,6, 3-22 |
| 195 | 1 | 4,75 x 1,96, 3-16 | |
| 111 | 2 | 7,83 x 2,45, 3-18 | |
| 71 | 3 | 10,27 x 2,41, 4-16 | |
| 66 | 4 | 11,48 bei 3,81, 6-22 | |
| Operator 2 | 290 | 1,81 x 0,98, 1-4 | 7,87 x 4,13, 3-22 |
| 142 | 1 | 5,69 x 3,32, 3-16 | |
| 89 | 2 | 8,48 x 2,79, 3-18 | |
| 30 | 3 | 11,37 bei 3,72, 4-20 | |
| 29 | 4 | 13,1 x 3,89, 9-22 | |
| Operator 3 | 287 | 1,98 x 1,05, 1-4 | 9,10 x 4,65, 3-22 |
| 121 | 1 | 6 x 2,19, 3-15 | |
| 89 | 2 | 9,6 x 3,87, 3-22 | |
| 38 | 3 | 12,66 x 4,55, 4-22 | |
| 39 | 4 | 14,13 x 4,8, 6-22 | |
| Operator 4 | 217 | 1,66 bei 0,87, 1-4 | 7,58 x 3,45, 3-22 |
| 118 | 1 | 5,58 x 1,96, 3-14 | |
| 66 | 2 | 8,92 x 2,91, 4-22 | |
| 21 | 3 | 11,48 x 2,34, 5-16 | |
| 12 | 4 | 13 x 4,26, 6-19 | |
| Operator 5 | 144 | 2,03 x 1,08, 1-4 | 9,43 x 4,24, 3-22 |
| 59 | 1 | 6,15 x 2,5, 3-16 | |
| 43 | 2 | 10,07 bei 2,73, 6-16 | |
| 20 | 3 | 12,6 x 2,89, 9-18 | |
| 22 | 4 | 14,09 bei 4,43, 6-22 | |
| Operator 6 | 121 | 1,67 x 0,94, 1-4 | 7,79 x 3,93, 3-22 |
| 70 | 1 | 6,19 x 2,95, 3-16 | |
| 32 | 2 | 8,12 x 1,72, 3-11 | |
| 9 | 3 | 12,78 bei 3,31, 9-18 | |
| 10 | 4 | 13,5 x 6,19, 6-22 | |
| Operator 7 | 42 | 1,62 bei 0,94, 1-4 | 14,19 x 4,24, 6-22 |
| 27 | 1 | 11,85 x 5,53, 6-16 | |
| 6 | 2 | 16,5 x 3,73, 11-22 | |
| 7 | 3 | 19,86 bei 3,34, 13-22 | |
| 2 | 4 | 19 x 4,24, 16-22 | |
| gesamt | 1544 | 1,89 x 1,03, 1-4 | 8,24 x 4,23, 3-22 |
| 732 | 1 | 5,78 x 2,94, 3-16 | |
| 436 | 2 | 8,85 x 3,14, 3-22 | |
| 196 | 3 | 11,72 bei 3,70, 4-22 | |
| 180 | 4 | 12,93 x 4,43, 6-22 |
Tabelle 1: Gesamtmittelwert der Biopsie und mittlere Anzahl von Blastozysten, die in jedem Verfahren gemäß biopsienden Operator biopsien. Der mittlere Zeitpunkt der Biopsie wurde auch nach jeder sequenziellen Anzahl von Blastozysten pro Verfahren biopsied gezeigt. Ein verallgemeinertes lineares Modell, das sowohl die Variablen "Biopsienoperator" als auch "Anzahl der Blastozysten, die pro Verfahren biopsiet" umfasst, korreliert perfekt mit dem "Timing der Biopsie" (R2 = 0,48, Leistung = 1).
Ergänzende Abbildung 1: Hauptgeräte und Stützen, die für das Verfahren erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Die logistische Regressionsanalyse zeigt keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Biopsie-Betreiber und der Lebendgeburt nach verglast-gewärmtem euploiden Blastozystentransfer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Nur erfahrene erfahrene Embryologen, die ihre Ausbildung abgeschlossen haben, sollten sowohl TE-Biopsie als auch Blastozysten-Vitrifikation durchführen. Darüber hinaus ist ein Zeuge verpflichtet, die Verfahren zu überwachen und eine effiziente Rückverfolgbarkeit während i) der Bewegungen der biopsied Blastozyste von der Biopsieschale(Zusatzabbildung 1) zur Nachbiopsieschale (Zusatzabbildung 1) zu gewährleisten. ), dann zur Verglasungsplatte (Zusatzabbildung 1) und schließlich zur Verglasungsunterstützung (Zusatzabbildung 1); ii) die Übertragung von biopsied TE-Zellen von der Biopsieschale auf die PCR-Röhre(Ergänzende Abbildung 1); iii) die Erwärmungs- und Transferschritte nach der Diagnose. Eine detaillierte Beschreibung aller Zeugenschritte finden Sie in einer fehlerbedenklichkeits- und Effektanalyse (FMEA), die zuvor veröffentlicht wurde14.
Alle in diesem Papier beschriebenen Methoden respektieren die lokale Verordnung (italienisches Gesetz 40/2004). Nach dem Gesetz kann das Paar sogar beantragen, über den Gesundheitszustand der Embryonen informiert zu werden, die sie während des IVF-Zyklus produziert haben. In diesem Zusammenhang muss von beiden Partnern eine detaillierte Informiertezustimmung für PGT unterzeichnet werden.
In diesem Artikel beschrieben wir, wie Blastozystenbiopsie für PGT in einer geschäftigen Laborroutine zu implementieren. Die Anwendung des Blastozysten-Biopsie-Ansatzes war ein wichtiger Fortschritt in den letzten zehn Jahren bei IVF. Erstmals von de Boer und Kollegen im Jahr 2004berichtet 17, es wurde bald als ein effektiveres und informativeres Verfahren im Vergleich zu Spaltung Seimtion und polare KörperBiopsie Ansätze3anerkannt. Der Wert dieses Verfahrens liegt hauptsächlich in einer Verringerung der technischen Belastungen, aber auch in einer geringeren Inzidenz von chromosomalen Mosaiken in diesem Entwicklungsstadium18,19. Darüber hinaus wurde die Entfernung einiger TE-Zellen aus einer Blastozyste als sichereres Verfahren vorgeschlagen als die Entfernung eines Blastomers aus einem Spaltstadium. In einer randomisierten Nichtauswahlstudie hatte der frühere Ansatz keine Auswirkungen auf das Implantationspotenzial von Embryonen, während letztere eine signifikante Reduktion um 20 % um20% mit sich nahm.
Das weltweit meist verwendete Protokoll beinhaltet die laserunterstützte Zonaöffnung am Tag 3 nach der Besamung. Bisher wurde keine randomisierte kontrollierte Studie durchgeführt, um die verschiedenen Blastozysten-Biopsieansätze zu vergleichen. Es ist jedoch vernünftig, dass je geringer die Anzahl der Manipulationen und Expositionen der heranwachsenden Embryonen gegenüber suboptimalen Umweltbedingungen, desto geringer ist die potenzielle Invasivität des Protokolls. Darüber hinaus könnte das Vorhandensein eines Lochs in der Zona pellucida vom 3. Tag der Entwicklung die Blastozystenexpansion beeinflussen und die Herniation von ICM-Zellen zusammen mit TE-Zellen verursachen. Aus diesen Gründen haben wir das hier beschriebene Protokoll festgelegt und implementiert, das die sequenzielle laserunterstützte Zona-Verletzung und te-Zellenabruf beinhaltet, sobald die Blastozyste die volle Ausdehnung erreicht. Es gibt auch ein anderes Protokoll, das einen Tag 5 oder 6 assistiertes Schlüpfen5,7beinhaltet. Insbesondere wird das Bohren der Zona am Tag 5 oder 6 der Präimplantationsentwicklung auf der gegenüberliegenden Seite in Bezug auf das ICM durchgeführt; Die Blastozyste wird dann zurück in den Brutkasten gebracht und wartet auf den spontanen Abziten von TE-Zellen. Es ist klar, dass die Blastozyste in den folgenden Stunden regelmäßig überwacht werden muss, um sie zu biopsien, sobald die TE mit dem Bandscheibenvorfall beginnt, und um zu verhindern, dass der Embryo vollständig schlüpft. Wenn einerseits ungelernte Praktiker diese alternative Biopsiestrategie problemlos umsetzen können, ist sie andererseits nicht für ein stark frequentiertes Labor geeignet, das mehrere Eingriffe pro Tag durchführt. Das hier beschriebene sequenzielle Zona-Öffnungs- und Blastozysten-Biopsieprotokoll ist weniger zeitaufwändig und ermöglicht eine kürzere Hands-on-Time und eine höhere Flexibilität, um die tägliche Aktivität im Labor zu planen, um die Zeitrahmen zu koordinieren, die für Biopsie und Verglasungsverfahren.
Schlechte Qualität Blastozysten könnten komplexer für die Biopsie sein, da die TE-Zellen klebrig sein können, aber mehr Laseraufnahmen mit der Dehnung des Fragments koordiniert, um die Verbindungen zwischen den Zellen zu entlarven, sind ausreichend, um es aus dem Körper der Blastozyste zu entfernen. Voll geschlüpfte Blastozysten können wie Blastozysten in der Zona pellucida eingeschlossen biopsied werden, aber sie könnten schwieriger zu vitrify und warm sein. Bei nicht schlüssigen Diagnosen nach der Biopsie sind die bisher gemeldeten Daten übereinstimmend, dass kein Schaden aus einer Rebiopsie und einem anschließenden Verglasungs-Erwärmungszyklus16,21zu ziehen scheint.
Vitrifikation wird derzeit im Zentrum verwendet, um Blastozysten Kryokonservierung durchzuführen, da es konsequent sicherer gemeldet wurde, effizienter und weniger zeitaufwändig als langsames Einfrieren Protokoll aus einer Überprüfung und Meta-Analyse der neuesten Literatur 10.
Sobald das Verfahren gut etabliert und die Bediener richtig geschult waren, führten wir eine retrospektive Analyse durch, um die idealen Verfahrenszeitpunkte sowohl für Blastozystenbiopsien als auch für Verglasungsverfahren zu definieren (hier in den repräsentativen Ergebnissen zusammengefasst). Als Endergebnis haben wir die Re-Expansionsrate der euploiden Blastozyste, die nach der Erwärmung auf 1,5 h ausgewertet wurde, und die Lebendgeburtsrate, die nach verglast-gewärmtem euploiden Einzelembryon-Transfer erreicht wurde, bewertet. Nach der Biopsie wurde kein Fall von Blastozystendegeneration beobachtet, und nach der Erwärmung wurde nur 0,2% (N = 1/572) der Degeneration berichtet, was die Zuverlässigkeit der angewandten Biopsie- und Verglasungsansätze bestätigte. Der Analyse zufolge hat der Zeitpunkt, der für die Durchführung einer Blastozystenbiopsie erforderlich ist, weder die Lebensfähigkeit von euploiden Blastozysten nach der Erwärmung, die als Re-Expansionsrate definiert ist, noch das Fortpflanzungspotenzial, das als Lebendgeburtsrate definiert ist. Obwohl verschiedene Timings für Betreiber mit unterschiedlichem Fachwissen beobachtet werden können, können wir Blastozystenbiopsie als sicher betrachten, wenn das Verfahren in ca. 8 min abgeschlossen ist, in einem Bereich von 3 bis 22 min, abhängig von der Anzahl der Embryonen pro Verfahren (jedoch sind keine Daten Biopsieverfahren in längeren Intervallen). Die durchschnittliche Zeit, die für blastozystische Biopsie von jedem einzelnen Bediener verbracht wird, sollte regelmäßig (mindestens alle drei Monate) als KPI überwacht werden. Daneben sollten auch die Rate der nicht schlüssigen Diagnose und die Lebendgeburtsrate nach verglast-gewärmter euploidem Blastozystentransfer angesprochen werden. Schließlich haben wir den idealen Zeitpunkt zwischen Biopsie und Vitrifizierung skizziert. Da wir die höchste Re-Expansionsrate nach der Erwärmung beobachteten, als Blastozysten innerhalb von 30 min nach der Biopsie verglast wurden, schlagen wir diesen Wert als idealen Schwellenwert vor. Insbesondere: Je länger die Zeit zwischen Biopsie und Vitrifizierung, desto mehr wird sich die biopsied Blastozyste wieder ausdehnen, bevor sie kryokonserviert wird. Dies kann schädlich für das Kryo-Überleben sein, vor allem, wenn es um schlechte Qualität und/oder Tag 7 Blastozysten11. Dennoch wurden keine signifikanten Auswirkungen auf die klinischen Ergebnisse beobachtet, selbst wenn sich die Verglasung über 90 min hinaus verzögerte. Daher könnten bei sporadischen Anlässen solche Timings erlaubt sein.
Die Methode, die zum Abrufen einer Probe für PGT gewählt wurde, sollte die Lebensfähigkeit des Embryos nicht beeinträchtigen, zuverlässige und informative Ergebnisse beinhalten, klinisch wirksam sein und einfach umzusetzen sein, wodurch die Kosten und die Arbeitsbelastung im Labor verringert werden. Blastozystenbiopsie erfüllt alle diese Voraussetzungen. Dennoch ist es immer noch ein invasives Verfahren, das von erfahrenen Bedienern in einem gut ausgestatteten Labor durchgeführt werden muss. Derzeit wird die Avantgarde eines nicht-invasiven PGT-Ansatzes (niPGT) untersucht. Vielleicht könnten in Zukunft die verbrauchten Kulturmedien nach IVF analysiert werden, um chromosomale und/oder genetische Tests durchzuführen. Dies ist eine faszinierende Zukunftsperspektive, da die Kosten für die IVF-Klinik niedriger wären und die gesamte Arbeitsbelastung, die mit der Embryobiopsie verbunden ist, umgangen würde. Die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der verbrauchten Medienanalyse für Gentests müssen jedoch noch bewertet werden22,23,24, daher müssen mehr Anstrengungen unternommen werden, um ein Protokoll zu definieren und zu validieren, das für alle IVF-Kliniken, die PGT weltweit durchführen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
AG und RM sammelten die Daten und verfassten das Manuskript. DC analysierte die Daten, erstellte die repräsentativen Ergebnisse, führte die Statistiken durch und überarbeitete das Manuskript. FMU und LR lieferten eine kritische Diskussion über die Ergebnisse und das gesamte Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B. Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. Jansen, R., Mortimer, D. , Parthenon Press. 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
