Summary
배반포 생검 및 유리화는 착상 전 유전자 검사를 효율적으로 수행하기 위해 필요합니다. 조나 펠루시다의 순차적 개방및 5-7일째에 7-8개의 트로페토더세포를 회수하는 접근법은 필요한 조작 횟수와 배아의 노출을 최적 이하의 환경 조건으로 제한한다.
Abstract
Blastocyst 생검은 착상 전 유전 시험을 가진 IVF 주기 도중 믿을 수 있는 유전 진단을 얻기 위하여 실행됩니다. 그런 다음, 이상적인 워크플로우에는 진단 기술의 처리 시간으로 인해 안전하고 효율적인 유리화 프로토콜이 수반되고, 선택된 배아를 다음과 같은 자연 주기에서 생리적 자궁 내막상으로 이송한다. 조나 펠루시다의 순차적 개방과 5-10 개의 영양 토내 세포 (이상적으로 7-8)의 검색을 포괄하는 생검 접근법은 필요한 조작 횟수와 배아의 노출을 최적 환경 조건에 모두 제한합니다. 적절한 훈련 후, 이 기술은 생검의 타이밍 (~8 분, 접시 당 생검에 대한 배아의 수에 따라 3-22 분 범위), 최종 진단을 얻은 (~ 97.5 %)에 걸쳐 다른 운영자에 걸쳐 재현 가능했다 그리고 생생한 출산율은 유혈모세포 전이(>40%)입니다. 생검, 유리화 및 온난화 후 생존율은 99.8%로 높았다. 온난화에서 1.5 h에서 재 팽창 속도 는 97%로 높았다, 주로 생검과 유리화 사이의 타이밍에 의존 (이상적으로 ≤30 분), 배반 세포 형태학적 품질과 생검의 날. 일반적으로 붕괴 된 배반포를 vitrify하는 것이 좋습니다. 따라서, 비 PGT 주기에서, 레이저 지원 인공 수축 은 동결 보존 전에 배아 붕괴를 유도하기 위해 수행 될 수있다. 가장 유망한 미래 관점은 배아 DNA의 가증한 근원으로서 배반포 배양 후 IVF 배양 배지의 비침습적 분석이다. 그러나 이 잠재적아방가르드는 아직 조사 중이며 신뢰할 수 있는 프로토콜을 정의하고 검증해야 합니다.
Introduction
현대 인간 발생학의 주요 목표는 자극된 주기 당 출생 수를 최대화하고 임신을 달성하기 위하여 비용, 시간 및 노력을 감소시키는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위하여는, 태아 선택을 위한 검증된 접근은 IVF 주기 도중 장악된 코호트 내의 생식 유능한 태아를 확인하기 위하여 이용되어야 합니다. 최신 증거에 따르면, blastocyst 배양 1은 포괄적인 염색체 검사 및 유리화 온난화 된 유엽태아 전달 (ET)과 결합되어 IVF 효율을 높이는 가장 효율적인 프레임 워크2이다. 분명히, 이수성 검사는 현재 주로 trophectoderm (TE)에서 검색 된 몇 가지 세포에서 표현되는 배아 표본을 필요로, 즉, 임신 중 배아 부속서 (예를 들어, 태반)에 기원을 제공하는 배반포의 섹션 . karyotype 분석을 넘어, 또한 단 하나 유전자 돌연변이는 착상 전 유전 시험으로 알려져 있는 임상 전략의 한 부분으로 TE 생검에서 평가될 수 있습니다 (PGT; -A 는 이수화에 대한, 구조 염색체 재배열을 위한 -SR, 단조로운 질병을 위한 -M). 그밖 난모세포/배아 생검 방법은 지난 십년간, 즉 극성 바디 생검 및 blastomere 생검을 통해 임상으로 이론화되고 채택되었습니다. 그러나, 그들의 사용은 그들의 절차적 단점 (예를 들어, 더 높은 워크로드 및 생식 영향에 대한 위험) 및 진단 한계 (예를 들어, 단일 세포 분석 문제)가 암시적으로 비용, 위험 및 및 사이의 충분한 균형을 방해하기 때문에 요즘 감소됩니다. (리뷰는3참조).
이 백서에서 TE 생검을 위한 주요 프로토콜 중 하나는 필요한 후속 유리화, 온난화 및 전달 절차와 함께 철저히 설명됩니다. 여기에 설명된 워크플로는 바쁜 PGT 장치에 이상적입니다.
이미 우리 그룹4,5에의해 이전에 설명한 바와 같이, 절차는 완전히 확장 된 배반포의 조나 펠루시다의 순차적 개방과 몇 가지 TE 세포의 제거를 포함한다 (평균 7-8). 3 일 레이저 보조 부화 기반 배반 포동 생검 방법6에비해,이 절차는 배반 세포 생검 및 유리화와 같은 섬세한 절차가 적시에 수행되어야하는 IVF 장치의 일일 일정을 완화 할 수 있습니다. 배반포가 완전한 확장에 도달하자마자, 생검은 제거하는 TE 세포를 선택하여 수행될 수 있고, 따라서 그렇지 않으면 절차를 도전하게 하는 내부 세포 질량 (ICM)의 탈장의 리스크를 방지합니다. 문헌에서, 배반포 생검의 제 3 프로토콜은 또한 설명되었습니다, 이는 배아가 이미 배반포 단계에 도달하면 수행되는 레이저보조 부화포함, 절차 5,7전에 몇 시간. 그러나, 이 접근법은 시간이 더 많이 소요되며 주로 제한된 숙련된 운영자의 손에 TE 생검을 구현하는 IVF 단위에 적합하며, 이는 보통 낮음의 일일 워크로드를 고려할 때 입니다.
Intracytoplasmatic 정액 주입 (ICSI)8 는 IVF에 있는 유전 분석을 실행하기 위하여 겨냥하는 경우에 통합한 기술이어야 합니다. 유사하게, 배아를 배반포 단계로 안전하게 수확하는 적절한 배양 시스템은 TE 생검 전략의 구현에 매우 중요하다. 적절한 수의 인큐베이터뿐만 아니라 낮은 산소 장력의 사용은 배반포 속도 9를 손상시키지 않는이 단원의 주요 전제 조건입니다. 동시에 PGT 주기를 안전하게 관리하기 위해서는 효율적인 냉동 보존 프로그램이 필요합니다. 지난 10 년간, 유리화의 구현은 배아 극저온 생존율을 >99%10,11까지증폭시켰습니다. 이것은 유전자 검사를 수행하고 다음 생리주기로 배아 전달을 연기하기에 충분한 시간을 제공, 비 자극 아마 더 수용 자궁 내막에12.
TE 생검과 유리화 는 엄격한 기술을 요구하는 작업을 요구하고 있으며 그 효과는 경험이없는 운영자에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 각 작업자가 이러한 절차를 임상적으로 수행할 수 있도록 하기 전에 특정 교육 기간이 주어지며, 또한, 냉동 보존 및 생검 절차에 대한 핵심 성과 지표(KPI)를 모니터링하여 운영자의 기술 유지를 주기적으로 평가해야 합니다. 각 IVF 클리닉은 내부 KPI를 이를 위해 설정해야 하며, 이는 국제 컨소시엄이 발표한 KPI 및/또는 참조 실험실에서 발표한 결과를 근사화해야 합니다.
TE 생검, 유리화 온난화 및 목격 절차는 3개의 이전 간행물11,13,14에 보고된 대로 관련된 모든 사업자에 걸쳐 표준화된 우리의 단위에 있는 기술을 검증됩니다 .
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Protocol
인간 배반세포 생검을 위한 프로토콜은, 여기에서 기술한, G.EN.E.R.A. 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
참고: 필요한 재료는 재료 표를 참조하십시오. 추가 필요한 재료는 실험실 신발과 의상, 수술 안면 마스크, 헤어 커버, 수술 장갑, 영구 무독성 마커, 집게 및 소독제를 수반한다. 외과 용 가운, 일회용 수술 장갑, 안면 마스크, 헤어 커버의 사용은 오염의 위험을 방지하기 위해 필수적입니다. 모든 작업 영역과 공정에 관련된 장비는 모든 절차를 시작하기 전에 실험실 소독제(예: Oosafe)로 철저히 세척해야 합니다. 사용되는 모든 소모품과 매체는 멸균되고 개별적으로 포장되거나 aliquoted되어야 합니다. 생검 및 튜브에 전용 워크스테이션을 사용하고 절차에 관련된 운영자 (배아 학자 및 증인)에게만 해당 영역의 액세스를 제한하는 것이 좋습니다.
1. 생검 절차 전날준비
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생검 문화 후 접시를 준비합니다.
- 20 μL IVF 배양 배지6 방울을 IVF 배양 접시에 놓고 배아 배양용 프리웜 미네랄 오일 6 mL로 오버레이(재료표).
- 각 방울에 IVF 배양 배지의 또 다른 10 μL을 추가합니다. 통제된 분위기에서 37°C에서 밤새 배양(5% O2, 6% CO2).
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생검 후 배반포를 헹구기 위해 IVF 접시 4-well 접시를 준비합니다.
- 처음 두 개의 우물에 IVF 배양 배지 600 μL을 놓고 배아 배양을 위해 미리 데운 미네랄 오일 300 μL을 겹쳐 놓습니다.
- 통제된 분위기에서 37°C에서 밤새 배양(5% O2, 6% CO2).
- TE 세포 튜브에 사용되는 각PCR 튜브에 1.5 μL의 로딩 용액 (재료 표)을 분배하고 회전시키고 4 °C로 유지하십시오.
2. 생검 수속당일 준비
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생검 접시를 준비합니다.
- 10 μL HEPES 완충배지 3 방울(인간 혈청 알부민보충제)을 IVF 배양 접시에 연속하여 놓습니다.
- 사용 가능한 배반포 수(접시당 최대 4개의 배반포)에 따라 1.1.1단계를 반복하고 배아 배양을 위해 미리 데운 미네랄 오일 6 mL로 오버레이합니다.
- 생검 절차를 수행하기 전에 적어도 1 시간 동안 37 °C에서 접시를 배양하십시오.
3. 배반포 선택 및 채점
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ICM 및 TE의 팽창 및 형태학적 외관에 따라 배반포를 채점한다(그림 1).
참고 : 채점 기준은 가드너와 스쿨 크래프트에서 적응하고있다15 이전에 카팔보 등 및 Cimadomo 등4,11에의해 설명 .- 크기 및 팽창 등급을 다음과 같이 정의합니다: 완전히 부화된 배반포의 경우 A, 부화 배반포의 경우 B, 완전히 확장된 배반포의 경우 C, 확장되지 않은 배반포의 경우 D(이 배아는 7일까지 더 확장되지 않은 경우에만 생검됩니다).
- ICM 등급 정의: 엄격하게 포장된 여러 셀이 있는 눈에 띄는 ICM의 경우 1; 2 는 여러 개의 셀을 통해 식별 할 수 있습니다. 3 은 매우 적은 품질의 셀로 구별하기 어렵다.
- 다음과 같이 TE 등급을 정의 : 여러 세포와 잘 조직 상피에 대한 1; 2 적은 세포와 느슨한 상피에 대한; 3 소수 및/또는 큰 저품질 셀용.
4. 트로피토더생검 생검
- 모든 실행 가능한 완전히 확장 된 blastocysts에 TE 생검을 수행 (바람직하게는 크기와 확장을위한 C 등급).
- 각 생검 절차에 대한 유지 및 생검 파이펫을 설정합니다. 생검 파이펫에 대한 권장 사항은 다음과 같습니다 : 30 μm 내부 직경, 35 ° 굽힘 각도, 굽힘 0.75mm 거리 팁.
- 환자의 세부 사항 (여성의 이름과 성, 생년월일 및 신분증)으로 생검 접시에 라벨을 붙인 다음 배아 및 주기 ID로 각 방울에 번호를 매습니다. 영구적인 무독성 마커를 사용하십시오.
- 300 μm 스트리핑 피펫으로 배반포를 생검 접시의 첫 번째 방울로 옮기고 배양 배지의 과잉을 제거하기 위해 헹구십시오. 그런 다음 생검 접시의 두 번째 방울에서 배반포를 옮기십시오.
- 접시를 거꾸로 된 현미경으로 옮기고 생검 접시의 세 번째 방울에서 일부 배지를 흡인하는 생검 파이펫을 프라이밍합니다.
- 20배 배율에서, 배반포를 배향하여 ICM을 명확하게 볼 수 있도록 한다. 7시 방향(TE 세포를 제거하기 위해 표적으로 하는 영역과 반대)에 시각화되면, 배아를 유지피펫 위에 고정한다(도 2a).
- 조나 펠루시다에 초점을 맞추고 파이펫과 배반포가 모두 같은 초점 면에 있는지 확인하십시오.
- 레이저 대물(펄스 시간 0.3ms, 6.5 μm)으로 전환하고 레이저 포인터를 ICM의 반대쪽에 조나 펠루시다에 배치합니다. 2−3 레이저 펄스를 통해 조나 펠루시다를 드릴 (그림2b).
- 조나 펠루시다에 대한 생검 피펫을 부드럽게 누르고 내부 표면에서 TE 세포를 분리하고 배반포 붕괴를 촉진하기 위해위반을 통해 일부 매체를 날려 보냅니다 (그림 2c).
- TE가 분리되면(그림 2d),구멍을 통해 입력 (필요한 경우, 마지막 레이저 펄스로 넓게) 몇 TE 세포 (이상적으로 7-813,16)부드러운 흡입과 생검 파이펫에 흡인 (그림2e).
- 대상 세포를 스트레칭하기 위해 적당한 흡입을 적용하면서 생검 피펫을뒤로 약간 이동시다(도 2f).
- 레이저를 흡인 세포의 가장 얇은 부분으로 향하게 하고 세포 사이의 접합부에서 2−5 레이저 펄스를 발사하여배아의 몸에서 표적 세포를 분리합니다(그림 2g). 레이저 펄스의 타이밍과 펄스의 수는 배반포의 품질에 따라 조정할 수 있습니다; 그러나, 세포 lysis를 피하기 위해 그들을 최소화 하려고.
- BLASTocyst (그림 2h)에서 TE단편을 분리 한 후, 배반포로부터 멀리 떨어진 동일한 생검 드롭으로 방출한다. 이것은 생검 파이펫으로 다시 흡입되는 것을 방지하기 위하여필요합니다 (그림 2i).
- 홀딩 파이펫에서 배반포를 풀어주고 파편이 부착되지 않도록 두 파이펫을 즉시 올립니다.
- 품질 관리 목적을 위해 생검 된 조각의사진을 찍습니다 (그림 3).
참고: 단일 배반포가 절차당 생검(생검 접시당 최대 4개)을 생검하는 경우, 배아 간 교차 오염을 방지하기 위해 생검 피펫을 새 파이펫으로 변경합니다. - 4.1-4.13단계를 반복한다.
- 생검 접시를 층류 후드로 다시 옮습니다.
- 생검 후 배양 접시에 부부 ID를 표시하고, 배아와 사이클 ID로 각 방울을 떨어뜨립니다.
- 목격자가있는 경우 깨끗한 IVF 배지에서 배반을 헹구고 마지막으로 생검 후 접시의 해당 드롭으로 옮습니다.
- 생검 후 접시를 조절된 분위기(37°C, 6% CO2, 5% O2)에서 유리화될 때까지 인큐베이터로 옮니다. 배반재 재팽창을 방지하기 위해 생검 절차에서 30 분 이내에 유리화를 수행하는 것이 좋습니다.
5화 튜브
참고: 전체 절차는 증인의 존재와 실온에서 층류 후드 내부에서 수행되어야한다. 시술 중에 PCR 튜브를 얼음 위에 있는 차가운 튜브 랙에 보관하십시오(보조그림1).
- PCR 튜브에 영구적인 무독성 마커로 라벨을 붙입니다.
참고: 라벨링은 유전 실험실의 요청에 따라 수행해야 합니다. 일반적으로, 환자의 이름과 성 (이니셜), 부부 ID, 배아 및 주기 ID (예를 들어: JD 12345 1.2 의 배아 N.1의 배아 N.1에 대한 그의 부부 ID는 12345입니다). 배아 ID는 또한 관의 바디에 편지에서 보고되어야 합니다. - 생검 배아의 아이디(보충그림1)와 함께 60 mm x 15mm 배양 접시(튜빙 접시)의 뚜껑을 라벨링하고 생검 세척용액 2개(재료표)를 준비합니다.
- 140 μm 스트리핑 피펫(보충도1)을 튜브 접시의 두 번째 방울로부터 생검 세척 용액으로 프라임.
- 스테레오현미경 아래에 생검 접시를 놓아 TE 단편을 쉽게 시각화합니다.
- TE 단편에 일부 생검 세척 용액을 부드럽게 풀어 놓습니다. 스트리핑 피펫에 로드합니다.
- TE 조각을 튜브 접시에 생검 세척 용액의 두 번째 방울로 옮기고 조심스럽게 2−3 회 헹구어 보입니다.
- TE 조각을 로딩 솔루션으로 PCR 튜브 의 바닥으로 옮기고 스트리핑 파이펫 끝으로 벽에 닿지 않도록 주의하십시오.
- 각 TE 단편에 대해 5.3단계에서 5.7단계까지 절차를 반복하여 모든 TE 단편에 대해 새로운 모세관을 사용하는 데 주의를 기울입니다.
- 튜브 절차가 끝나면 모든 PCR 튜브를 미니 원심 분리기에 넣고 몇 초 동안 회전시십시오.
- 샘플을 -20°C에서 저장하여 검사를 위해 참조 유전 실험실로 배송합니다.
6. 배반포 유리화
- Vitrify는 TE 생검에서 30 분 이내에 배반포를 붕괴하여 재팽창을 방지합니다.
- 유리화 판에 여성의 세부 사항과 유리화해야 하는 배반포의 아이디를 레이블로 지정합니다.
- 여성의 이름과 성, 부부 ID, 태아의 신분증, 그리고 시술 날짜를 적어 정하는 유리화 지원서에 라벨을 붙입니다. 매우 낮은 온도(-196°C)에서도 무결성을 보존하는 특수 저온 라벨이 사용됩니다.
- 실온에서 유리화될 각 배반포에 대해 0.3mL의 평형 용액(ES)(재료 표)을 분배합니다.
- 목격자가있는 경우 300 μm 스트리핑 피펫을 사용하여 ES에서 배반포를 이동하십시오.
- 13-15 분 동안 ES에 배반소를 둡니다. 부피의 초기 수축 후, 점진적인 재팽창이 관찰될 것이다.
- 액체 질소 (LN 2)로작은 냉각 랙을 채우고 층류 후드 아래에 놓습니다.
- 제2 우물에서 300 μL의 유리화용액(VS)(재료 표)을 분배한다. blastocyst가 완전히 재팽창된 후, VS 용액에 1분 간 옮기고 헹구어 ES를 희석시다.
- 목격자가 있는 경우, 배반포를 유리화 지지체에 적재하고 VS의 과잉을 제거하십시오. 솔루션의 미묘한 필름은 배반포를 둘러싸고 있어야합니다.
- 유리화 지지체를 LN 2로 급락시키고 시편에 가까운 기포 형성의 위험을 줄이기 위해 힘차게 움직입니다.
- LN 2에 잠긴 유리화 지지체를 유지하면서 보호 캡을 놓습니다.
- 목격자가 있는 경우, 장기간 LN2 저장 탱크에서 유리화 지지체를 이동한다.
7. 비생검배포의 인공수축
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TE 생검이 수행되지 않으면, 유리화 직전에 배반포를 인위적으로붕괴시다(그림 4).
- 배양 접시를 인큐베이터에서 반전된 현미경으로 옮기고 선택된 배아에 초점을 맞춥니다.
- 레이저 목표(사전 설정된 펄스: 0.3 ms, 6.5 μm)로 전환하고 ICM의 반대쪽에 있는 조나 펠루시다를 대상으로 한 다음 ICM에서 안전한 거리에서 TE 세포 사이의 접합부로 1-2개의 레이저 펄스를 직접 향합니다. 배반포는 5 분 이내에 붕괴해야합니다.
- 섹션 6에 설명된 바와 같이 붕괴된 배반포의 유리화를 진행한다.
8. 양도 가능한 배반포 온난화
- ET의 날에, 각 웰에 대해 600 μL의 미리 균형잡힌 IVF 배양 배지를 배치하여 ET 4-웰 플레이트를 준비한다. 변폭성 온난화를 수행하면서 제어 된 분위기(5 % O 2, 6 % CO 2)에서 37 °C에서 배양하십시오.
- 따뜻하게 데우는 여성의 이름과 성, 커플 ID, 배아의 신분증으로 따뜻하게 하는 접시에 라벨을 붙입니다.
- 해동용액(TS)의 1 mL을분주하여 체질 원웰 접시(보충도 1)에 17°C로 조절하여 시술을 시작하기 전에 적어도 1시간 동안 온도조절기에서 37°C로 데운다.
- LN 2로 작은 냉각 지지대를 채우고 작업 영역 가까이에 층류 후드에 놓습니다.
- 절차를 시작하기 전에 유리화 지원에 보고된 배반포 정보를 확인하십시오. 모든 아이디는 유전 보고서와 일치해야하며 따뜻하게하는 배반포는 양도 할 수있는 것들 중에서 선택해야합니다. 절차 중에 증인이 필요합니다.
- 온도 조절기에서 따뜻하게 데운 TS가 들어있는 원웰 접시를 스테레오현미경 아래 가열된 스테이지에 놓습니다.
- 집게를 사용하여 LN2 내의 보호 캡을 당깁니다.
- 유리화 지지체의 팁을 37°C TS로 빠르게 플런지합니다.
- 현미경 관찰하에 배반포가 끝에서 풀려나갈 때까지 유리화 지지체를 부드럽게 움직입니다.
- TS의 바닥에 그것을 유지하기 위해주의를 지불, TS에 총 1 분 동안 배반을 둡니다.
- 실온에서 200 μL의 희석 액 (DS) (재료표)을유리화 판의 첫 번째 우물에 분배합니다.
- 배반을 DS로 전송하고 그라데이션의 일종을 만들기 위해 그것의 상단에 일부 TS를 해제하는 동안 우물의 하단에 배치합니다. 3 분 동안 둡니다.
- 2개의 다른 웰(WS1 및 WS2)에 200 μL의 세척 액(WS)을 분배합니다.
- WS1에 배반포를 전송하고 그것의 상단에 일부 DS 매체를 해제하면서 우물의 바닥에 배치합니다. 그런 다음 바포포리스트를 WS2로 옮기고 1분 동안 방해받지 않고 둡니다.
- 여성의 이름과 성, 커플 ID, 배아의 신분증으로 온난화 후 ET 플레이트에 라벨을 붙입니다.
- 증인이있는 경우, 온난화 된 배반포를 온난화 후 ET 플레이트에서 미리 균형 된 배양 매체로 옮김을 옮니다.
- ET 플레이트의 첫 번째 우물에서 배반포를 헹구고 두 번째 우물에 놓습니다.
- 온난화 후 배양 접시를 조절된 분위기(37°C, 6% CO2, 5% O2)에서 인큐베이터로 옮기고 배반포를 적어도 1.5시간 동안 배양한 후 생존 및 재팽창을 확인한다.
참고: 그림 5는 퇴화된, 저온 생존하지만 다시 확장되지 않고 저온 생존및 완전히 확장된 배반포의 예를 보여줍니다.
9. 배아 이동
- ET를 수행하려면 접시를 층류 후드의 가열 단계에 놓아 배아가 낮은 배율로 현미경 으로 볼 수 있도록하십시오.
- IVF 배양 배지의 약 0.4 mL를 취합니다. 주사기 팁을 내부 카테터의 수신 단부로 단단히 고정한 다음 매체를 최대 0.1 mL까지 방출합니다.
- 배양 배지는 카테터에 들어가는 배아를 관찰할 때까지(최소량의 배지: 10-15 μL).
- 카테터를 플라스틱 케이스에 넣고 수술실로 가서 내부 카테터를 외부 가이드에 넣습니다.
- 일단 자궁에 도달하면, 주사기 플런저를 밀어 배아를 풀어 놓습니다. 플런저가 0.1 mL를 읽을 때까지 매체를 매우 천천히 해제합니다.
- 카테터를 다시 실험실로 가져가서 현미경으로 배아가 옮겨졌는지 확인하십시오.
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Representative Results
도 6은 프로토콜을 표준화하고 각 작업자의 성능을 모니터링하기 위해 채택될 수 있는 생검 절차의 모든 결과의 체계를 나타낸다. 주요 절차 결과는 생검 / 생검을 완료하는 타이밍입니다; 주요 기술적 인 결과는 결정적 이거나 결정적인 진단을 초래할 수있는 유전자 검사 후 생성 된 플롯의 품질이며, 후자는 진단되지 않은 배반포의 재생검을 필요로합니다. 주요 생물학적 결과는 온난화 후 저온 생존 및 재팽창 대 변성의 속도; 마지막으로, 주요 임상 결과는 유리화 된 배반포 전달 후 의 출생 률입니다. 3개의 이전 연구 결과에서는 기술, 생물학 및 임상 결과를 위한 중앙에 정의된 KPI를보고했습니다 11,13,16. 여기서는 생검 시기에 대한 KPI가 어떻게 정의되었는지 보고합니다. 더욱이, 유플로이드 배동포포포포낭의 온난화 후 행동에 대한 생검과 유리화 사이의 타이밍의 실질적인 영향도 조사되었다.
2년 동안 총 1,544건의 트로피토더 생검 시술이 7명의 사업자에 의해수행되었다(표 1). 모든 생검 배반포는 다음 유리화 될 때까지 생검 후 문화 접시로 인큐베이터로 다시 이동하였다. 모든 관련 데이터는 관계형 데이터베이스에서 수집되었습니다. 생검의 모든 타이밍과 생검과 유리화 사이의 모든 타이밍은 IVF 전자 목격 시스템의 소프트웨어로부터 소급하여 수득되었다. 그런 다음 데이터를 내보내고 통계를 분석했습니다.
영양토학 생검 및 유리화 온난화 후 유플로이드 배반포의 저온 생존율은 N =571/572, 99.8%였다. 온난화 후 1.5시간에서 재팽창률은 N =556/571, 97.4%였다. 15 개의 다시 확장되지 않은 배반포 중 하나는 자궁에서 옮겨진 후 살아있는 출생을 초래했습니다. 유리화 된 euploid 단일 blastocyst 전송 후 살아있는 출생률은 N = 227/572, 39.7%였다.
생검의 이상적인 타이밍의 정의
표 1은 수행된 생검 절차의 관련 데이터를 요약한 것입니다. 전반적으로, 1.89±1.03 (범위 1-4) 배반포는 8.24±4.23 분(범위 3-22)에서 시술당 생검하였다. 생검의 평균 타이밍은 시술당 배반포생술의 수가 모두 다양하기 때문에, 배아를 순차적으로 생검할 때 배아를 최대 12.93±4.43분(범위 6-22)까지 접시에 놓았을 때 최소 5.78±2.94분(범위 3-16)에서 다시 4. 또 다른 관련 파라미터는 시술에 관여하는 연산자였다: 가장 전문가(N= 443 절차)가 가장 빠르고(7.41±3.6 분, 범위 3-22), 경험이 적은 경우(N=42)가 가장 느린 반면(14.19±4.24 분, 범위 6-22)이었다. 실제로, "절차당 배반생생검 수"와 "연산자" 변수를 모두 수반하는 일반화된 선형 모델은 R2 = 0.48 및 전력 = 1로 "생검의 타이밍"을 완벽하게 설명합니다. 이 분석은 배아만 접시에 놓일 때 배반포 생검 절차에 이상적으로 ~6 분이 충분하다는 것을 정의하는 데 유용했으며, ~9 분, ~ 12 분 및 ~ 13 분 동안 2, 3 및 4 배반포낭에 대해 각각 유용했습니다. 분명히, 전체 절차는 또한 배아를 배양에서 생검 접시로 옮기고 후자에서 후생검 배양 접시로 옮기고, 순차적 생검 사이의 생검 피펫을 변경하는 것을 수반합니다.
그림 7은 연구 삼분기를 따라 각 작업자에 대한 생검의 평균 타이밍을 플롯합니다(1st에서 8일까지). 점선 빨간색 선은 8.24 분의 평균 전체 값을 식별합니다. 이러한 그래프는 각 개업자의 평균 성능을 모니터링하는 데 유용합니다. 예를 들어, 가장 전문적인 연산자(1및 2)는 이 타이밍의 지속적인 감소를 보였으며, 이는 학습 곡선의 전형적인 추세를 시사합니다. 3에서 6까지의 모든 연산자는 삼분기의 평균 전체 값을 중심으로 성능이 충분히 일정했습니다. 그들은 주어진 삼분기 (예를 들어, 7 삼분기의 연산자 3, 6 삼분기의 연산자 4, 3번째 삼분기의 연산자 5)에서 평균 값의 피크를 보여 주었을 때, 그들은 성능을 수정하기 위해 경고를 받았습니다. 운영자 7 (즉, 경험이 적은) 방금 훈련을 마친 배아학자의 전형적인 타이밍을 보여주었습니다. 전문 지식이 증가함에 따라 실험실 내부의 표준을 충족할 수 있습니다.
중요한 것은, 생검의 시간은 온난화로부터 1.5시간에서 재팽창 및 재팽창되지 않은 유플로이드 배반포(9.52±4.23 분, 범위 3-22 대 10.5±5.68 분, 범위 4-22; t-test = 0.37)에 걸쳐 유사하였다. 가능성이, 이식(N=229) 및 이식되지 않은(N=343) 유리화-온화 된 유플로이드 블라포시스트는 또한 유사한 생검 타이밍(9.77±4.15 분, 범위 3-22 대 9.41±4.36 분, 범위 3-22; t-시험 =0.39)을 보였다. 아마도, 최대 4 개의 배반포를 생검하는 타이밍 ≤22 분은 온난화 후 배아 행동에 영향을 미치지 않습니다. 따라서 이 값을 최대 임계값으로 정의했습니다.
유사하게, 이미 보고된 바와 같이, 상이한 생검 연산자 에 걸쳐 살아있는 출생률의 관점에서 차이가 나타나지 않았다 (보충표1).
각 작업자의 성능을 모니터링하는 또 다른 중요한 매개 변수는 각 실험실의 일반적인 성능에 최대한 가까워야 하는 진단 후 결정적인 결과의 비율입니다. 이상적으로이 비율은 2.5 %를 초과해서는 안되며 생검 및 튜브 절차(16)의전문 지식이 증가함에 따라 시간이 지남에 따라 감소 할 수 있습니다. 검색할 TE 세포의 목표 수는 이전 두 연구13,16에따라 7-8이다. 이를 위해, 품질 관리 목적을 위해 생검 된 단편의 사진을 찍는 것이 좋습니다 (도3의 몇 가지 예 참조). 이러한 그림은 결정적인 진단의 경우 원인이 단편의 치수 /품질 (즉, 분자 분석의 낮은 품질), 튜브 (즉, DNA 증폭 실패) 또는 일부 문제에 대한 명백한 인지 여부를 평가하기 위해 검사 될 수 있습니다. 유전 실험실에서 샘플의 처리.
생검과 유리화 사이의 이상적인 타이밍의 정의
연구 기간에서, 572 유우로이드 배반포는 유화증의 진단 후 배아 이식을 겪기 위해 따뜻화되었다. 그림 8A는 생검과 유리화 사이의 증가 타이밍에 걸쳐 분포된 검은 원으로 각 온난화 배반포를 보여주고 조사 중인 결과에 따라 두 그룹으로 군집: 재확장 또는 1.5시간 내에 다시 확장되지 않음 온난화. 모든 배반포 (N = 117/117) 30 분 이내에 유리화, 97.6% (N = 245/251) 31-90 분 사이 유화, 그리고 95.1% (N = 194/204) 배반포의 90 분 이상 재팽창, (재 팽창 속도 없음: 0%, 2.4% 및 4.9%). 따라서 생검과 유리화 사이의 초기 및 후반 임계값으로 30 분 및 90 분설정합니다.
도 8B는 착상 전개발의 배반포 품질 및 날에 따라 추가로 서브클러스터된 3군(≤30 분, 31-90분, >90분)에서의 재팽창속도를 나타낸다. 특히 품질이 나빠지거나 7일째 배반포의 경우, 생검과 유리화 사이의 타이밍이 온난화 후 재팽창을 달성하는 데 결정적인 역할을 합니다. 구체적으로, 90분 이상 생검에서 30분 이내에 정력화된 배반포의 배반포 품질과 생검의 날에 대해 보정된 온난화 후 재팽창의 확률-비율은 3.05(95% CI 1.01-9.4, p=0.05)였다. 대신 이 두 임계값(31-90분) 사이의 기간은 영향을 미치거나 영향을 미치지 않을 수 있는 회색 영역을 나타내었습니다.
15명 중 1명만이 배반포를 다시 확장하지 않았고, 그 결과 이송 후 생사결과가 나왔다. 따라서, 우리는 마지막으로 생검과 유리화 사이의 타이밍에 따라 세 그룹에서 군집된 euploid 단일 blastocyst 전송 후에 달성된 살아있는 출생 비율을 조사했습니다. 가장 높은 출생률은 영양토학 생검으로부터 30분 간 유플로이드 블라포포시스트를 이송함으로써 달성되었다(N = 56/117, 47.9%). 그러나, 이 결과는 31 및 90 분 사이에서 유리화 된 배반포와 동일한 결과와 비교했을 때 통계적 유의성에 도달하지 못했습니다 (N = 92/251, 36.7%; 어부의 정확한 테스트 = 0.06), 또는 생검에서 송화 >90 분 배반포 (N = 81/204, 39.7 %; 피셔의 정확한 테스트 = 0.16). 따라서, 배반포 생식 능력에 대한 부정적인 영향은 무시할 수 있거나 이 데이터 세트의 샘플 크기(N=572)는 통계적 유의성에 도달하기에 충분하지 않았다.
그림 1: 배반포 정지에 대한 매개변수입니다. 확장:(A) 완전히 해치 , (B) 해치, (C) 완전히 확장 및 (D) 확장 되지 않습니다. 이상적인 단계는 C이며, 배반포 D는 이 단계가 7일째에 도달하지 않는 한 전체 확장을 달성하는 데 더 많은 시간을 주어야 합니다. 내부 세포 질량 (ICM) 형태학적 품질: 1 (여러 개의 엄격하게 포장 된 세포로 눈에 띄는), 2 (여러 개의 셀로 식별 할 수 있음) 및 3 (극히 소수의 저품질 세포로 구별하기 어렵다); 트로페토더럼 (TE) 형태학적 품질: 1 (여러 세포가있는 잘 조직 된 상피), 2 (셀이 적은 느슨한 상피) 및 3 (몇 가지 및 / 또는 큰 저품질 세포). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 순차적 조나 펠루시다(ZP)의 요약 개구부 및 트로페토더 (TE) 배반포 생검을 위한 세포 검색 접근. (a) 배반포를 내측 세포 질량(ICM)과 함께 배반파이펫에 가깝게, 선택된 TE 세포가 회수될 스팟으로부터 멀리 떨어진 지점에서 오리엔트한다. 홀딩 파이펫상에 배반포를 고정; (b) 2-3 레이저 샷을 통해 ZP를 엽니 다; (c) 구멍을 통해 일부 배양 배지를 날려; (d) 배반포는 ZP에서 분리됩니다. (e) ZP를 입력하고 생검 파이펫에 5-10 TE 세포를 빨아; (f) 선택된 단편을 스트레칭하고 세포 들 사이의 접합을 노출하기 위해 생검 파이펫과 함께 뒤로 이동; (g) 세포 사이의 접합부에서 발사하고 TE 세포가 배반포의 몸에서 방출 될 때까지 조각을 계속 스트레칭; (h) TE 생검 후 배반포가 붕괴되고; (i) 품질 관리를 위해 생검 단편의 사진을 찍어 유전 실험실로 보내질 PCR 튜브로 옮김을 옮김을 전송한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 생검 단편의 예: (a-c)바람직한 단편; (d) 리시스 프래시 프래시; (e) 퇴화된 세포를 가진 작은 단편; (f) 작은, 부분적으로 분해 및 퇴화 조각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 인공 수축. (a) 배반포를 배향하여 내세포 질량(ICM)이 트로프토더(TE)의 표적 부분으로부터 멀리 떨어져 있도록 한다; (b) TE 세포 사이의 접합부에서 연속으로 2-3 레이저 샷을 발사하고 바깥쪽으로 이동; (c) 배반포가 붕괴될 때까지 기다렸다가 유리화를 시작합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 배반포 변성(a), 저온 생존의 예는 재팽창(b) 및 저온 생존 및 완전 재팽창(c) 1.5h 후온난화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 작업자의 성능을 모니터링하고 각 실험실 내부의 핵심 성과 지표를 정의하는 데 사용될 수 있는 트로피토더 생검의 다양한 결과에 대한 요약. 주요 절차 결과는 생검의 타이밍입니다. 주요 기술적 인 결과는 결정적 (euploid 또는 aneuploid) 및 결정적인 진단 (재생 검 필요)의 속도입니다. 후자는 DNA 증폭 또는 낮은 품질의 분자 데이터에 의해 발생할 수 있습니다., 둘 다 해석할 수 없는 염색체 카피 수 프로필 플롯의 결과. 주요 생물학적 결과는 생검, 유리화 및 온난화 후 저온 생존 및 재팽창 또는 변성의 속도입니다. 주요 임상 결과는 유리화 온난화 배반포 전송 후에 달성된 살아있는 출생 또는 부정적인 임신 결과의 비율입니다. 주의, 절차 결과는 전적으로 운영자와 절차 당 생검에 배반포의 수에 의존하지만, 다른 모든 결과는 생검 연산자 (예를 들어, 단계 및 운영자)에서 독립적 인 다른 confounders에서 영향을받을 수 있습니다 분자 분석에 관여, 배반의 형태 학적 품질, 생검의 날) 그 / 그녀의 성능을 제대로 평가하기 위해 설명되어야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 8개의 연구 삼분기에 걸쳐 연산자당 생검의 평균 타이밍. 표는 8 개의 연구 삼분기의 각 운영자에 의해 절차 당 생검 된 관련 절차 수와 평균 배반 포낭송 수를 요약합니다. 각 그래프 내의 점선 빨간색 선은 생검의 전체 평균 타이밍(8.24분)을 나타냅니다. 오류 막대는 표준 편차입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 생검과 유리화 사이의 타이밍 대 온난화 후 재팽창. (A) 온난화 후 1.5시간 동안 배반포를 다시 팽창 및 재팽창시키지 않는 것을 나타낸다. 각 배반포는 증가하는 타이밍에 걸쳐 검은 원으로 표시됩니다. 수직 연속 블랙 라인은 초기 임계값으로 설정된 30분, 후반 임계값으로 설정된 90분입니다. (B) 3개의 그룹(생검과 유리화 사이의 타이밍: ≤30 분, 31-90 분, >90 분)에서 배반포 품질 및 생검의 날에 따라 추가로 군집된 재팽창 속도를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 절차의 N | N 배반포는 절차 당 생검 | 생검 ± SD의 평균 타이밍, 범위 (최소) | |
| 연산자 1 | 443 | 2.01 ± 1.09, 1-4 | 7.41 ± 3.6, 3-22 |
| 195년 | 1개 | 4.75 ± 1.96, 3-16 | |
| 111 | 2개 | 7.83 ± 2.45, 3-18 | |
| 71세 | 3개 | 10.27 ± 2.41, 4-16 | |
| 66세 | 4개 | 11.48 ± 3.81, 6-22 | |
| 연산자 2 | 290개 | 1.81 ± 0.98, 1-4 | 7.87 ± 4.13, 3-22 |
| 142 | 1개 | 5.69 ± 3.32, 3-16 | |
| 89세 | 2개 | 8.48 ± 2.79, 3-18 | |
| 30개 | 3개 | 11.37 ± 3.72, 4-20 | |
| 29세 | 4개 | 13.1 ± 3.89, 9-22 | |
| 연산자 3 | 287 | 1.98 ± 1.05, 1-4 | 9.10 ± 4.65, 3-22 |
| 121 | 1개 | 6 ± 2.19, 3-15 | |
| 89세 | 2개 | 9.6 ± 3.87, 3-22 | |
| 38세 | 3개 | 12.66 ± 4.55, 4-22 | |
| 39세 | 4개 | 14.13 ± 4.8, 6-22 | |
| 연산자 4 | 217 | 1.66 ± 0.87, 1-4 | 7.58 ± 3.45, 3-22 |
| 118 | 1개 | 5.58 ± 1.96, 3-14 | |
| 66세 | 2개 | 8.92 ± 2.91, 4-22 | |
| 21세 | 3개 | 11.48 ± 2.34, 5-16 | |
| 12세 | 4개 | 13 ± 4.26, 6-19 | |
| 연산자 5 | 144 | 2.03 ± 1.08, 1-4 | 9.43 ± 4.24, 3-22 |
| 59세 | 1개 | 6.15 ± 2.5, 3-16 | |
| 43세 | 2개 | 10.07 ± 2.73, 6-16 | |
| 20개 | 3개 | 12.6 ± 2.89, 9-18 | |
| 22세 | 4개 | 14.09 ± 4.43, 6-22 | |
| 연산자 6 | 121 | 1.67 ± 0.94, 1-4 | 7.79 ± 3.93, 3-22 |
| 70세 | 1개 | 6.19 ± 2.95, 3-16 | |
| 32세 | 2개 | 8.12 ± 1.72, 3-11 | |
| 9개 | 3개 | 12.78 ± 3.31, 9-18 | |
| 10개 | 4개 | 13.5 ± 6.19, 6-22 | |
| 연산자 7 | 42세 | 1.62 ± 0.94, 1-4 | 14.19 ± 4.24, 6-22 |
| 27세 | 1개 | 11.85 ± 5.53, 6-16 | |
| 6개 | 2개 | 16.5 ± 3.73, 11-22 | |
| 7명 | 3개 | 19.86 ± 3.34, 13-22 | |
| 2개 | 4개 | 19 ± 4.24, 16-22 | |
| 총 | 1544년 | 1.89 ± 1.03, 1-4 | 8.24 ± 4.23, 3-22 |
| 732 | 1개 | 5.78 ± 2.94, 3-16 | |
| 436 | 2개 | 8.85 ± 3.14, 3-22 | |
| 196년 | 3개 | 11.72 ± 3.70, 4-22 | |
| 180년 | 4개 | 12.93 ± 4.43, 6-22 |
표 1: 생검 연산자에 따라 각 절차에서 생검의 총 평균 타이밍 및 배반포의 평균 수는 생검 연산자에 따라 생검합니다. 생검의 평균 타이밍은 또한 절차 당 생검하는 배반포의 각 순차적인 수에 따라 표시되었습니다. "생검 연산자" 및 "시술당 배반포 생검 수" 변수를 모두 포함하는 일반화된 선형 모델은 "생검의 타이밍"(R2 = 0.48, 전력 = 1)과 완벽하게 상관관계가 있습니다.
추가 그림 1: 절차에 필요한 주요 장치 및 지원. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 물류 회귀 분석은 유리화 된 euploid blastocyst 전송 후 생검 연산자와 살아있는 출생 사이의 중요한 연관성을 보여주지 않습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
훈련 기간을 마친 숙련된 숙련된 배아학자만이 TE 생검과 배반포 유리화를 모두 수행해야 합니다. 또한, 생검 접시에서 생검 된 배반포의 움직임을 시술 을 모니터링하고 효율적인 추적성을 보장하기 위해 증인이 필요합니다 (보충그림1) 생검 후 접시에 (보충그림 1) ), 다음 유리화 판(보충 도1) 및 마지막으로 유리화 지지체 (보조도1); ii) 생검접시로부터 PCR관으로 의생TE세포의이송(보충체도1); iii) 온난화 및 전사 단계 사후 진단. 모든 감시 단계에 대한 자세한 설명은 이전에 게시된 실패 모드 및 효과 분석(FMEA)을 참조하십시오14.
이 백서에 설명된 모든 방법은 현지 규정(이탈리아 법 40/2004)을 존중합니다. 법에 따르면, 사실, 부부는 IVF 주기 동안 생산 된 배아의 건강 상태에 대한 정보를 요청할 수 있습니다. 이와 관련하여 PGT에 대한 자세한 동의는 두 파트너모두 서명해야 합니다.
이 논문에서는 바쁜 실험실 루틴에서 PGT에 대한 배반포 생검을 구현하는 방법을 설명했습니다. blastocyst 생검 접근의 응용은 IVF에 있는 마지막 십년간에 있는 중요한 전진이었습니다. 2004년17년드보어와 동료들에 의해 처음 보고된 이 법은 절단 단계및 극지 생체 생검접근법3에 비해 보다 효과적이고 유익한 절차로 곧 인식되고 있다. 이 절차의 가치는 주로 기술적 부담의 감소에 있지만, 또한 개발18,19의이단계에서 염색체 모자이크의 낮은 발생률에 있습니다. 더욱이, 배반포로부터 소수의 TE 세포를 제거하는 것은 절단 단계 배아로부터 하나의 블래스토미어를 제거하는 것보다 더 안전한 절차로서 제안되었다. 실제로, 무작위 비선택 연구에서, 전접근법은 배아 이식 잠재력에 어떠한 영향도 미치지 않았고, 후자는 유의한 ~20% 감소20을수반하였다.
전 세계적으로 주로 사용되는 프로토콜은 3 일째에 레이저 보조 조나 개방을 수반합니다. 아니 무작위 통제 재판 다른 blastocyst 생검 접근을 비교 하기 위해 날짜에 실시 되었습니다. 그러나, 성장하는 배아의 조작 및 노출 수가 낮아질수록 최적이 아닌 환경 조건에, 프로토콜의 잠재적 침습성이 낮아지는 것이 합리적이다. 더욱이, 개발의 3 일째부터 조나 pellucida에 있는 구멍의 존재는 blastocyst 확장에 영향을 미치고 TE 세포와 함께 ICM 세포의 탈축을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는 블래스토포리스트가 완전한 확장에 도달하는 즉시 순차적인 레이저 보조 조나 위반 및 TE 세포 검색을 수반하는 프로토콜을 설정하고 구현했습니다. 또한 하루 5 또는 6 보조 해칭5,7을수반하는 다른 프로토콜이 존재합니다. 구체적으로, Zona의 드릴링은 ICM에 대하여 반대측에 착상전 개발의 5 일 또는 6일에 수행된다; 배반포는 TE 세포의 자발적인 탈수를 기다리는 인큐베이터로 다시 이동됩니다. 분명히, 배반포의 정기적 인 모니터링은 TE가 탈장시작즉시 생검하고 배아가 완전히 부화하는 것을 방지하기 위해 다음 시간에 제공되어야합니다. 한편으로는 숙련되지 않은 실무자가 이 대체 생검 전략을 쉽게 구현할 수 있다면, 다른 한편으로는 하루에 여러 가지 절차를 수행하는 바쁜 실험실에 적합하지 않습니다. 여기에 설명된 순차적 조나 개구부 및 배반포 생검 프로토콜은 시간이 덜 소요되며 실험실에서 일일 활동을 예약할 수 있는 더 짧은 실습 시간과 더 높은 유연성을 허용하여 전용 기간을 조정합니다. 생검 및 유리화 절차에.
TE 세포가 끈적 일 수 있기 때문에 가난한 품질의 배반포는 생검에 더 복잡 할 수 있지만, 세포 사이의 접합을 노출하는 조각의 스트레칭과 조정 더 레이저 샷은 배반포의 몸에서 제거하기에 충분하다. 완전히 부화 한 배반포는 조나 펠루시다에 둘러싸인 배반포처럼 생검 될 수 있지만, vitrify및 따뜻한 하기가 어려울 수 있습니다. 생검 후 결정적인 진단의 경우, 현재까지 보고된 데이터는 재생검 및 다음 의 유리화 온난화 주기16,21에서파생되는 것으로 보인다는 것을 일치한다.
Vitrification는 가장 최근의 문헌의 검토 및 메타 분석에서 느린 동결 프로토콜보다 일관되게 더 안전하고 효율적이며 시간이 덜 소요되는 것으로 일관되게 보고되었기 때문에 배반포 동결 보존을 수행하기 위해 센터에서 현재 사용되고 있습니다. 10.
절차가 잘 확립되고 운영자가 제대로 훈련되면, 우리는 배반 세포 생검 및 유리화 절차 모두에 대한 이상적인 절차 타이밍을 정의하기 위해 회고 분석을 수행했습니다 (대표 결과에 요약). 최종 결과로, 우리는 온난화 후에 1.5 시간에서 평가된 euploid blastocyst의 재팽창 비율을 평가하고 유리화한 온난화 euploid 단 하나 태아 전송 후에 달성한 살아있는 출생 비율. 생검 후 배반포 변성의 경우는 관찰되지 않았으며, 온난화 후 변성 비율의 단지 0.2%(N=1/572)가 보고되었고, 채택된 생검 및 유리화 접근법의 신뢰성을 확인하였다. 분석에 따르면, 배반포 생검을 수행하는 데 필요한 타이밍은 재팽창율로 정의된 온난화 후 유플로이드 배반포의 생존력, 또는 살아있는 출생률로 정의된 생식 잠재력에 영향을 미치지 않습니다. 다양한 전문 지식을 가진 운영자에 걸쳐 다양한 타이밍을 관찰 할 수 있지만, 우리는 절차가 약 8 분에서 완료 될 때 배반 포병 생검 안전을 고려할 수 있습니다, 절차 당 배아의 수에 따라 3 ~ 22 분 범위 (그러나 데이터는 없습니다 더 긴 간격으로 수행 된 생검 절차에 사용할 수 있습니다). 각 단일 작업자의 배반포 생검에 소요되는 평균 시간은 주기적으로(적어도 3개월마다) KPI로 모니터링되어야 합니다. 병가적 인 온난화 된 euploid blastocyst 전송 후 결정적인 진단및 살아있는 출생비율의 비율도 해결되어야 합니다. 마지막으로, 우리는 생검과 유리화 사이의 이상적인 타이밍을 설명했습니다. 우리는 배반포가 생검에서 30 분 안에 유리화되었을 때 온난화 후에 가장 높은 재팽창 비율을 관찰했기 때문에, 우리는 이상적인 임계값으로 이 값을 건의합니다. 특히, 생검과 유리화 사이의 시간이 길수록 생검 배동포가 저온 보존되기 전에 다시 확장됩니다. 이것은 저온 생존에 해로울 수 있습니다, 특히 가난한 품질 및 /또는 일 7 배반 11을 다룰 때 . 그럼에도 불구하고, 유리화가 90분 이상 지연되더라도 임상 결과에 대한 유의한 영향은 관찰되지 않았다. 따라서 산발적인 경우에는 이러한 타이밍이 허용될 수 있습니다.
PGT를 위한 견본을 검색하기 위하여 선택된 방법은 태아 생존에 영향을 미치지 않아야 합니다, 믿을 수 있고 유익한 결과를 관련시켜야 합니다, 임상적으로 효과적이어야 하고, 그것으로 비용 및 실험실 워크로드를 감소시키는 가능하게 실행하기 쉬워야 합니다. Blastocyst 생검은 이 모든 전제 조건을 충족합니다. 그럼에도 불구하고, 그것은 여전히 잘 갖추어진 실험실에서 숙련 된 운영자에 의해 수행되어야하는 침략적 인 절차입니다. 현재, 비침습적 PGT(niPGT) 접근법의 아방가르드는 조사 중이다. 아마도, 미래에, IVF 후에 소비된 문화 매체는 염색체 및/또는 유전 시험을 수행하기 위하여 분석될 지도 모릅니다. 이것은 IVF 진료소를 위한 비용이 더 낮을 것이고 태아 생검에 의해 수반되는 모든 워크로드가 회피될 것이기 때문에 흥미로운 미래 관점입니다. 그러나 유전자 검사를 위한 소비된 매체 분석의 신뢰성그리고 재현성은 아직도 평가되어야 합니다22,23,24,그러므로 더 많은 노력은 정의하고 할 수 있는 프로토콜을 검증하기 위하여 투자되어야 합니다 전 세계적으로 PGT를 수행하는 모든 IVF 클리닉에 적합합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
AG와 RM은 데이터를 수집하고 원고를 작성했습니다. DC는 데이터를 분석하고, 대표 결과를 작성하고, 통계를 수행하고, 원고를 수정했습니다. FMU와 LR은 결과와 전체 원고에 대한 비판적 인 토론을 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
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