Summary
Blastocyst biopsi og vitrifikasjon er nødvendig for å effektivt utføre Preimplantation genetisk testing. En tilnærming innebærer den sekvensielle åpningen av Zona pellucida og gjenfinning av 7-8 trophectoderm celler i dag 5-7 post-befruktning begrenser både antall manipulasjoner som kreves og eksponeringen av fosteret til sub-optimale miljøforhold.
Abstract
Blastocyst biopsi er utført for å oppnå en pålitelig genetisk diagnose under IVF sykluser med Preimplantation genetisk testing. Den ideelle arbeidsflyten medfører deretter en sikker og effektiv vitrifikasjon protokoll, på grunn av behandlingstiden for diagnose teknikkene og for å overføre det valgte fosteret (ene) på en fysiologisk endometrium i en påfølgende naturlig syklus. En biopsi tilnærming omfatter sekvensiell åpning av Zona pellucida og gjenfinning av 5-10 trophectoderm celler (ideelt 7-8) begrenser både antall manipulasjoner som kreves og eksponeringen av fosteret til sub-optimale miljøforhold. Etter riktig trening, var teknikken reproduserbar på tvers av ulike operatører i form av timing av biopsi (~ 8 min, alt 3-22 min basert på antall embryo å biopsi per tallerken), avgjørende diagnoser innhentet (~ 97,5%) og leve fødselsrater etter vitrified-varmet euploid blastocyst overføring (> 40%). Overlevelsesraten etter biopsi, vitrifikasjon og oppvarming var så høy som 99,8%. Den re-ekspansjon rate på 1,5 h fra oppvarmingen var så høy som 97%, i stor grad avhengig av timingen mellom biopsi og vitrifikasjon (ideelt ≤ 30 min), blastocyst morfologiske kvalitet og dag med biopsi. Generelt er det bedre å vitrify en kollapset blastocyst; Derfor, i ikke-PGT sykluser, laser-assistert kunstig krymping kan utføres for å indusere embryo kollaps før kryonisk bevaring. Den mest lovende fremtidsperspektiv er ikke-invasiv analyse av IVF kulturen Media etter blastocyst kultur som en antatte kilde til embryonale DNA. Imidlertid er dette potensialet avant-garde fortsatt under etterforskning og en pålitelig protokoll ennå må defineres og validert.
Introduction
Hovedmålet med moderne menneskelig embryologi er å maksimere antall levende fødsler per stimulert syklus og redusere kostnader, tid og innsats for å oppnå en graviditet. For å oppnå dette målet bør det benyttes validerte tilnærminger for embryo-valg for å identifisere reproductively kompetente embryo i en kohort som oppnås under en IVF-syklus. Ifølge de siste bevisene, blastocyst kultur1 kombinert med omfattende kromosom testing og vitrified euploid embryo Transfer (et) er det mest effektive rammeverket for å øke IVF effektivitet2. Åpenbart krever avvik testing en embryonale prøven, som i dag er mest representert fra noen få celler Hentet fra trophectoderm (TE), dvs., den delen av blastocyst som gir opphav til embryo vedlegg (f. eks morkaken) under graviditet . Utover Karyotype analyse, kan også enkelt genmutasjoner vurderes fra en TE biopsi som en del av en klinisk strategi kjent som Preimplantation genetisk testing (PGT;-A for aneuploidies,-SR for strukturelle kromosom rearrangements,-M for monogenic sykdommer). Andre oocyte/embryo biopsi metoder har blitt theorized og vedtatt klinisk over de siste ti årene, nemlig Polar organer biopsi og blastomere biopsi. Imidlertid er bruken redusert i dag siden deres prosessuelle ulemper (f. eks høyere arbeidsmengde og risiko for reproduktiv effekt) og diagnostiske begrensninger (f. eks, enkelt celle analyseproblemer) implisitt hindrer en tilstrekkelig balanse mellom kostnader, risiko og fordeler (for en gjennomgang se3).
I denne utredningen er en av de viktigste protokollene for TE biopsi grundig beskrevet sammen med de påfølgende vitrifikasjon, oppvarming og overføring prosedyrer som kreves. Arbeidsflyten her skissert er ideell for en travel PGT enhet.
Som allerede beskrevet tidligere av vår gruppe4,5, prosedyren innebærer sekvensiell åpning av Zona pellucida av fullt utvidet blastocysts og fjerning av få te celler (i gjennomsnitt 7-8). Sammenlignet med dag 3 laser-assistert klekking-baserte blastocyst biopsi metode6, denne prosedyren kan lette den daglige planen for en IVF enhet hvor delikate prosedyrer, for eksempel blastocyst biopsi og vitrifikasjon, må være betimelig utført. Så snart blastocyst når sin fulle ekspansjon, kan biopsi utføres ved å velge TE cellene å fjerne, og dermed hindre risikoen for herniation av den indre celle massen (ICM), som ellers ville gjøre prosedyren utfordrende. I litteraturen, en tredje protokoll av blastocyst biopsi er også beskrevet, som innebærer laser-assistert klekking utføres når fosteret har allerede nådd blastocyst scenen, noen timer før prosedyren5,7. Denne tilnærmingen er imidlertid mer tidkrevende og passer hovedsakelig IVF-enheter som implementerer TE biopsi i hendene på limitedly erfarne operatører og i lys av en moderat lav daglig arbeidsbelastning.
Intracytoplasmatic sperm injeksjon (ICSI)8 bør være en konsolidert teknikk hvis sikte på å gjennomføre genetiske analyser i IVF. Tilsvarende er en skikkelig kultur system trygt høste embryo til blastocyst scenen er avgjørende for gjennomføringen av TE biopsi strategi. Et tilstrekkelig antall inkubatorer, samt bruk av lav oksygen spenning er viktige forutsetninger for dette formål, for ikke å kompromittere blastocyst rate9. Samtidig er et effektivt kryonisk bevaring-program nødvendig for å administrere en PGT-syklus på en sikker måte. I det siste tiåret, har gjennomføringen av vitrifikasjon økt embryo fryse overlevelse selv opp til > 99%10,11. Dette ga tilstrekkelig tid til å utføre genetisk testing og utsette embryo overføring til følgende menstruasjonssyklus, på en ikke-stimulert og sannsynligvis mer mottakelig endometrium12.
Både TE biopsi og vitrifikasjon er krevende oppgaver som krever strenge ferdigheter og deres effektivitet kan variere mellom uerfarne operatører. En spesifikk opplæringsperiode er derfor til orde for at hver operatør skal kunne utføre disse prosedyrene klinisk; Videre bør vedlikehold av operatørens ferdigheter vurderes periodisk ved å overvåke viktige ytelsesindikatorer (KPI) for kryonisk bevaring og biopsi prosedyrer. Hver IVF klinikk bør sette interne KPIer til dette formål, som må omtrentlige de som er publisert av internasjonale konsortier og/eller resultatene publisert av referanselaboratorier.
TE biopsi, vitrifikasjon-oppvarming og vitne prosedyrer er validert teknikker på vår enhet, som er standardisert på tvers av alle operatørene er involvert som rapportert i tre tidligere publikasjoner11,13,14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen for menneskelig blastocyst biopsi, her beskrevet, følger retningslinjene for G. EN. E.R.A. Human Research ethic Committee.
Merk: Se Material fortegnelsen for nødvendige materialer. Ytterligere materiale som kreves innebærer laboratorie fottøy og antrekk, kirurgiske ansiktsmaske, hår deksel, kirurgiske hansker, en permanent ikke-giftig markør, tang og desinfeksjonsmiddel. Bruk av kirurgisk kappe, disponibel kirurgisk hansker, ansiktsmaske, hår deksel er obligatorisk for å forebygge risiko for forurensning. Alle arbeidsområder, samt utstyr som er involvert i prosessen, må rengjøres grundig med laboratorie desinfeksjonsmiddel (f. eks, Oosafe) før du starter en prosedyre. Alle forbruksvarer og medier som brukes, bør være sterile og individuelt pakket eller aliquoted. Det foreslås å bruke en dedikert arbeidsstasjon for biopsi og slanger og begrense tilgangen av området bare til operatørene som er involvert i prosedyren (embryologist og vitne).
1. forberedelse på dagen før biopsi prosedyre
-
Forbered innlegget biopsi kultur parabolen.
- Plasser 6 dråper 20 μL IVF kultur medium (tabell av materialer) i en IVF kultur parabol og overlegg med 6 ml prewarmed mineralolje for embryo kultur (tabell over materialer).
- Tilsett ytterligere 10 μL av IVF kultur medium til hver dråpe. Ruge over natten ved 37 ° c i en kontrollert atmosfære (5% O2, 6% co2).
-
Forbered en IVF parabolen 4-brønn plate for skylling av blastocyst etter biopsi.
- Plasser 600 μL av IVF kultur medium i de to første brønnene og overlapp med 300 μL av forvarmet mineralolje for embryo kultur.
- Ruge over natten ved 37 ° c i en kontrollert atmosfære (5% O2, 6% co2).
- Dispensere 1,5 μL av laste løsning (tabell over materialer) i hvert PCR-rør som skal brukes til te celle rør, snurre den og holde den ved 4 ° c.
2. forberedelse på dagen av biopsi prosedyre
-
Forbered biopsi parabolen.
- Plasser 3 dråper 10 μL HEPES-medium (supplert med humant serum albumin) (tabell av materialer) på rad i en IVF kultur parabolen.
- Gjenta trinn 1.1.1 i henhold til antall tilgjengelige blastocysts (opptil 4 blastocysts per fat) og overlapping med 6 mL pre-varmet mineralolje for embryo kultur.
- Ruge fatet ved 37 ° c i minst 1 time før du utfører biopsi prosedyren.
3. blastocyst utvalg og gradering
-
Vurder blastocyst i henhold til dens ekspansjon og morfologiske utseende av ICM og TE (figur 1).
Merk: vurderingskriteriene er tilpasset fra Gardner og Schoolcraft15 og tidligere beskrevet av Capalbo et al. og Cimadomo et al.4,11.- Definer størrelse og ekspansjon karakter som: A for en fullt klekket blastocyst, B for en klekking blastocyst, C for en fullt utvidet blastocyst, og D for en ikke utvidet blastocyst (disse embryo er biopsied bare hvis de ikke utvides ytterligere opp til dag 7).
- Definer ICM-grad: 1 for merkbar ICM med flere strengt pakkede celler. 2 for merkes med flere, men grovt-pakket celler; 3 for vanskelig å skille med svært få lav kvalitet celler.
- Definer TE klasse som følger: 1 for godt organisert epitel med flere celler; 2 for løs epitel med få celler; 3 for få og/eller store celler med lav kvalitet.
4. Trophectoderm biopsi
- Utfør TE biopsi på alle levedyktige fullt utvidet blastocysts (fortrinnsvis C klasse for størrelse og ekspansjon).
- Sett Holding og biopsi Pipetter for hver biopsi prosedyre. Anbefalingene for biopsi pipette er følgende: 30 μm intern diameter, 35 ° vinkel, 0,75 mm avstand spissen for å bøye.
- Label biopsi parabolen med pasientens detaljer (kvinnens navn og etter navn, fødselsdato og ID) og deretter nummer hver dråpe med embryo og syklus IDer. Bruk en permanent ikke-giftig markør.
- Overfør blastocyst med en 300 μm stripping pipette til den første dråpe av biopsi parabolen og skyll den for å fjerne det overskytende av kultur medium. Deretter flytter blastocyst i den andre dråpe av biopsi parabolen.
- Flytt parabolen til den omvendte mikroskop og Prime biopsi pipette aspirating noen medium fra den tredje dråpe av biopsi parabolen.
- Ved 20x forstørrelse, orientere blastocyst å ha en klar visning av ICM. Når det er visualisere ved 7 o ' Clock (motsatt av området som vil bli målrettet for å fjerne TE celler), sikre fosteret på holde pipette (figur 2a).
- Fokuser på de Zona pellucida og konstatere at både Pipetter og blastocyst er på samme fokal plan.
- Bytt til laser målet (puls tid 0,3 MS, 6,5 μm) og plasser laser pekeren på den Zona pellucida på motsatt side av ICM. Bor de Zona pellucida gjennom 2 − 3 laser pulser (figur 2b).
- Trykk forsiktig på biopsi pipette mot Zona pellucida og blåse noe medium gjennom bruddet for å løsne TE cellene fra den interne overflaten og fremskynde blastocyst kollaps (figur 2C).
- Når te er løsrevet (figur 2D), gå inn gjennom hullet (om nødvendig, gjør det bredere med en siste laser puls) og aspirer få te celler (ideelt 7 − 813,16) i biopsi pipette med skånsom sug (figur 2e).
- Litt flytte biopsi pipette bakover mens du bruker en moderat sug å strekke målcellene (figur 2F).
- Rett laseren mot den tynneste delen av de pustende cellene og skyt 2 − 5 laser pulser ved veikryss mellom cellene for å skille målcellene fra kroppen til fosteret (figur 2g). Tidspunktet for laser pulser og antall pulser kan justeres i henhold til kvaliteten på blastocyst; Prøv imidlertid å minimere dem for å unngå cellelyse.
- Etter separasjon av TE fragment fra blastocyst (figur 2h), slipp den inn i samme biopsi fall langt fra blastocyst. Dette er nødvendig for å hindre dem fra å bli sugd igjen inn i biopsi pipette (figur 2i).
- Løsne blastocyst fra holde pipette og raskt heve begge Pipetter for å hindre at fragmentet stikker til dem.
- Ta et bilde av biopsied fragment for kvalitetskontroll formål (Figur 3).
Merk: Hvis mer enn en enkelt blastocyst skal biopsied per prosedyre (opptil fire per biopsi parabol), endre biopsi pipette med en ny for å hindre krysskontaminering mellom embryo. - Gjenta trinn 4.1 − 4.13.
- Flytt biopsi parabolen tilbake til laminær Flow panseret.
- Label post-biopsi kultur parabolen med paret ID, og hver dråpe med fosteret og syklusen ID.
- I nærvær av et vitne, skyll blastocyst i ren IVF medium, og til slutt flytte den til tilsvarende dråpe av post-biopsi parabolen.
- Flytt etter biopsi parabolen til inkubator i en kontrollert atmosfære (37 ° c, 6% CO2, 5% O2) til vitrifikasjon. Det er tilrådelig å utføre vitrifikasjon innen 30 min fra biopsi prosedyren, for å hindre blastocyst re-ekspansjon.
5. slange
Merk: Hele prosedyren må utføres i nærvær av et vitne og inne i laminær Flow panseret ved romtemperatur. Under prosedyren, holde PCR-rør i et kaldt rør rack på isen (supplerende figur 1).
- Merk PCR-rørene med en permanent ikke-giftig markør.
Merk: Merkingen bør utføres som forespurt av genetisk laboratorium. Vanligvis, pasientens navn og etter navn (initialer), par ID, embryo og syklus ID (for eksempel: JD 12345 1,2 for fosteret N. 1 av 2dre syklus som tilhører Jane Doe som par ID er 12345). Embryo ID skal rapporteres også i bokstaver på kroppen av røret. - Merk lokket på en 60 mm x 15 mm kultur rett (slange rett) med biopsied Foster IDer (supplerende figur 1) og Forbered 2 10 μL dråper biopsi vaskeløsning (tabell av materialer) i den.
- Prime den 140 μm stripping pipette (supplerende figur 1) med noen biopsi vaskeløsning fra den andre dråpe av slangen parabolen.
- Plasser biopsi parabolen under stereomikroskopet å lett visualisere TE fragment (s).
- Løsne forsiktig noen biopsi vaskeløsning på TE fragment; deretter laste den inn i Stripping pipette.
- Flytt TE-fragmentet til den andre dråpe biopsi vaskeløsningen i slange fatet og skyll den forsiktig 2 − 3 ganger.
- Overfør TE-fragmentet til bunnen av PCR-røret (tidligere merket etter det) med laste løsning, og pass på å unngå å berøre veggene med tuppen av stripping pipette.
- Gjenta prosedyren fra trinn 5,3 til trinn 5,7 for hvert TE-fragment, og Vær oppmerksom på å bruke en ny kapillær for hvert TE-fragment.
- På slutten av slangen prosedyren, Legg alle PCR rør i en mini sentrifuge, og spinne dem i noen sekunder.
- Oppbevar prøvene ved-20 ° c til forsendelse til det henvisende genetiske laboratoriet for testing.
6. blastocyst vitrifikasjon
- Vitrify kollapset blastocysts innen 30 min fra TE biopsi for å hindre deres re-ekspansjon.
- Merk vitrifikasjon platen med kvinnens detaljer og ID-ene til blastocysts som må vitrified.
- Label vitrifikasjon støtte (r) med kvinnens navn og etter navn, par ID, ID av fosteret som vil bli lastet på den, samt dato for prosedyren. Spesielle cryolabels brukes som bevarer sin integritet selv ved svært lav temperatur (-196 ° c).
- Ved romtemperatur, dispensere 0,3 mL likevekts oppløsning (ES) (tabell av materialer) for hver blastocyst som skal vitrified.
- I nærvær av et vitne, flytte blastocyst i ES ved hjelp av 300 μm stripping pipette.
- La blastocyst i ES i 13 − 15 min. Etter en første krymping av volumet, en gradvis re-ekspansjon vil bli observert.
- Fyll et lite kjøle stativ med flytende nitrogen (LN2) og plasser det under laminær strømnings hette.
- Dispensere 300 μL av vitrifikasjon oppløsning (VS) (tabell av materialer) i den andre brønnen. Etter blastocyst fullføre re-ekspansjon, overføre den i VS løsningen i 1 min og skyll den for å fortynne ES.
- Inne tilstedeværelse av en vitne, belaste det blastocyst på vitrifikasjon oppbacking og ta vare på fjerner det overskytende av VS. En subtil film av løsningen skal omgi blastocyst.
- Senk vitrifikasjon støtten inn i LN2 og beveg den energisk for å redusere risikoen for boble dannelse i nærheten av prøven.
- Plasser beskyttelseslokket mens vitrifikasjon støtte senkes i LN2.
- I nærvær av et vitne, flytte vitrifikasjon støtte i en lang sikt LN2 lagringstanken.
7. kunstig krymping av ikke-biopsied blastocysts
-
Hvis ingen biopsi er utført, kunstig kollaps blastocysts umiddelbart før vitrifikasjon (Figur 4).
- Flytt kulturen parabolen fra inkubator til invertert mikroskop og fokus på den valgte embryo.
- Bytt til laser målet (forhåndsinnstilt puls: 0,3 MS, 6,5 μm), Målrett mot Zona-pellucida på motsatt side av ICM, og deretter direkte 1 – 2 Laser pulser til veikryss mellom TE-celler på trygg avstand fra ICM. Blastocysts skal kollapse på mindre enn 5 min.
- Fortsett med vitrifikasjon av de skjulte blastocyst som beskrevet i avsnitt 6.
8. overførbar blastocyst oppvarming
- På dagen for ET, forberede ET 4-brønn plate ved å plassere 600 μL av pre-equilibrated IVF kultur medium for hver brønn. Ruge ved 37 ° c i en kontrollert atmosfære (5% O2, 6% co2), mens du utfører blastocyst oppvarming.
- Label oppvarmingen parabolen med kvinnens navn og etter navn, par ID, ID av fosteret som vil bli varmet i den.
- Dispensere 1 mL av tine-oppløsningen (TS) (tabell av materialer) i en IVF én brønn rett (supplerende figur 1) og varm den til 37 ° c i en termostat i minst 1 time før prosedyren startes.
- Fyll en liten kjøle støtte med LN2 og plasser den i laminær strømnings hette i umiddelbar nærhet av arbeidsområdet.
- Før du starter prosedyren, sjekk blastocyst informasjon rapportert på vitrifikasjon støtte. Alle ID-ene skal samsvare med den genetiske rapporten, og blastocyst til varme må velges blant de overførbare. Et vitne kreves under inngrepet.
- Ta en-brønn parabolen inneholder varmet TS ut av termostaten og plassere den på et oppvarmet stadium under stereomikroskopet.
- Dra over beskyttelseslokket i LN2 med tang.
- Kast raskt spissen på vitrifikasjon støtte i 37 ° c TS.
- Under mikroskopisk observasjon, Flytt forsiktig vitrifikasjon støtte til blastocyst slippes ut fra spissen.
- La blastocyst for totalt 1 min i TS, betaler oppmerksomhet for å holde den på bunnen av TS.
- Ved romtemperatur dispensere 200 μL av fortynning oppløsning (DS) (tabell av materialer) på den første brønnen på vitrifikasjon plate.
- Overfør blastocyst til DS og plassere den på bunnen av brønnen mens slippe noen TS på toppen av det å lage en slags gradient. La den stå i 3 minutter.
- Dispensere 200 μL av vaskeløsning (WS) i 2 forskjellige brønner (WS1 og WS2).
- Overfør blastocyst til WS1 og plasser den på bunnen av brønnen mens slippe noen DS medium på toppen av det. Deretter overfører du blastocyst til WS2 og lar den stå uforstyrret i 1 min.
- Label den post-oppvarming ET plate med kvinnens navn og etter navn, par ID, ID på embryo som vil bli kultivert i den.
- I nærvær av et vitne, overføre varmet blastocyst til pre-equilibrated kultur medium i post-oppvarmingen ET plate.
- Skyll blastocyst i den første brønnen på ET-platen og plasser den i den andre brønnen.
- Overfør den post-oppvarming kultur parabolen til inkubator i en kontrollert atmosfære (37 ° c, 6% CO2,5% O2) og kultur blastocyst i minst 1,5 timer før du sjekker sin overlevelse og re-ekspansjon.
Merk: Figur 5 viser eksempler på utartet, fryse-overlevde, men ikke re-utvidet og fryse-overlevde og fullt utvidet blastocysts.
9. EmbryoTransfer
- For å utføre ET, plasserer parabolen på den oppvarmede fasen av laminær Flow hette, slik at fosteret er synlig under mikroskopet på en lav forstørrelse.
- Ta ca 0,4 mL av IVF kultur medium. Fest sprøytespissen godt inn i mottaks enden av det interne kateteret, og slipp deretter mediet opp til 0,1 mL.
- Aspirer kultur medium inntil observere embryo inn kateteret (minimal mengde medier: 10 − 15 μL).
- Plasser kateteret i plast etuiet og gå til operasjonsstuen og plasser det interne kateteret inn i den eksterne føreren.
- Når du har nådd livmoren, skyver du sprøytestempelet for å frigjøre fosteret (ene). Frigjør veldig langsomt mediet til stempelet leser 0,1 mL.
- Ta kateteret tilbake til laboratoriet og sjekk under mikroskopet at fosteret er overført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6 representerer en ordning av alle resultatene av en biopsi prosedyre som kan vedtas for å standardisere protokollen og overvåke ytelsen til hver operatør. De viktigste prosessuelle utfallet er tidspunktet for å fullføre biopsi/biopsier; de viktigste tekniske utfallet er kvaliteten på plottet produsert etter genetisk testing som kan resultere i enten en avgjørende eller ufullstendig diagnose, sistnevnte som krever en re-biopsi av udiagnostisert blastocyst; de viktigste biologiske utfallet er frekvensen av fryse-overlevelse og re-ekspansjon versus degenerasjon etter oppvarming; Endelig, det viktigste kliniske utfallet er den levende fødselsrate etter vitrified-varmet blastocyst overføring. I tre tidligere studier rapporterte vi KPI-ene som er definert i senteret (e) for tekniske, biologiske og kliniske utfall11,13,16. Heretter, vi i stedet rapportere hvordan KPI for tidspunktet for biopsi ble definert. Videre ble antatte påvirkning av timingen mellom biopsi og vitrifikasjon på den post-varmende atferden til euploid blastocysts også undersøkt.
I en 2 års periode, totalt 1 544 trophectoderm biopsi prosedyrer ble utført av 7 operatører (tabell 1). Alle biopsied blastocysts ble deretter flyttet tilbake til inkubator i en post-biopsi kultur parabolen før vitrifikasjon. Alle relevante data ble samlet i en relasjonsdatabase. Alle tidsberegninger av biopsi og mellom biopsi og vitrifikasjon ble ettertid innhentet fra programvaren til IVF elektronisk vitne system. Dataene ble deretter eksportert og analysert for statistikk.
Den fryse-overlevelse rate av euploid blastocysts etter trophectoderm biopsi og vitrifikasjon-oppvarmingen var N = 571/572, 99,8%. Den re-ekspansjon rate på 1,5 h etter oppvarmingen var N = 556/571, 97,4%. Blant de 15 ikke re-utvidet blastocysts, en resulterte i en levende fødsel etter å ha blitt overført i Utero. Den levende fødselsrate etter vitrified-varmet euploid enkelt blastocyst overføring var N = 227/572, 39,7%.
Definisjon av den ideelle timing av biopsi
Tabell 1 oppsummerer relevante data av biopsi prosedyrene utført. Totalt sett var 1,89 ± 1,03 (Range 1-4) blastocysts biopsied per prosedyre i 8,24 ± 4,23 min (rekkevidde 3-22). Gjennomsnittlig timing av biopsi varierte på grunn av både antall blastocysts biopsied per prosedyre, fra et minimum av 5,78 ± 2,94 min (rekkevidde 3-16) når bare ett embryo ble lagt i fatet til maksimalt 12,93 ± 4,43 min (rekkevidde 6-22) når embryo sekvensielt biopsied vi Re 4. En annen relevant parameter var operatøren involvert i prosedyren: den mest ekspert (N = 443 prosedyrer) var den raskeste (7,41 ± 3,6 min, rekkevidde 3-22), mens den minst erfarne (N = 42) var den tregeste (14,19 ± 4,24 min, rekkevidde 6-22). Faktisk, en generalisert lineær modell innebærer både "antall blastocysts biopsied per prosedyre" og "operatør" variabler perfekt forklarer "timing av biopsi" med en R2 = 0,48 og en makt = 1. Denne analysen var nyttig å definere at ideelt sett ~ 6 min er nok for en blastocyst biopsi prosedyre når bare et embryo legges i fatet, mens ~ 9 min, ~ 12 min og ~ 13 min for 2, 3 og 4 blastocysts, henholdsvis. Klart, innebærer hele prosedyren også flytte embryo fra kulturen til biopsi parabolen og fra sistnevnte til post-biopsi kultur parabolen etter inngrepet, samt endre biopsi pipette mellom sekvensiell biopsier.
Figur 7 tomter gjennomsnittlig timing av biopsi for hver operatør langs studien trimester (fra 1St til 8th). Den prikkete røde linjen identifiserer gjennomsnittlig total verdi på 8,24 min. En slik graf er nyttig å overvåke gjennomsnittlig ytelse for hver utøver. For eksempel viste de mest erfarne operatørene (1 og 2) en konstant reduksjon av denne timingen, noe som tyder på en trend som er typisk for en læringskurve. Alle operatørene fra 3 til 6 var i stedet tilstrekkelig konstant i sin opptreden rundt gjennomsnittet samlede verdien over trimester. Anytime de viste en topp i middelverdien fra en gitt trimester (f. eks operatør 3 i 7th trimester, operatør 4 i 6th trimester, operatør 5 i 3Rd trimester), ble de advart for å revidere sine resultater. Operatør 7 (dvs. den minst erfarne) viste timing typisk for en embryologist som nettopp har avsluttet sin trening. Muligens, han/hun vil møte standardene interne til laboratoriet som kompetanse vil øke.
Viktigere var tidspunktet for biopsi lignende på nytt utvidet og ikke re-utvidet euploid blastocysts på 1,5 h fra oppvarmingen (9,52 ± 4,23 min, rekkevidde 3-22 versus 10,5 ± 5,68 min, rekkevidde 4-22; t-test = 0,37). Sannsynlige, implantert (N = 229) og ikke implantert (N = 343) vitrified-varmet euploid blastocysts viste også sammenlignbare biopsi tidsberegninger (9,77 ± 4,15 min, rekkevidde 3-22 versus 9,41 ± 4,36 min, rekkevidde 3-22; t-test = 0,39). Muligens da, en timing ≤ 22 min til biopsi opp til 4 blastocysts påvirker ikke embryo atferd etter oppvarming. Derfor har vi definert denne verdien som maksimal terskel.
Tilsvarende ble ingen forskjell vist i form av Live fødselsrate på tvers av ulike biopsi operatører, som allerede rapportert tidligere13 (supplerende tabell 1).
En annen viktig parameter for å overvåke hver operatørens ytelse er frekvensen av mangelfulle resultater etter diagnose, som bør være så nær som mulig til den generelle ytelsen til hvert laboratorium. Ideelt denne prisen bør ikke overstige 2,5% og kan reduseres med tiden på grunn av en økende kompetanse i biopsi og slange prosedyrer16. Målet antall te celler å hente er 7-8 i henhold til to tidligere studier13,16. For dette formålet, er det foreslått å ta et bilde av biopsied fragment for kvalitetskontroll formål (se noen eksempler i Figur 3). Et slikt bilde kan bli sjekket i tilfelle av mangelfulle diagnoser for å vurdere om årsaken var imputable til dimensjonen/kvaliteten av fragmentet (dvs. lav kvalitet på molekyl analyse), til slangen (dvs. feil ved DNA-forsterkning) eller noen problemer i behandlingen av prøven i det genetiske laboratoriet.
Definisjon av den ideelle timingen mellom biopsi og vitrifikasjon
I studieperioden ble 572 euploid blastocysts varmet opp til å gjennomgå et embryo overføring etter en diagnose av euploidy. Figur 8a viser hver varmet blastocyst som en svart sirkel fordelt over den økende timingen mellom biopsi og vitrifikasjon og gruppert i to grupper i henhold til utfallet under etterforskning: re-utvidet eller ikke re-utvidet innen 1,5 h fra Oppvarming. Alle blastocysts (N = 117/117) vitrified innen 30 min, 97,6% (N = 245/251) av blastocysts vitrified mellom 31-90 min, og 95,1% (N = 194/204) av blastocysts vitrified utover 90 min re-utvidet, henholdsvis (ingen re-utvidelse priser: 0%, 2,4% og 4,9%). Derfor setter vi 30 min og 90 min som tidlig og sent terskler av tid mellom biopsi og vitrifikasjon.
Figur 8B viser re-Utvidelses raten i de tre gruppene (≤ 30 min, 31-90 min, > 90 min) ytterligere sub-gruppert i henhold til blastocyst kvalitet og dag for Preimplantation utvikling. Spesielt for dårlig kvalitet og/eller dag 7 blastocysts, timingen mellom biopsi og vitrifikasjon synes avgjørende for å oppnå re-ekspansjon etter oppvarming. Nærmere bestemt, oddsen-ratio av re-ekspansjon etter oppvarmingen korrigert for både blastocyst kvalitet og dag av biopsi i blastocysts vitrified innen 30 min fra biopsi versus blastocysts vitrified utover 90 min var 3,05 (95% CI 1.01-9.4, p = 0,05). I stedet representerte perioden mellom disse to terskler (31-90 min) et grått område som kanskje eller kanskje ikke har en innvirkning.
Bare 1 av 15 ikke re-utvidet blastocysts resulterte i en levende fødsel etter overføring. Derfor, vi endelig undersøkt Live fødselsrate oppnås etter varmet euploid enkelt blastocyst overføring gruppert i de tre gruppene i henhold til timingen mellom biopsi og vitrifikasjon. Den høyeste Live fødselsraten ble oppnådd ved å overføre euploid blastocysts vitrified ≤ 30 min fra trophectoderm biopsi (N = 56/117, 47,9%). Imidlertid nådde ikke dette resultatet statistisk betydning sammenlignet med det samme resultatet oppnådd enten med blastocysts vitrified mellom 31 og 90 min (N = 92/251, 36,7%; Fisher ' s eksakt test = 0,06), eller med blastocysts vitrified > 90 min fra biopsi (N = 81/204, 39,7%; Fisher ' s eksakt test = 0,16). Derfor er enten en negativ effekt på blastocyst reproduktiv kompetanse ubetydelig eller utvalgsstørrelsen i dette datasettet (N = 572) var utilstrekkelig for å oppnå statistisk betydning.
Figur 1: parametre for blastocyst gradering. Ekspansjon: (A) fullt klekket, (B) i klekking, (C) fullt utvidet, og (D) ikke utvidet. Den ideelle scenen er C, mens en blastocyst D bør gis mer tid til å oppnå full ekspansjon, med mindre dette stadiet er nådd i dag 7; Indre cellemasse (ICM) morfologiske kvalitet: 1 (merkbar med flere strengt pakket celler), 2 (merkes med flere, men grovt pakket celler) og 3 (vanskelig å skille med svært få lav kvalitet celler); trophectoderm (te) morfologiske kvalitet: 1 (godt organisert epitel med flere celler), 2 (løs epitel med få celler) og 3 (få og/eller store lav kvalitet celler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: oppsummering av sekvensiell Zona pellucida (ZP) åpning og trophectoderm (te) celler henting tilnærming for blastocyst biopsi. (a) orientere blastocyst med den indre celle MASSEN (ICM) nær holde pipette og langt fra stedet der de valgte te cellene vil bli hentet. Fest blastocyst på holde pipette; (b) åpne ZP gjennom 2-3 laser Shots; (c) blåse noen kultur medier gjennom hullet; (d) blastocyst vil LØSNE fra ZP; (e) Skriv inn ZP og Suck 5-10 te celler i biopsi pipette; (f) gå baklengs med biopsi pipette å strekke det valgte fragment og eksponere veikryss mellom cellene; (g) brann ved veikryss mellom cellene og fortsette å strekke FRAGMENTET til te cellene slippes fra kroppen av blastocyst; (h) BLASTOCYST etter te biopsi er kollapset; (i) ta et bilde av biopsi fragment for kvalitetskontroll og overføre den til PCR tube som vil bli sendt til genetisk laboratorium. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: eksempler på biopsi fragmenter: (a-c) ønskelig fragmenter; (d) lysert fragment; (e) lite fragment med utartet celler; (f) liten, delvis lysert og utartet fragment. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: kunstig krymping. (a) orientere blastocyst slik at den indre celle MASSEN (ICM) er langt fra den målrettede delen av TROPHECTODERM (te); (b) brann 2-3 laser skudd på rad ved veikryss mellom te celler og flytte utover; (c) vent på at blastocyst skal kollapse før den starter vitrifikasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: eksempler på blastocyst degenerasjon (a), fryse-overlevelse, men ingen re-ekspansjon (b) og fryse-overlevelse og full re-ekspansjon (c) 1,5 h post-oppvarming. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: oppsummering av de ulike resultatene av trophectoderm biopsi som kan brukes til å overvåke ytelsen til en operatør og definere de viktigste prestasjons indikatorene internt til hvert laboratorium. De viktigste prosessuelle utfallet er tidspunktet for biopsi. De viktigste tekniske utfallet er frekvensen av avgjørende (euploid eller aneuploid) og mangelfulle diagnoser (re-biopsi kreves) innhentet; sistnevnte kan være forårsaket av DNA forsterkning eller lav kvalitet molekylære data, både resulterer i ikke-interpretable kromosom kopiere nummer profil tomter. Den viktigste biologiske utfallet er frekvensen av fryse-overlevelse og re-ekspansjon eller degenerasjon etter biopsi, vitrifikasjon og oppvarming. De viktigste kliniske utfallet er frekvensen av levende fødsler eller negative graviditet utfall oppnås etter vitrified-varmet blastocyst overføring. Av notatet, mens den prosessuelle utfallet er utelukkende avhengig av operatøren og antall blastocysts til biopsi per prosedyre, kan alle andre utfall påvirkes av andre confounders uavhengig av biopsi operatøren (f. eks, trinnene og operatører involvert i den molekylære analysen, den morfologiske kvaliteten på blastocyst, dagen for biopsi) som bør regnskapsføres til riktig evaluere sin ytelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: gjennomsnittlig timing av biopsi per operatør på tvers av 8 studie trimester. Tabellen oppsummerer det relaterte antall prosedyrer og gjennomsnittlig antall blastocysts biopsied per prosedyre av hver operatør i 8 studien trimester. Den prikkete røde linjen i hver graf representerer den samlede gjennomsnittlige timingen av biopsi (8,24 min). Feil stolpene er standardavvikene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: re-ekspansjon etter oppvarming kontra timing mellom biopsi og vitrifikasjon. (A) viser ikke re-utvidet og re-utvidet blastocysts 1,5 HR etter oppvarmingen. Hver blastocyst representeres av en svart sirkel over den økende tidsberegningen. Den vertikale kontinuerlig svarte linjer representerer 30 min satt som tidlig terskel og 90 min satt som sen terskel. (B) viser re-ekspansjon priser i de tre gruppene (timing mellom biopsi og vitrifikasjon: ≤ 30 min, 31-90 min, > 90 min) videre gruppert i henhold til blastocyst kvalitet og dag med biopsi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| N av prosedyrer | N blastocysts biopsied per prosedyre | Gjennomsnittlig timing av biopsi ± SD, rekkevidde (min) | |
| Operatør 1 | 443 | 2,01 ± 1,09, 1-4 | 7,41 ± 3,6, 3-22 |
| 195 | 1 | 4,75 ± 1,96, 3-16 | |
| 111 | 2 | 7,83 ± 2,45, 3-18 | |
| 71 | 3 | 10,27 ± 2,41, 4-16 | |
| 66 | 4 | 11,48 ± 3,81, 6-22 | |
| Operatør 2 | 290 | 1,81 ± 0,98, 1-4 | 7,87 ± 4,13, 3-22 |
| 142 | 1 | 5,69 ± 3,32, 3-16 | |
| 89 | 2 | 8,48 ± 2,79, 3-18 | |
| 30 | 3 | 11,37 ± 3,72, 4-20 | |
| 29 | 4 | 13,1 ± 3,89, 9-22 | |
| Operatør 3 | 287 | 1,98 ± 1,05, 1-4 | 9,10 ± 4,65, 3-22 |
| 121 | 1 | 6 ± 2,19, 3-15 | |
| 89 | 2 | 9,6 ± 3,87, 3-22 | |
| 38 | 3 | 12,66 ± 4,55, 4-22 | |
| 39 | 4 | 14,13 ± 4,8, 6-22 | |
| Operatør 4 | 217 | 1,66 ± 0,87, 1-4 | 7,58 ± 3,45, 3-22 |
| 118 | 1 | 5,58 ± 1,96, 3-14 | |
| 66 | 2 | 8,92 ± 2,91, 4-22 | |
| 21 | 3 | 11,48 ± 2,34, 5-16 | |
| 12 | 4 | 13 ± 4,26, 6-19 | |
| Operatør 5 | 144 | 2,03 ± 1,08, 1-4 | 9,43 ± 4,24, 3-22 |
| 59 | 1 | 6,15 ± 2,5, 3-16 | |
| 43 | 2 | 10,07 ± 2,73, 6-16 | |
| 20 | 3 | 12,6 ± 2,89, 9-18 | |
| 22 | 4 | 14,09 ± 4,43, 6-22 | |
| Operatør 6 | 121 | 1,67 ± 0,94, 1-4 | 7,79 ± 3,93, 3-22 |
| 70 | 1 | 6,19 ± 2,95, 3-16 | |
| 32 | 2 | 8,12 ± 1,72, 3-11 | |
| 9 | 3 | 12,78 ± 3,31, 9-18 | |
| 10 | 4 | 13,5 ± 6,19, 6-22 | |
| Operatør 7 | 42 | 1,62 ± 0,94, 1-4 | 14,19 ± 4,24, 6-22 |
| 27 | 1 | 11,85 ± 5,53, 6-16 | |
| 6 | 2 | 16,5 ± 3,73, 11-22 | |
| 7 | 3 | 19,86 ± 3,34, 13-22 | |
| 2 | 4 | 19 ± 4,24, 16-22 | |
| Totalt | 1544 | 1,89 ± 1,03, 1-4 | 8,24 ± 4,23, 3-22 |
| 732 | 1 | 5,78 ± 2,94, 3-16 | |
| 436 | 2 | 8,85 ± 3,14, 3-22 | |
| 196 | 3 | 11,72 ± 3,70, 4-22 | |
| 180 | 4 | 12,93 ± 4,43, 6-22 |
Tabell 1: Total gjennomsnittlig timing av biopsi og gjennomsnittlig antall blastocysts biopsied i hver prosedyre i henhold til biopsi operatør. Gjennomsnittlig timing av biopsi er også vist i henhold til hvert sekvensielle antall blastocysts biopsied per prosedyre. En generalisert lineær modell som inkluderer både "biopsi operatør" og "antall blastocysts biopsied per prosedyre" variabler perfekt samsvarer med "timing av biopsi" (R2 = 0,48, Power = 1).
Supplerende figur 1: hovedenheter og støtter kreves for prosedyren. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Logistikk regresjonsanalyse viser ikke noen signifikant forbindelse mellom biopsi operatøren og leve fødselen etter vitrified-varmet euploid blastocyst overføring. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bare godt erfarne dyktige embryologer som har fullført treningsperioden, skal utføre både TE-biopsi og blastocyst vitrifikasjon. Videre er et vitne kreves for å overvåke prosedyrer og garantere en effektiv sporbarhet under i) bevegelsene til biopsied blastocyst fra biopsi parabolen (supplerende figur 1) til post-biopsi parabolen (supplerende figur 1 ), deretter til vitrifikasjon plate (supplerende figur 1) og til slutt til vitrifikasjon støtte (supplerende figur 1); II) overføring av biopsied TE celler fra biopsi parabolen til PCR røret (supplerende figur 1); III) oppvarmingen og overføringstrinnene etter diagnosen. For en detaljert beskrivelse av alle vitne trinn referere til en feil moduser og effekter analyse (FMEA) tidligere utgitt14.
Alle metodene som er beskrevet i denne utredningen respekterer den lokale forskriften (italiensk lov 40/2004). Ifølge loven, faktisk kan paret be om å bli informert om helsetilstanden til embryo de produserte under IVF syklus. I denne forbindelse må et detaljert informert samtykke for PGT signeres fra begge parter.
I dette papiret beskrev vi hvordan man implementerer blastocyst biopsi for PGT i en travel laboratorie rutine. Anvendelsen av blastocyst biopsi tilnærming har vært en viktig fremgang i det siste tiåret i IVF. Først rapportert av de Boer og kolleger i 200417, har det vært snart anerkjent som en mer effektiv og informativ prosedyre i forhold til kløft scenen og Polar kroppen biopsi tilnærminger3. Verdien av denne prosedyren ligger hovedsakelig i en reduksjon av de tekniske byrdene, men også i en lavere forekomst av kromosom mosaikk på dette stadiet i utbyggingen18,19. Videre har fjerning av få TE celler fra en blastocyst blitt foreslått som en tryggere prosedyre enn fjerning av en blastomere fra en kløft scenen embryo. I en randomisert ikke-utvalgs studie resulterte faktisk ikke den tidligere tilnærmingen i noen form for potensiell påvirkning på embryo implantat, mens sistnevnte involverte en betydelig reduksjon på ~ 20%20.
Protokollen mest brukt over hele verden medfører laser assistert Zona åpning i dag 3 post-befruktning. Ingen randomisert kontrollert rettssak har blitt gjennomført til dags dato for å sammenligne de ulike blastocyst biopsi tilnærminger. Det er imidlertid rimelig at jo lavere antall manipulasjoner og eksponeringer av den voksende embryo å suboptimal miljømessige forhold, jo lavere potensialet invasiveness av protokollen. Videre kan tilstedeværelsen av et hull i Zona pellucida fra dag 3 av utviklingen påvirke blastocyst ekspansjon og føre til herniation av ICM-celler sammen med TE celler. Av disse grunner, setter vi og implementert protokollen beskrevet her som innebærer sekvensiell laser-assistert Zona brudd og TE celler henting så snart blastocyst når full ekspansjon. Det finnes også en annen protokoll som innebærer en dag 5 eller 6 assistert klekking5,7. Nærmere bestemt er boringen av Zona utført på dag 5 eller 6 av Preimplantation utvikling på motsatt side med hensyn til ICM; blastocyst blir deretter flyttet tilbake til inkubator venter på spontane herniation av TE celler. Tydelig, periodisk overvåking av blastocyst må gis i de følgende timene, for å biopsi det så snart TE vil starte herniating, samt å hindre embryo fra klekking helt. Hvis på den ene siden ufaglærte utøvere kan enkelt implementere denne alternative biopsi strategi, på den annen side er det ikke egnet for en travel laboratorium utføre flere prosedyrer per dag. Den sekvensielle Zona åpning og blastocyst biopsi protokollen beskrevet her er i stedet mindre tidkrevende og gir en kortere hands-on tid og en høyere fleksibilitet til å planlegge den daglige aktiviteten i laboratoriet så å koordinere tidsrammer dedikert til biopsi og til vitrifikasjon prosedyrer.
Dårlig kvalitet blastocysts kan være mer komplisert å biopsi siden TE cellene kan være klissete, men mer laser skudd koordinert med strekking av fragmentet for å avdekke veikryss mellom cellene er tilstrekkelig til å fjerne den fra kroppen av blastocyst. Fullt klekket blastocyst kan være biopsied som blastocysts omsluttet av Zona pellucida, men de kan være vanskeligere å vitrify og varm. I tilfelle av mangelfulle diagnoser etter biopsi, dataene rapporteres til dato er konkordante at ingen skade synes å avlede fra en re-biopsi og en følgende vitrifikasjon-oppvarming syklus16,21.
Vitrifikasjon er i dag brukes i sentrum for å utføre blastocyst kryonisk bevaring siden det har vært gjennomgående rapportert tryggere, mer effektiv og mindre tidkrevende enn langsom frysing protokollen fra en gjennomgang og meta-analyse av den nyeste litteraturen 10i.
Når prosedyren var godt etablert og operatørene riktig trent, utførte vi en retrospektiv analyse for å definere den ideelle prosessuelle tidsberegninger for både blastocyst biopsi og vitrifikasjon prosedyrer (oppsummert her i representative resultater). Som endelig utfall, har vi vurdert re-ekspansjon rate av euploid blastocyst evaluert på 1,5 h etter oppvarming og live fødselsraten oppnås etter vitrified-varmet euploid enkelt embryo overføring. Ingen tilfelle av blastocyst degenerasjon ble observert etter biopsi, og bare 0,2% (N = 1/572) av degenerasjon rate ble rapportert etter oppvarming, bekrefter påliteligheten av biopsi og vitrifikasjon tilnærminger vedtatt. Ifølge analysen, ikke timingen som kreves for å utføre blastocyst biopsi påvirker ikke enten euploid blastocysts ' levedyktighet etter oppvarmingen definert som re-ekspansjon rate, eller reproduktive potensial definert som levende fødselsrate. Selv om ulike tidsberegninger kan observeres på tvers av operatører med ulik ekspertise, kan vi vurdere blastocyst biopsi trygt når prosedyren er fullført i ca 8 min, i et område fra 3 til 22 min, avhengig av antall embryo per prosedyre (men ingen data er tilgjengelig for biopsi prosedyrer utført i lengre intervaller). Gjennomsnittlig tid brukt på blastocyst biopsi fra hver enkelt operatør bør være periodisk (minst hver tredje måned) overvåkes som KPI. Ved siden av, bør frekvensen av ufullstendig diagnose og live fødselsrate etter vitrified-varmet euploid blastocyst overføring være også adressert. Til slutt skisserte vi den ideelle timingen mellom biopsi og vitrifikasjon. Siden vi observerte den høyeste re-ekspansjon rate etter oppvarming når blastocysts ble vitrified innen 30 min fra biopsi, foreslår vi denne verdien som den ideelle terskelen. Nærmere bestemt, jo lenger tid mellom biopsi og vitrifikasjon, jo mer den biopsied blastocyst vil re-utvide før de blir embryo. Dette kan være skadelig for fryse-overlevelse, spesielt når du arbeider med dårlig kvalitet og/eller dag 7 blastocysts11. Likevel ble det ikke observert noen signifikant innvirkning på de kliniske resultatene selv om vitrifikasjon ble forsinket utover 90 min. Derfor, i sporadiske anledninger, kan slike tidspunkter tillates.
Metoden som velges for å hente en prøve for PGT skal ikke påvirke embryo levedyktighet, bør involvere pålitelige og informative resultater, bør være klinisk effektiv og bør være lett å implementere og dermed redusere kostnadene og laboratorie arbeidsmengden. Blastocyst biopsi oppfyller alle disse forutsetningene. Likevel er det fortsatt en invasiv prosedyre som må utføres av dyktige operatører i et godt utstyrt laboratorium. Foreløpig er avant-garde av en ikke-invasiv PGT (niPGT) tilnærming er under etterforskning. Kanskje, i fremtiden, tilbrakte kulturen Media etter IVF kan bli analysert for å gjennomføre kromosom og/eller genetisk testing. Dette er en spennende fremtid perspektiv siden kostnadene for IVF klinikken vil være lavere og all arbeidsmengden innebar av embryo biopsi ville være sidestepped. Påliteligheten og reproduserbarheten til brukte medieanalyse for genetisk testing er imidlertid fortsatt å bli vurdert til22,23,24, og derfor må det investeres i flere tiltak for å definere og validere en protokoll som kan passer alle IVF-klinikker som utfører PGT over hele verden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
AG og RM samlet inn data og utarbeidet manuskriptet. DC analyserte data, utarbeidet representative resultater, utførte statistikk og revidert manuskriptet. FMU og LR sørget for en kritisk drøfting av resultatene og hele manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B. Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. Jansen, R., Mortimer, D. , Parthenon Press. 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
