Summary
الخزعة الكيسية الكيسية والتزجيج مطلوبان لإجراء اختبارات جينية قبل الزرع بكفاءة. نهج ينطوي على فتح تسلسلي للpellucida المنطقة واسترجاع 7-8 خلايا التروبسيتوديرم في اليوم 5-7 بعد التلقيح يحد من كل من عدد التلاعبات المطلوبة والتعرض للجنين لظروف بيئية دون الأمثل.
Abstract
يتم إجراء خزعة الكيسة الكيسية للحصول على تشخيص وراثي موثوق به خلال دورات التلقيح الاصطناعي مع الاختبار الوراثي قبل الزرع. ثم، فإن سير العمل المثالي ينطوي على بروتوكول التزجيج آمنة وفعالة، وذلك بسبب الوقت التحول من تقنيات التشخيص ونقل الجنين (الأجنة) المختارة على بطانة الرحم الفسيولوجية في دورة طبيعية التالية. نهج خزعة يشمل فتح تسلسلي للpellucida المنطقة واسترجاع 5-10 خلايا التروبسيتوديرم (من الناحية المثالية 7-8) يحد من كل من عدد التلاعبات المطلوبة والتعرض للجنين لظروف بيئية دون المستوى الأمثل. بعد التدريب المناسب، تم استنساخ هذه التقنية عبر مشغلين مختلفين من حيث توقيت الخزعة (حوالي 8 دقائق، تتراوح 3-22 دقيقة استناداً إلى عدد الأجنة إلى خزعة لكل طبق)، والتشخيصات القاطعة التي تم الحصول عليها (حوالي 97.5٪) ومعدلات المواليد الحية بعد نقل الكيسة الكيسية النيولويدية الدافئة (> 40٪). وكان معدل البقاء على قيد الحياة بعد خزعة، والتزجيج والاحترار يصل إلى 99.8٪. وكان معدل إعادة التوسع في 1.5 ساعة من الاحترار يصل إلى 97٪، ويعتمد إلى حد كبير على التوقيت بين خزعة والتزجيج (من الناحية المثالية ≤ 30 دقيقة)، ونوعية الكيسة الكيسية المورفولوجية ويوم الخزعة. بشكل عام، فمن الأفضل لvitrify الكيسة الكيسية المنهارة. ولذلك، في دورات غير PGT، يمكن إجراء انكماش اصطناعي بمساعدة الليزر للحث على انهيار الجنين قبل الحفظ بالتبريد. المنظور المستقبلي الواعد هو التحليل غير الغازي لوسائل الإعلام الثقافية التلقيح الاصطناعي بعد ثقافة الكيسة الكيسية كمصدر مفترض للحمض النووي الجنيني. ومع ذلك، لا تزال هذه الطليعة المحتملة قيد التحقيق، ومع ذلك لا بد من تحديد بروتوكول موثوق به والتحقق من صحته.
Introduction
والهدف الرئيسي لعلم الأجنة البشرية الحديثة هو زيادة عدد المواليد الأحياء في كل دورة محفزة إلى أقصى حد وخفض التكاليف والوقت والجهود المبذولة لتحقيق الحمل. ولتحقيق هذا الهدف، ينبغي استخدام نُهُج معتمدة لاختيار الأجنة لتحديد الأجنة المختصة بالإنجاب ضمن مجموعة تم الحصول عليها خلال دورة التلقيح الاصطناعي. وفقا لأحدث الأدلة، ثقافة الكيسة الكيسية1 جنبا إلى جنب مع اختبار الكروموسومات الشاملة ونقل الأجنة euploid المزجج (ET) هو الإطار الأكثر كفاءة لزيادة كفاءة التلقيح الاصطناعي2. ومن الواضح أن اختبار الأنوبلويدي يتطلب عينة جنينية، والتي تمثل في الوقت الحاضر في الغالب من عدد قليل من الخلايا المستردة من التروبسيتوديرم (TE)، أي الجزء من الكيسة الكيسية التي تعطي الأصل لمرفقات الجنين (على سبيل المثال، المشيمة) أثناء الحمل . وإلى جانب تحليل النمط الكاريوبي، يمكن أيضاً تقييم طفرات جينية واحدة من خزعة TE كجزء من استراتيجية سريرية تعرف باسم الاختبارات الجينية قبل الزرع (PGT; -A لداء الأويوبلويدات، -SR لإعادة ترتيب الكروموسومات الهيكلية، -M للأمراض المونوجينية). وقد تم التصورة عن طرق خزعة البويضة/الأجنة الأخرى واعتمدت سريرياً على مدى العقود الماضية، وهي خزعة الأجسام القطبية وخزعة البلابومير. ومع ذلك، فإن استخدامها ينخفض في الوقت الحاضر لأن عيوبها الإجرائية (مثل زيادة عبء العمل وخطر التأثير الإنجابي) والقيود التشخيصية (مثل قضايا تحليل الخلايا الواحدة) تعوق ضمناً تحقيق توازن كاف بين التكاليف والمخاطر و الفوائد (للاطلاع على مراجعة انظر3).
في هذه الورقة، يتم وصف أحد البروتوكولات الرئيسية لخزعة TE بدقة جنبا إلى جنب مع إجراءات التزجيج والاحترار والنقل اللاحقة المطلوبة. سير العمل هنا الموضح مثالي لوحدة PGT مشغول.
كما سبق وصفه من قبل مجموعتنا4،5، ينطوي الإجراء على فتح تسلسلي للبيلوسيدا زونا من الكيسات الكيسية الموسعة بالكامل وإزالة عدد قليل من خلايا TE (في المتوسط 7-8). بالمقارنة مع اليوم 3 بمساعدة الليزر الفقس القائم على الكيسة الكيسية خزعة الأسلوب6، وهذا الإجراء قد يخفف الجدول اليومي لوحدة التلقيح الاصطناعي حيث يجب تنفيذ الإجراءات الدقيقة ، مثل خزعة الكيسة الكيسية والتزجيج ، في الوقت المناسب. بمجرد أن تصل الكيسة الكيسية إلى توسعها الكامل، يمكن إجراء الخزعة عن طريق اختيار خلايا TE لإزالتها، وبالتالي منع خطر فتق كتلة الخلية الداخلية (ICM)، مما يجعل الإجراء صعباً. في الأدب ، تم وصف بروتوكول ثالث من خزعة الكيسة الكيسية أيضا ، والذي ينطوي على إجراء الفقس بمساعدة الليزر بمجرد أن يصل الجنين بالفعل إلى مرحلة الكيسة الكيسية ، قبل ساعات قليلة من الإجراء5،7. ومع ذلك، فإن هذا النهج هو أكثر استهلاكا للوقت ويناسب أساسا وحدات التلقيح الاصطناعي التي تقوم بتنفيذ خزعة TE في أيدي المشغلين ذوي الخبرة المحدودة ونظرا لعبء العمل اليومي المتوسط والمنخفض.
ينبغي أن يكون حقن الحيوانات المنوية داخل التسرّسي (ICSI)8 تقنية موحدة إذا كان الهدف من إجراء التحاليل الوراثية في التلقيح الاصطناعي. وبالمثل، فإن وجود نظام ثقافي مناسب لحصاد الأجنة بأمان إلى مرحلة الكيسة الكيسية الكيسية أمر بالغ الأهمية لتنفيذ استراتيجية خزعة TE. وهناك عدد كاف من الحاضنات، فضلا عن استخدام التوتر الأكسجين المنخفض هي الشروط الأساسية لهذه الغاية، وليس للتنازل عن معدل الكيسة الكيسية9. وفي الوقت نفسه، هناك حاجة إلى برنامج فعال للحفظ بالتبريد لإدارة دورة PGT بأمان. في العقد الماضي، أدى تنفيذ التزجيج إلى زيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بالتبريد في الأجنة حتى تصل إلى > 99%10،11. وقد وفر ذلك وقتاً كافياً لإجراء الاختبارات الجينية وتأجيل نقل الأجنة إلى الدورة الشهرية التالية، على بطانة الرحم غير المحفزة وربما الأكثر تقبلاً12.
كل من خزعة TE والتزجيج تتطلب مهام تتطلب مهارات صارمة وفعاليتها قد تختلف عبر المشغلين عديمي الخبرة. ولذلك، يُدعى إلى فترة تدريب محددة قبل السماح لكل مشغل بإجراء هذه الإجراءات سريرياً؛ وعلاوة على ذلك، ينبغي تقييم الحفاظ على مهارات المشغلين بصورة دورية عن طريق رصد مؤشرات الأداء الرئيسية لإجراءات الحفظ بالتبريد والخزعة. وينبغي لكل عيادة من عيادات التلقيح الاصطناعي أن تضع مؤشرات الأداء الرئيسية الداخلية لهذه الغاية، التي يجب أن تُقارب تلك التي تنشرها الاتحادات الدولية و/أو النتائج التي تنشرها المختبرات المرجعية.
يتم التحقق من صحة الخزعة TE، وتسخين التزجيج، وإجراءات المشاهدة في وحدتنا، التي تم توحيدها عبر جميع المشغلين المعنيين كما ورد في ثلاثة منشورات سابقة11،13،14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بروتوكول خزعة الكيسة الكيسية البشرية، هنا وصفها، يتبع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية G.EN.E.R.A.
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى جدول المواد للاطلاع على المواد المطلوبة. وتنطوي المواد الأخرى المطلوبة على الأحذية المختبرية والزي، وقناع الوجه الجراحي، وغطاء الشعر، والقفازات الجراحية، والعلامة الدائمة غير السامة، وملقط، ومطهر. استخدام ثوب الجراحية، والقفازات الجراحية القابل للتصرف، قناع الوجه، وغطاء الشعر إلزامي لمنع خطر التلوث. يجب تنظيف جميع مناطق العمل، وكذلك المعدات المشاركة في العملية، بشكل كامل مع مطهر المختبر (على سبيل المثال، Oosafe) قبل البدء في أي إجراء. يجب أن تكون جميع المواد الاستهلاكية ووسائل الإعلام المستخدمة معقمة ومعبأة بشكل فردي أو aliquoted. ويُقترح استخدام محطة عمل مخصصة لإجراء خزعة وأنابيب والحد من وصول المنطقة فقط إلى المشغلين المشاركين في الإجراء (أخصائي الأجنة والشاهد).
1. التحضير في اليوم السابق لإجراء خزعة
-
إعداد طبق ثقافة الخزعة آخر.
- ضع 6 قطرات من 20 ميكرولتر وسط ثقافة التلقيح الاصطناعي (جدولالمواد)في طبق ثقافة التلقيح الاصطناعي وتراكب مع 6 مل من الزيوت المعدنية قبل الدافئة لثقافة الجنين (جدولالمواد).
- إضافة 10 ميكرولتر أخرى من التلقيح الاصطناعي وسط الثقافة إلى كل قطرة. حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجةمئوية في جو تسيطر عليها (5٪ س 2، 6٪ CO2).
-
إعداد طبق التلقيح الاصطناعي 4 جيدا لوحة لالرينسالكيسة بعد خزعة.
- ضع 600 ميكرولتر من وسط ثقافة التلقيح الاصطناعي في أول بئرين وتراكب مع 300 ميكرولتر من الزيوت المعدنية قبل تسخينها لثقافة الأجنة.
- حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجةمئوية في جو تسيطر عليها (5٪ س 2، 6٪ CO2).
- الاستغناء عن 1.5 ميكرولتر من محلول التحميل (جدولالمواد)في كل أنبوب PCR لاستخدامها لأنابيب خلايا TE، وتدور عليه والاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية.
2. التحضير في يوم إجراء الخزعة
-
إعداد طبق خزعة.
- ضع 3 قطرات من 10 ميكرولتر HEPES-buffered المتوسطة (تستكملمع الزلال المصل البشري) (جدول المواد) في صف واحد في طبق ثقافة التلقيح الاصطناعي.
- كرر الخطوة 1.1.1 وفقًا لعدد الكيسات الكيسية المتوفرة (ما يصل إلى 4 أكياس كيسة واحدة لكل طبق) وتراكب مع 6 مل من الزيت المعدني المُدفأ مسبقًا لثقافة الأجنة.
- قم بحضانة الطبق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل إجراء الخزعة.
3. اختيار الكيسة الكيسية والدرجات
-
الصف الكيسة الكيسية وفقا لتوسعها والمظهر المورفولوجي من ICM وTE (الشكل1).
ملاحظة: تم تكييف معايير الدرجات من غاردنر ومدرسة15 ووصفها سابقا من قبل Capalbo وآخرون وCimadomo وآخرون4،11.- تعريف حجم وتوسيع الصف على النحو التالي: A لكيسة الكيسة الكيسية فقست بالكامل، B لكيسة البلاسط الفقس، C لكيسة كيسة مكبرة موسعة بالكامل، وD لكيسة لا توسع (يتم biopsied هذه الأجنة فقط إذا لم تتوسع أكثر حتى اليوم 7).
- تعريف ICM الصف: 1 لICM ملحوظ مع العديد من الخلايا معبأة بدقة؛ 2 لتمييز مع عدة خلايا ولكن معبأة تقريبا. 3 لصعوبة التمييز مع عدد قليل جدا من الخلايا منخفضة الجودة.
- تعريف درجة TE على النحو التالي: 1 للظهارة منظمة تنظيما جيدا مع عدة خلايا؛ 1 للظهارة منظمة تنظيما جيدا مع عدة خلايا؛ 1 للظهارة منظمة تنظيما جيدا مع عدة خلايا؛ 1 للظهارة منظمة 2 للظهارة فضفاضة مع عدد قليل من الخلايا. 3 لخلايا قليلة و/ أو كبيرة منخفضة الجودة.
4. خزعة التروبيتودرم
- إجراء خزعة TE على جميع الكيسات الكيسية القابلة للحياة الموسعة بالكامل (ويفضل أن يكون C درجة للحجم والتوسع).
- تعيين عقد وخزعة ماصات لكل إجراء خزعة. توصيات ماصة خزعة هي التالية: 30 ميكرومتر القطر الداخلي، 35 درجة زاوية الانحناء، 0.75 مم طرف المسافة لثني.
- تسمية طبق خزعة مع تفاصيل المريض (اسم المرأة واللقب، وتاريخ الميلاد والهوية) ومن ثم ترقيم كل قطرة مع الجنين ودورة الهويات. استخدام علامة دائمة غير سامة.
- نقل الكيسة الكيسية مع 300 م تجريد ماصة إلى أول قطرة من طبق خزعة وشطفه من أجل إزالة الزائدة من وسط الثقافة. ثم حرك الكيسة الكيسية في القطرة الثانية من طبق الخزعة.
- نقل الطبق إلى المجهر المقلوب ورئيس خزعة ماصة aspirating بعض المتوسطة من القطرة الثالثة من طبق خزعة.
- في التكبير 20x، توجيه الكيسة الكيسية للحصول على رؤية واضحة من ICM. عندما يتم تصورها في الساعة 7 (مقابل المنطقة التي سيتم استهدافها لإزالة خلايا TE)، وتأمين الجنين على ماصة عقد (الشكل2a).
- التركيز على pellucida المنطقة والتأكد من أن كل من الماصات والكيسة الكيسية هي على نفس المستوى البؤري.
- التبديل إلى هدف الليزر (نبض الوقت 0.3 مللي ثانية، 6.5 م) ووضع مؤشر الليزر على pellucida المنطقة في الجانب الآخر من ICM. حفر pellucida المنطقة من خلال 2-3 نبضات الليزر (الشكل2ب).
- اضغط بلطف على ماصة خزعة ضد pellucida المنطقة وضربة بعض المتوسطة من خلال خرق لفصل خلايا TE من سطحها الداخلي وتسريع انهيار الكيسة الكيسية (الشكل2ج).
- بمجرد فصل TE (الشكل2D)،أدخل من خلال ثقب (إذا لزم الأمر، وجعلها أوسع مع نبض الليزر الأخير) واستنشاق عدد قليل من خلايا TE (من الناحية المثالية 7−813،16) في ماصة خزعة مع شفط لطيف (الشكل2e).
- تحريك قليلا ماصة خزعة إلى الوراء أثناء تطبيق شفط معتدلة لتمتد الخلايا المستهدفة (الشكل2f).
- توجيه الليزر نحو أنحف جزء من الخلايا المستنشقة وإشعال نبضات الليزر 2−5 عند التقاطعات بين الخلايا لفصل الخلايا المستهدفة عن جسم الجنين (الشكل2g). يمكن تعديل توقيت نبضات الليزر وعدد النبضات وفقا لنوعية الكيسة الكيسية. ومع ذلك، حاول التقليل منها لتجنب lysis الخلية.
- بعد فصل جزء TE من الكيسة الكيسية (الشكل2H)،الإفراج عنه في نفس قطرة خزعة بعيدا عن الكيسة الكيسية. وهذا ضروري لمنعهم من أن يتم امتص مرة أخرى في ماصة خزعة (الشكل2i).
- الإفراج عن الكيسة الكيسية من ماصة عقد ورفع على الفور كل من الماصات لمنع جزء من التمسك بها.
- التقاط صورة للجزء biopsied لغرض مراقبةالجودة (الشكل 3).
ملاحظة: إذا كان أكثر من كيسة واحدة أن يكون biopsied لكل إجراء (ما يصل إلى أربعة لكل طبق خزعة)، تغيير ماصة خزعة مع واحد جديد لمنع التلوث المتبادل بين الأجنة. - كرر الخطوات 4.1-4.13.
- نقل طبق خزعة مرة أخرى إلى غطاء محرك السيارة تدفق laminar.
- وضع علامة على طبق ثقافة ما بعد الخزعة مع هوية الزوجين، وكل قطرة مع الجنين وهوية الدورة.
- في حضور شاهد، شطف الكيسة الكيسية في وسط التلقيح الاصطناعي نظيفة، وأخيرا نقله إلى قطرة المقابلة لها من طبق ما بعد خزعة.
- نقل طبق ما بعد خزعة إلى الحاضنة في جو تسيطرعليها (37 درجة مئوية، 6٪ CO 2، 5٪ O2)حتى التزجيج. من المستحسن إجراء التزجيج في غضون 30 دقيقة من إجراء خزعة، لمنع إعادة توسيع الكيسة الكيسية.
5. الأنابيب
ملاحظة: يجب أن يتم الإجراء بأكمله في حضور شاهد وداخل غطاء تدفق laminar في درجة حرارة الغرفة. أثناء الإجراء، والحفاظ على أنابيب PCR في رف أنبوب الباردة على الجليد (الشكلالتكميلي1).
- تسمية أنابيب PCR مع علامة غير سامة دائمة.
ملاحظة: وينبغي أن يتم وضع العلامات على النحو الذي يطلبه المختبر الوراثي. عموما، اسم المريض ولقبه (الأحرف الأولى)، هوية الزوجين، الجنين ومعرف الدورة (على سبيل المثال: 12345 دينار أردني 1.2 للجنين N.1 من الدورة الثانية التي تنتمي إلى جين دو الذي هو هوية الزوجين هو 12345). وينبغي الإبلاغ عن هوية الجنين أيضا في رسائل على جسم الأنبوب. - وضع علامة على غطاء طبق ثقافة 60 مم × 15 مم (طبق أنابيب) مع هويات الأجنة biopsied (الشكلالتكميلي1) وإعداد قطرتين 10 ميكرولتر من محلول غسل خزعة (جدولالمواد)فيه.
- قم بتعبئة ماصة تجريد 140 م (الشكلالتكميلي1) مع بعض محلول غسيل خزعة من القطرة الثانية من طبق الأنابيب.
- ضع طبق الخزعة تحت المجهر المجسم لتصور جزء (أجزاء) TE بسهولة.
- الإفراج بلطف بعض محلول غسل خزعة على جزء TE. ثم، تحميلها في ماصة تجريد.
- حرّك جزء TE إلى القطرة الثانية من محلول غسيل الخزعة في طبق الأنابيب واشطفه بعناية 2-3 مرات.
- نقل جزء TE إلى الجزء السفلي من أنبوب PCR (وصفت سابقا بعد ذلك) مع حل التحميل، مع إيلاء الاهتمام لتجنب لمس جدرانها مع غيض من ماصة تجريد.
- كرر الإجراء من الخطوة 5.3 إلى الخطوة 5.7 لكل جزء TE، مع إيلاء الاهتمام لاستخدام الشعرية الجديدة لكل جزء TE.
- في نهاية إجراء الأنابيب، ووضع جميع أنابيب PCR في جهاز طرد مركزي صغير، وتدور لهم لبضع ثوان.
- تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى شحنها إلى المختبر الوراثي ة المرجعية للاختبار.
6. الكيسة الكيسية التزجيج
- انهار الكيسات الكيسية في فيتريفي في غضون 30 دقيقة من خزعة TE لمنع إعادة توسيعها.
- تسمية لوحة التزجيج مع تفاصيل المرأة وبطاقات الأيّيل من الكيسات الكيسية التي يجب أن تكون زجاجية.
- تسمية دعم (دعم) التزجيج مع اسم المرأة ولقبها، وهوية الزوجين، وهوية الجنين التي سيتم تحميلها عليها، وكذلك تاريخ الإجراء. وتستخدم التسميات الجليدية الخاصة التي تحافظ على سلامتها حتى في درجة حرارة منخفضة جدا (-196 درجة مئوية).
- في درجة حرارة الغرفة، الاستغناء عن 0.3 ملمن محلول التوازن (ES) (جدول المواد) لكل كيسة الكيسة التي سيتم مزجها.
- في حضور شاهد، نقل الكيسة الكيسية في ES باستخدام ماصة تجريد 300 م.
- اترك الكيسة الكيسية في ES لمدة 13-15 دقيقة. وبعد انكماش أولي في الحجم، سيلاحظ إعادة توسع تدريجية.
- ملء رف التبريد الصغيرة معالنيتروجين السائل (LN 2) ووضعها تحت غطاء محرك السيارة تدفق laminar.
- الاستغناء عن 300 ميكرولتر منمحلول التزجيج (VS) (جدول المواد) في البئر الثاني. بعد إعادة توسيع الكيسة الكيسية الكاملة، قم بنقله في محلول VS لمدة دقيقة واحدة واشطفه لتخفيف ES.
- في حضور شاهد، تحميل الكيسة الكيسية على دعم التزجيج ورعاية إزالة الزائدة من VS. فيلم دقيق من الحل يجب أن تحيط الكيسة الكيسية.
- يغرق دعم التزجيج في LN2 ونقله بنشاط من أجل الحد من خطر تشكيل فقاعة قريبة من العينة.
- ضع الغطاء الواقي مع الحفاظ على دعم التزجيج المغمور في LN2.
- في حضور شاهد، نقل دعم التزجيج في خزان LN2 على المدى الطويل.
7. انكماش اصطناعي من الكيسات الكيسية غير biopsied
-
إذا لم يتم إجراء خزعة TE، انهيار مصطنع الكيساتالكيسية مباشرة قبل التزجيج (الشكل 4).
- نقل طبق الثقافة من الحاضنة إلى المجهر المقلوب والتركيز على الجنين المحدد.
- قم بالتبديل إلى هدف الليزر (نبض محدد مسبقًا: 0.3 مللي ثانية، 6.5 ميكرومتر)، استهداف المنطقة pellucida على الجانب الآخر من ICM، ثم توجيه نبضات الليزر 1-2 إلى التقاطعات بين خلايا TE على مسافة آمنة من ICM. يجب أن تنهار الكيسات الكيسية في أقل من 5 دقائق.
- المضي قدما في التزجيج من الكيسة الكيسية المنهارة كما هو موضح في القسم 6.
8. القابلة للتحويل الكيسة النارية الاحترار
- في يوم ET، قم بإعداد لوحة ET 4-well عن طريق وضع 600 ميكرولتر من متوسط ثقافة التلقيح الاصطناعي قبل الاعتدال لكل بئر. حضانة في 37 درجة مئوية في الغلاف الجويالخاضعة للرقابة (5٪ س 2، 6٪ CO2)،في حين إجراء ارتفاع درجة حرارة الكيسة الكيسية.
- تسمية طبق الاحترار مع اسم المرأة واللقب، هوية الزوجين، هوية الجنين التي سيتم تسخينها في ذلك.
- الاستغناء عن 1 مل من محلول الذوبان (TS) (جدول المواد) في طبق التلقيح الاصطناعي بئر واحد (الشكلالتكميلي 1)وتسخينه إلى 37 درجة مئوية في ترموستات لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل بدء الإجراء.
- ملء دعم التبريد الصغيرة مع LN2 ووضعها في غطاء محرك السيارة تدفق laminar على مقربة من منطقة العمل.
- قبل بدء الإجراء، تحقق من معلومات الكيسة الكيسية التي تم الإبلاغ عنها على دعم التزجيج. يجب أن تتطابق جميع البطاقات المعتمة مع التقرير الوراثي ويجب اختيار الكيسة الكيسية للتدفئة من بين البطاقات القابلة للتحويل. يجب على الشاهد أثناء الإجراء.
- خذ طبق واحد جيدا يحتوي على TS الدافئة من الحرارة ووضعها على مرحلة ساخنة تحت المجهر المجسم.
- اسحب الغطاء الواقي داخل LN2 باستخدام ملقط.
- يغرق بسرعة غيض من دعم التزجيج في 37 درجة مئوية TS.
- تحت المراقبة المجهرية، نقل بلطف دعم التزجيج حتى يتم تحرير الكيسة الكيسية من طرف.
- ترك الكيسة الكيسية لما مجموعه 1 دقيقة في TS، مع إيلاء الاهتمام للحفاظ عليه في الجزء السفلي من TS.
- في درجة حرارة الغرفة الاستغناء 200 درجة مئويةمن محلول التخفيف (DS) (جدول المواد) على البئر الأول من لوحة التزجيج.
- نقل الكيسة الكيسية إلى DS ووضعها في الجزء السفلي من البئر في حين الإفراج عن بعض TS على الجزء العلوي منه لخلق نوع من التدرج. اتركها لمدة 3 دقائق.
- الاستغناء عن 200 درجة مئوية من محلول الغسيل (WS) في بئرين مختلفين (WS1 و WS2).
- نقل الكيسة الكيسية إلى WS1 ووضعها في الجزء السفلي من البئر في حين الإفراج عن بعض DS المتوسطة على الجزء العلوي منه. ثم نقل الكيسة الكيسية إلى WS2 وتركها دون عائق لمدة دقيقة واحدة.
- تسمية لوحة ET ما بعد الاحترار مع اسم المرأة واللقب، هوية الزوجين، هوية الجنين الذي سيتم المستزرع في ذلك.
- في حضور شاهد، نقل الكيسة الكيسية الدافئة إلى وسط الثقافة قبل الاعتدال في لوحة ET ما بعد الاحترار.
- شطف الكيسة الكيسية في البئر الأول من لوحة ET ووضعها في البئر الثاني.
- نقل طبق الثقافة ما بعد الاحترار إلى الحاضنة في جو تسيطرعليها (37 درجة مئوية، 6٪ CO 2، 5٪ O2)وثقافة الكيسة الكيسية لمدة 1.5 ساعة على الأقل قبل التحقق من بقائها وإعادة التوسع.
ملاحظة: ويبين الشكل 5 أمثلة على الكيسات الكيسية الكيسية التي تم المنحطّمة والمنحلة بالتبريد ولكنها لم تُوسع من حيث التبريد والبقاء على قيد الحياة وتوسعت بالكامل.
9. نقل الأجنة
- لأداء ET، ضع الطبق على مرحلة ساخنة من غطاء محرك السيارة تدفق اللامينار، وبالتالي فإن الجنين مرئية تحت المجهر في التكبير منخفضة.
- خذ حوالي 0.4 مل من متوسط ثقافة التلقيح الاصطناعي. تأمين تلميح الحقنة بحزم في الطرف المتلقي للقسطرة الداخلية ومن ثم الإفراج عن المتوسطة تصل إلى 0.1 مل.
- يستنشق وسط الثقافة حتى مراقبة الأجنة التي تدخل القسطرة (الحد الأدنى من وسائل الإعلام: 10-15 درجة مئوية).
- ضع القسطرة في العلبة البلاستيكية واذهب إلى غرفة العمليات وضع القسطرة الداخلية في الدليل الخارجي.
- بمجرد الوصول إلى الرحم، دفع الغطاس حقنة لإطلاق سراح الجنين (الأجنة). الافراج ببطء شديد المتوسطة حتى الغطاس هو قراءة 0.1 مل.
- خذ القسطرة إلى المختبر وتحقق تحت المجهر من أن الجنين قد تم نقله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمثل الشكل 6 مخططًا لجميع نتائج إجراء الخزعة الذي يمكن اعتماده لتوحيد البروتوكول ورصد أداء كل مشغل. والنتيجة الإجرائية الرئيسية هي توقيت إكمال الخزعة/الخزعات؛ النتيجة التقنية الرئيسية هي نوعية المؤامرة التي تنتج بعد الاختبارات الجينية التي قد تؤدي إما إلى تشخيص قاطع أو غير حاسم، وهذا الأخير يتطلب إعادة خزعة من الكيسة الكيسية غير المشخصة. والنتيجة البيولوجية الرئيسية هي معدل البقاء على قيد الحياة بالتبريد وإعادة التوسع مقابل الانحطاط بعد الاحترار؛ وأخيرا، فإن النتيجة السريرية الرئيسية هي معدل المواليد الحية بعد نقل الكيسة الكيسية الدافئة. في ثلاث دراسات سابقة أبلغنا مؤشرات الأداء الرئيسية المحددة في المركز (المراكز) للنتائج التقنية والبيولوجية والسريرية11،13،16. وفيما بعد، نبلغ بدلا ً من ذلك عن كيفية تحديد مؤشر الأداء الأساسي لتوقيت الخزعة. وعلاوة على ذلك، تم أيضا التحقيق في التأثير المفترض للتوقيت بين خزعة والتزجيج على سلوك ما بعد الاحترار من الكيسات الكيسية euploid.
وفي فترة سنتين، أجرى 7 مشغلين ما مجموعه 544 1 إجراء لخزعة التروبسيتوديرم (الجدول1). ثم تم نقل جميع الكيسات الكيسية الخزعية مرة أخرى إلى الحاضنة في طبق ثقافة ما بعد خزعة حتى التزجيج. وقد جُمعت جميع البيانات ذات الصلة في قاعدة بيانات علائقية. تم الحصول على جميع توقيت اتّزان الخزعة وبين الخزعة والتزجيج بأثر رجعي من برنامج نظام المشاهدة الإلكترونية للإخصاب خارج الرحم. ثم تم تصدير البيانات وتحليلها للحصول على إحصاءات.
وكان معدل البقاء على قيد الحياة بالتبريد من الكيسات الكيسية euploid بعد خزعة التروبيتوفديرم والاحترار المزج N = 571/572، 99.8٪. وكان معدل إعادة التوسع في 1.5 ساعة بعد الاحترار N = 556/571، 97.4٪. ومن بين الأكياس الكيسية الـ 15 التي لم يتم إعادة توسيعها، أدى أحدها إلى ولادة حية بعد نقلها في الرحم. وكان معدل المواليد الحية بعد نقل الكيسة الكيسية واحدة بالمزجج N = 227/572، 39.7٪.
تعريف التوقيت المثالي للخزعة
ويلخص الجدول 1 البيانات ذات الصلة بإجراءات الخزعة التي أجريت. عموما، 1.89 ± 1.03 (مجموعة 1-4) تم biopsied الكيسات الكيسية لكل إجراء في 8.24 ± 4.23 دقيقة (نطاق 3-22). وتفاوت متوسط توقيت الخزعة بسبب كل من عدد الكيسات الكيسية الكيسية الخزعة لكل إجراء، من الحد الأدنى 5.78 ± 2.94 دقيقة (النطاق 3-16) عندما تم وضع جنين واحد فقط في الطبق إلى حد أقصى 12.93 ± 4.43 دقيقة (نطاق 6-22) عندما الأجنة biopsied بالتتابع نحن إعادة 4. وثمة معلمة أخرى ذات صلة هي المشغل المشارك في الإجراء: فأكثر الخبراء (N = 443 إجراءً) هو الأسرع (7.41 ± 3.6 دقيقة، النطاق 3-22)، في حين أن الأقل خبرة (N = 42) كان الأبطأ (14.19 ± 4.24 دقيقة، النطاق 6-22). وفي الواقع، فإن النموذج الخطي المعمم الذي ينطوي على كل من "عدد الكيسات الكيسية الكيسية الخزعية لكل إجراء" ومتغيرات "المشغل" يفسر تماما "توقيت الخزعة" مع R2 = 0.48 والقوة = 1. كان هذا التحليل مفيداً لتحديد أن من الناحية المثالية ~ 6 دقيقة يكفي لإجراء خزعة الكيسة الكيسية عندما يتم وضع جنين فقط في الطبق، في حين أن ~ 9 دقيقة، ~ 12 دقيقة و ~ 13 دقيقة لمدة 2 و 3 و 4 الكيسات الكيسية، على التوالي. ومن الواضح أن الإجراء بأكمله ينطوي أيضا على نقل الأجنة من الثقافة إلى طبق خزعة ومن الأخير إلى طبق ثقافة ما بعد الخزعة بعد الإجراء، فضلا عن تغيير ماصة خزعة بين الخزعات المتسلسلة.
الشكل 7 يحدد متوسط توقيت خزعة لكل مشغل على طول الأشهر الثلاثة للدراسة (من1 ش إلى8). يحدد الخط الأحمر المنقط متوسط القيمة الإجمالية البالغة 8.24 دقيقة. ومثل هذا الرسم البياني مفيد لرصد الأداء المتوسط لكل ممارس. فعلى سبيل المثال، أظهر معظم المشغلين الخبراء (1 و2) انخفاضاً مستمراً في هذا التوقيت، مما يشير إلى وجود اتجاه نموذجي لمنحنى التعلم. وكانت جميع المشغلين من 3 إلى 6 بدلا من ذلك ثابتة بما فيه الكفاية في أدائها حول متوسط القيمة الإجمالية عبر الأشهر الثلاثة. في أي وقت أظهروا ذروة في القيمة المتوسطة من الثلث معين (على سبيل المثال، المشغل 3 في الثلث السابع، المشغل 4 في 6ال ثلاثة أشهر، المشغل 5 في الثلثالثالث 3)، تم تحذيرهم من أجل مراجعة أدائهم. المشغل 7 (أي الأقل خبرة) أظهر توقيتات نموذجية لأخصائي الأجنة الذي أنهى للتو تدريبه. من المحتمل أن يفي بالمعايير الداخلية للمختبر مع زيادة الخبرة.
الأهم من ذلك، كان وقت خزعة مماثلة عبر إعادة توسيع وليس إعادة توسيع الكيسات الكيسية euploid في 1.5 ساعة من الاحترار (9.52 ± 4.23 دقيقة، ومجموعة 3-22 مقابل 10.5 ± 5.68 دقيقة، ومجموعة 4-22؛ t-test = 0.37). من المحتمل، المزروعة (N = 229) وغير المزروعة (N = 343) الكيسات الكيسية الكيسية اللوبلويدية الدافئة بالمزجج أظهرت أيضا توقيتات خزعة مماثلة (9.77 ± 4.15 دقيقة، ومجموعة 3-22 مقابل 9.41 ± 4.36 دقيقة، والنطاق 3-22؛ t-test = 0.39). ربما بعد ذلك، توقيت ≤ 22 دقيقة لخزعة تصل إلى 4 الكيسات الكيسية لا يؤثر على سلوك الجنين بعد الاحترار. لذلك، قمنا بتعريف هذه القيمة كعتبة قصوى.
وبالمثل، لم يظهر أي فرق من حيث معدل المواليد الأحياء عبر مختلف مشغلي خزعة، كما سبق الإبلاغ عن13 (الجدولالتكميلي1).
معلمة هامة أخرى لرصد أداء كل مشغل هو معدل النتائج غير الحاسمة بعد التشخيص، والتي ينبغي أن تكون أقرب ما يمكن إلى الأداء العام لكل مختبر. من الناحية المثالية يجب أن لا يتجاوز هذا المعدل 2.5٪ ويمكن أن ينخفض مع مرور الوقت بسبب زيادة الخبرة في خزعة وإجراءات الأنابيب16. العدد المستهدف من خلايا TE لاسترداد هي 7-8 وفقا لدراستين سابقتين13،16. ولهذا الغرض، يُقترح التقاط صورة للجزء الأحيائي لأغراض مراقبة الجودة (انظر بعض الأمثلة في الشكل3). ويمكن التحقق من هذه الصورة في حالة التشخيصات غير الحاسمة لتقييم ما إذا كان السبب يعزى إلى بعد/نوعية القطعة (أي انخفاض جودة التحليل الجزيئي)، أو إلى الأنابيب (أي فشل تضخيم الحمض النووي) أو إلى بعض القضايا في معالجة العينة في المختبر الوراثي.
تعريف التوقيت المثالي بين الخزعة والتزجيج
في فترة الدراسة، تم تسخين 572 كيسة من الكيسات الكيسية الإيوبلويدية للخضوع لعملية نقل الأجنة بعد تشخيص اللوبلويد. الشكل 8A يظهر كل كيسة كيسة ساخنة كدائرة سوداء موزعة عبر توقيت متزايد بين خزعة والتزجيج وتجميعها في مجموعتين وفقا للنتيجة قيد التحقيق: إعادة توسيع أو عدم توسيع في غضون 1.5 ساعة من الاحترار. جميع الكيسات الكيسية (N = 117/117) الزجاجية في غضون 30 دقيقة، 97.6٪ (N = 245/251) من الكيسات الكيسية المزجج بين 31-90 دقيقة، و 95.1٪ (N = 194/204) من الكيسات الكيسية المزجية بعد 90 دقيقة إعادة توسيع، على التوالي (لا معدلات إعادة التوسع: 0٪ ، 2.4٪ و 4.9٪). لذلك، وضعنا 30 دقيقة و 90 دقيقة كعتبات في وقت مبكر ومتأخر من الوقت بين خزعة والتزجيج.
ويبين الشكل 8باء معدل إعادة التوسع في المجموعات الثلاث (≤ 30 دقيقة، 31-90 دقيقة، > 90 دقيقة) مزيد من التجمعات الفرعية وفقا لنوعية الكيسة الكيسية الكيسية ويوم تطوير ما قبل الزرع. خاصة بالنسبة لنوعية رديئة و / أو اليوم 7 الكيسات الكيسية، والتوقيت بين خزعة والتزجيج يبدو حاسما لتحقيق إعادة التوسع بعد الاحترار. وعلى وجه التحديد، فإن نسبة احتمالات إعادة التوسع بعد تصحيح الاحترار لكل من جودة الكيسة الكيسية ويوم الخزعة في الكيسات الكيسية المزجج في غضون 30 دقيقة من خزعة مقابل الكيسات الكيسية المنكرة بعد 90 دقيقة كان 3.05 (95٪ CI 1.01-9.4، p = 0.05). وبدلاً من ذلك، فإن الفترة الفاصلة بين هذين الحدين (31-90 دقيقة) تمثل منطقة رمادية قد يكون لها أو لا يكون لها تأثير.
فقط 1 من أصل 15 لم يتم إعادة توسيع الكيسات الكيسية أدى إلى ولادة حية بعد نقل. لذلك، قمنا أخيرا بالتحقيق في معدل المواليد الحية التي تحققت بعد ارتفاع درجة حرارة نقل الكيسة الكيسية واحدة euploid مجمعة في المجموعات الثلاث وفقا للتوقيت بين خزعة والتزجيج. وقد تحقق أعلى معدل ولادة حية عن طريق نقل الكيسات الكيسية الكيسية الليلويدية الزجاجية ≤ 30 دقيقة من خزعة التروبيتوفرم (N = 56/117، 47.9٪). ومع ذلك، لم تصل هذه النتيجة إلى أهمية إحصائية بالمقارنة مع نفس النتيجة التي تم الحصول عليها إما مع الكيسات الكيسية المزجج بين 31 و 90 دقيقة (N = 92/251، 36.7٪؛ اختبار فيشر الدقيق = 0.06)، أو مع الكيسات الكيسية الزجاجية > 90 دقيقة من الخزعة (N = 81/204، 39.7٪؛ اختبار فيشر الدقيق = 0.16). ولذلك، إما أن يكون التأثير السلبي على الكفاءة الإنجابية للكيسة الكيسية لا يكاد يذكر أو أن حجم العينة في مجموعة البيانات هذه (N = 572) لم يكن كافياً للوصول إلى الأهمية الإحصائية.
الشكل 1: معلمات تصنيف الكيسة الكيسية. التوسع:(أ) فقست بالكامل، (ب) في الفقس، (ج) توسعت تماما، و (د) لم تتوسع. المرحلة المثالية هي C، في حين ينبغي إعطاء الكيسة الكيسية D المزيد من الوقت لتحقيق التوسع الكامل، ما لم يتم التوصل إلى هذه المرحلة في اليوم 7. كتلة الخلية الداخلية (ICM) نوعية مورفولوجية: 1 (ملحوظ مع عدة خلايا معبأة بدقة)، 2 (يمكن تمييزها مع عدة خلايا ولكن معبأة تقريبا) و 3 (من الصعب التمييز مع عدد قليل جدا من الخلايا منخفضة الجودة)؛ تروبسيتوديرم (TE) الجودة المورفولوجية:1 (ظهارة منظمة تنظيما جيدا مع عدة خلايا)، 2 (ظهارة فضفاضة مع عدد قليل من الخلايا) و 3 (عدد قليل و / أو خلايا كبيرة منخفضة الجودة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ملخص للزونا بيلوسيدا المتسلسلة (ZP) فتح وتروبسيتوديرم (TE) نهج استرداد الخلايا لخزعة الكيسة الكيسية. (أ) توجيه الكيسة الكيسية مع كتلة الخلية الداخلية (ICM) على مقربة من ماصة عقد وبعيدا عن المكان الذي سيتم استرداد خلايا TE المحددة. تأمين الكيسة الكيسية على ماصة عقد. (ب) فتح ZP من خلال 2-3 لقطات الليزر؛ (ج) تفجير بعض وسائل الإعلام الثقافية من خلال ثقب؛ (د) سيتم فصل الكيسة الكيسية من ZP. (هـ)أدخل ZP وتمتص 5-10 خلايا TE في ماصة خزعة؛ (و) التحرك إلى الوراء مع ماصة خزعة لتمتد الجزء المحدد وفضح التقاطعات بين الخلايا. (ز) النار عند التقاطعات بين الخلايا ومواصلة تمتد الجزء حتى يتم تحرير خلايا TE من جسم الكيسة الكيسية. (ح) الكيسة الكيسية بعد انهيار خزعة TE. (ط) التقاط صورة لجزء خزعة لمراقبة الجودة ونقلها إلى أنبوب PCR التي سيتم إرسالها إلى المختبر الوراثي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أمثلة على شظايا الخزعة: (أ-ج)الشظايا المستصوبة؛ (د) جزء من اللمعة؛ (هـ)جزء صغير مع الخلايا المتدهورة؛ (و) جزء صغير، متحلل جزئيا والمتدهورة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الانكماش الاصطناعي. (أ) توجيه الكيسة الكيسية بحيث كتلة الخلية الداخلية (ICM) بعيدة عن القسم المستهدف من التروبسيتوديرم (TE)؛ (ب) إطلاق النار 2-3 طلقات الليزر في صف واحد عند تقاطعات بين خلايا TE والانتقال إلى الخارج؛ (ج) انتظر حتى تنهار الكيسة الكيسية قبل البدء في التزجيج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أمثلة على انحطاط الكيسة الكيسية (أ)، والبقاء على قيد الحياة بالتبريد ولكن لا إعادة التوسع (ب) والبقاء على قيد الحياة بالتبريد وإعادة التوسع الكامل (ج) 1.5 ساعة بعد الاحترار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: ملخص النتائج المختلفة لخزعة التروبسيتوديرم التي يمكن استخدامها لرصد أداء المشغل وتحديد مؤشرات الأداء الرئيسية الداخلية لكل مختبر. والنتيجة الإجرائية الرئيسية هي توقيت الخزعة. والنتيجة التقنية الرئيسية هي معدل التشخيصات القاطعة (اللولويد أو الأنوبلويد) وغير الحاسمة (إعادة الخزعة المطلوبة) التي تم الحصول عليها؛ قد يكون سبب هذا الأخير تضخيم الحمض النووي أو البيانات الجزيئية منخفضة الجودة، وكلاهما يؤدي إلى غير قابلة للتفسير الكروموسوم نسخة عدد المؤامرات الشخصي. والنتيجة البيولوجية الرئيسية هي معدل البقاء على قيد الحياة بالتبريد وإعادة التوسع أو الانحطاط بعد الخزعة والتزجيج والاحترار. والنتيجة السريرية الرئيسية هي معدل المواليد الأحياء أو نتائج الحمل السلبية التي تحققت بعد نقل الكيسة الكيسية الدافئة بحرارة. وتجدر الإشارة إلى أنه في حين أن النتيجة الإجرائية تعتمد حصراً على المشغل وعدد الكيسات الكيسية إلى خزعة لكل إجراء، فإن جميع النتائج الأخرى قد تتأثر من مؤسسين آخرين مستقلين عن مشغل الخزعة (على سبيل المثال، الخطوات والمشغلين المشاركة في التحليل الجزيئي، ونوعية مورفولوجية من الكيسة الكيسية، يوم الخزعة) التي ينبغي حسابها لتقييم أدائه بشكل صحيح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: متوسط توقيت الخزعة لكل مشغل عبر الأشهر الثلاثة الـ 8 للدراسة. ويلخص الجدول العدد ذو الصلة من الإجراءات ومتوسط عدد الكيسات الكيسية الكيسية الخزعة لكل إجراء من قبل كل مشغل في الأشهر الثلاثة الدراسة 8. يمثل الخط الأحمر المنقط داخل كل رسم بياني التوقيت المتوسط العام للخزعة (8.24 دقيقة). أشرطة الخطأ هي الانحرافات المعيارية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: إعادة التوسع بعد الاحترار مقابل التوقيت بين خزعة والتزجيج. (أ) يظهر لا إعادة توسيع وإعادة توسيع الكيسات الكيسية 1.5 ساعة بعد الاحترار. يتم تمثيل كل كيسة من قبل دائرة سوداء عبر توقيت متزايد. تمثل الخطوط السوداء العمودية المستمرة 30 دقيقة كعتبة مبكرة و90 دقيقة كعتبة متأخرة. (B) يظهر معدلات إعادة التوسع في المجموعات الثلاث (التوقيت بين خزعة والتزجيج: ≤ 30 دقيقة، 31-90 دقيقة، > 90 دقيقة) مجمعة أخرى وفقا لنوعية الكيسة الكيسية ويوم الخزعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نون من الإجراءات | N الكيسات الكيسية biopsied لكل إجراء | متوسط توقيت خزعة ± SD، مجموعة (دقيقة) | |
| عامل التشغيل 1 | 443 | 2.01 ± 1.09، 1-4 | 7.41 ± 3.6، 3-22 |
| 195 | 1 | 4.75 ± 1.96، 3-16 | |
| 111 | 2 | 7.83 ± 2.45، 3-18 | |
| 71 | 3 | 10.27 ± 2.41، 4-16 | |
| 66 | 4 | 11.48 ± 3.81، 6-22 | |
| عامل التشغيل 2 | 290 | 1.81 ± 0.98، 1-4 | 7.87 ± 4.13، 3-22 |
| 142 | 1 | 5.69 ± 3.32، 3-16 | |
| 89 | 2 | 8.48 ± 2.79، 3-18 | |
| 30 | 3 | 11.37 ± 3.72، 4-20 | |
| 29 | 4 | 13.1 ± 3.89، 9-22 | |
| عامل التشغيل 3 | 287 | 1.98 ± 1.05، 1-4 | 9.10 ± 4.65، 3-22 |
| 121 | 1 | 6 ± 2.19، 3-15 | |
| 89 | 2 | 9.6 ± 3.87، 3-22 | |
| 38 | 3 | 12.66 ± 4.55، 4-22 | |
| 39 | 4 | 14.13 ± 4.8، 6-22 | |
| عامل التشغيل 4 | 217 | 1.66 ± 0.87، 1-4 | 7.58 ± 3.45، 3-22 |
| 118 | 1 | 5.58 ± 1.96، 3-14 | |
| 66 | 2 | 8.92 ± 2.91، 4-22 | |
| 21 | 3 | 11.48 ± 2.34، 5-16 | |
| 12 | 4 | 13 ± 4.26، 6-19 | |
| عامل التشغيل 5 | 144 | 2.03 ± 1.08، 1-4 | 9.43 ± 4.24، 3-22 |
| 59 | 1 | 6.15 ± 2.5، 3-16 | |
| 43 | 2 | 10.07 ± 2.73، 6-16 | |
| 20 | 3 | 12.6 ± 2.89، 9-18 | |
| 22 | 4 | 14.09 ± 4.43، 6-22 | |
| عامل التشغيل 6 | 121 | 1.67 ± 0.94، 1-4 | 7.79 ± 3.93، 3-22 |
| 70 | 1 | 6.19 ± 2.95، 3-16 | |
| 32 | 2 | 8.12 ± 1.72، 3-11 | |
| 9 | 3 | 12.78 ± 3.31، 9-18 | |
| 10 سنوات | 4 | 13.5 ± 6.19، 6-22 | |
| عامل التشغيل 7 | 42 | 1.62 ± 0.94، 1-4 | 14.19 ± 4.24، 6-22 |
| 27 | 1 | 11.85 ± 5.53، 6-16 | |
| 6 | 2 | 16.5 ± 3.73، 11-22 | |
| 7 | 3 | 19.86 ± 3.34، 13-22 | |
| 2 | 4 | 19 ± 4.24، 16-22 | |
| مجموع | 1544 | 1.89 ± 1.03، 1-4 | 8.24 ± 4.23، 3-22 |
| 732 | 1 | 5.78 ± 2.94، 3-16 | |
| 436 | 2 | 8.85 ± 3.14، 3-22 | |
| 196 | 3 | 11.72 ± 3.70، 4-22 | |
| 180 | 4 | 12.93 ± 4.43، 6-22 |
الجدول 1: إجمالي متوسط توقيت خزعة ومتوسط عدد الكيسات الكيسية الكيسية biopsied في كل إجراء وفقا لمشغل خزعة. وقد تبين أيضا متوسط توقيت خزعة وفقا لكل عدد تسلسلي من الكيسات الكيسية الكيسية biopsied لكل إجراء. نموذج خطي معمم يتضمن كلاً من "مشغل خزعة" و"عدد الكيسات الكيسية الكيسية الخزعية لكل إجراء" المتغيرات يرتبط تماماً مع "توقيت خزعة" (R2 = 0.48، الطاقة = 1).
الشكل التكميلي 1: الأجهزة الرئيسية والدعم اللازم للإجراء. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: تحليل الانحدار اللوجستي لا يظهر أي ارتباط كبير بين مشغل خزعة والولادة الحية بعد نقل الكيسة الكيسية النيولويد ية الدافئة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فقط علماء الأجنة المهرة ذوي الخبرة الذين أكملوا فترة تدريبهم يجب أن يقوموا بكل من خزعة TE واستئصال الكيسة الكيسية. وعلاوة على ذلك، يطلب من الشاهد رصد الإجراءات وضمان تتبع فعال خلال i) حركات الكيسة الكيسية الخزعية من طبق الخزعة (الشكلالتكميلي1) إلى طبق ما بعد الخزعة (الشكلالتكميلي 1) )، ثم إلى لوحة التزجيج (الشكلالتكميلي1) وأخيرا إلى دعم التزجيج (الشكلالتكميلي1)؛ '2' نقل خلايا TE الخزعة من طبق الخزعة إلى أنبوب PCR (الشكلالتكميلي1)؛ '3' درجات الاحترار والنقل بعد التشخيص. للحصول على وصف مفصل لجميع خطوات المشاهدة تشير إلى تحليل أوضاع الفشل والآثار (FMEA) التي تم نشرهامسبقًا 14.
جميع الطرق الموصوفة في هذه الورقة تحترم اللائحة المحلية (القانون الإيطالي 40/2004). وفقا للقانون، في الواقع، يمكن للزوجين طلب أن تكون على علم بالحالة الصحية للأجنة التي تنتجها خلال دورة التلقيح الاصطناعي. وفي هذا الصدد، يجب أن يتم التوقيع على موافقة مستنيرة مفصلة على PGT من كلا الشريكين.
في هذه الورقة وصفنا كيفية تنفيذ خزعة الكيسة الكيسية لPGT في روتين المختبر مشغول. كان تطبيق نهج خزعة الكيسة الكيسية تقدما هاما في العقد الماضي في التلقيح الاصطناعي. أول تقرير من قبل دي بوير وزملاؤه في 200417, وقد اعترف قريبا كإجراء أكثر فعالية ومفيدة بالمقارنة مع مرحلة الانقسام وخزعة الجسم القطبية النهج3. قيمة هذا الإجراء تكمن أساسا في الحد من الأعباء التقنية، ولكن أيضا في انخفاض حدوث الفسيفساء الكروموسومات في هذه المرحلة من التنمية18،19. وعلاوة على ذلك، تم اقتراح إزالة عدد قليل من خلايا TE من الكيسة الكيسية كإجراء أكثر أمانا من إزالة blastomere واحد من جنين مرحلة الانقسام. في الواقع، في دراسة عشوائية عدم الاختيار النهج السابق لم يسفر عن أي تأثير على إمكانية زرع الأجنة، في حين أن هذا الأخير ينطوي على تخفيض كبير ~ 20٪20.
ويستتبع البروتوكول المستخدم في الغالب في جميع أنحاء العالم افتتاح زونا بمساعدة الليزر في اليوم الثالث بعد التلقيح. لم يتم إجراء أي تجربة معشاة ذات شواهد حتى الآن لمقارنة النهج خزعة الكيسة الكيسية المختلفة. ومع ذلك، فمن المعقول أنه كلما انخفض عدد عمليات التلاعب والتعرض للأجنة المتنامية لظروف بيئية دون المستوى الأمثل، كلما انخفض احتمال حدوث تدخل في البروتوكول. وعلاوة على ذلك، فإن وجود ثقب في pellucida المنطقة من اليوم 3 من التنمية قد تؤثر على توسع الكيسة الكيسية وتسبب فتق خلايا ICM جنبا إلى جنب مع خلايا TE. لهذه الأسباب، وضعنا ونفذت البروتوكول الموصوف هنا الذي ينطوي على اختراق المناطق بمساعدة الليزر المتسلسلة واسترداد خلايا TE بمجرد أن تصل الكيسة الكيسية إلى التوسع الكامل. كما يوجد بروتوكول مختلف ينطوي على يوم 5 أو 6 يساعد الفقس5،7. وعلى وجه التحديد، يتم حفر المنطقة في اليوم 5 أو 6 من تطوير ما قبل الزرع على الجانب الآخر فيما يتعلق بالإدارة الدولية للزراعة؛ ثم يتم نقل الكيسة الكيسية مرة أخرى إلى الحاضنة في انتظار الفتق التلقائي لخلايا TE. ومن الواضح أنه يجب توفير الرصد الدوري للكيسة الكيسية في الساعات التالية، لخزعة بمجرد أن تبدأ TE الفتق، وكذلك لمنع الجنين من الفقس تماما. إذا كان من ناحية الممارسين غير المهرة يمكن بسهولة تنفيذ هذه الاستراتيجية خزعة بديلة، من ناحية أخرى أنها ليست مناسبة لمختبر مشغول أداء عدة إجراءات في اليوم الواحد. إن بروتوكول الخزعة المتسلسلة لفتح الزونا والكيسة الكيسية الموصوفة هنا هو بدلاً من ذلك أقل استهلاكاً للوقت ويسمح بوقت عملي أقصر ومرونة أعلى لجدولة النشاط اليومي في المختبر لتنسيق الأطر الزمنية المخصصة لـ خزعة وإجراءات التزجيج.
قد تكون الكيسات الكيسية ذات الجودة السيئة أكثر تعقيداً للخزعة لأن خلايا TE يمكن أن تكون لزجة، ولكن المزيد من لقطات الليزر المنسقة مع تمدد الشظية لفضح التقاطعات بين الخلايا كافية لإزالتها من جسم الكيسة الكيسية. يمكن أن تكون الكيسة الكيسية المفقسة بالكامل مفقسة مثل الكيسات الكيسية المغلقة في منطقة بيلوسيدا، ولكنها قد تكون أصعب من التفيري والحارة. في حالة التشخيص غير حاسمة بعد خزعة، والبيانات التي ذكرت حتى الآن متوافقة أنه لا يبدو أن الضرر مستمدة من إعادة خزعة ودورة الاحترار التزجيج التالية16،21.
يستخدم التزجيج حاليا في المركز لإجراء الحفظ بالتبريد الكيسة الكيسية منذ تم الإبلاغ عنها باستمرار أكثر أمانا وأكثر كفاءة وأقل استهلاكا للوقت من بروتوكول التجميد البطيء من استعراض وتحليل تلوي لأحدث المؤلفات 10.
وبمجرد أن تم تأسيس الإجراء وتدريب المشغلين بشكل صحيح، قمنا بإجراء تحليل رجعي لتحديد التوقيتات الإجرائية المثالية لكل من خزعة الكيسة الكيسية وإجراءات التزجيج (ملخصة هنا في النتائج التمثيلية). كنتائج نهائية، قمنا بتقييم معدل إعادة التوسع في الكيسة الكيسية اللولويدية التي تم تقييمها عند 1.5 ساعة بعد الاحترار ومعدل المواليد الحية التي تحققت بعد نقل الجنين الواحد المعتثّف بالمشاعر. لم تلاحظ أي حالة من انحطاط الكيسة الكيسية بعد خزعة، ولم يتم الإبلاغ سوى 0.2٪ (N = 1/572) من معدل الانحطاط بعد الاحترار، مما يؤكد موثوقية الخزعة ونهج التزجيج المعتمدة. ووفقا للتحليل، فإن التوقيت المطلوب لإجراء خزعة الكيسة الكيسية لا يؤثر على صلاحية الكيسات الكيسية الكيسية اللولويدية بعد الاحترار الذي يعرف بأنه معدل إعادة التوسع، أو القدرة الإنجابية التي تعرف بأنها معدل المواليد الحية. على الرغم من أنه يمكن ملاحظة توقيتات مختلفة عبر المشغلين ذوي الخبرة المختلفة، قد نعتبر خزعة الكيسة الكيسية آمنة عند اكتمال الإجراء في حوالي 8 دقائق، في نطاق من 3 إلى 22 دقيقة اعتمادا على عدد الأجنة لكل إجراء (ولكن لا توجد بيانات متاح لإجراءات الخزعة التي يتم إجراؤها على فترات أطول). وينبغي رصد متوسط الوقت الذي يقضيه في خزعة الكيسة الكيسية من كل مشغل واحد بشكل دوري (كل ثلاثة أشهر على الأقل) على أنه مؤشر الأداء الأساسي. وإلى جانب ذلك، ينبغي أيضا معالجة معدل التشخيص غير الحاسم ومعدل المواليد الحيبعد نقل الكيسة الكيسية النيولويدية الدافئة. وأخيرا، حددنا التوقيت المثالي بين خزعة والتزجيج. منذ لاحظنا أعلى معدل إعادة التوسع بعد الاحترار عندما تم المزج ية الكيسات الكيسية في غضون 30 دقيقة من الخزعة، نقترح هذه القيمة كعتبة مثالية. على وجه التحديد، كلما طال الوقت بين خزعة والتزجيج، كلما زاد تمدد الكيسة الكيسية الكيسية الخزعية قبل حفظها بالتبريد. قد يكون هذا ضارًا للبقاء على قيد الحياة بالتبريد، خاصة عند التعامل مع سوء الجودة و/أو اليوم 7 الكيسات الكيسية11. ومع ذلك، لم يلاحظ أي تأثير كبير على النتائج السريرية حتى لو تأخر التزجيج إلى ما بعد 90 دقيقة. ولذلك، قد يسمح في مناسبات متفرقة بمثل هذه المواعيد.
وينبغي ألا تؤثر الطريقة المختارة لاسترداد عينة من الـ PGT على قدرة الجنين على البقاء، وينبغي أن تنطوي على نتائج موثوقة ومفيدة، وينبغي أن تكون فعالة سريريا، وينبغي أن تكون سهلة التنفيذ وبالتالي خفض التكاليف وعبء العمل في المختبرات. خزعة الكيسة الكيسية تفي بجميع هذه المتطلبات الأساسية. ومع ذلك، فإنه لا يزال إجراء الغازية التي يجب أن يؤديها المشغلين المهرة في مختبر مجهزة تجهيزا جيدا. وفي الوقت الراهن، يجري التحقيق في الطليعة التي يقوم بها نهج غير الغازية PGT (niPGT). ربما، في المستقبل، قد يتم تحليل وسائل الإعلام الثقافة المستهلكة بعد التلقيح الاصطناعي لإجراء اختبارات كروموسومية و / أو وراثية. هذا هو منظور المستقبل مثيرة للاهتمام لأن تكاليف عيادة التلقيح الاصطناعي ستكون أقل وسيتم تجنب جميع عبء العمل الذي ينطوي عليه خزعة الجنين. ومع ذلك، فإن موثوقية واستنساخ تحليل وسائل الإعلام المستهلكة للاختبارات الجينية لا يزال يتعين تقييم22،23،24،لذلك يجب بذل المزيد من الجهود لتحديد والتحقق من صحة البروتوكول الذي يمكن أن تناسب جميع عيادات التلقيح الاصطناعي أداء PGT في جميع أنحاء العالم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقامت شركة AG وRM بجمع البيانات وصياغة المخطوطة. وقامت العاصمة بتحليل البيانات، وصياغة النتائج التمثيلية، وإجراء الإحصاءات، وتنقيح المخطوطة. وقدمت جامعة فمو وLR مناقشة نقدية للنتائج وللمخطوطة بأكملها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B. Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. Jansen, R., Mortimer, D. , Parthenon Press. 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
