Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Human blastocyst biopsi og Forvitrifikation

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59625

Summary

Blastocyst biopsi og forvitrifikation er forpligtet til effektivt at udføre præimplantations genetiske test. En fremgangsmåde, der medfører sekventiel åbning af zona pellucida og genfinding af 7-8 trophectoderm-celler i dag 5-7 efter inseminering, begrænser både antallet af nødvendige manipulationer og embryoernes eksponering for suboptimale miljøforhold.

Abstract

Blastocyst biopsi udføres for at opnå en pålidelig genetisk diagnose under IVF-cyklusser med præimplantations genetisk testning. Derefter, den ideelle arbejdsgang indebærer en sikker og effektiv forglasning protokol, på grund af ekspeditionstid af diagnostiske teknikker og til at overføre de udvalgte embryoer (r) på en fysiologisk endometriet i en efterfølgende naturlige cyklus. En biopsi tilgang, der omfatter den sekventielle åbning af zona pellucida og hentning af 5-10 trophectoderm celler (ideelt 7-8) begrænser både antallet af manipulationer kræves og eksponeringen af embryonet til sub-optimale miljøforhold. Efter korrekt træning, var teknikken reproducerbar på tværs af forskellige operatører med hensyn til timing af biopsi (~ 8 min, spænder 3-22 min baseret på antallet af embryoner til biopsi per skål), afgørende diagnoser opnået (~ 97,5%) og levende fødselsrater efter vitrificeret-varmet euploid blastocyst Transfer (> 40%). Overlevelsesraten efter biopsi, forvitrifikation og opvarmning var så høj som 99,8%. Re-ekspansion sats på 1,5 h fra opvarmning var så højt som 97%, i vid udstrækning afhængig af timing mellem biopsi og forvitrifikation (ideelt ≤ 30 min), blastocyst morfologiske kvalitet og dag af biopsi. Generelt er det bedre at vitrificere en kollapset blastocyst; i ikke-PGT-cyklusser kan der derfor udføres laser assisteret kunstig krympning for at inducere embryo kollaps før kryopreserveringen. Det mest lovende fremtidsperspektiv er den ikke-invasive analyse af IVF-kultur medierne efter blastocyst-kulturen som en formodet kilde til embryonale DNA. Denne potentielle avantgarde er imidlertid stadig under efterforskning, og der skal dog fastlægges og valideres en pålidelig protokol.

Introduction

Hovedformålet med moderne menneskelig embryologi er at maksimere antallet levende fødsler pr stimuleret cyklus og reducere omkostninger, tid og indsats for at opnå en graviditet. For at nå dette mål bør der anvendes validerede tilgange til embryo udvælgelse for at identificere reproduktivt kompetente embryoner i en kohorte, som er opnået under en IVF-cyklus. Ifølge de seneste beviser er blastocyst Culture1 kombineret med omfattende kromosomal testning og vitrificeret-opvarmet euploid Embryo Transfer (et) den mest effektive ramme til at øge IVF Efficiency2. Det er klart, at aneuploidi-testning kræver en embryonal prøve, som for øjeblikket for det meste er repræsenteret fra få celler, der er hentet fra trophectoderm (te), dvs den del af blastocyst, som giver oprindelse til embryonale bilag (f. eks. placenta) under graviditet . Ud over karyotype analyse kan også enkelt genmutationer vurderes ud fra en TE biopsi som en del af en klinisk strategi kendt som præimplantation genetisk testning (PGT;-A for aneuploidies,-SR for strukturelle kromosomale rearrangementer,-M for monogene sygdomme). Andre oocyte/embryo biopsi metoder er blevet teoretiseret og vedtaget klinisk i de sidste årtier, nemlig Polar kroppe biopsi og blastomerkerneoverførsel biopsi. Men deres anvendelse reduceres i dag, da deres proceduremæssige ulemper (f. eks. højere arbejdsbyrde og risiko for reproduktiv påvirkning) og diagnostiske begrænsninger (f. eks. problemer med enkelt celle analyse) implicit hindrer en tilstrækkelig balance mellem omkostninger, risici og fordele (for en gennemgang Se3).

I dette dokument er en af de vigtigste protokoller for TE biopsi grundigt beskrevet sammen med de efterfølgende forvitrifikation, opvarmning og overførsel procedurer, der kræves. Den beskrevne arbejdsgang er ideel til en travl PGT-enhed.

Som allerede beskrevet af vores gruppe4,5, omfatter proceduren den sekventielle åbning af zona pellucida af fuldt ekspanderede blastocyster og fjernelse af få te celler (i gennemsnit 7-8). Sammenlignet med den dag 3 laser-assisteret rugeæg-baseret blastocyst biopsi metode6, denne procedure kan lette den daglige tidsplan for en IVF-enhed, hvor sarte procedurer, såsom blastocyst biopsi og forvitning, skal være rettidig udføres. Så snart blastocyst når sin fulde ekspansion, biopsi kan udføres ved at vælge TE celler til at fjerne, og dermed forhindre risikoen for herniation af den indre cellemasse (ICM), som ellers ville gøre proceduren udfordrende. I litteraturen er der også beskrevet en tredje protokol af blastocyst biopsi, som involverer laser assisteret ruge, der udføres, når embryonet allerede har nået blastocyst-stadiet, få timer før proceduren5,7. Denne fremgangsmåde er imidlertid mere tidskrævende og passer hovedsagelig til IVF-enheder, der implementerer TE biopsi i hænderne på ubegrænsede erfarne operatører og i lyset af en moderat lav daglig arbejdsbyrde.

Intracytoplasmatisk sædinjektion (ICSI)8 bør være en konsolideret teknik, hvis der sigtes mod at udføre genetiske analyser i IVF. Tilsvarende er en ordentlig kultur system til sikkert at høste embryoner til blastocyst fase afgørende for gennemførelsen af TE biopsi strategi. Et tilstrækkeligt antal inkubatorer, samt brugen af lav ilt spændinger er vigtige forudsætninger for dette formål, ikke at kompromittere blastocyst sats9. Samtidig er det nødvendigt med et effektivt cryopreservations program for at kunne administrere en PGT-cyklus på en sikker måde. I det sidste årti har gennemførelsen af forvitrifikation boostet embryon kryo-overlevelsesrater selv op til > 99%10,11. Dette gav tilstrækkelig tid til at udføre genetisk testning og udsætte embryo overførsel til følgende menstruationscyklus, på en ikke-stimuleret og sandsynligvis mere modtagelig endometriet12.

Både TE biopsi og vitrificering er krævende opgaver, der kræver strenge færdigheder, og deres effektivitet kan variere på tværs af uerfarne operatører. Der anbefales derfor en særlig uddannelsesperiode, inden hver operatør får mulighed for at udføre disse procedurer klinisk. Desuden bør vedligeholdelsen af operatørernes færdigheder vurderes periodisk ved at overvåge nøgleresultatindikatorer (KPI) for kryopreserverings-og biopsi-procedurer. Hver IVF klinik bør fastsætte interne KPI'er med henblik herpå, som skal tilnærme dem, der offentliggøres af internationale konsortier og/eller resultaterne offentliggjort af referencelaboratorier.

TE biopsi, forvitrifikation-opvarmning og vidne procedurer er validerede teknikker på vores enhed, der er blevet standardiseret på tværs af alle de involverede aktører som rapporteret i tre tidligere publikationer11,13,14 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen for human blastocyst biopsi, her beskrevet, følger retningslinjerne fra G. EN.

Bemærk: Se tabellen over materialer til de nødvendige materialer. Yderligere materiale kræver laboratorie fodtøj og outfit, kirurgisk facemask, hårdække, kirurgiske handsker, en permanent ikke-giftig markør, pincet og desinfektionsmiddel. Brugen af kirurgisk kjole, engangs kirurgiske handsker, ansigtsmaske, hårdække er obligatorisk for at forhindre risiko for kontaminering. Alle arbejdsområder samt det udstyr, der er involveret i processen, skal rengøres grundigt med laboratorie desinfektionsmiddel (f. eks. Oosafe), før der indledes en procedure. Alle anvendte forbrugsstoffer og medier skal være sterile og pakket enkeltvis eller. Det foreslås at bruge en dedikeret arbejdsstation til biopsi og slanger og begrænse adgangen til området kun til de operatører, der er involveret i proceduren (embryo olog og vidne).

1. forberedelse dagen før biopsi proceduren

  1. Forbered post biopsi kultur skålen.
    1. 6 dråber 20 μL IVF-dyrkningsmedium (tabel over materialer) placeres i en IVF-kultur skål og overlejring med 6 ml forvarmet mineralolie til embryo kultur (tabel over materialer).
    2. Tilsæt yderligere 10 μL IVF-kulturmedium til hver dråbe. Inkuber natten over ved 37 °C i en kontrolleret atmosfære (5% O2, 6% Co2).
  2. Forbered en IVF skål 4-brønd plade til skylning af blastocyst efter biopsi.
    1. Placer 600 μL IVF-kulturmedium i de første to brønde og overlejring med 300 μL forvarmet mineralolie til embryo kultur.
    2. Inkuber natten over ved 37 °C i en kontrolleret atmosfære (5% O2, 6% Co2).
  3. Der dispenserer 1,5 μL indlæsnings opløsning (tabel over materialer) i hvert PCR-rør, som skal anvendes til te-cellernes slange, og den opbevares ved 4 °c.

2. forberedelse på dagen for biopsi procedure

  1. Forbered biopsi skålen.
    1. Placer 3 dråber 10 μL HEPES-bufferet medium (suppleret med humant serumalbumin) (tabel over materialer) i træk i en IVF-kulturret.
    2. Gentag trin 1.1.1 efter antallet af tilgængelige blastocyster (op til 4 blastocyster pr. skål) og overlay med 6 mL forvarmet mineralolie til embryo kultur.
    3. Indfør skålen ved 37 °C i mindst 1 time, inden biopsi-proceduren udføres.

3. valg og sortering af blastocyst

  1. Gradere blastocyst i henhold til dens ekspansion og det morfologiske udseende af ICM og TE (figur 1).
    Bemærk:
    klassificeringskriterierne er blevet tilpasset fra Gardner og Schoolcraft15 og tidligere beskrevet af capalbo et al. og cimadomo et al.4,11.
    1. Definer størrelse og ekspansions grad som: a for en fuldt udklækket blastocyst, B for en ruge blastocyst, C for en fuldt udbygget blastocyst, og D for en ikke ekspanderet blastocyst (disse embryoner er kun biopsi, hvis de ikke ekspanderede yderligere op til dag 7).
    2. Definer ICM grade: 1 for mærkbar ICM med flere strengt pakkede celler; 2 for at kunne skelne med flere, men groft pakkede celler; 3 for vanskeligt at skelne med meget få lav-kvalitet celler.
    3. Definer TE grade som følger: 1 for velorganiseret epitelet med flere celler; 2 for løs epitelet med få celler; 3 for få og/eller store lavkvalitets celler.

4. trophectoderm biopsi

  1. Udfør te biopsi på alle de levedygtige fuldt ekspanderede blastocyster (fortrinsvis C grade for størrelse og ekspansion).
  2. Sæt bedrift og biopsi pipetter for hver biopsi procedure. Anbefalingerne til biopsi pipetten er følgende: 30 μm indvendig diameter, 35 ° Bøjningsvinkel, 0,75 mm afstands spids til bøjning.
  3. Mærk biopsi skålen med patientens detaljer (kvindens navn og efter navn, fødselsdato og ID), og tal derefter hvert fald med embryoer og cyklus-id'er. Brug en permanent ikke-giftig markør.
  4. Overfør blastocyst med en 300 μm stripping pipette til den første dråbe af biopsi skålen og skyl den for at fjerne overskydende af kulturmedium. Flyt derefter blastocyst i den anden dråbe af biopsi skålen.
  5. Flyt skålen til det inverterede mikroskop og Prime biopsi pipetten aspirerer nogle medium fra den tredje dråbe af biopsi skålen.
  6. Ved 20x forstørrelse, orientere blastocyst at have en klar visning af ICM. Når det er visualiseret klokken 7 (modsat det område, der vil være målrettet til at fjerne TE celler), fastgør embryonet på bedriften pipetten (figur 2a).
  7. Fokuser på zona pellucida og få oplyst, at både pipetterne og blastocyst er på samme brændplan.
  8. Skift til laserens mål (puls tid 0,3 MS, 6,5 μm) og Placer laser markøren på zona pellucida på den modsatte side af ICM. Bor zona pellucida gennem 2 − 3 laser impulser (figur 2b).
  9. Tryk forsigtigt biopsi pipetten mod zona pellucida og blæse nogle medium gennembruddet for at løsne TE celler fra sin indre overflade og fremskynde blastocyst kollaps (figur 2c).
  10. Når te er løsrevet (figur 2D), skal du indtaste gennem hullet (hvis det er nødvendigt, gøre det bredere med en sidste laser puls) og aspirere nogle te celler (ideelt 7 − 813,16) ind i biopsi pipetten med blid sugning (figur 2E).
  11. Bevæg biopsi-pipetten lidt bagud, mens du anvender en moderat sugning for at strække målcellerne (figur 2F).
  12. Dirigere laseren mod den tyndeste del af de aspirerede celler og ild 2 − 5 laser impulser ved vejkryds mellem cellerne for at adskille målcellerne fra embryoens legeme (figur 2g). Timingen af laser pulser og antallet af bælgfrugter kan justeres i henhold til kvaliteten af blastocyst; Men, forsøge at minimere dem for at undgå cellelyse.
  13. Efter adskillelse af TE-fragmentet fra blastocyst (figur 2H), frigives det til den samme biopsi dråbe langt fra blastocyst. Dette er nødvendigt for at forhindre, at de igen suges ind i biopsi pipetten (figur 2i).
  14. Slip blastocyst fra holde pipetten og løft straks begge pipetter for at forhindre, at fragmentet klæber til dem.
  15. Tag et billede af det biopsierede fragment til kvalitetskontrol formål (figur 3).
    Bemærk: Hvis mere end en enkelt blastocyst skal biopsieres pr. procedure (op til fire pr. biopsi skål), ændres biopsi pipetten med en ny for at forhindre krydskontaminering mellem embryoner.
  16. Gentag trin 4.1 − 4.13.
  17. Flyt biopsi skålen tilbage til laminar flow hætten.
  18. Mærk den post-biopsi kultur skål med parret ID, og hvert fald med embryonet og cyklus ID.
  19. I nærværelse af et vidne, skyl blastocyst i ren IVF medium, og endelig flytte den til den tilsvarende dråbe af post-biopsi skålen.
  20. Flyt efter biopsi skålen til inkubator i en kontrolleret atmosfære (37 °C, 6% CO2,5% O2) indtil forvitrifikation. Det er tilrådeligt at udføre vitrifikation inden for 30 minutter fra biopsi procedure, for at forhindre blastocyst re-ekspansion.

5. slanger

Bemærk: Hele proceduren skal udføres i nærværelse af et vidne og inde i laminar flow hætte ved stuetemperatur. Under proceduren skal PCR-rørene opbevares i en kold rørs rist på is (supplerende figur 1).

  1. Mærk PCR-rørene med en permanent ikke-giftig markør.
    Bemærk: Mærkning skal udføres som krævet af det genetiske laboratorium. Generelt, patientens navn og efter navn (initialer), par ID, embryo og cyklus ID (for eksempel: JD 12345 1,2 for embryo N. 1 af 2nd Cycle tilhører Jane Doe hvis par ID er 12345). Embryo-ID skal også rapporteres i bogstaver på røret.
  2. Mærk låget på en 60 mm x 15 mm kultur skål (slange skål) med de biopsierede embryoer (supplerende figur 1), og Forbered 2 10 μl dråber biopsi vaskeopløsning (tabel over materialer) i den.
  3. Prime 140 μm stripping pipette (supplerende figur 1) med nogle biopsi vaskeopløsning fra den anden dråbe af slangen skålen.
  4. Placer biopsi skålen under stereomicroskop for nemt at visualisere TE fragment (r).
  5. Slip forsigtigt nogle biopsi vaskeopløsning på TE fragment; Læg den derefter i stripping-pipetten.
  6. Flyt TE-fragmentet til den anden dråbe biopsi vaskeopløsning i slange skålen og skyl den forsigtigt 2 − 3 gange.
  7. Overføre TE-fragmentet til bunden af PCR-røret (tidligere mærket efter det) med læsse opløsning, idet man skal være opmærksom på at undgå at røre ved væggene med spidsen af stripping pipetten.
  8. Gentag proceduren fra trin 5,3 til trin 5,7 for hvert TE fragment, og Vær opmærksom på at bruge en ny kapillar for hver TE fragment.
  9. Ved afslutningen af slangen procedure, sætte alle PCR rør i en mini centrifuge, og spin dem i nogle få sekunder.
  10. Prøverne opbevares ved-20 °C, indtil de afsendes til det henvisende genetiske laboratorium til afprøvning.

6. blastocyst Forvitrifikation

  1. Vitrify kollapsede blastocyster inden for 30 minutter fra TE biopsi for at forhindre deres re-ekspansion.
  2. Mærk forvitrifikationpladen med kvindens detaljer og id'erne for blastocysterne, der skal vitrificeres.
  3. Mærk forvitrifikation støtte (r) med kvindens navn og efter navn, par ID, ID af embryonet, der vil blive indlæst på det, samt datoen for proceduren. Der anvendes særlige cryolabels, som bevarer deres integritet selv ved meget lav temperatur (-196 °C).
  4. Ved stuetemperatur dispenserer 0,3 mL ækvibrationsvæske (ES) (tabel over materialer) for hver blastocyst, der vil blive vitrificeret.
  5. I nærværelse af et vidne, flytte blastocyst i ES ved hjælp af 300 μm stripping pipette.
  6. Lad blastocyst være i ES i 13 − 15 minutter. Efter en indledende krympning af volumen, en gradvis re-ekspansion vil blive observeret.
  7. Fyld et lille køle stativ med flydende nitrogen (LN2), og Anbring det under laminar flow hætten.
  8. Dispensere 300 μl forglasning opløsning (vs) (tabel over materialer) i den anden brønd. Efter blastocyst komplet re-ekspansion, overføre det i VS-opløsningen i 1 min og skyl den for at fortynde ES.
  9. I nærværelse af et vidne, indlæse blastocyst på forvitrifikation støtte og tage sig af at fjerne overskydende af VS. En diskret film af opløsning bør omgive blastocyst.
  10. Spring forvitrifikation støtte ind i LN2 og flytte det energisk for at reducere risikoen for bobledannelse tæt på prøven.
  11. Anbring beskyttelseshætten, mens vitrifikationsupporten holdes nedsænket i LN2.
  12. I nærværelse af et vidne, flytte forglasning støtte i en lang sigt LN2 Opbevaringstank.

7. kunstig krympning af ikke-biopsierede blastocyster

  1. Hvis der ikke foretages en TE biopsi, kollapser blastocysterne kunstigt umiddelbart før forvitrifikation (figur 4).
    1. Flyt kultur skålen fra inkubator til det inverterede mikroskop og Fokuser på det valgte embryo.
    2. Skift til laserens mål (forudindstillet puls: 0,3 MS, 6,5 μm), mål zona pellucida på den modsatte side af ICM, og direkte 1 – 2 laser impulser til vejkryds mellem TE-celler i sikker afstand fra ICM. Blastocysterne skal kollapse i mindre end 5 minutter.
  2. Fortsæt med forvitrifikation af den kollapsede blastocyst som beskrevet i afsnit 6.

8. overdrages blastocyst Warming

  1. På dagen for ET, Forbered ET 4-brønd plade ved at placere 600 μL præ-ækvibreret IVF-kulturmedium for hver brønd. Inkubér ved 37 °C i en kontrolleret atmosfære (5% O2, 6% Co2), mens der udføres blastocyst-opvarmning.
  2. Mærk opvarmnings skålen med kvindens navn og efter navn, par ID, ID for embryonet, der vil blive varmet i det.
  3. 1 mL optønings opløsning (TS) (tabel over materialer) dispenserer i en IVF-brønd skål (supplerende figur 1) og varme den til 37 °c i en termostat i mindst 1 time, inden proceduren påbegyndes.
  4. Fyld en lille køle støtte med LN2 og Placer den i laminar flow hætten i nærheden af arbejdsområdet.
  5. Før du starter proceduren, kontrollere blastocyst oplysninger rapporteret om forvitrifikation støtte. Alle id'er skal matche den genetiske rapport og blastocyst til varme skal vælges blandt de omsættelige dem. Der kræves et vidne under proceduren.
  6. Tag den ene-brønd skål, der indeholder varmede TS ud af termostaten, og Placer den på en opvarmet scene under stereomicroskop.
  7. Træk over beskyttelseshætten i LN2 ved hjælp af pincet.
  8. Springet hurtigt spidsen af forvitrifikation støtte i 37 °C TS.
  9. Under mikroskopisk observation skal du forsigtigt flytte forglasning-støtten, indtil blastocyst frigives fra spidsen.
  10. Lad blastocyst i alt 1 min i TS, opmærksom på at holde det i bunden af TS.
  11. Ved stuetemperatur dispenserer 200 μL fortyndings opløsning (DS) (tabel over materialer) på første brønd af forvitrifikationspladen.
  12. Overfør blastocyst til DS og Placer den i bunden af brønden, mens du slipper nogle TS på toppen af den for at skabe en slags gradient. Lad det i 3 min.
  13. 200 μL vaskeopløsning (WS) dispenserer i 2 forskellige brønde (WS1 og WS2).
  14. Overfør blastocyst til WS1 og Placer den på bunden af brønden, mens du frigiver nogle DS medium på toppen af den. Derefter overføre blastocyst til WS2 og lade det uforstyrret i 1 min.
  15. Mærk post-Warming ET plade med kvindens navn og efter navn, par ID, ID af embryonet, der vil blive dyrket i det.
  16. I nærværelse af et vidne, overføre den varmede blastocyst til præ-equilibrated kulturmedium i post-Warming ET plade.
  17. Skyl blastocyst i det første brønd af ET plade og Placer den i den anden brønd.
  18. Efter opvarmningen af kultur skålen overføres til inkubator i en kontrolleret atmosfære (37 °C, 6% CO2,5% O2) og kulturen blastocyst i mindst 1,5 h før kontrol af dens overlevelse og re-ekspansion.
    Bemærk: Figur 5 viser eksempler på degenereret, Cryo-overlevede, men ikke re-ekspanderet og Cryo-overlevede og fuldt udbygget blastocysts.

9. Embryooverførsel

  1. For at udføre ET, Placer skålen på den opvarmede fase af laminar flow hætten, så fosteret er synligt under mikroskopet ved en lav forstørrelse.
  2. Tag ca. 0,4 mL IVF-kulturmedium. Fastgør sprøjtespidsen fast i den modtagende ende af det indvendige kateter, og slip derefter mediet op til 0,1 mL.
  3. Aspirere dyrkningsmedium indtil observere embryonerne ind i kateteret (minimal mængde af medier: 10 − 15 μL).
  4. Anbring kateteret i plastik etuiet og gå til operationsstuen og Placer det indvendige kateter i den eksterne vejledning.
  5. Når du har nået livmoderen, skal du skubbe sprøjtestemplet for at frigøre embryonet (erne). Slip meget langsomt mediet, indtil stemplet læser 0,1 mL.
  6. Tag kateteret tilbage til laboratoriet og tjek under mikroskopet, at embryonet er blevet overført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 6 repræsenterer en ordning med alle resultaterne af en biopsi procedure, der kan vedtages for at standardisere protokollen og overvåge udførelsen af hver operatør. Det vigtigste proceduremæssige resultat er timingen til at fuldføre biopsi/biopsier; det vigtigste tekniske resultat er kvaliteten af plottet produceret efter genetisk testning, der kan resultere i enten en endegyldig eller inkonklusiv diagnose, hvoraf sidstnævnte kræver en re-biopsi af udiagnosticeret blastocyst; det vigtigste biologiske resultat er hastigheden af Cryo-overlevelse og re-ekspansion versus degeneration efter opvarmning; Endelig er det primære kliniske resultat den levende fødselsrate efter vitrified-varmet blastocyst-overførsel. I tre tidligere undersøgelser rapporterede vi de KPI'er, der er defineret i Center (r) for de tekniske, biologiske og kliniske resultater11,13,16. Herefter rapporterer vi i stedet, hvordan KPI'EN for timingen af biopsi blev defineret. Desuden blev den formodede indflydelse af timingen mellem biopsi og vitrificering på post-Warming opførsel af euploid blastocyster også undersøgt.

I en 2-årig periode blev i alt 1.544 trophectoderm biopsi procedurer udført af 7 operatører (tabel 1). Alle biopsierede blastocyster blev derefter flyttet tilbage til inkubator i en post-biopsi kultur skål indtil forvitrifikation. Alle relevante data blev indsamlet i en relationsdatabase. Alle Timinger af biopsi og mellem biopsi og forvitrifikation blev retrospektivt indhentet fra softwaren i IVF elektronisk vidne system. Dataene blev derefter eksporteret og analyseret for statistik.

Kryo-overlevelsesraten for euploid blastocyster efter trophectoderm biopsi og forvitrifikation-opvarmning var N = 571/572, 99,8%. Re-ekspansions raten ved 1,5 h efter opvarmning var N = 556/571, 97,4%. Blandt de 15 ikke re-ekspanderede blastocysts, en resulterede i en levende fødsel efter at være blevet overført i utero. Den levende fødselsrate efter vitrified-varmet euploid enkelt blastocyst overførsel var N = 227/572, 39,7%.

Definition af den ideelle timing af biopsi

Tabel 1 opsummerer de relevante data for de gennemførte biopsi-procedurer. Samlet var 1,89 ± 1,03 (område 1-4) blastocyster biopsieret pr. procedure i 8,24 ± 4,23 min (interval 3-22). Den gennemsnitlige timing af biopsi varierede på grund af både antallet af blastocyster biopsi pr. procedure, fra et minimum på 5,78 ± 2,94 min (interval 3-16), når kun ét embryo blev lagt i skålen til et maksimum på 12,93 ± 4,43 min (interval 6-22), når embryonerne sekventielt biopsi vi re 4. En anden relevant parameter var den operatør, der var involveret i proceduren: den mest ekspert (N = 443 procedurer) var den hurtigste (7,41 ± 3,6 min, Range 3-22), mens den mindst erfarne (N = 42) var den langsomste (14,19 ± 4,24 min, Range 6-22). En generaliseret lineær model, der indebærer både "antallet af blastocyster biopsi pr. procedure" og "Operator"-variablerne, forklarer perfekt "timing af biopsi" med en R2 = 0,48 og en effekt = 1. Denne analyse var nyttigt at definere, at ideelt ~ 6 min er nok til en blastocyst biopsi procedure, når kun et embryon er lagt i skålen, mens ~ 9 min, ~ 12 min og ~ 13 min for 2, 3 og 4 blastocysts, hhv. Det er klart, hele proceduren indebærer også at flytte embryoner fra kulturen til biopsi skålen og fra sidstnævnte til post-biopsi kultur skålen efter proceduren, samt at ændre biopsi pipette mellem sekventielle biopsier.

Figur 7 afbilde den gennemsnitlige timing af biopsi for hver operatør langs studiet trimester (fra 1St til 8th). Den stiplede røde linje identificerer den gennemsnitlige samlede værdi på 8,24 min. En sådan Graf er nyttig til at overvåge den gennemsnitlige præstation af hver praktiserende læge. F. eks. viste de mest erfarne operatører (1 og 2) et konstant fald i denne timing, hvilket tyder på en tendens, der er typisk for en indlæringskurve. Alle operatørerne fra 3 til 6 var i stedet tilstrækkeligt konstante i deres præstationer omkring den gennemsnitlige samlede værdi på tværs af trimesterne. Når som helst de viste et højdepunkt i middelværdi fra et givet trimester (f. eks operatør 3 i 7th trimester, operatør 4 i 6th trimester, operatør 5 i 3Rd trimester), blev de advaret for at revidere deres præstationer. Operatør 7 (dvs. den mindst erfarne) viste tidsindstillinger typisk for en embryo olog, der netop har afsluttet sin uddannelse. Muligvis, han/hun vil opfylde de standarder interne til laboratoriet som den ekspertise vil stige.

Det er vigtigt, at tidspunktet for biopsi var ens på tværs af re-ekspanderet og ikke re-ekspanderet euploid blastocyster på 1,5 h fra opvarmning (9,52 ± 4,23 min, interval 3-22 versus 10,5 ± 5,68 min, Range 4-22; t-test = 0,37). Sandsynligt, implanteret (n = 229) og ikke implanteret (n = 343) vitrificeret-opvarmet euploid blastocyster viste også sammenlignelige biopsi tidsindstillinger (9,77 ± 4,15 min, interval 3-22 versus 9,41 ± 4,36 min, Range 3-22; t-test = 0,39). Muligvis så, en timing ≤ 22 min til biopsi op til 4 blastocyster påvirker ikke embryo adfærd efter opvarmning. Derfor har vi defineret denne værdi som maksimum tærskel.

Tilsvarende blev der ikke påvist nogen forskel med hensyn til levende fødselsrate på tværs af de forskellige biopsi operatører, som allerede rapporteret tidligere13 (supplerende tabel 1).

En anden vigtig parameter til at overvåge den enkelte operatørs præstationer er hastigheden af inkonklusive resultater efter diagnosen, som bør være så tæt som muligt på den generelle præstation af hvert laboratorium. Ideelt set bør denne sats ikke overstige 2,5% og kan falde med tiden på grund af en stigende ekspertise i biopsi og slange procedurer16. Målet antallet af te-celler til at hente er 7-8 ifølge to tidligere undersøgelser13,16. Med henblik herpå foreslås det at tage et billede af det biopsierede fragment til kvalitetskontrol formål (se nogle eksempler i figur 3). Et sådant billede kan kontrolleres i tilfælde af inkonklusive diagnoser for at vurdere, om årsagen var årsag til Fragmentets dimension/kvalitet (dvs. den molekylære analyses lave kvalitet), til slangen (dvs. svigt af DNA-amplifikation) eller til nogle problemer i behandlingen af prøven i det genetiske laboratorium.

Definition af den ideelle timing mellem biopsi og forvitrifikation

I studieperioden blev 572 euploid blastocyster varmet til at gennemgå en embryo overførsel efter en diagnose af euploidy. Figur 8a viser hver opvarmet blastocyst som en sort cirkel fordelt på tværs af den stigende timing mellem biopsi og forvitrifikation og grupperet i to grupper i henhold til resultatet under undersøgelse: re-ekspanderet eller ikke re-ekspanderet inden for 1,5 h fra Opvarmning. Alle blastocysterne (N = 117/117) vitrificeret inden for 30 min., 97,6% (N = 245/251) af blastocysterne, der blev vitrificeret mellem 31-90 min og 95,1% (N = 194/204) af blastocysterne, der blev vitrificeret ud over 90 min re-ekspanderede, henholdsvis (ingen re-udvidelses rater: 0%, 2,4% og 4,9%). Derfor sætter vi 30 min og 90 min som de tidlige og sene tærskler for tid mellem biopsi og forvitrifikation.

Figur 8b viser re-ekspansions raten i de tre grupper (≤ 30 min, 31-90 min, > 90 min) yderligere sub-Clustered efter blastocyst kvalitet og dag for præimplantation udvikling. Især for dårlig kvalitet og/eller dag 7 blastocysts, timingen mellem biopsi og forvitrifikation synes afgørende for at opnå re-ekspansion efter opvarmning. Specifikt, odds-forholdet af re-ekspansion efter opvarmning korrigeret for både blastocyst kvalitet og dag af biopsi i blastocyster forglasset inden for 30 min fra biopsi versus blastocyster vitrificeret ud over 90 min var 3,05 (95% CI 1.01-9.4, p = 0,05). I stedet repræsenterede perioden mellem disse to tærskler (31-90 min) et gråt område, der måske eller måske ikke havde nogen virkning.

Kun 1 ud af 15 ikke re-ekspanderet blastocyster resulterede i en levende fødsel efter overførsel. Derfor har vi endelig undersøgt den levende fødselsrate opnået efter varmet euploid enkelt blastocyst overførsel grupperet i de tre grupper efter timing mellem biopsi og forvitrifikation. Den højeste levende fødselsrate blev opnået ved at overføre euploid blastocyster vitrificeret ≤ 30 min fra trophectoderm biopsi (N = 56/117, 47,9%). Dette resultat nåede imidlertid ikke Statistisk signifikans i forhold til det samme resultat, som blev opnået enten med blastocyster, som blev vitrificeret mellem 31 og 90 min (N = 92/251, 36,7%; Fishers eksakte test = 0,06), eller med blastocyster vitrificeret > 90 min fra biopsi (N = 81/204, 39,7%; Fishers eksakte test = 0,16). Derfor er enten en negativ effekt på blastocyst reproduktive kompetence ubetydelig, eller stikprøvestørrelsen i dette datasæt (N = 572) var utilstrækkelig til at opnå Statistisk signifikans.

Figure 1
Figur 1: parametre for blastocyst-sortering. Ekspansion: (A) fuldt udklækket, (B) i klækning, (C) fuldt udbygget, og (D) ikke ekspanderet. Den ideelle fase er C, mens en blastocyst D bør gives mere tid til at opnå fuld ekspansion, medmindre denne fase er nået i dag 7; Indvendig cellemasse (ICM) morfologiske kvalitet: 1 (mærkbar med flere strengt pakkede celler), 2 (kan skelne med flere, men groft pakkede celler) og 3 (vanskeligt at skelne med meget få lav-kvalitet celler); trophectoderm (te) morfologisk kvalitet: 1 (velorganiseret epitel med flere celler), 2 (løs epitel med få celler) og 3 (få og/eller store lav-kvalitet celler). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Resumé af den sekventielle zona pellucida (ZP) åbning og trophectoderm (te) celler hentning tilgang til blastocyst biopsi. (a) orientere blastocyst med den indre cellemasse (ICM) tæt på holde pipetten og langt fra det sted, hvor de valgte te-celler vil blive hentet. Fastgør blastocyst på holde pipetten; (b) åbne ZP gennem 2-3 laser skud; (c) blæse nogle kultur medier gennem hullet; d) blastocyst løsnes fra ZP. (e) Indtast ZP og SUTTE 5-10 te celler i biopsi pipetten; f) bevæge sig baglæns med biopsi pipetten for at strække det valgte fragment og udsætte vejkryds mellem cellerne g) brand ved vejkryds mellem cellerne og Fortsæt med at strække fragmentet, indtil te-cellerne frigives fra blastocyst-kroppen h) blastocyst efter te biopsi er kollapset (i) tage et billede af biopsi fragment for kvalitetskontrol og overføre det til PCR tube, der vil blive sendt til det genetiske laboratorium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: eksempler på biopsi fragmenter: (a-c) ønskværdige fragmenter; d) lyseres-fragment e) lille fragment med degenererede celler f) små, delvist lyserede og degenererede fragmenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: kunstig svind. (a) orientere blastocyst, således at den indre cellemasse (ICM) er langt fra den målrettede del af trophectoderm (te); (b) brand 2-3 laser skud i træk ved vejkryds mellem te-celler og bevægelige udad; c) vent på, at blastocyst kollapser, inden forvitrifikation påbegyndes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: eksempler på blastocyst degeneration (a), Cryo-overlevelse, men ingen re-ekspansion (b) og Cryo-overlevelse og fuld re-ekspansion (c) 1,5 h efter opvarmning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Resumé af de forskellige resultater af trophectoderm biopsi, som kan anvendes til at overvåge en operatørs præstationer og definere de vigtigste præstationsindikatorer internt for hvert laboratorium. Det vigtigste proceduremæssige resultat er timingen af biopsi. Det vigtigste tekniske resultat er den rate af konklusive (euploid eller aneuploid) og inkonklusive diagnoser (re-biopsi påkrævet) opnået; sidstnævnte kan være forårsaget af DNA amplifikation eller lav kvalitet molekylære data, begge resulterer i ikke-fortoldbare kromosom kopi nummer profil plots. Det vigtigste biologiske resultat er hastigheden af kryo-overlevelse og re-ekspansion eller degeneration efter biopsi, forvitrifikation og opvarmning. Det vigtigste kliniske resultat er antallet af levendefødte eller negative graviditetsudfald opnået efter vitrified-varmet blastocyst overførsel. Bemærk, at selv om procedure resultatet udelukkende afhænger af operatøren og antallet af blastocyster til biopsi pr. procedure, kan alle andre resultater blive påvirket af andre confoundere, der er uafhængige af biopsi operatøren (f. eks. de trin og operatører, der involveret i den molekylære analyse, den morfologiske kvalitet af blastocyst, den dag af biopsi), der skal bogføres til korrekt evaluere hans/hendes præstation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: gennemsnitlig timing af biopsi pr. operatør på tværs af de 8 studie trimestere. Tabellen opsummerer det relaterede antal procedurer og det gennemsnitlige antal blastocyster biopsierede pr. procedure af hver enkelt operatør i de 8 forsøgs trimester. Den stiplede røde linje i hver graf repræsenterer den samlede gennemsnitlige timing af biopsi (8,24 min). Fejllinjerne er standardafvigelserne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: re-ekspansion efter opvarmning versus timing mellem biopsi og forvitrifikation. (A) viser ikke re-ekspanderet og re-ekspanderet blastocyster 1,5 hr efter opvarmning. Hver blastocyst repræsenteres af en sort cirkel på tværs af de stigende tidsindstillinger. De lodrette, kontinuerlige sorte linjer repræsenterer 30 min. indstillet som tidlig tærskel og 90 min indstillet som sen tærskel. B) viser re-ekspansions raten i de tre grupper (timing mellem biopsi og forvitrifikation: ≤ 30 min, 31-90 min, > 90 min) yderligere grupperet efter blastocyst kvalitet og dag af biopsi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

N af procedurer N blastocyster biopsi pr. procedure Gennemsnitlig timing af biopsi ± SD, interval (min.)
Operatør 1 443 2,01 ± 1,09, 1-4 7,41 ± 3,6, 3-22
195 1 4,75 ± 1,96, 3-16
111 2 7,83 ± 2,45, 3-18
71 3 10,27 ± 2,41, 4-16
66 4 11,48 ± 3,81, 6-22
Operator 2 290 1,81 ± 0,98, 1-4 7,87 ± 4,13, 3-22
142 1 5,69 ± 3,32, 3-16
89 2 8,48 ± 2,79, 3-18
30 3 11,37 ± 3,72, 4-20
29 4 13,1 ± 3,89, 9-22
Operator 3 287 1,98 ± 1,05, 1-4 9,10 ± 4,65, 3-22
121 1 6 ± 2,19, 3-15
89 2 9,6 ± 3,87, 3-22
38 3 12,66 ± 4,55, 4-22
39 4 14,13 ± 4,8, 6-22
Operatør 4 217 1,66 ± 0,87, 1-4 7,58 ± 3,45, 3-22
118 1 5,58 ± 1,96, 3-14
66 2 8,92 ± 2,91, 4-22
21 3 11,48 ± 2,34, 5-16
12 4 13 ± 4,26, 6-19
Operatør 5 144 2,03 ± 1,08, 1-4 9,43 ± 4,24, 3-22
59 1 6,15 ± 2,5, 3-16
43 2 10,07 ± 2,73, 6-16
20 3 12,6 ± 2,89, 9-18
22 4 14,09 ± 4,43, 6-22
Operatør 6 121 1,67 ± 0,94, 1-4 7,79 ± 3,93, 3-22
70 1 6,19 ± 2,95, 3-16
32 2 8,12 ± 1,72, 3-11
9 3 12,78 ± 3,31, 9-18
10 4 13,5 ± 6,19, 6-22
Operatør 7 42 1,62 ± 0,94, 1-4 14,19 ± 4,24, 6-22
27 1 11,85 ± 5,53, 6-16
6 2 16,5 ± 3,73, 11-22
7 3 19,86 ± 3,34, 13-22
2 4 19 ± 4,24, 16-22
Samlede 1544 1,89 ± 1,03, 1-4 8,24 ± 4,23, 3-22
732 1 5,78 ± 2,94, 3-16
436 2 8,85 ± 3,14, 3-22
196 3 11,72 ± 3,70, 4-22
180 4 12,93 ± 4,43, 6-22

Tabel 1: Den totale gennemsnitlige timing af biopsi og det gennemsnitlige antal blastocyster biopsieret i hver procedure i henhold til biopsi operatør. Den gennemsnitlige timing af biopsi er også vist i henhold til hvert sekventielt antal blastocyster biopsi pr. procedure. En generaliseret lineær model, der omfatter både "biopsi operatør" og "antallet af blastocyster biopsi per procedure" variabler perfekt korrelerer med "timing af biopsi" (R2 = 0,48, Power = 1).

Supplerende figur 1: vigtigste anordninger og understøtter, der kræves til proceduren. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1: Logistisk regressionsanalyse viser ikke nogen signifikant sammenslutning mellem biopsi operatøren og levende fødsel efter vitrified-varmet euploid blastocyst overførsel. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kun velerfarne, dygtige embryologer, der har afsluttet deres træningsperiode, skal udføre både TE biopsi og blastocyst vitrification. Endvidere er et vidne forpligtet til at overvåge procedurerne og sikre en effektiv sporbarhed under i) flytninger af biopsieret blastocyst fra biopsi skålen (supplerende figur 1) til post-biopsi skålen (supplerende figur 1 ), derefter til forvitrifikationpladen (supplerende figur 1) og til sidst til Forvitrifikation (supplerende figur 1) II) overførsel af biopsierede TE celler fra biopsi skålen til PCR tube (supplerende figur 1); III) opvarmnings-og overførsels trinnene efter diagnosticering. For en detaljeret beskrivelse af alle vidne trin refererer til en fejltilstande og effektanalyse (FMEA) tidligere offentliggjort14.

Alle de metoder, der er beskrevet i dette dokument, respekterer den lokale lovgivning (italiensk lov 40/2004). I henhold til loven kan parret faktisk anmode om at blive informeret om sundhedsstatussen for de embryoner, de producerede i løbet af IVF-cyklussen. I den forbindelse skal der underskrives et detaljeret informeret samtykke til PGT fra begge parter.

I dette papir beskrev vi, hvordan man implementerer blastocyst biopsi til PGT i en travl laboratorie rutine. Anvendelsen af blastocyst biopsi tilgang har været et vigtigt fremskridt i det sidste årti i IVF. Først rapporteret af de boer og kolleger i 200417, er det blevet snart anerkendt som en mere effektiv og informativ procedure i forhold til spaltning scenen og Polar krop biopsi tilgange3. Værdien af denne procedure ligger hovedsageligt i en reduktion af de tekniske byrder, men også i en lavere forekomst af kromosomal mosaisme på dette stadium af udviklingen18,19. Desuden er fjernelsen af få te celler fra en blastocyst blevet foreslået som en sikrere procedure end fjernelse af en blastomerkerneoverførsel fra et kavalergang embryon. I en randomiseret ikke-udvælgelses undersøgelse resulterede den tidligere tilgang ikke i nogen indvirkning på embryo implantations potentialet, mens sidstnævnte involverede en signifikant ~ 20% reduktion20.

Den protokol, der oftest anvendes på verdensplan, indebærer laser assisteret Zona åbning i dag 3 efter inseminering. Ingen randomiserede kontrolleret forsøg er blevet gennemført til dato for at sammenligne de forskellige blastocyst biopsi tilgange. Men det er rimeligt, at jo lavere antallet af manipulationer og eksponeringer af de voksende embryoner til suboptimale miljøforhold, jo lavere den potentielle invasivitet af protokollen. Desuden kan tilstedeværelsen af et hul i zona pellucida fra dag 3 i udvikling påvirke blastocyst ekspansion og forårsage herniation af ICM celler sammen med TE celler. Af disse grunde, vi satte og implementeret den protokol, der er beskrevet her, som indebærer den sekventielle laser-assisteret Zona overtræder og te celler hentning, så snart blastocyst når fuld ekspansion. Der findes også en anden protokol, som indebærer en dag 5 eller 6 assisteret ruge5,7. Specifikt udføres boringen af Zona på dag 5 eller 6 af præimplantations udvikling på den modsatte side med hensyn til ICM; blastocyst flyttes derefter tilbage til inkubator og venter på spontan hernisering af TE-celler. Det er klart, at periodisk overvågning af blastocyst skal gives i de følgende timer, at biopsi det, så snart TE vil begynde at hykle, samt at forhindre embryonet fra klækning helt. Hvis på den ene side ufaglærte praktikere nemt kan gennemføre denne alternative biopsi strategi, på den anden side er det ikke egnet til en travl laboratorium udfører flere procedurer per dag. Den sekventielle Zona åbning og blastocyst biopsi protokol beskrevet her er i stedet mindre tidskrævende og giver mulighed for en kortere hands-on tid og en højere fleksibilitet til at planlægge den daglige aktivitet i laboratoriet, så at koordinere tidsrammer dedikeret til biopsi og forvitrifikation procedurer.

Dårlig kvalitet blastocyster kan være mere komplekse at biopsi, da te-cellerne er klæbrig, men flere laser skud koordineret med strækning af fragmentet for at afsløre kryds mellem cellerne er tilstrækkelige til at fjerne det fra kroppen af blastocyst. Fuldt udklækket blastocyst kan biopsieret som blastocyster indesluttet i zona pellucida, men de kan være sværere at vitrify og varm. I tilfælde af inkonklusive diagnoser efter biopsi er de data, der er indberettet til dato, samstemmende, at ingen skade synes at stamme fra en re-biopsi og en følgende vitrification-opvarmning cyklus16,21.

Forvitrifikation anvendes i øjeblikket i midten til at udføre blastocyst kryopræservering, da det er blevet konsekvent rapporteret sikrere, mere effektiv og mindre tidskrævende end langsom frysning protokol fra en gennemgang og meta-analyse af den seneste litteratur 10.

Når proceduren var veletableret og operatørerne ordentligt uddannet, vi udførte en retrospektiv analyse for at definere de ideelle proceduremæssige tidsindstillinger for både blastocyst biopsi og forvitrifikation procedurer (opsummeret her i de repræsentative resultater). Som endelige resultater har vi vurderet reekspansions raten for euploid blastocyst evalueret ved 1,5 h efter opvarmning og den levende fødselsrate opnået efter vitrificeret-opvarmet euploid enkelt embryo overførsel. Der blev ikke observeret nogen tilfælde af blastocyst degeneration efter biopsi, og kun 0,2% (N = 1/572) af degeneration sats blev rapporteret efter opvarmning, bekræfter pålideligheden af biopsi og forvitrifikation tilgange vedtaget. Ifølge analysen påvirker den timing, der kræves for at udføre blastocyst biopsi, hverken euploid blastocysts levedygtighed efter opvarmning defineret som re-ekspansions hastighed eller reproduktions potentiale defineret som levende fødselsrate. Selv om forskellige tidsindstillinger kan observeres på tværs af operatører med forskellig ekspertise, kan vi overveje blastocyst biopsi sikker, når proceduren er afsluttet i ca 8 min, i et interval fra 3 til 22 min afhængigt af antallet af embryoner pr procedure (dog ingen data er tilgængelige for biopsi procedurer udført i længere intervaller). Den gennemsnitlige tid, der bruges på blastocyst biopsi fra hver enkelt operatør, bør periodisk (mindst hver tredje måned) overvåges som KPI. Sideløbende med, at satsen for inkonklusive diagnose og den levende fødselsrate efter vitrified-varmet euploid blastocyst overførsel bør også behandles. Endelig skitserede vi den ideelle timing mellem biopsi og forvitrifikation. Da vi observerede den højeste re-ekspansion sats efter opvarmning, når blastocyster blev vitrificeret inden for 30 min fra biopsi, vi foreslår denne værdi som den ideelle tærskel. Specifikt, jo længere tid mellem biopsi og forvitrifikation, jo mere biopsi blastocyst vil re-ekspandere, før de bliver cryopreserved. Dette kan være skadeligt for Cryo-overlevelse, især når der beskæftiger sig med dårlig kvalitet og/eller dag 7 blastocyster11. Ikke desto mindre blev der ikke observeret nogen signifikant indvirkning på de kliniske resultater, selv om vitrificering var forsinket ud over 90 min. Derfor kan sådanne tidsindstillinger i sporadiske situationer tillades.

Den metode, der vælges til at hente en prøve for PGT, bør ikke påvirke embryo levedygtigheden, bør omfatte pålidelige og informative resultater, bør være klinisk effektiv og bør være let at gennemføre og derved reducere omkostningerne og laboratorie belastningen. Blastocyst biopsi opfylder alle disse forudsætninger. Ikke desto mindre er det stadig en invasiv procedure, der skal udføres af dygtige operatører i et veludstyret laboratorium. I øjeblikket er avantgarde af en ikke-invasiv PGT (niPGT) tilgang under efterforskning. Måske, i fremtiden, de brugte kultur medier efter IVF kan analyseres for at udføre kromosomale og/eller genetisk testning. Dette er et spændende fremtidsperspektiv, da omkostningerne til IVF klinikken ville være lavere, og al den arbejdsbyrde, som embryo biopsi ville indebære, ville blive omgået. Pålideligheden og reproducerbarhed af brugte medie analyser til genetisk testning skal dog stadig vurderes22,23og24, og der skal derfor investeres mere for at definere og validere en protokol, som kan passer til alle IVF-klinikker, som udfører PGT på verdensplan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

AG og RM indsamlede data og udarbejdede manuskriptet. DC analyserede dataene, udarbejdede de repræsentative resultater, udførte statistikken og reviderede manuskriptet. FMU og LR gav en kritisk drøftelse af resultaterne og af hele manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Cold tube rack Biocision XTPCR96
Electronic pipette controller Fisher Scientific 710931
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
IVF Electronic Witness System CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions RI Witness ART Management System
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Laser objective RI Saturn 5
Microinjectors Nikon Narishige NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes Eppendorf CSLQSPIN for 0.2 mLl PCR tubes
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermostat Panasonic MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Consumables
Biopsy pipette RI 7-71-30FB35720 30 µm ID, flat 35 °C
Cryolock Cryolock CL-R-CT
CSCM complete Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter Cook G17934
Flexipet pipette Cook G26712 140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette Cook G46020 300µm stripping pipette tips
Holding pipette RI 7-71-IH35/20 30 µm ID, flat 35 °C
Human Serum Albumin Irvine Scientific 9988
IVF One well dish Falcon 353653
Mineral Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Irvine Scientific 90126 Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface Thermofisher scientific 176740 IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish Corning 353802 60 mm x15 mm
Reproplate Kitazato 83016
Serological pipette Falcon 357551 10ml
Sterile disposable Gilson tips Eppendorf 0030 075.021 200 µL
Tubing Kit Provided by the genetic lab PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media Kitazato VT801 Equilibration and vitrification solutions
Warming media Kitazato VT802 Thawing and dilution solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
  2. Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
  3. Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
  4. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
  5. Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
  6. McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
  7. Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
  8. Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
  9. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  10. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  11. Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
  12. Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
  13. Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
  14. Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
  15. Gardner, D. K., Schoolcraft, B. Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. Jansen, R., Mortimer, D. , Parthenon Press. 377-388 (1999).
  16. Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
  17. de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
  18. Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
  19. McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
  20. Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  21. Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
  22. Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  23. Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
  24. Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).

Tags

Udviklingsmæssige biologi præimplantations genetiske test (PGT) blastocyst trophectoderm biopsi nøgletal (KPI) forvitrering opvarmning kunstig krympning
Human blastocyst biopsi og Forvitrifikation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maggiulli, R., Giancani, A.,More

Maggiulli, R., Giancani, A., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human Blastocyst Biopsy and Vitrification. J. Vis. Exp. (149), e59625, doi:10.3791/59625 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter