Summary
La biopsie et la vitrification de Blastocyst sont nécessaires pour mener efficacement le test génétique préimplantatoire. Une approche impliquant l'ouverture séquentielle de la pellucida de zona et la récupération de 7-8 cellules de trophectoderm dans le jour 5-7 post-insémination limite le nombre de manipulations exigées et l'exposition de l'embryon aux conditions environnementales sous-optimales.
Abstract
La biopsie de Blastocyst est effectuée pour obtenir un diagnostic génétique fiable pendant des cycles de FIV avec l'essai génétique préimplantatoire. Ensuite, le flux de travail idéal implique un protocole de vitrification sûr et efficace, en raison du délai d'exécution des techniques de diagnostic et de transférer l'embryon sélectionné sur un endomètre physiologique dans un cycle naturel suivant. Une approche de biopsie englobant l'ouverture séquentielle de la zona pellucida et la récupération de 5-10 cellules de trophectoderm (idéalement 7-8) limite le nombre de manipulations exigées et l'exposition de l'embryon aux conditions environnementales sous-optimales. Après une formation adéquate, la technique a été reproductible entre différents opérateurs en termes de synchronisation de la biopsie (8 min, allant de 3 à 22 min en fonction du nombre d'embryons à la biopsie par plat), diagnostics concluants obtenus (97,5%) et les taux de natalité vivante après le transfert de blastocyste euploïde vitrifié (40 %). Le taux de survie après biopsie, vitrification et réchauffement était aussi élevé que 99,8%. Le taux de réexpansion à 1,5 h du réchauffement était aussi élevé que 97%, en grande partie dépendant du moment entre la biopsie et la vitrification (idéalement 30 min), la qualité morphologique blastocyste et le jour de la biopsie. En général, il est préférable de vitrifier un blastocyste effondré; par conséquent, dans les cycles non-PGT, le rétrécissement artificiel laser-assisté pourrait être exécuté pour induire l'effondrement d'embryon avant la cryoconservation. La perspective future la plus prometteuse est l'analyse non invasive des médias de culture de FIV après la culture blastocyste comme source putative de l'ADN embryonnaire. Toutefois, cette avant-garde potentielle est toujours à l'étude et un protocole fiable doit encore être défini et validé.
Introduction
L'objectif principal de l'embryologie humaine moderne est de maximiser le nombre de naissances vivantes par cycle stimulé et de réduire les coûts, le temps et les efforts pour atteindre une grossesse. Pour atteindre cet objectif, des approches validées pour la sélection des embryons devraient être utilisées pour identifier les embryons compétents en matière de reproduction au sein d'une cohorte obtenue au cours d'un cycle de FIV. Selon les dernières preuves, la culture blastocyste1 combinée à des tests chromosomiques complets et au transfert d'embryons euploïdes vitrifiés (ET) est le cadre le plus efficace pour augmenter l'efficacité de la FIV2. De toute évidence, le dépistage de l'anéuploïde nécessite un spécimen embryonnaire, qui est actuellement principalement représenté à partir de quelques cellules extraites du trophectoderm (TE), c'est-à-dire la section du blastocyste qui donne naissance aux annexes embryonnaires (par exemple, le placenta) pendant la grossesse . Au-delà de l'analyse karyotype, des mutations génétiques uniques pourraient également être évaluées à partir d'une biopsie TE dans le cadre d'une stratégie clinique connue sous le nom de test génétique préimplantatoire (PGT; -A pour les anéuploidies, -SR pour les réarrangements chromosomiques structurels, -M pour les maladies monogéniques). D'autres méthodes de biopsie d'ovocyte/embryon ont été théorisées et adoptées cliniquement au cours des dernières décennies, à savoir la biopsie des corps polaires et la biopsie blastomere. Cependant, leur utilisation est réduite de nos jours puisque leurs inconvénients procéduraux (p. ex., charge de travail et risque accrus d'impact sur la reproduction) et leurs limitations diagnostiques (p. ex., problèmes d'analyse cellulaire unique) entravent implicitement un équilibre suffisant entre les coûts, les risques et les avantages (pour un examen voir3).
Dans cet article, l'un des protocoles principaux pour la biopsie de TE est soigneusement décrit avec les procédures suivantes de vitrification, de réchauffement et de transfert exigées. Le flux de travail décrit ici est idéal pour une unité DE TGP occupée.
Comme déjà décrit précédemment par notre groupe4,5, la procédure implique l'ouverture séquentielle de la pellucida zona de blastocystes entièrement élargis et l'élimination de quelques cellules TE (en moyenne 7-8). Comparée à la méthode de biopsie blastocyste à base d'éclosion laser-assistée36, cette procédure pourrait faciliter le programme quotidien d'une unité de FIV où les procédures délicates, telles que la biopsie blastocyste et la vitrification, doivent être exécutées en temps opportun. Dès que le blastocyste atteint sa pleine expansion, la biopsie peut être effectuée en sélectionnant les cellules TE à enlever, empêchant ainsi le risque d'hernie de la masse cellulaire interne (ICM), ce qui rendrait autrement la procédure difficile. Dans la littérature, un troisième protocole de biopsie blastocyste a également été décrit, qui implique l'éclosion au laser assistée étant effectuée une fois que l'embryon a déjà atteint le stade blastocyste, quelques heures avant la procédure5,7. Cependant, cette approche prend plus de temps et convient principalement aux unités de FIV qui mettent en œuvre la biopsie TE entre les mains d'opérateurs peu expérimentés et en raison d'une charge de travail quotidienne modérée-faible.
L'injection de spermatozoïdes intracytoplasmatic (ICSI)8 devrait être une technique consolidée si l'objectif de mener des analyses génétiques dans la FIV. De même, un système de culture approprié pour récolter en toute sécurité les embryons au stade blastocyste est crucial pour la mise en œuvre de la stratégie de biopsie TE. Un nombre suffisant d'incubateurs, ainsi que l'utilisation de faible tension d'oxygène sont des conditions préalables clés à cette fin, de ne pas compromettre le taux de blastocyste9. En même temps, un programme de cryoconservation efficace est nécessaire pour gérer en toute sécurité un cycle pgT. Au cours de la dernière décennie, la mise en œuvre de la vitrification a augmenté les taux de cryo-survie des embryons, même jusqu'à 99 %10,11. Cela a fourni suffisamment de temps pour effectuer des tests génétiques et reporter le transfert d'embryons au cycle menstruel suivant, sur un endomètre non stimulé et probablement plus réceptif12.
La biopsie TE et la vitrification exigent des tâches exigeantes et leur efficacité peut varier d'un opérateur inexpérimenté à l'autre. Une période de formation spécifique est donc préconisée avant de permettre à chaque opérateur d'effectuer ces interventions cliniquement; en outre, le maintien des compétences des opérateurs devrait être évalué périodiquement en surveillant les indicateurs de performance clés (KPI) pour les procédures de cryoconservation et de biopsie. Chaque clinique de FIV doit définir les indicateurs de la santé interne à cette fin, qui doivent se rapprocher de ceux publiés par les consortiums internationaux et/ou des résultats publiés par les laboratoires de référence.
La biopsie TE, le réchauffement de la vitrification et les procédures de témoignage sont des techniques validées dans notre unité, qui ont été normalisées dans tous les opérateurs impliqués comme indiqué dans trois publications précédentes11,13,14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le protocole pour la biopsie humaine de blastocyste, ici décrit, suit les lignes directrices du comité d'éthique de recherche humaine de G.EN.E.R.A.
REMARQUE: Consultez le Tableau des matériaux pour les matériaux requis. D'autres matériaux requis comprennent des chaussures et des tenues de laboratoire, un masque chirurgical, un couvre-cheveux, des gants chirurgicaux, un marqueur permanent non toxique, des forceps et du désinfectant. L'utilisation d'une blouse chirurgicale, de gants chirurgicaux jetables, d'un masque facial, d'une couverture capillaire est obligatoire pour prévenir les risques de contamination. Toutes les zones de travail, ainsi que l'équipement impliqué dans le processus, doivent être nettoyés à fond avec du désinfectant de laboratoire (p. ex., Oosafe) avant de commencer toute procédure. Tous les consommables et les supports utilisés doivent être stériles et emballés individuellement ou aliquoted. Il est suggéré d'utiliser un poste de travail dédié à la biopsie et à la tuyauterie et de limiter l'accès de la zone uniquement aux opérateurs impliqués dans la procédure (embryologiste et témoin).
1. Préparation le jour avant la procédure de biopsie
-
Préparer le plat de culture post biopsie.
- Placer 6 gouttes de 20 l de culture FIV (Tableau des matériaux) dans un plat de culture FIV et la reposition de 6 ml d'huile minérale préchauffée pour la culture embryonnaire (Tableau des matériaux).
- Ajouter un autre 10 'L de milieu de culture DE FIV à chaque goutte. Incuber toute la nuit à 37 oC dans une atmosphère contrôlée (5 % O2, 6 % CO2).
-
Préparer un plat de FIV 4-bien assiette pour rincer le blastocyste après la biopsie.
- Placez 600 ll de milieu de culture de FIV dans les deux premiers puits et regroupez-vous de 300 l d'huile minérale pré-chauffée pour la culture embryonnaire.
- Incuber toute la nuit à 37 oC dans une atmosphère contrôlée (5 % O2, 6 % CO2).
- Distribuer 1,5 L de solution de chargement (Table of Materials) dans chaque tube PCR à utiliser pour les tubes des cellules TE, le faire tourner et le garder à 4 oC.
2. Préparation le jour de la procédure de biopsie
-
Préparer le plat de biopsie.
- Placer 3 gouttes de 10 l hePES-tamponné milieu (complété avec l'albumine de sérum humain) (Table of Materials) dans une rangée dans un plat de culture FIV.
- Répétez l'étape 1.1.1 selon le nombre de blastocystes disponibles (jusqu'à 4 blastocystes par plat) et recassez avec 6 ml d'huile minérale pré-chauffée pour la culture embryonnaire.
- Incuber le plat à 37 oC pendant au moins 1 h avant d'effectuer la biopsie.
3. Sélection et classement Blastocyst
-
Grade le blastocyste en fonction de son expansion et l'apparence morphologique de ICM et TE (Figure 1).
REMARQUE : Les critères de classement ont été adaptés de Gardner et Schoolcraft15 et précédemment décrits par Capalbo et coll. et Cimadomo et al.4,11.- Définissez la taille et la teneur d'expansion comme : A pour un blastocyste entièrement éclos, B pour un blastocyste d'éclosion, C pour un blastocyste entièrement élargi, et D pour un blastocyste non étendu (ces embryons sont biopsiés seulement s'ils ne se sont pas étendus plus loin jusqu'au jour 7).
- Définir icM grade: 1 pour ICM notable avec plusieurs cellules strictement emballées; 2 pour discernable avec plusieurs cellules, mais grossièrement emballées; 3 pour difficile à distinguer avec très peu de cellules de mauvaise qualité.
- Définir la catégorie TE comme suit : 1 pour l'épithélium bien organisé avec plusieurs cellules ; 2 pour l'épithélium lâche avec peu de cellules ; 3 pour peu et/ou de grandes cellules de faible qualité.
4. Biopsie de trophectoderm
- Effectuez une biopsie TE sur tous les blastocystes viables entièrement élargis (de préférence de catégorie C pour la taille et l'expansion).
- Définir les pipettes de fixation et de biopsie pour chaque procédure de biopsie. Les recommandations pour la pipette de biopsie sont les suivantes : 30 m de diamètre interne, angle de courbure de 35 degrés, pointe de distance de 0,75 mm à plier.
- Étiquetez le plat de biopsie avec les détails du patient (nom et prénom de la femme, date de naissance et iD) et faites ensuite le numéro de chaque goutte avec des iD d'embryon et de cycle. Utilisez un marqueur permanent non toxique.
- Transférer le blastocyste à l'arme de 300 m pour décaper la première goutte du plat de biopsie et le rincer afin d'éliminer l'excès de milieu de culture. Déplacez ensuite le blastocyste dans la deuxième goutte du plat de biopsie.
- Déplacer le plat au microscope inversé et amorcer la pipette de biopsie en apitant un milieu à partir de la troisième goutte du plat de biopsie.
- À 20x grossissement, orienter le blastocyste pour avoir une vue claire de l'ICM. Lorsqu'il est visualisé à 7 heures (en face de la zone qui sera ciblée pour enlever les cellules TE), fixez l'embryon sur la pipette de retenue (figure 2a).
- Concentrez-vous sur la zona pellucida et s'assurer que les pipettes et le blastocyste sont sur le même plan focal.
- Passez à l'objectif laser (temps d'impulsion 0,3 ms, 6,5 m) et placez le pointeur laser sur la zona pellucida du côté opposé de l'ICM. Percer la zona pellucida à travers 2 3 impulsions laser (Figure 2b).
- Appuyez doucement sur la pipette de biopsie contre la zona pellucida et soufflez un peu de milieu à travers la brèche pour détacher les cellules TE de sa surface interne et accélérer l'effondrement du blastocyste (Figure 2c).
- Une fois que le TE est détaché (Figure 2d), entrez par le trou (si nécessaire, le rendre plus large avec une dernière impulsion laser) et aspirez peu de cellules TE (idéalement 7-813,16) dans la pipette de biopsie avec une aspiration douce (Figure 2e).
- Déplacez légèrement la pipette de biopsie vers l'arrière tout en appliquant une aspiration modérée pour étirer les cellules cibles (Figure 2f).
- Dirigez le laser vers la partie la plus mince des cellules aspirées et tirez des impulsions laser de 2 à 5 aux jonctions entre les cellules pour séparer les cellules cibles du corps de l'embryon (Figure 2g). Le moment des impulsions laser et le nombre d'impulsions peuvent être ajustés en fonction de la qualité du blastocyste; cependant, essayez de les minimiser pour éviter la lyse cellulaire.
- Après la séparation du fragment te du blastocyste (Figure 2h), relâchez-le dans la même goutte de biopsie loin du blastocyste. Ceci est nécessaire pour éviter qu'ils ne soient à nouveau aspirés dans la pipette de biopsie (figure 2i).
- Relâchez le blastocyste de la pipette de retenue et soulevez rapidement les deux pipettes pour empêcher le fragment de s'y coller.
- Prenez une photo du fragment biopsié à des fins de contrôle de la qualité (figure 3).
REMARQUE : Si plus d'un seul blastocyste doit être biopsié par procédure (jusqu'à quatre par plat de biopsie), changez la pipette de biopsie avec une nouvelle pour empêcher la contamination croisée entre les embryons. - Répétez les étapes 4.1-4.13.
- Déplacez le plat de biopsie vers le capuchon à débit laminaire.
- Étiquetez le plat de culture post-biopsie avec l'ID du couple, et chaque goutte avec l'embryon et l'ID du cycle.
- En présence d'un témoin, rincez le blastocyste dans un milieu de FIV propre, et enfin déplacez-le à sa goutte correspondante du plat post-biopsie.
- Déplacer le plat post-biopsie à l'incubateur dans une atmosphère contrôlée (37 oC, 6 % CO2, 5 % O2) jusqu'à la vitrification. Il est conseillé d'effectuer la vitrification dans les 30 minutes de la procédure de biopsie, pour empêcher la ré-expansion blastocyste.
5. Tubing
REMARQUE: L'ensemble de la procédure doit être effectué en présence d'un témoin et à l'intérieur du capot à débit laminaire à température ambiante. Pendant la procédure, garder les tubes PCR dans un support à tube froid sur la glace (Figure supplémentaire 1).
- Étiqueter les tubes PCR avec un marqueur permanent non toxique.
REMARQUE: L'étiquetage doit être effectué à la demande du laboratoire génétique. En général, le nom et le nom de famille du patient (initiales), l'iD de couple, l'embryon et l'iD de cycle (par exemple : JD 12345 1.2 pour l'embryon N.1 du 2ème cycle appartenant à Jane Doe dont l'ID de couple est 12345). L'ID d'embryon devrait également être rapporté dans les lettres sur le corps du tube. - Étiquetez le couvercle d'un plat de culture de 60 mm x 15 mm (plat de tube) avec les iD des embryons biopsiés (figuresupplémentaire 1) et préparez-y deux gouttes de 10 l de solution de lavage de biopsie (Tableaudes matériaux).
- Premier la pipette de décapage de 140 m (figuresupplémentaire 1) avec une solution de lavage de biopsie de la deuxième goutte du plat de tuyauterie.
- Placez le plat de biopsie sous le stéréomicroscope pour visualiser facilement le fragment TE(s).
- Libérez doucement une solution de lavage de biopsie sur le fragment te ; puis, chargez-le dans la pipette de décapage.
- Déplacez le fragment te à la deuxième goutte de la solution de lavage de biopsie dans le plat de tuyauterie et rincez-le soigneusement 2/3 fois.
- Transférer le fragment TE au fond du tube PCR (précédemment étiqueté après lui) avec la solution de chargement, en prêtant attention pour éviter de toucher ses parois avec la pointe de la pipette de décapage.
- Répétez la procédure de l'étape 5.3 à l'étape 5.7 pour chaque fragment TE, en prêtant attention à l'utilisation d'un nouveau capillaire pour chaque fragment TE.
- À la fin de la procédure de tuyauterie, mettre tous les tubes PCR dans une mini centrifugeuse, et les faire tourner pendant quelques secondes.
- Entreposer les échantillons à -20 oC jusqu'à ce qu'ils les expédient au laboratoire génétique référé pour les tester.
6. Vitrification blastocyste
- Vitrify s'est effondré blastocystes dans les 30 min de la biopsie TE pour empêcher leur ré-expansion.
- Étiquetez la plaque de vitrification avec les détails de la femme et les iD des blastocystes qui doivent être vitrifiés.
- Étiquetez le support de vitrification (s) avec le nom et le nom de famille de la femme, l'ID de couple, l'iD de l'embryon qui sera chargé sur elle, aussi bien que la date de la procédure. Des cryolabels spéciaux sont utilisés qui préservent leur intégrité même à très basse température (-196 oC).
- À température ambiante, distribuer 0,3 ml de solution d'équilibre (ES) (tableaudes matériaux)pour chaque blastocyste qui sera vitrifié.
- En présence d'un témoin, déplacez le blastocyste en ES à l'aide de la pipette de décapage de 300 m.
- Laisser le blastocyste dans l'ES pendant 13 à 15 min. Après un premier rétrécissement du volume, une réexpansion graduelle sera observée.
- Remplissez une petite grille de refroidissement d'azote liquide (LN2) et placez-la sous le capot d'écoulement laminaire.
- Dispense 300 L de solution de vitrification (VS) (Tableau des Matériaux) dans le deuxième puits. Après la réexpansion complète du blastocyste, transférez-le dans la solution VS pendant 1 min et rincez-le pour diluer l'ES.
- En présence d'un témoin, chargez le blastocyste sur le support de vitrification et prenez soin d'enlever l'excès de VS. Un film subtil de solution devrait entourer le blastocyste.
- Plongez le support de vitrification dans Le LN2 et déplacez-le énergiquement afin de réduire le risque de formation de bulles près du spécimen.
- Placez le bouchon de protection tout en gardant le support de vitrification immergé dans le LN2.
- En présence d'un témoin, déplacez le support de vitrification dans un réservoir de stockage LN2 à long terme.
7. Rétrécissement artificiel des blastocystes non biopsiés
-
Si aucune biopsie TE n'est effectuée, effondrez artificiellement les blastocystes immédiatement avant la vitrification (Figure 4).
- Déplacez le plat de culture de l'incubateur au microscope inversé et concentrez-vous sur l'embryon sélectionné.
- Passez à l'objectif laser (impulsion pré-fixée : 0,3 ms, 6,5 m), ciblez la zona pellucida du côté opposé de l'ICM, puis dirigez des impulsions laser de 1 à 2 vers les jonctions entre les cellules TE à une distance sécuritaire de l'ICM. Les blastocystes devraient s'effondrer en moins de 5 min.
- Procéder à la vitrification du blastocyste effondré tel que décrit dans la section 6.
8. Réchauffement de Blastocysttransférable
- Le jour de l'ET, préparez la plaque ET 4-puits en plaçant 600 L de milieu de culture de FIV pré-équilibré pour chaque puits. Incuber à 37 oC dans une atmosphère contrôlée (5 % O2, 6 % CO2), tout en effectuant un réchauffement blastocyste.
- Étiquetez le plat chauffant avec le nom et le nom de famille de la femme, l'ID de couple, l'iD de l'embryon qui sera réchauffé en lui.
- Distribuer 1 ml de la solution de décongélation (TS) (tableaudes matériaux)dans un plat iVF d'un puits (figuresupplémentaire 1) et le réchauffer à 37 oC dans un thermostat pendant au moins 1 h avant de commencer la procédure.
- Remplissez un petit support de refroidissement avec LN2 et placez-le dans le capot d'écoulement laminaire à proximité de la zone de travail.
- Avant de commencer la procédure, vérifiez les informations blastocystes rapportées sur le soutien de vitrification. Toutes les pièces d'intention doivent correspondre au rapport génétique et le blastocyste au chaud doit être choisi parmi les plus transférables. Un témoin est requis pendant l'intervention.
- Sortez le plat d'un puits contenant de la TS réchauffée du thermostat et placez-le sur une scène chauffée sous le stéréomicroscope.
- Tirez sur le bouchon de protection dans le LN2 à l'aide de forceps.
- Plongez rapidement la pointe du support de vitrification dans le TS de 37 oC.
- Sous observation microscopique, déplacez doucement le support de vitrification jusqu'à ce que le blastocyste soit libéré de la pointe.
- Laissez le blastocyste pendant un total de 1 min dans le TS, en faisant attention pour le garder au fond de la TS.
- À température ambiante, distribuez 200 l de solution de dilution (DS) (Tableaudes matériaux)sur le premier puits de la plaque de vitrification.
- Transférer le blastocyste à DS et le placer au fond du puits tout en libérant un peu de TS sur le dessus de celui-ci pour créer une sorte de gradient. Laisser agir 3 min.
- Distribuer 200 l de solution de lavage (WS) dans 2 puits différents (WS1 et WS2).
- Transférer le blastocyste à WS1 et le placer sur le fond du puits tout en libérant un peu de milieu DS sur le dessus de celui-ci. Ensuite, transférer le blastocyste à WS2 et le laisser intact pendant 1 min.
- Étiquetez la plaque ET post-réchauffement avec le nom et le nom de la femme, l'ID de couple, l'iD de l'embryon qui sera cultivé en elle.
- En présence d'un témoin, transférez le blastocyste réchauffé au milieu de culture pré-équilibré dans la plaque ET post-réchauffement.
- Rincer le blastocyste dans le premier puits de la plaque ET et le placer dans le deuxième puits.
- Transférer le plat de culture post-réchauffement à l'incubateur dans une atmosphère contrôlée (37 oC, 6 % CO2, 5 % O2) et culture du blastocyste pendant au moins 1,5 h avant de vérifier sa survie et sa réexpansion.
REMARQUE: La figure 5 montre des exemples de blastocystes dégénérés, cryo-survivants, mais non réexpansés et cryo-survivants et entièrement expansés.
9. EmbryoTransfert
- Pour effectuer ET, placez le plat sur la scène chauffée de la hotte à débit laminaire, de sorte que l'embryon est visible sous le microscope à un faible grossissement.
- Prenez environ 0,4 ml de milieu de culture FIV. Fixez fermement la pointe de la seringue dans l'extrémité de réception du cathéter interne, puis relâchez le milieu jusqu'à 0,1 ml.
- Aspirez le milieu de culture jusqu'à ce qu'ils observent les embryons entrant dans le cathéter (quantité minimale de milieux : 10 à 15 l).
- Placez le cathéter dans le boîtier en plastique et allez à la salle d'opération et placez le cathéter interne dans le guide externe.
- Une fois atteint l'utérus, poussez le piston de seringue pour libérer l'embryon. Relâchez très lentement le milieu jusqu'à ce que le piston lisse 0,1 ml.
- Aprenez le cathéter au laboratoire et vérifiez au microscope que l'embryon a été transféré.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 6 représente un schéma de tous les résultats d'une procédure de biopsie qui peut être adoptée pour normaliser le protocole et surveiller le rendement de chaque opérateur. Le principal résultat procédural est le moment pour terminer la biopsie/biopsies; le principal résultat technique est la qualité de l'intrigue produite après des tests génétiques qui pourraient entraîner un diagnostic concluant ou non concluant, ce dernier qui nécessite une re-biopsie du blastocyste non diagnostiqué; le principal résultat biologique est le taux de cryo-survie et de réexpansion par rapport à la dégénérescence après le réchauffement; enfin, le résultat clinique principal est le taux de natalité vivante après le transfert vitrifié-chauffé de blastocyst. Dans trois études précédentes, nous avons rapporté les KPI définis au centre (s) pour les résultats techniques, biologiques et cliniques11,13,16. Par la suite, nous rapportons plutôt comment l'IpCE pour le moment de la biopsie a été défini. En outre, l'influence putative du moment entre la biopsie et la vitrification sur le comportement post-réchauffement des blastocystes euploïdes a également été étudiée.
Au cours d'une période de 2 ans, un total de 1 544 procédures de biopsie du trophectoderm ont été effectuées par 7 exploitants (tableau1). Tous les blastocystes biopsiés ont ensuite été déplacés vers l'incubateur dans un plat de culture post-biopsie jusqu'à la vitrification. Toutes les données pertinentes ont été recueillies dans une base de données relationnelle. Tous les moments de biopsie et entre la biopsie et la vitrification ont été obtenus rétrospectivement à partir du logiciel du système électronique de témoin de FIV. Les données ont ensuite été exportées et analysées pour obtenir des statistiques.
Le taux de cryo-survie des blastocystes euploïdes après la biopsie trophectoderm et le réchauffement de la vitrification était N 571/572, 99,8%. Le taux de réexpansion à 1,5 h après le réchauffement était N 556/571, 97,4%. Parmi les 15 blastocystes non re-élargis, un a eu comme conséquence une naissance vivante après avoir été transféré in utero. Le taux de natalité vivante après le transfert de blastocyste unique vitrifié-chauffé était N-227/572, 39,7%.
Définition du moment idéal de la biopsie
Le tableau 1 résume les données pertinentes des procédures de biopsie effectuées. Dans l'ensemble, 1,89 à 1,03 (gamme 1-4) blastocystes ont été biopsied par procédure dans 8,24 - 4,23 min (gamme 3-22). Le moment moyen de la biopsie a varié en raison du nombre de blastocystes biopsiés par procédure, d'un minimum de 5,78 à 2,94 min (gamme 3-16) lorsqu'un seul embryon a été déposé dans le plat jusqu'à un maximum de 12,93 à 4,43 min (gamme 6-22) lorsque les embryons ont été biopsiénaux re 4. Un autre paramètre pertinent était l'opérateur impliqué dans la procédure : le plus expert (N - 443 procédures) était le plus rapide (7,41 à 3,6 min, gamme 3-22), tandis que le moins expérimenté (N - 42) était le plus lent (14,19 à 4,24 min, gamme 6-22). En effet, un modèle linéaire généralisé impliquant à la fois le « nombre de blastocystes biopsiés par procédure » et les variables « opérateur » explique parfaitement le « moment de la biopsie » avec un R2 à 0,48 et une puissance 1. Cette analyse a été utile pour définir qu'idéalement 6 min est suffisant pour une procédure de biopsie blastocyste lorsque seulement un embryon est posé dans le plat, tandis que 9 min, 12 min et 13 min pour 2, 3 et 4 blastocystes, respectivement. De toute évidence, l'ensemble de la procédure consiste également à déplacer les embryons de la culture vers le plat de biopsie et de ce dernier au plat de culture post-biopsie après la procédure, ainsi que de changer la pipette de biopsie entre les biopsies séquentielles.
La figure 7 trace le moment moyen de la biopsie pour chaque opérateur le long des trimestres d'étude (du 1er au 8 e). La ligne rouge pointillée identifie la valeur globale moyenne de 8,24 min. Un tel graphique est utile pour surveiller la performance moyenne de chaque praticien. Par exemple, les opérateurs les plus experts (1 et 2) ont montré une diminution constante de ce calendrier, ce qui suggère une tendance typique d'une courbe d'apprentissage. Tous les opérateurs de 3 à 6 ont plutôt été suffisamment constants dans leur performance autour de la valeur globale moyenne à travers les trimestres. Chaque fois qu'ils montraient un pic de la valeur moyenne d'un trimestre donné (p. ex., opérateur 3 au 7e trimestre, opérateur 4 au 6e trimestre, opérateur 5 au 3e trimestre), ils ont été avertis afin de revoir leurs performances. L'opérateur 7 (c.-à-d. le moins expérimenté) a montré des chronométrages typiques d'un embryologiste qui vient de terminer sa formation. Peut-être qu'il répondra aux normes internes au laboratoire à mesure que l'expertise augmenterait.
Fait important, le temps de la biopsie était semblable dans les blastocystes euploïdes réélargi et non réélargi à 1,5 h du réchauffement (9,52 à 4,23 min, gamme 3-22 contre 10,5 à 5,68 min, gamme 4-22; t-test 0,37). Probablement, les blastocystes euploïdes vitrifiés implantés (N - 229) et non implantés (N - 343) ont également montré des synchronisations de biopsie comparables (9,77 à 4,15 min, gamme 3-22 contre 9,41 à 4,36 min, gamme 3-22; t-test - 0,39). Peut-être alors, un moment de 22 min à la biopsie jusqu'à 4 blastocystes n'affecte pas le comportement des embryons après le réchauffement. Par conséquent, nous avons défini cette valeur comme un seuil maximal.
De même, aucune différence n'a été démontrée en ce qui concerne le taux de natalité vivante entre les différents opérateurs de biopsie, comme cela a déjà été signalé13 (tableausupplémentaire 1).
Un autre paramètre important pour surveiller les performances de chaque opérateur est le taux de résultats non concluants après le diagnostic, qui devrait être aussi proche que possible de la performance générale de chaque laboratoire. Idéalement, ce taux ne devrait pas dépasser 2,5 % et pourrait diminuer avec le temps en raison d'une expertise croissante dans les procédures de biopsie et de tuyauterie16. Le nombre cible de cellules TE à récupérer est de 7-8 selon deux études précédentes13,16. À cette fin, il est suggéré de prendre une photo du fragment biopsié à des fins de contrôle de la qualité (voir quelques exemples à la figure 3). Une telle image peut être vérifiée en cas de diagnostics non concluants afin d'évaluer si la cause était imputable à la dimension/qualité du fragment (c.-à-d. de faible qualité de l'analyse moléculaire), à la tuyauterie (c.-à-d. défaillance de l'amplification de l'ADN) ou à certains problèmes le traitement de l'échantillon en laboratoire génétique.
Définition du moment idéal entre biopsie et vitrification
Pendant la période d'étude, 572 blastocystes euploïdes ont été réchauffés pour subir un transfert d'embryon après un diagnostic d'euploïde. La figure 8A montre chaque blastocyste réchauffé comme un cercle noir réparti à travers le calendrier croissant entre la biopsie et la vitrification et regroupé en deux groupes selon les résultats à l'étude : réélargi s'est réétendu ou non réélargi dans un rayon de 1,5 h à partir de Réchauffement. Tous les blastocystes (N - 117/117) vitrifiés dans les 30 min, 97,6 % (N et 245/251) des blastocystes vitrifiés entre 31 et 90 min, et 95,1 % (N - 194/204) des blastocystes vitrifiés au-delà de 90 min re-élargis, respectivement (pas de taux de ré-expansion: 0%, 2,4% et 4,9%). Par conséquent, nous avons fixé 30 min et 90 min comme seuils précoces et tardifs de temps entre la biopsie et la vitrification.
La figure 8B montre le taux de réexpansion dans les trois groupes (30 min, 31-90 min, 90 min) subgroupés en fonction de la qualité du blastocyste et du jour du développement préimplantatoire. Particulièrement pour les blastocystes de mauvaise qualité et/ou de jour 7, le moment entre la biopsie et la vitrification semble crucial pour réaliser la ré-expansion après le réchauffement. Plus précisément, le rapport-cote de la ré-expansion après réchauffement corrigé pour la qualité blastocyste et le jour de la biopsie dans les blastocystes vitrifiés dans les 30 min de la biopsie par rapport aux blastocystes vitrifiés au-delà de 90 min était de 3,05 (IC à 95 % 1,01-9,4, p-0,05). Au lieu de cela, la période entre ces deux seuils (31-90 min) représentait une zone grise qui pourrait ou non avoir un impact.
Seulement 1 sur 15 blastocystes non re-élargis ont eu comme conséquence une naissance vivante après transfert. Par conséquent, nous avons enfin étudié le taux de natalité vivante atteint après le transfert de blastocyste unique éuploïde réchauffé groupé dans les trois groupes selon le moment entre la biopsie et la vitrification. Le taux de natalité vivante le plus élevé a été atteint en transférant les blastocystes euploïdes vitrifiés à 30 min de la biopsie du trophectoderm (N 56/117, 47,9 %). Cependant, ce résultat n'a pas atteint la signification statistique par rapport au même résultat obtenu non plus avec des blastocystes vitrifiés entre 31 et 90 min (N - 92/251, 36,7%; Le test exact de Fisher 0,06), ou avec des blastocystes vitrifiés à 90 min de la biopsie (N-81/204, 39,7%; Le test exact de Fisher 0,16). Par conséquent, soit un effet négatif sur la compétence reproductrice blastocyste est négligeable, soit la taille de l'échantillon dans cet ensemble de données (N - 572) n'était pas suffisante pour atteindre une signification statistique.
Figure 1 : Paramètres pour le classement blastocyste. Expansion: (A) entièrement éclos, (B) dans l'éclosion, (C) entièrement élargi, et (D) pas élargi. L'étape idéale est C, tandis qu'un blastocyste D devrait être donné plus de temps pour réaliser l'expansion complète, à moins que cette étape soit atteinte dans le jour 7 ; Masse cellulaire interne (ICM) qualité morphologique: 1 (notable avec plusieurs cellules strictement emballées), 2 (discernable avec plusieurs cellules à peu près emballées) et 3 (difficile à distinguer avec très peu de cellules de mauvaise qualité); trophectoderm (TE) Qualité morphologique: 1 (épithélium bien organisé avec plusieurs cellules), 2 (épithélium lâche avec peu de cellules) et 3 (peu et/ou grandes cellules de mauvaise qualité). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Résumé de la zona pellucida séquentielle (ZP) ouverture et trophectoderm (TE) approche de récupération de cellules pour la biopsie blastocyste. (a) Orientez le blastocyste avec la masse cellulaire interne (ICM) près de la pipette de retenue et loin de l'endroit où les cellules TE sélectionnées seront récupérées. Fixer le blastocyste sur la pipette de retenue; (b) ouvrir le ZP par 2-3 tirs laser; (c) souffler quelques médias de culture par le trou ; d) le blastocyste se détachera du ZP; (e) entrez dans le ZP et aspirez 5-10 cellules TE dans la pipette de biopsie; (f) reculer avec la pipette de biopsie pour étirer le fragment sélectionné et exposer les jonctions entre les cellules; (g) feu aux jonctions entre les cellules et continuer à étirer le fragment jusqu'à ce que les cellules TE sont libérés du corps du blastocyste; (h) le blastocyste après la biopsie te est effondré ; (i) prendre une photo du fragment de biopsie pour le contrôle de la qualité et le transférer dans le tube PCR qui sera envoyé au laboratoire génétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Exemples de fragments de biopsie : (a-c) fragments souhaitables; d) fragment lysé; (e) petit fragment avec des cellules dégénérées; f) petit fragment partiellement lysé et dégénéré. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Rétrécissement artificiel. (a) Orientez le blastocyste de sorte que la masse cellulaire interne (ICM) soit loin de la section ciblée du trophectoderm (TE); (b) Tirer 2-3 tirs laser d'affilée aux jonctions entre les cellules TE et se déplaçant vers l'extérieur; (c) Attendez que le blastocyste s'effondre avant de commencer la vitrification. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Exemples de dégénérescence blastocyste (a), de cryo-survie, mais pas de réexpansion (b) et de cryo-survie et de réexpansion complète (c) 1,5 h après le réchauffement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Résumé des différents résultats de la biopsie du trophectoderm qui pourraient être utilisés pour surveiller le rendement d'un opérateur et définir les indicateurs de rendement clés internes à chaque laboratoire. Le principal résultat procédural est le moment de la biopsie. Le principal résultat technique est le taux de diagnostics concluants (euloïdes ou aneuploides) et non concluants (rebiopsie requise) obtenus; ces dernières peuvent être causées par l'amplification de l'ADN ou des données moléculaires de mauvaise qualité, les deux résultant en des parcelles de profil de numéro de copie chromosomique non interprétables. Le principal résultat biologique est le taux de cryo-survie et de réexpansion ou de dégénérescence après biopsie, vitrification et réchauffement. Les résultats cliniques principaux sont le taux des naissances vivantes ou des résultats négatifs de grossesse réalisés après le transfert vitrifié-chauffé de blastocyst. Il convient de noter que, bien que l'issue de la procédure dépend exclusivement de l'exploitant et du nombre de blastocystes à la biopsie par procédure, tous les autres résultats pourraient être affectés par d'autres facteurs de confusion indépendants de l'opérateur de biopsie (p. ex., les étapes et les opérateurs l'analyse moléculaire, la qualité morphologique du blastocyste, le jour de la biopsie) qui devrait être pris en compte pour évaluer correctement sa performance. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Calendrier moyen de la biopsie par opérateur au cours des 8 trimestres d'étude. Le tableau résume le nombre connexe de procédures et le nombre moyen de blastocystes biopsiés par procédure par chaque opérateur dans les 8 trimestres d'étude. La ligne rouge pointillée dans chaque graphique représente le moment moyen global de la biopsie (8,24 min). Les barres d'erreur sont les écarts types. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Réexpansion après réchauffement par rapport au moment entre la biopsie et la vitrification. (A) montre non ré-élargi et re-élargi blastocystes 1,5 heures après le réchauffement. Chaque blastocyste est représenté par un cercle noir à travers les calendriers croissants. Les lignes noires verticales continues représentent 30 min fixées comme seuil précoce et 90 min fixées comme seuil tardif. (B) montre les taux de réexpansion dans les trois groupes (synchronisation entre la biopsie et la vitrification : 30 min, 31-90 min, 'gt;90 min) regroupés en fonction de la qualité du blastocyste et du jour de la biopsie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| N des procédures | N blastocystes biopsiés par procédure | Calendrier moyen de la biopsie et SD, plage (min) | |
| Opérateur 1 | 443, en plus d'en avoir pour | 2,01 à 1,09, 1-4 | 7,41 à 3,6, 3-22 |
| En 195, états-unis qui ont été | 1 Fois | 4,75 à 1,96, 3-16 | |
| 111 (états-unis qui l'en | 2 (en) | 7,83 à 2,45, 3-18 | |
| 71 Annonces | 3 (en) | 10.27 à 2.41, 4-16 | |
| 66 Annonces | 4 ( en plus) | 11,48 à 3,81, 6-22 | |
| Opérateur 2 | 290 Ans, états-unis (en) | 1,81 à 0,98, 1-4 | 7,87 à 4,13, 3-22 |
| 142, en plus | 1 Fois | 5,69 à 3,32, 3-16 | |
| 89 Ans et plus | 2 (en) | 8,48 à 2,79, 3-18 | |
| 30 Ans, états-unis ( | 3 (en) | 11.37 à 3.72, 4-20 | |
| 29 Ans et plus | 4 ( en plus) | 13,1 à 3,89, 9-22 | |
| Opérateur 3 | 287 Annonces | 1,98 à 1,05, 1-4 | 9,10 à 4,65, 3-22 |
| 121 (en) | 1 Fois | 6 à 2,19, 3-15 | |
| 89 Ans et plus | 2 (en) | 9,6 à 3,87, 3-22 | |
| 38 Annonces | 3 (en) | 12,66 à 4,55, 4-22 | |
| 39 Ans et plus qu'ils | 4 ( en plus) | 14.13 à 4.8, 6-22 | |
| Opérateur 4 | 217 Annonces | 1,66 à 0,87, 1-4 | 7,58 à 3,45, 3-22 |
| 118 Annonces | 1 Fois | 5,58 à 1,96, 3-14 | |
| 66 Annonces | 2 (en) | 8,92 à 2,91, 4-22 | |
| 21 Ans, états-unis | 3 (en) | 11,48 à 2,34, 5-16 | |
| 12 Ans, états-unis | 4 ( en plus) | 13 à 4,26, 6-19 | |
| Opérateur 5 | 144, en plus d'avoir | 2,03 à 1,08, 1-4 | 9,43 à 4,24, 3-22 |
| 59 Annonces | 1 Fois | 6,15 à 2,5, 3-16 | |
| 43 Ans, états-unis ( | 2 (en) | 10.07 à 2.73, 6-16 | |
| 20 Ans, états-unis | 3 (en) | 12,6 à 2,89, 9-18 | |
| 22 Ans | 4 ( en plus) | 14,09 à 4,43, 6-22 | |
| Opérateur 6 | 121 (en) | 1,67 à 0,94, 1-4 | 7,79 à 3,93, 3-22 |
| 70 Ans et plus | 1 Fois | 6,19 à 2,95, 3-16 | |
| 32 Ans, états-unis ( | 2 (en) | 8.12 - 1.72, 3-11 | |
| 9 (en) | 3 (en) | 12,78 à 3,31, 9-18 | |
| 10 Ans et plus | 4 ( en plus) | 13,5 à 6,19, 6-22 | |
| Opérateur 7 | 42 Ans, états-unis ( | 1,62 à 0,94, 1-4 | 14,19 à 4,24, 6-22 |
| 27 Annonces | 1 Fois | 11,85 à 5,53, 6-16 | |
| 6 Annonces | 2 (en) | 16,5 à 3,73, 11-22 | |
| 7 Annonces | 3 (en) | 19,86 à 3,34, 13-22 | |
| 2 (en) | 4 ( en plus) | 19 à 4,24, 16-22 | |
| total | en 1544, | 1,89 à 1,03, 1-4 | 8,24 à 4,23, 3-22 |
| 732 Annonces | 1 Fois | 5,78 à 2,94, 3-16 | |
| 436 Annonces | 2 (en) | 8,85 à 3,14, 3-22 | |
| En 196, états-unis qui en ont | 3 (en) | 11,72 à 3,70, 4-22 | |
| 180 annonces | 4 ( en plus) | 12,93 à 4,43, 6-22 |
Tableau 1 : Le moment moyen total de la biopsie et le nombre moyen de blastocystes biopsiés dans chaque procédure selon l'opérateur de biopsie. Le moment moyen de la biopsie a été également montré selon chaque nombre séquentiel de blastocystes biopsiés par procédure. Un modèle linéaire généralisé qui comprend à la fois les variables « opérateur de biopsie » et « nombre de blastocystes biopsiés par procédure » est parfaitement corrélé avec le « moment de la biopsie » (R2 à 0,48, puissance et 1).
Figure supplémentaire 1 : Principaux dispositifs et supports requis pour la procédure. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : L'analyse logistique de régression ne montre aucune association significative entre l'opérateur de biopsie et la naissance vivante après le transfert de blastocyste euploïde vitrifié-chauffé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Seuls les embryologistes qualifiés expérimentés qui ont terminé leur période de formation devraient effectuer la biopsie TE et la vitrification blastocyste. De plus, un témoin est tenu de surveiller les procédures et de garantir une traçabilité efficace pendant i) les mouvements du blastocyste biopsié du plat de biopsie (figure supplémentaire 1) au plat post-biopsie (figure supplémentaire1 ), puis à la plaque de vitrification (figure supplémentaire 1) et enfin au support de vitrification ( figure supplémentaire1); ii) le transfert de cellules TE biopsiées du plat de biopsie au tube PCR (figuresupplémentaire1); iii) le réchauffement et les étapes de transfert après le diagnostic. Pour une description détaillée de toutes les étapes de témoin se référer à une analyse des modes de défaillance et des effets (FMEA) précédemment publié14.
Toutes les méthodes décrites dans ce document respectent le règlement local (loi italienne 40/2004). Selon la loi, en effet, le couple peut demander à être informé de l'état de santé des embryons qu'ils ont produits pendant le cycle de FIV. À cet égard, un consentement éclairé détaillé pour le TCP doit être signé par les deux partenaires.
Dans cet article nous avons décrit comment mettre en œuvre la biopsie blastocyste pour PGT dans une routine de laboratoire occupée. L'application de l'approche de biopsie blastocyste a été un progrès important dans la dernière décennie dans la FIV. D'abord rapporté par de Boer et ses collègues en 200417, il a été rapidement reconnu comme une procédure plus efficace et informative par rapport à l'étape de clivage et les approches de biopsie du corps polaire3. La valeur de cette procédure réside principalement dans une réduction des charges techniques, mais aussi dans une incidence plus faible de mosaïsme chromosomique à ce stade de développement18,19. En outre, l'enlèvement de quelques cellules de TE d'un blastocyste a été suggéré comme procédure plus sûre que le déplacement d'un blastomere d'un embryon de stade de clivage. En effet, dans une étude randomisée de non-sélection, la première approche n'a eu aucun impact sur le potentiel d'implantation d'embryons, tandis que la seconde a entraîné une réduction significative de 20 %20.
Le protocole principalement utilisé dans le monde entier implique l'ouverture du zona assisté au laser au jour 3 après l'insémination. Aucun essai contrôlé randomisé n'a été mené à ce jour pour comparer les différentes approches de biopsie blastocyste. Cependant, il est raisonnable que plus le nombre de manipulations et d'expositions des embryons en croissance à des conditions environnementales sous-optimales est faible, plus le potentiel d'invasivité du protocole est faible. En outre, la présence d'un trou dans le pellucida zona du jour 3 du développement pourrait affecter l'expansion blastocyste et causer l'hernie des cellules icM avec des cellules de TE. Pour ces raisons, nous avons établi et mis en œuvre le protocole décrit ici qui implique la rupture séquentielle de zona au laser et la récupération des cellules TE dès que le blastocyste atteint sa pleine expansion. Aussi un protocole différent existe qui implique un jour 5 ou 6 aidée à l'éclosion5,7. Plus précisément, le forage de la zona est effectué le jour 5 ou 6 du développement préimplantatoire de l'autre côté par rapport à l'ICM; le blastocyste est alors déplacé de nouveau à l'incubateur attendant l'hernie spontanée des cellules de TE. De toute évidence, une surveillance périodique du blastocyste doit être fournie dans les heures suivantes, pour le biopsier dès que l'E commencera à hernine, ainsi que pour empêcher l'embryon d'éclore complètement. Si d'une part les praticiens non qualifiés peuvent facilement mettre en œuvre cette stratégie alternative de biopsie, d'autre part il n'est pas approprié pour un laboratoire occupé effectuant plusieurs procédures par jour. Le protocole séquentiel d'ouverture de zona et de biopsie blastocyste décrit ici est plutôt moins long et permet un temps pratique plus court et une plus grande flexibilité pour programmer l'activité quotidienne dans le laboratoire afin de coordonner les délais consacrés à biopsie et aux procédures de vitrification.
Blastocystes de mauvaise qualité pourrait être plus complexe à la biopsie puisque les cellules TE peuvent être collantes, mais plus de coups de laser coordonnés avec l'étirement du fragment pour exposer les jonctions entre les cellules sont suffisants pour l'enlever du corps du blastocyste. Le blastocyste entièrement éclos peut être biopsié comme des blastocystes enfermés dans la zona pellucida, mais ils pourraient être plus difficiles à vitrifier et réchauffer. En cas de diagnostics non concluants après biopsie, les données rapportées à ce jour sont concordantes qu'aucun dommage ne semble dériver d'une re-biopsie et d'un cycle suivant de vitrification-réchauffement16,21.
Vitrification est actuellement utilisé dans le centre pour effectuer la cryoconservation blastocyste car il a été constamment signalé plus sûr, plus efficace et moins de temps que le protocole de congélation lente à partir d'un examen et une méta-analyse de la littérature la plus récente 10.
Une fois que la procédure était bien établie et que les opérateurs étaient correctement formés, nous avons effectué une analyse rétrospective afin de définir les calendriers procéduraux idéaux pour les procédures de biopsie et de vitrification du blastocyste (résumées ici dans les résultats représentatifs). Comme résultats finaux, nous avons évalué le taux de ré-expansion du blastocyste euploïde évalué à 1,5 h après le réchauffement et le taux de natalité vivante atteint après le transfert d'embryon unique vitrifié-chauffé. Aucun cas de dégénérescence blastocyste n'a été observé après biopsie, et seulement 0,2% (N - 1/572) du taux de dégénérescence a été rapporté après le réchauffement, confirmant la fiabilité des approches de biopsie et de vitrification adoptées. Selon l'analyse, le moment requis pour effectuer une biopsie blastocyste n'affecte pas la viabilité des blastocystes euploïdes après le réchauffement défini comme le taux de réexpansion, ou le potentiel reproducteur défini comme le taux de natalité vivante. Bien que divers calendriers puissent être observés entre les opérateurs ayant une expertise différente, nous pouvons considérer la biopsie blastocyste sans danger lorsque la procédure est terminée dans environ 8 minutes, dans une gamme de 3 à 22 min selon le nombre d'embryons par procédure (toutefois aucune donnée ne sont pour les procédures de biopsie effectuées à intervalles plus longs). Le temps moyen passé pour la biopsie blastocyste de chaque opérateur unique devrait être périodiquement (au moins tous les trois mois) surveillé comme KPI. Parallèlement, le taux de diagnostic non concluant et le taux de natalité vivante après le transfert de blastocyste euploïde vitrifié-chauffé devrait également être abordé. Enfin, nous avons décrit le moment idéal entre la biopsie et la vitrification. Puisque nous avons observé le taux de ré-expansion le plus élevé après le réchauffement quand les blastocystes ont été vitrifiés dans les 30 min de la biopsie, nous suggérons cette valeur comme seuil idéal. Plus précisément, plus le temps entre la biopsie et la vitrification est long, plus le blastocyste biopsié se redéveloppera avant d'être cryoconservé. Cela pourrait être nocif pour la cryo-survie, en particulier lorsqu'il s'agit de mauvaise qualité et / ou jour 7 blastocystes11. Néanmoins, aucun impact significatif sur les résultats cliniques n'a été observé même si la vitrification a été retardée au-delà de 90 min. Par conséquent, dans des occasions sporadiques, de tels délais pourraient être autorisés.
La méthode choisie pour récupérer un spécimen pour le TGP ne devrait pas affecter la viabilité de l'embryon, devrait comporter des résultats fiables et informatifs, devrait être cliniquement efficace et devrait être facile à mettre en œuvre, réduisant ainsi les coûts et la charge de travail en laboratoire. La biopsie blastocyste remplit toutes ces conditions préalables. Néanmoins, il s'agit toujours d'une procédure invasive qui doit être effectuée par des opérateurs qualifiés dans un laboratoire bien équipé. À l'heure actuelle, l'avant-garde d'une approche non invasive du TPG (niPGT) fait l'objet d'une enquête. Peut-être, à l'avenir, les médias de culture dépensés après LA FIV pourraient être analysés pour effectuer des tests chromosomiques et/ou génétiques. Il s'agit d'une perspective d'avenir intrigante puisque les coûts de la clinique de FIV seraient plus faibles et que toute la charge de travail entraînée par la biopsie des embryons serait écartée. Cependant, la fiabilité et la reproductibilité de l'analyse des médias dépensés pour les tests génétiques doivent encore être évaluées22,23,24, donc plus d'efforts doivent être investis pour définir et valider un protocole qui pourrait tous les cliniques de FIV effectuant PGT dans le monde entier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
AG et RM ont recueilli les données et rédigé le manuscrit. DC a analysé les données, rédigé les résultats représentatifs, effectué les statistiques et révisé le manuscrit. L'UMF et LR ont fourni une discussion critique des résultats et de l'ensemble du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B. Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. Jansen, R., Mortimer, D. , Parthenon Press. 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
