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Developmental Biology

मानव ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी और Vitrification

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59625
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1G.EN.E.R.A. Centers for Reproductive Medicine, 2DAHFMO, Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome

Summary

ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी और विट्रीफिकेश को प्रीइम्प्लांटेशन जेनेटिक परीक्षण को कुशलतापूर्वक संचालित करने की आवश्यकता होती है। एक दृष्टिकोण जोना pellucida के अनुक्रमिक खोलने और दिन में 7-8 trophectoderm कोशिकाओं की बहाली पर जोर देते हुए 5-7 के बाद गर्भाधान दोनों जोड़तोड़ की संख्या की आवश्यकता है और उप इष्टतम पर्यावरण की स्थिति के लिए भ्रूण के जोखिम को सीमित करता है.

Abstract

Blastcyst बायोप्सी preimplantation आनुवंशिक परीक्षण के साथ आईवीएफ चक्र के दौरान एक विश्वसनीय आनुवंशिक निदान प्राप्त करने के लिए किया जाता है। फिर, आदर्श कार्यप्रवाह नैदानिक तकनीकों के टर्नअराउंड समय के कारण और निम्नलिखित प्राकृतिक चक्र में एक शारीरिक एंडोमेट्रियम पर चयनित भ्रूण (एस) को स्थानांतरित करने के लिए एक सुरक्षित और कुशल vitrification प्रोटोकॉल पर जोर देता है। एक बायोप्सी दृष्टिकोण जोना pellucida के अनुक्रमिक खोलने और 5-10 trophectoderm कोशिकाओं की बहाली को शामिल (आदर्श रूप से 7-8) दोनों जोड़तोड़ की संख्या की आवश्यकता है और उप इष्टतम पर्यावरण की स्थिति के लिए भ्रूण के जोखिम को सीमित करता है. उचित प्रशिक्षण के बाद, इस तकनीक बायोप्सी के समय के मामले में विभिन्न ऑपरेटरों भर में reproduible था ($8 मिनट, 3-22 मिनट प्रति डिश बायोप्सी के लिए भ्रूण की संख्या के आधार पर लेकर), निर्णायक निदान प्राप्त ($97.5%) और vitrified-warmed euploid blastcyst हस्तांतरण के बाद जीवित जन्म दर (gt; 40%)। बायोप्सी, vitrification और वार्मिंग के बाद जीवित रहने की दर के रूप में 99.8% के रूप में उच्च था. वार्मिंग से 1.5 एच पर फिर से विस्तार दर 97% के रूप में उच्च के रूप में था, काफी हद तक बायोप्सी और vitrification के बीच समय पर निर्भर (आदर्श रूप से $ 30 मिनट), blastcyst रूपात्मक गुणवत्ता और बायोप्सी के दिन. सामान्य में, यह एक ढह blastcyst vitrify करने के लिए बेहतर है; इसलिए, गैर-पीजीटी चक्र में, लेजर की मदद से कृत्रिम संकुचन cryopservation से पहले भ्रूण पतन प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। सबसे होनहार भविष्य के परिप्रेक्ष्य भ्रूण डीएनए के एक putative स्रोत के रूप में blastcyst संस्कृति के बाद आईवीएफ संस्कृति मीडिया के गैर इनवेसिव विश्लेषण है. हालांकि, इस संभावित avant-garde अभी भी जांच के तहत है और एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल अभी तक परिभाषित और मान्य करने की जरूरत है.

Introduction

आधुनिक मानव भ्रूण विज्ञान का मुख्य लक्ष्य प्रेरित चक्र प्रति संख्या लाइव जन्मों को अधिकतम करने और लागत, समय और एक गर्भावस्था को प्राप्त करने के प्रयासों को कम करने के लिए है। इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए, भ्रूण चयन के लिए मान्य दृष्टिकोण एक आईवीएफ चक्र के दौरान प्राप्त एक सहगण के भीतर प्रजनन सक्षम भ्रूण की पहचान करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए. नवीनतम सबूत के अनुसार, blastcyst संस्कृति1 व्यापक गुणसूत्र परीक्षण और vitrified-warmed euploid भ्रूण हस्तांतरण (ईटी) के साथ संयुक्त आईवीएफ दक्षता2बढ़ाने के लिए सबसे कुशल रूपरेखा है। स्पष्ट रूप से, एनुलॉयडी परीक्षण के लिए एक भ्रूण ीय नमूना की आवश्यकता होती है, जो वर्तमान में ज्यादातर ट्रोफीक्टोडरम (टीई) से प्राप्त कुछ कोशिकाओं से प्रतिनिधित्व करता है, यानी ब्लास्टोसिस्ट का खंड जो गर्भावस्था के दौरान भ्रूण annexes (जैसे, प्लेसेंटा) को मूल देता है . केरियोटाइप विश्लेषण के अलावा, एकल जीन उत्परिवर्तनों का मूल्यांकन एक नैदानिक रणनीति के भाग के रूप में एक टीई बायोप्सी से किया जा सकता है जिसे प्रीइम्प्लांटेशन जेनेटिक टेस्टिंग (पीजीटी; ए ए ए ए ए ए, संरचनात्मक गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था के लिए, मोनोजेनिक रोगों के लिए -एम)। पिछले दशकों में अन्य अंडाणु/भ्रूण बायोप्सी विधियों को सिद्धांतीकृत किया गया है और नैदानिक रूप से अपनाया गया है, अर्थात् ध्रुवीय शरीर बायोप्सी और ब्लास्टोमेर बायोप्सी। हालांकि, उनके उपयोग आजकल कम हो गया है क्योंकि उनके प्रक्रियात्मक कमियां (उदाहरण के लिए, उच्च कार्यभार और प्रजनन प्रभाव के लिए जोखिम) और नैदानिक सीमाओं (जैसे, एकल सेल विश्लेषण मुद्दों) स्पष्ट रूप से लागत, जोखिम और के बीच एक पर्याप्त संतुलन में बाधा लाभ (एक समीक्षा के लिए देखें3).

इस कागज में, TE बायोप्सी के लिए मुख्य प्रोटोकॉल में से एक अच्छी तरह से बाद vitrification, वार्मिंग और हस्तांतरण प्रक्रियाओं की आवश्यकता के साथ एक साथ वर्णित है. यहाँ रेखांकित वर्कफ़्लो एक व्यस्त PGT इकाई के लिए आदर्श है.

जैसा कि पहले से ही हमारे समूह4,5द्वारा वर्णित है , प्रक्रिया पूरी तरह से विस्तारित blastcysts के zona pellucida के अनुक्रमिक खोलने और कुछ टीई कोशिकाओं को हटाने शामिल है (औसत 7-8 पर). दिन की तुलना में 3 लेजर की मदद से हैचिंग आधारित blastcyst बायोप्सी विधि6,इस प्रक्रिया को एक आईवीएफ इकाई के दैनिक कार्यक्रम को कम कर सकता है जहां नाजुक प्रक्रियाओं, जैसे ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी और vitrification, समय पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए। जैसे ही ब्लास्टोसिस्ट अपने पूर्ण विस्तार तक पहुंचता है, बायोप्सी को हटाने के लिए टीई कोशिकाओं का चयन करके किया जा सकता है, जिससे आंतरिक सेल द्रव्यमान (आईसीएम) के हर्निया के जोखिम को रोका जा सकता है, जो अन्यथा प्रक्रिया को चुनौतीदेने प्रदान करेगा। साहित्य में ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी के तीसरे प्रोटोकॉल का भी वर्णन किया गया है, जिसमें लेजर की मदद से हैचिंग की जा रही है एक बार भ्रूण पहले से ही ब्लास्टोसिस्ट चरण तक पहुंच गया है, प्रक्रिया5,7से कुछ घंटे पहले। हालांकि, इस दृष्टिकोण और अधिक समय लेने वाली है और मुख्य रूप से आईवीएफ इकाइयों है कि सीमित अनुभवी ऑपरेटरों के हाथों में ते बायोप्सी को लागू कर रहे हैं और एक मध्यम कम दैनिक कार्यभार के मद्देनजर सूट.

आईवीएफ में आनुवंशिक विश्लेषण करने का लक्ष्य रखने पर इंट्रासाइटोप्लाज्मा शुक्राणु इंजेक्शन (आईसीएसआई)8 को एक समेकित तकनीक होनी चाहिए। इसी तरह, ब्लास्टोसिस्ट चरण के लिए भ्रूणों को सुरक्षित रूप से काटने के लिए एक उचित संस्कृति प्रणाली टीई बायोप्सी रणनीति के कार्यान्वयन के लिए महत्वपूर्ण है। पर्याप्त संख्या में इनक्यूबेटर, साथ ही कम ऑक्सीजन तनाव का उपयोग इस अंत के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकताएँ हैं, ब्लास्टोसिस्ट दर9से समझौता नहीं करने के लिए। एक ही समय में, एक कुशल cryopservation कार्यक्रम के लिए सुरक्षित रूप से एक पीजीटी चक्र का प्रबंधन की जरूरत है. पिछले दशक में, vitrification के कार्यान्वयन भ्रूण cryo-survival दरों को भी बढ़ाया गया है और तक 99%10,11. यह आनुवंशिक परीक्षण करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान की है और निम्नलिखित मासिक धर्म चक्र के लिए भ्रूण हस्तांतरण स्थगित, एक गैर उत्तेजित और शायद अधिक ग्रहणशील एंडोमेट्रियम12पर.

दोनों ते बायोप्सी और vitrification कड़े कौशल की आवश्यकता कार्यों की मांग कर रहे हैं और उनके प्रभाव अनुभवहीन ऑपरेटरों भर में भिन्न हो सकते हैं. इसलिए प्रत्येक ऑपरेटर को इन प्रक्रियाओं को चिकित्सकीय रूप से करने की अनुमति देने से पहले एक विशिष्ट प्रशिक्षण अवधि की वकालत की जाती है; इसके अलावा, ऑपरेटरों के कौशल के रखरखाव का समय-समय पर क्रायोप्रेक्षण और बायोप्सी प्रक्रियाओं के लिए प्रमुख प्रदर्शन संकेतकों (KPI) की निगरानी करके मूल्यांकन किया जाना चाहिए। प्रत्येक आईवीएफ क्लिनिक इस अंत करने के लिए आंतरिक KPIs सेट करना चाहिए, जो अंतरराष्ट्रीय consortia द्वारा प्रकाशित लोगों का अनुमान है और /

ते बायोप्सी, vitrification-वार्मिंग और साक्षी प्रक्रियाओं हमारी इकाई में तकनीक मान्य कर रहे हैं, कि सभी शामिल ऑपरेटरों भर में मानकीकृत किया गया है के रूप में तीन पिछले प्रकाशनों में रिपोर्ट11,13,14 .

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Protocol

मानव blastcyst बायोप्सी के लिए प्रोटोकॉल, यहाँ वर्णित, G.EN.E.R.A. मानव अनुसंधान नीति समिति के दिशा निर्देशों का पालन करता है.

नोट: आवश्यक सामग्री के लिए सामग्री की तालिका को देखें. इसके अलावा आवश्यक सामग्री प्रयोगशाला जूते और संगठन, सर्जिकल facemask, बाल कवर, शल्य दस्ताने, एक स्थायी गैर विषैले मार्कर, संदंश और कीटाणुनाशक जरूरत पर जोर देता है. सर्जिकल गाउन, डिस्पोजेबल सर्जिकल दस्ताने, फेसमास्क, हेयर कवर का उपयोग संदूषण के जोखिम को रोकने के लिए अनिवार्य है। सभी कार्य क्षेत्रों, साथ ही प्रक्रिया में शामिल उपकरण, किसी भी प्रक्रिया को शुरू करने से पहले प्रयोगशाला कीटाणुनाशक (जैसे, Oosafe) के साथ अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए। इस्तेमाल की जाने वाली सभी उपभोग्य वस्तुएं और मीडिया बाँझ और व्यक्तिगत रूप से पैक किए गए या अलिकोट किए जाने चाहिए। यह बायोप्सी और ट्यूबिंग के लिए एक समर्पित कार्य केंद्र का उपयोग करें और केवल प्रक्रिया में शामिल ऑपरेटरों के लिए क्षेत्र के उपयोग को सीमित करने का सुझाव दिया है (भ्रूण विज्ञानी और गवाह).

1. बायोप्सी प्रक्रिया से पहले दिन पर तैयारी

  1. पोस्ट बायोप्सी संस्कृति पकवान तैयार करें.
    1. आईवीएफ कल्चर डिश में 20 एमएल आईवीएफ कल्चर मीडियम (सामग्री की तालिका) की 6 बूँदें रखें और भ्रूण संस्कृति के लिए 6 एमएल प्रीवार्म्ड खनिज तेल ( सामग्री की तालिका )केसाथ ओवरले रखें .
    2. प्रत्येक ड्रॉप करने के लिए आईवीएफ संस्कृति माध्यम का एक और 10 डिग्री जोड़ें. नियंत्रित वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट (5% हे2, 6% ब्व्2) .
  2. बायोप्सी के बाद ब्लास्टोसिस्ट को rinsing के लिए एक आईवीएफ डिश 4-वेल प्लेट तैयार करें।
    1. पहले दो कुओं में आईवीएफ संस्कृति माध्यम के 600 डिग्री सेल्सियस रखें और भ्रूण संस्कृति के लिए पूर्व-गर्म खनिज तेल के 300 डिग्री सेल्सियस के साथ ओवरले रखें।
    2. नियंत्रित वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट (5% हे2, 6% ब्व्2) .
  3. प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में टीई कोशिकाओं के ट्यूबिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले लोडिंग विलयन (सामग्रीकीसारणी) का 1.5 डिग्री सेल्सियस का वितरण करें, इसे स्पिन करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

2. बायोप्सी प्रक्रिया के दिन पर तैयारी

  1. बायोप्सी पकवान तैयार करें।
    1. एक आईवीएफ संस्कृति डिश में एक पंक्ति में 10 डिग्री एचईपीएस-बफर्ड माध्यम (मानव सीरम एल्बुमिन के साथ पूरक) (सामग्री कीतालिका) की 3 बूँदें रखें।
    2. उपलब्ध ब्लास्टोसिस्टों की संख्या के अनुसार चरण 1.1.1 दोहराएँ (प्रति डिश 4 ब्लास्टोसिस्ट तक) और भ्रूण संस्कृति के लिए पूर्व-वार्म्ड खनिज तेल के 6 एमएल के साथ ओवरले।
    3. बायोप्सी प्रक्रिया करने से पहले कम से कम 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान इनक्यूबेट करें।

3. ब्लास्टोसिस्ट चयन और ग्रेडिंग

  1. इसके विस्तार और आईसीएम और टीई के रूपात्मक रूप के अनुसार ब्लास्टोसिस्ट को ग्रेड करें (चित्र 1)।
    नोट:     ग्रेडिंग मानदंड Gardner और Schoolcraft15 से अनुकूलित किया गया है और पहले Capalbo एट अल द्वारा वर्णित और Cimadomo एट अल.4,11.
    1. आकार और विस्तार ग्रेड को परिभाषित करें के रूप में: एक पूरी तरह से हैचकिएड ब्लास्टोसिस्ट के लिए, बी के लिए एक पूरी तरह से विस्तारित ब्लास्टोसिस्ट के लिए, सी, और एक विस्तारित ब्लास्टोसिस्ट के लिए डी (ये भ्रूण केवल तभी बायोप्सी किए जाते हैं जब वे दिन 7 तक आगे का विस्तार नहीं करते हैं)।
    2. ICM ग्रेड परिभाषित करें: कई सख्ती से पैक कोशिकाओं के साथ ध्यान देने योग्य आईसीएम के लिए 1; 2 कई लेकिन मोटे तौर पर पैक कोशिकाओं के साथ समझदार के लिए; 3 के लिए बहुत कुछ कम गुणवत्ता कोशिकाओं के साथ भेद करने के लिए मुश्किल है.
    3. निम्नानुसार टीई ग्रेड को परिभाषित करें: कई कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से संगठित उपकला के लिए 1; 2 कुछ कोशिकाओं के साथ ढीला उपकला के लिए; 3 कुछ और / या बड़े कम गुणवत्ता कोशिकाओं के लिए.

4. ट्रोपैक्टोडरम बायोप्सी

  1. सभी व्यवहार्य पूरी तरह से विस्तारित blastocysts (अधिमानतः आकार और विस्तार के लिए सी ग्रेड) पर ते बायोप्सी प्रदर्शन करते हैं।
  2. प्रत्येक बायोप्सी प्रक्रिया के लिए पकड़े और बायोप्सी पिपेट सेट करें। बायोप्सी पिपेट के लिए सिफारिशें निम्नलिखित हैं: 30 डिग्री मीटर आंतरिक व्यास, 35 डिग्री मोड़ कोण, 0.75 मिमी दूरी टिप मोड़ करने के लिए।
  3. रोगी के विवरण (महिला का नाम और उपनाम, जन्म तिथि और आईडी) के साथ बायोप्सी डिश लेबल और फिर भ्रूण और चक्र आईडी के साथ प्रत्येक ड्रॉप संख्या। एक स्थायी गैर विषैले मार्कर का प्रयोग करें.
  4. बायोप्सी डिश की पहली बूंद के लिए एक 300 मीटर अलग करना पिपेट के साथ ब्लास्टोसिस्ट स्थानांतरण और संस्कृति माध्यम की अधिकता को दूर करने के लिए इसे कुल्ला। फिर बायोप्सी डिश की दूसरी बूंद में ब्लास्टोसिस्ट को ले जाएं।
  5. उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए डिश ले जाएँ और बायोप्सी डिश की तीसरी बूंद से कुछ माध्यम aspirating बायोप्सी पाइपेट प्रधानमंत्री.
  6. 20x आवर्धन पर, आईसीएम का एक स्पष्ट दृश्य है करने के लिए ब्लास्टोसिस्ट उन्मुख। जब यह 7 बजे कल्पना की जाती है (क्षेत्र है कि TE कोशिकाओं को दूर करने के लिए लक्षित किया जाएगा के विपरीत), पकड़े pipette पर भ्रूण सुरक्षित (चित्र 2a).
  7. जोना पेलुसिडा पर ध्यान केंद्रित करें और यह सुनिश्चित करें कि पिपेट और ब्लास्टोसिस्ट दोनों एक ही फोकल प्लेन पर हैं।
  8. लेजर उद्देश्य के लिए स्विच (पल्स समय 0.3 एमएस, 6.5 डिग्री मी) और ICM के विपरीत पक्ष पर zona pellucida पर लेजर सूचक की स्थिति. 2 $3 लेजर दालों के माध्यम से zona pellucida ड्रिल (चित्र 2b).
  9. धीरे से जोना pellucida के खिलाफ बायोप्सी पिपेट दबाएँ और दरार के माध्यम से कुछ माध्यम झटका अपनी आंतरिक सतह से टीकोशिकाओं को अलग करने और blastcyst पतन में तेजी लाने के लिए (चित्र 2c) .
  10. एक बार टीई अलग हो जाने के बाद (चित्र 2द), छेद के माध्यम से प्रवेश करें (यदि आवश्यक हो, तो इसे अंतिम लेजर पल्स के साथ चौड़ा करें) और कुछ टीई कोशिकाओं (आदर्श रूप से 7 डिग्री 813,16) को कोमल चूषण के साथ बायोप्सी पिपेट में (चित्र 2e) में प्रवेश करें ।
  11. बायोप्सी पिपेट को लक्ष्य कोशिकाओं को फैलाने के लिए एक मध्यम चूषण को लागू करते समय बायोप्सी पिपेट को पीछे की ओर ले जाएं (चित्र 2च) ।
  12. लेजर को एपिर्ड कोशिकाओं के सबसे पतले भाग की ओर निर्देशित करें तथा कोशिकाओं के बीच जंक्शनों पर 2 डिग्री 5 लेजर दालों को आग लगाकर लक्ष्य कोशिकाओं को भ्रूण के शरीर से अलग कर सकते हैं (चित्र 2ह)। लेजर दालों के समय और दालों की संख्या blastcyst की गुणवत्ता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है; हालांकि, सेल lysis से बचने के लिए उन्हें कम से कम करने की कोशिश.
  13. ब्लास्टोसिस्ट (चित्र 2h)से टीई टुकड़ा के अलग होने के बाद , इसे ब्लास्टोसिस्ट से दूर एक ही बायोप्सी ड्रॉप में छोड़ दें। यह उन्हें बायोप्सी पिपेट में फिर से चूसा जा रहा से रोकने के लिए की जरूरत है (चित्र 2i) .
  14. होल्डिंग पिपेट से ब्लास्टोसिस्ट को छोड़ें और तुरंत दोनों पिपेट को बढ़ाएं ताकि टुकड़े को चिपके रहने से रोका जा सके।
  15. गुणवत्ता नियंत्रण उद्देश्य के लिए बायोप्सी खंडित की एक तस्वीर ली (चित्र 3)।
    नोट: यदि एक एकल ब्लास्टोसिस्ट से अधिक प्रक्रिया के प्रति बायोप्सी किया जाना है (बायोप्सी डिश प्रति चार तक), भ्रूण के बीच क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए एक नए के साथ बायोप्सी पिपेट बदलें।
  16. 4.1$4.13 चरणों को दोहराएँ.
  17. बायोप्सी पकवान वापस ले जाने के लिए ले जाने के स्तरीय प्रवाह हुड.
  18. जोड़ी आईडी के साथ पोस्ट बायोप्सी संस्कृति पकवान लेबल, और भ्रूण और चक्र आईडी के साथ प्रत्येक ड्रॉप.
  19. एक गवाह की उपस्थिति में, स्वच्छ आईवीएफ माध्यम में ब्लास्टोसिस्ट कुल्ला, और अंत में यह पोस्ट बायोप्सी पकवान की अपनी इसी ड्रॉप करने के लिए ले जाएँ।
  20. एक नियंत्रित वातावरण में इनक्यूबेटर के लिए पोस्ट बायोप्सी पकवान ले जाएँ (37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ2, 5% हे2) जब तक vitrification. ब्लास्टोसिस्ट पुनः विस्तार को रोकने के लिए बायोप्सी प्रक्रिया से 30 मिनट के भीतर vitrification प्रदर्शन करने की सलाह दी जाती है।

5. ट्यूबिंग

नोट: पूरी प्रक्रिया एक गवाह की उपस्थिति में और कमरे के तापमान पर स्तरीय प्रवाह हुड के अंदर किया जाना चाहिए। प्रक्रिया के दौरान, बर्फ पर एक ठंडा ट्यूब रैक में पीसीआर ट्यूब रखने के लिए (पूरक चित्र 1)।

  1. एक स्थायी गैर विषैले मार्कर के साथ पीसीआर ट्यूबों लेबल.
    नोट: लेबलिंग आनुवंशिक प्रयोगशाला द्वारा अनुरोध के रूप में किया जाना चाहिए. आम तौर पर, रोगी का नाम और उपनाम (प्रारंभिक), युगल आईडी, भ्रूण और चक्र आईडी (उदाहरण के लिए: JD 12345 1.2 जेन डो से संबंधित 2 चक्र के भ्रूण N.1 के लिए जिसका जोड़ा आईडी 12345 है). भ्रूण आईडी ट्यूब के शरीर पर पत्र में भी रिपोर्ट किया जाना चाहिए.
  2. बायोप्सी भ्रूण की आईडी (अनुपूरक चित्र 1) के साथ 60 मिमी x 15 मिमी संस्कृति डिश (टबिंग डिश) के ढक्कन को लेबल करें और इसमें बायोप्सी धोने के घोल (सामग्री की तालिका)कीदो 10 डिग्री एल बूँदें तैयार करें।
  3. ट्यूबिंग डिश की दूसरी बूंद से कुछ बायोप्सी धोने के समाधान के साथ 140 मीटर अलग करना पिपेट (अनुपूरक चित्र 1) प्राइम करें।
  4. टीई टुकड़ा (ओं) को आसानी से कल्पना करने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे बायोप्सी पकवान रखें।
  5. धीरे से टीई टुकड़ा पर कुछ बायोप्सी धोने समाधान जारी; तो, यह अलग करना pipette में लोड.
  6. ट्यूबिंग डिश में बायोप्सी धोने के समाधान की दूसरी बूंद के लिए टीई टुकड़ा ले जाएँ और ध्यान से यह 2 -3 बार कुल्ला।
  7. पीसीआर ट्यूब के नीचे करने के लिए TE टुकड़ा स्थानांतरण (पहले इसके बाद लेबल) समाधान लोड हो रहा है के साथ, अलग करना pipette की नोक के साथ अपनी दीवारों को छूने से बचने के लिए ध्यान दे.
  8. कदम 5.3 से प्रत्येक TE टुकड़ा के लिए 5.7 कदम करने के लिए प्रक्रिया दोहराएँ, हर TE टुकड़ा के लिए एक नई केशिका का उपयोग करने के लिए ध्यान दे.
  9. ट्यूबिंग प्रक्रिया के अंत में, एक मिनी अपकेंद्रित्र में सभी पीसीआर ट्यूब ों को रखें, और उन्हें कुछ सेकंड के लिए स्पिन करें।
  10. -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को तब तक स्टोर करें जब तक कि उन्हें परीक्षण के लिए संदर्भित आनुवंशिक प्रयोगशाला में भेज दिया जाए।

6. ब्लास्टोसिस्ट विट्रीफिकेश

  1. उनके फिर से विस्तार को रोकने के लिए TE बायोप्सी से 30 मिनट के भीतर Vitrify ढह blastcysts.
  2. महिला के विवरण और ब्लास्टोसिस्ट्स की आईडी के साथ vitrification प्लेट लेबल कि vitrified किया जाना चाहिए.
  3. महिला के नाम और उपनाम, युगल आईडी, उस पर लोड किया जाएगा कि भ्रूण की आईडी, साथ ही प्रक्रिया की तारीख के साथ vitrification समर्थन (ओं) लेबल. विशेष cryolabels का उपयोग किया जाता है जो बहुत कम तापमान (-196 डिग्री सेल्सियस) पर भी उनकी अखंडता को बनाए रखता है।
  4. कमरे के तापमान पर, प्रत्येक ब्लास्टोसिस्ट के लिए 0.3 एमएल तुल्यता विलयन (ES) (सामग्रीकीतालिका) को वितरित करें जो कि कोचरीकृत किया जाएगा।
  5. एक गवाह की उपस्थिति में, 300 मीटर अलग करना पिपेट का उपयोग करते हुए ES में ब्लास्टोसिस्ट को स्थानांतरित करें।
  6. 13 डिग्री 15 मिनट के लिए ES में ब्लास्टोसिस्ट छोड़ दें। मात्रा के एक प्रारंभिक संकुचन के बाद, एक क्रमिक फिर से विस्तार मनाया जाएगा.
  7. तरल नाइट्रोजन (LN 2)के साथ एक छोटे से ठंडा रैक भरें और यह laminar प्रवाह हुड के नीचे जगह है.
  8. दूसरे कुएं में 300 डिग्री सेल्सियस का विपरिकरण विलयन (वीएस) (सामग्री की तालिका) का वितरण करें। ब्लास्टोसिस्ट पूरा फिर से विस्तार के बाद, यह 1 मिनट के लिए वी एस समाधान में स्थानांतरण और ईएस को पतला करने के लिए इसे कुल्ला।
  9. एक गवाह की उपस्थिति में, vitrification समर्थन पर blastcyst लोड और वी एस की अधिक हटाने का ख्याल रखना. समाधान की एक सूक्ष्म फिल्म ब्लास्टोसिस्ट को घेर लेना चाहिए।
  10. LN2 में vitrification समर्थन डुबकी और नमूना के करीब बुलबुला गठन के जोखिम को कम करने के क्रम में यह ऊर्जावान रूप से ले जाएँ.
  11. LN2 में विट्रिफिकेश समर्थन को जलमग्न रखते हुए सुरक्षात्मक टोपी रखें।
  12. एक गवाह की उपस्थिति में, एक दीर्घकालिक LN2 भंडारण टैंक में vitrification समर्थन ले जाएँ.

7. गैर बायोप्सीड ब्लास्टोसिस्ट्स का कृत्रिम संकुचन

  1. यदि कोई ते बायोप्सी नहीं किया जाता है, तो कृत्रिम रूप से विरोज़ीकोशियों को विरीकरण से तुरंत पहले ध्वस्त कर दिया जाता है (चित्र 4)।
    1. इनक्यूबेटर से उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए संस्कृति पकवान ले जाएँ और चयनित भ्रूण पर ध्यान केंद्रित.
    2. लेजर उद्देश्य के लिए स्विच (पूर्व निर्धारित पल्स: 0.3 एमएस, 6.5 डिग्री मीटर), ICM के विपरीत पक्ष पर zona pellucida लक्ष्य है, तो प्रत्यक्ष 1-2 लेजर दालों ICM से एक सुरक्षित दूरी पर TE कोशिकाओं के बीच जंक्शनों के लिए. ब्लास्टोसिस्ट्स को 5 मिनट से भी कम समय में गिर जाना चाहिए।
  2. खंड 6 में वर्णित के रूप में ढह blastcyst के vitrification के साथ आगे बढ़ें.

8. स्थानांतरणीय ब्लास्टोसिस्ट वार्मिंग

  1. ईटी के दिन, प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्व-समान आईवीएफ संस्कृति माध्यम के 600 डिग्री सेल्सियस रखकर ईटी 4-वेल प्लेट तैयार करें। ब्लास्टोसिस्ट वार्मिंग करते समय एक नियंत्रित वातावरण (5% O2, 6% CO2) में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  2. महिला के नाम और उपनाम, युगल आईडी, भ्रूण की आईडी है कि यह में गर्म हो जाएगा के साथ वार्मिंग पकवान लेबल.
  3. एक आईवीएफ एक-वेल डिश (अनुपूरक चित्र 1) में थिंग घोल (टीएस) ( सामग्री कीतालिका) के 1 एमएल का वितरण करें और प्रक्रिया शुरू करने से पहले कम से कम 1 एच के लिए थर्मोस्टेट में इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  4. LN2 के साथ एक छोटे से ठंडा समर्थन भरें और काम क्षेत्र के करीब निकटता में laminar प्रवाह हुड में जगह है.
  5. प्रक्रिया शुरू करने से पहले, vitrification समर्थन पर रिपोर्ट blastcyst जानकारी की जाँच करें। सभी आईडी आनुवंशिक रिपोर्ट से मेल खाना चाहिए और गर्म करने के लिए blastcyst हस्तांतरणीय लोगों के बीच चुना जाना चाहिए। प्रक्रिया के दौरान एक गवाह की आवश्यकता होती है।
  6. एक अच्छी तरह से गर्म टीएस युक्त पकवान ले लोमोस्टेट से बाहर और यह स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत एक गर्म मंच पर जगह है.
  7. एलएन2 के भीतर सुरक्षात्मक टोपी पर पुल forceps का उपयोग कर.
  8. 37 डिग्री सेल्सियस में vitrification समर्थन की नोक जल्दी से डुबकी.
  9. सूक्ष्म अवलोकन के तहत, धीरे vitrification समर्थन ले जाएँ जब तक blastcyst टिप से जारी है.
  10. टीएस में 1 मिनट की कुल के लिए blastcyst छोड़ दो, यह टीएस के तल पर रखने के लिए ध्यान दे.
  11. कमरे के तापमान पर विपरिकरण प्लेट के पहले कूप पर 200 डिग्री सेल्सियस कमजोर पड़ने के घोल (डीएस) (सामग्री कीसारणी) वितरित करें।
  12. डी एस के लिए ब्लास्टोसिस्ट स्थानांतरण और यह अच्छी तरह से नीचे जगह है, जबकि यह के शीर्ष पर कुछ टीएस जारी करने के लिए ढाल का एक प्रकार बनाने के लिए. यह 3 मिनट के लिए छोड़ दें.
  13. 2 अलग कुओं (WS1 और WS2) में धोने समाधान (WS) के 200 $L वितरित करें।
  14. WS1 के लिए blastcyst स्थानांतरण और यह के शीर्ष पर कुछ डी एस माध्यम जारी करते हुए अच्छी तरह से के तल पर जगह है। फिर ब्लास्टोसिस्ट को WS2 में स्थानांतरित करें और इसे 1 मिनट के लिए अबाधित छोड़ दें।
  15. पोस्ट-वार्मिंग एट प्लेट को महिला के नाम और उपनाम, युगल आईडी, भ्रूण की आईडी के साथ लेबल करें जो उसमें सुसंस्कृत होगा।
  16. एक गवाह की उपस्थिति में, गर्म ब्लास्टोसिस्ट को पोस्ट-वार्मिंग एट प्लेट में पूर्व-समान संस्कृति माध्यम में स्थानांतरित करें।
  17. एट प्लेट के पहले कुएं में ब्लास्टोसिस्ट को कुल्ला करें और इसे दूसरी अच्छी तरह से रखें।
  18. एक नियंत्रित वातावरण में इनक्यूबेटर के लिए पोस्ट-वार्मिंग संस्कृति पकवान स्थानांतरण (37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ2, 5% हे2) और संस्कृति अपने अस्तित्व की जाँच करने से पहले कम से कम 1.5 एच के लिए blastcyst और फिर से विस्तार.
    नोट: चित्र 5 अपभ्रष्ट, क्रायो-जीवित के उदाहरणों को दर्शाता है लेकिन पुनः विस्तारित नहीं होता है और क्रायो-जीवित और पूरी तरह से विस्तारित ब्लास्टोसिस्ट्स।

9. भ्रूण स्थानांतरण

  1. ईटी प्रदर्शन करने के लिए, लैमिनर प्रवाह हुड के गर्म चरण पर पकवान जगह है, तो भ्रूण एक कम आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई देता है.
  2. आईवीएफ संस्कृति माध्यम के बारे में 0.4 एमएल ले लो. आंतरिक कैथेटर के प्राप्त अंत में मजबूती से सिरिंज टिप सुरक्षित और फिर 0.1 एमएल तक मध्यम रिलीज.
  3. Aspirate संस्कृति माध्यम कैथेटर में प्रवेश भ्रूण देख जब तक (मीडिया की न्यूनतम राशि: 10 "15 $L).
  4. प्लास्टिक के मामले में कैथेटर प्लेस और ऑपरेटिंग कमरे में जाने के लिए और बाहरी गाइड में आंतरिक कैथेटर जगह है.
  5. एक बार गर्भाशय में पहुंचने के बाद, सिरिंज प्लंजर को भ्रूण को छोड़ने के लिए धक्का देना। बहुत धीरे धीरे मध्यम रिलीज जब तक प्लंजर 0.1 एमएल पढ़ रहा है.
  6. कैथेटर को वापस प्रयोगशाला में ले जाएं और माइक्रोस्कोप के नीचे जांच ें कीजाएं कि भ्रूण को स्थानांतरित कर दिया गया है।

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Representative Results

चित्र 6 बायोप्सी प्रक्रिया के सभी परिणामों की एक योजना का प्रतिनिधित्व करता है जिसे प्रोटोकॉल के मानकीकरण और प्रत्येक प्रचालक के प्रदर्शन की निगरानी करने के लिए अपनाया जा सकता है। मुख्य प्रक्रियात्मक परिणाम बायोप्सी/बायोप्सी को पूरा करने का समय है; मुख्य तकनीकी परिणाम आनुवंशिक परीक्षण के बाद उत्पादित साजिश की गुणवत्ता है जो या तो एक निर्णायक या अनिर्णायक निदान में परिणाम हो सकता है, जिसके बाद undiagnosed blastcyst के एक फिर से बायोप्सी की आवश्यकता है; मुख्य जैविक परिणाम वार्मिंग के बाद क्रायो-सर्वाइवल और पुन: विस्तार बनाम अध: पतन की दर है; अंत में, मुख्य नैदानिक परिणाम काष् ठ-गर्म ब्लास्टोसिस्ट स्थानांतरण के बाद जीवित जन्म दर है। पिछले तीन अध्ययनों में हमने तकनीकी , जैविक और नैदानिक परिणामों11,13,16के लिए केंद्र में परिभाषित KPIs की सूचना दी . इसके बाद, हम इसके बजाय रिपोर्ट कैसे biopsy के समय के लिए KPI परिभाषित किया गया था. इसके अलावा, इउपलित ब्लास्टोसिस्ट्स के बाद चेतावनी वाले व्यवहार पर बायोप्सी और विटिलीकरण के बीच समय के putative प्रभाव की भी जांच की गई थी।

2 वर्ष की अवधि में 7 प्रचालकों द्वारा कुल 1,544 ट्रोफिक्टोडर बायोप्सी प्रक्रियाएं आयोजित की गई (तालिका 1)। सभी बायोप्सी ब्लास्टोसिस्ट्स को फिर से इनक्यूबेटर में एक पोस्ट-बायोप्सी कल्चर डिश में ले जाया गया जब तक कि विरिकेश नहीं किया जाता। सभी प्रासंगिक डेटा एक संबंधपरक डेटाबेस में एकत्र किए गए थे. बायोप्सी के सभी समय और बायोप्सी और vitrification के बीच पूर्वव्यापी आईवीएफ इलेक्ट्रॉनिक साक्षी प्रणाली के सॉफ्टवेयर से प्राप्त किए गए थे. इसके बाद आंकड़ों का निर्यात किया गया और आंकड़ों के लिए उनका विश्लेषण किया गया।

ट्रोफिक्टोडरम बायोप्सी और विट्रिफिकेश-वार्मिंग के बाद इउपलब्लास्टिस्टों की क्रायो-सर्वाइवल दर एन - 571/572, 99.8% थी। वार्मिंग के बाद 1.5 एच पर फिर से विस्तार दर N था $ 556/571, 97.4%. 15 नहीं फिर से विस्तार blastcysts के बीच, एक utero में स्थानांतरित होने के बाद एक जीवित जन्म के परिणामस्वरूप. काचाभ-गर्म euploid एकल blastcyst हस्तांतरण के बाद जीवित जन्म दर N $ 227/572, 39.7% था।

बायोप्सी के आदर्श समय की परिभाषा

तालिका 1 में की गई बायोप्सी प्रक्रियाओं के संगत आंकड़ों का सारांश दिया गया है। कुल मिलाकर, 1.89 - 1.03 (रेंज 1-4) blastcysts 8.24 में प्रक्रिया प्रति बायोप्सी थे - 4.23 मिनट (रेंज 3-22). बायोप्सी का औसत समय दोनों ब्लास्टोसिस्ट्स बायोप्सी प्रति प्रक्रिया की संख्या के कारण भिन्न होता है, कम से कम 5.78 से - 2.94 मिनट (रेंज 3-16) जब केवल एक भ्रूण पकवान में 12.93 की अधिकतम करने के लिए रखा गया था - 4.43 मिनट (रेंज 6-22) जब भ्रूण क्रमिक रूप से बायोप्सी हम पुन: 4. एक अन्य प्रासंगिक पैरामीटर प्रक्रिया में शामिल ऑपरेटर था: सबसे विशेषज्ञ (एन $ 443 प्रक्रियाओं) सबसे तेजी से (7.41 - 3.6 मिनट, रेंज 3-22) था, जबकि कम से कम अनुभवी (एन $ 42) सबसे धीमी थी (14.19 - 4.24 मिनट, रेंज 6-22). वास्तव में, एक सामान्यीकृत रैखिक मॉडल दोनों "विस्फोटों की संख्या बायोप्सी प्रति प्रक्रिया" और "ऑपरेटर" चर पूरी तरह से बताते हैं "बायोप्सी के समय" एक आर2 के साथ $ 0.48 और एक शक्ति $ 1. यह विश्लेषण यह परिभाषित करने के लिए उपयोगी था कि आदर्श रूप से $ 6 मिनट एक ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी प्रक्रिया के लिए पर्याप्त है जब केवल एक भ्रूण पकवान में रखा जाता है, जबकि $ 9 मिनट, $ 12 मिनट और $ 13 मिनट के लिए 2, 3 और 4 blastcysts, क्रमशः। जाहिर है, पूरी प्रक्रिया भी बायोप्सी पकवान के लिए संस्कृति से भ्रूण चलती है और बाद से प्रक्रिया के बाद बायोप्सी संस्कृति पकवान के लिए, साथ ही अनुक्रमिक बायोप्सी के बीच बायोप्सी पाइपेट बदलने पर जोर देता है.

चित्र 7 अध्ययन तिमाही के साथ प्रत्येक ऑपरेटर के लिए बायोप्सी का माध्य समय (1सेंट से 8वें) के लिए । डॉटेड लाल रेखा 8.24 मिनट के माध्य समग्र मूल्य की पहचान करती है। इस तरह के एक ग्राफ प्रत्येक व्यवसायी के मतलब प्रदर्शन की निगरानी के लिए उपयोगी है. उदाहरण के लिए, सबसे विशेषज्ञ ऑपरेटरों (1 और 2) इस समय है, जो एक सीखने की अवस्था की एक प्रवृत्ति विशिष्ट पता चलता है की एक निरंतर कमी दिखाई. 3 से 6 तक के सभी ऑपरेटरों के बजाय trimesters भर में मतलब समग्र मूल्य के आसपास अपने प्रदर्शन में पर्याप्त रूप से स्थिर थे. किसी भी समय वे एक दिए गए तिमाही से मतलब मूल्य में एक चोटी दिखाया (उदाहरण के लिए, ऑपरेटर 3 7वें तिमाही में, ऑपरेटर 4 में 6वें तिमाही, ऑपरेटर 5 3rd तिमाही में), वे क्रम में अपने प्रदर्शन को संशोधित करने के लिए चेतावनी दी गई थी. ऑपरेटर 7 (यानी, कम से कम अनुभवी) एक भ्रूण विज्ञानी है कि अभी अपने प्रशिक्षण समाप्त हो गया है की विशिष्ट समय दिखाया. संभवत:, वह प्रयोगशाला के आंतरिक मानकों को पूरा करेगा क्योंकि विशेषज्ञता में वृद्धि होगी।

महत्वपूर्ण बात यह है कि बायोप्सी का समय पुनः विस्तार में समान था और गर्म होने से 1.5 एच पर यूपलॉयड ब्लास्टोसिस्टों का पुन: विस्तार नहीं किया गया था (9.52 डिग्री 4.23 मिनट, सीमा 3-22 बनाम 10.5 - 5.68 मिनट, रेंज 4-22; टी-परीक्षण ] 0.37)। संभावना है, प्रत्यारोपित (एन $ 229) और प्रत्यारोपित नहीं (एन $ 343) vitrified-warmed euploid blastcysts भी तुलनीय बायोप्सी समय दिखाया (9.77 - 4.15 मिनट, सीमा 3-22 बनाम 9.41 - 4.36 मिनट, सीमा 3-22; टी परीक्षण ] 0.39). संभवतः तब, एक समय $ 22 मिनट अप करने के लिए बायोप्सी करने के लिए 4 blastcysts वार्मिंग के बाद भ्रूण व्यवहार को प्रभावित नहीं करता है. इसलिए, हम इस मान अधिकतम थ्रेशोल्ड के रूप में निर्धारित है।

इसी प्रकार, विभिन्न बायोप्सी प्रचालकों में जीवित जन्म दर के संदर्भ में कोई अंतर नहीं दिखाया गया, जैसा कि पहले ही13 (पूरकतालिका1) पहले बताया गया था।

प्रत्येक ऑपरेटर के प्रदर्शन की निगरानी करने के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर निदान के बाद अनिर्णायक परिणामों की दर है, जो प्रत्येक प्रयोगशाला के सामान्य प्रदर्शन के लिए जितना संभव हो उतना करीब होना चाहिए। आदर्श रूप में यह दर 2.5% से अधिक नहीं होनी चाहिए औरबायोप्सी और ट्यूबिंग प्रक्रियाओं में बढ़ती विशेषज्ञता के कारण समय के साथ कम हो सकती है . पुनः प्राप्त करने के लिए टीई कोशिकाओं की लक्ष्य संख्या 7-8 है जो पिछले दो अध्ययनों13,16के अनुसार है . इस उद्देश्य के लिए, गुणवत्ता नियंत्रण उद्देश्य के लिए बायोप्सी खंडित की एक तस्वीर लेने का सुझाव दिया गया है (चित्र 3में कुछ उदाहरण देखें)। इस तरह की तस्वीर अनिर्णायक निदान के मामले में जाँच की जा सकती है कि क्या कारण टुकड़ा के आयाम / गुणवत्ता के लिए imputable था (यानी, आणविक विश्लेषण की निम्न गुणवत्ता), ट्यूबिंग के लिए (यानी, डीएनए प्रवर्धन विफलता) या में कुछ मुद्दों के लिए आनुवंशिक प्रयोगशाला में नमूने के प्रसंस्करण.

बायोप्सी और vitrification के बीच आदर्श समय की परिभाषा

अध्ययन अवधि में, 572 euploid blastcysts euploidy के निदान के बाद एक भ्रूण हस्तांतरण से गुजरना करने के लिए गर्म किया गया. चित्रा 8A बायोप्सी और vitrification के बीच बढ़ती समय भर में वितरित एक काले चक्र के रूप में प्रत्येक गर्म blastcyst से पता चलता है और जांच के तहत परिणाम के अनुसार दो समूहों में संकुल: फिर से विस्तार या नहीं 1.5 एच के भीतर फिर से विस्तार वार्मिंग. सभी ब्लास्टोसिस्ट्स (एन जेड 117/ ब्लास्टोसिस्टों के 97.6% (एन $ 245/251) 31-90 मिनट के बीच काचाभ, और 95.1% (एन $ 194/204) ब्लास्टोसिस्टों के 90 मिनट से अधिक का काटे गए, क्रमशः (कोई पुनः विस्तार दर: 0%, 2.4% और 4.9%)। इसलिए, हम बायोप्सी और vitrification के बीच समय की जल्दी और देर से सीमा के रूप में 30 मिनट और 90 मिनट निर्धारित किया है.

चित्रा 8B तीन समूहों में फिर से विस्तार दर से पता चलता है ($30 मिनट, 31-90 मिनट, और 90 मिनट) आगे sub-clustered blastcyst गुणवत्ता और preimplantation विकास के दिन के अनुसार. विशेष रूप से खराब गुणवत्ता और / या दिन 7 blastcysts के लिए, बायोप्सी और vitrification के बीच समय वार्मिंग के बाद फिर से विस्तार को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण लगता है. विशेष रूप से, दोनों blastcyst गुणवत्ता और blastcysts में बायोप्सी के दिन के लिए सही किया जा रहा है के बाद फिर से विस्तार की बाधाओं अनुपात बायोप्सी बनाम blastcysts से 30 मिनट के भीतर vitrified 90 मिनट से परे vitrified 3.05 (95% CI 1.01-9.4, p$0.05) था. इसके बजाय, इन दो थ्रेशोल्ड (31-90 मिनट) के बीच की अवधि एक ग्रे क्षेत्र है कि हो सकता है या एक प्रभाव नहीं हो सकता है प्रतिनिधित्व किया.

15 में से केवल 1 ने ब्लास्टोसिस्टों का पुन: विस्तार नहीं किया जिसके परिणामस्वरूप स्थानांतरण के बाद जीवित जन्म हुआ। इसलिए, हम अंत में बायोप्सी और vitrification के बीच समय के अनुसार तीन समूहों में संकुल euploid एकल blastocyst हस्तांतरण के बाद हासिल की लाइव जन्म दर की जांच की। उच्चतम जीवित जन्म दर trophectoderm बायोप्सी से eupoid blastcysts vitrified $30 मिनट स्थानांतरित करके प्राप्त किया गया था (N ] 56/117, 47.9%). हालांकि, यह परिणाम सांख्यिकीय महत्व तक नहीं पहुंचा जब एक ही परिणाम की तुलना में प्राप्त 31 और 90 मिनट के बीच blastocysts के साथ vitrified (N ] 92/251, 36.7%; फिशर की सटीक परीक्षण - 0.06), या blastcysts के साथ vitrified और 90 मिनट बायोप्सी से (N $81$204, 39.7%; फिशर की सटीक परीक्षण - 0.16). इसलिए, या तो ब्लास्टोसिस्ट प्रजनन क्षमता पर नकारात्मक प्रभाव नगण्य है या इस डेटासेट में नमूना आकार (एन जेड 572) सांख्यिकीय महत्व तक पहुंचने के लिए अपर्याप्त था।

Figure 1
चित्र 1: ब्लास्टोसिस्ट ग्रेडिंग के लिए पैरामीटर। विस्तार:(क) पूरी तरह से रची गई , (बी) अंडे से निकलने में, (ग) पूरी तरह से विस्तार, और (डी) का विस्तार नहीं हुआ। आदर्श चरण सी है, जबकि एक ब्लास्टोसिस्ट डी को पूर्ण विस्तार प्राप्त करने के लिए अधिक समय दिया जाना चाहिए, जब तक कि यह चरण 7 दिन में नहीं पहुंच जाता है; इनर सेल द्रव्यमान (आईसीएम) आकृतिकगुणवत्ता: 1 (कई सख्ती से पैक कोशिकाओं के साथ ध्यान देने योग्य), 2 (कई लेकिन मोटे तौर पर पैक कोशिकाओं के साथ अलग) और 3 (बहुत कम गुणवत्ता वाले कोशिकाओं के साथ भेद करने के लिए मुश्किल); ट्रोफिक्टोडरम (टीई) आकृतिकगुणवत्ता: 1 (कई कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से संगठित उपकला), 2 (कुछ कोशिकाओं के साथ उपकला) और 3 (कुछ और/ कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: अनुक्रमिक जोना पेलुसिडा का सारांश ([P) खोलने और ट्रोफीक्टोडरम (टीई) ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी के लिए कोशिकाओं पुनर्प्राप्ति दृष्टिकोण। (क) आंतरिक कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) के साथ ब्लास्टोसिस्ट को होल्डिंग पिपेट के पास और उस स्थान से दूर जहां चयनित टीई कोशिकाओं को पुनः प्राप्त किया जाएगा। होल्डिंग पिपेट पर ब्लास्टोसिस्ट को सुरक्षित करें; (ख) 2-3 लेजर शॉट्स के माध्यम से $P खोलें; (ग) छेद के माध्यम से कुछ संस्कृति मीडिया उड़ा; (घ) ब्लास्टोसिस्ट $P से अलग हो जाएगा; (ई) बायोप्सी पिपेट में 5-10 टीई कोशिकाओं को चूसें; (च) चयनित खंड को फैलाने और कोशिकाओं के बीच के जंक्शनों को उजागर करने के लिए बायोप्सी पिपेट के साथ पीछे की ओर गति करते हैं; (छ) कोशिकाओं के बीच जंक्शनों पर आग और टुकड़ा खींच जारी रखने के लिए जब तक टीकोशिकाओं blastcyst के शरीर से जारी कर रहे हैं; (ज) ते बायोप्सी के बाद ब्लास्टोसिस्ट गिर गया है; (i) गुणवत्ता नियंत्रण के लिए बायोप्सी टुकड़ा की एक तस्वीर लेने के लिए और यह पीसीआर ट्यूब है कि आनुवंशिक प्रयोगशाला के लिए भेजा जाएगा करने के लिए स्थानांतरण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: बायोप्सी टुकड़े के उदाहरण: (ए-सी) वांछनीय टुकड़े; (घ) lysed टुकड़ा; (ई) अपभ्रष्ट कोशिकाओं के साथ छोटा टुकड़ा; (च) छोटे, आंशिक रूप से lysed और अपभ्रष्ट टुकड़ा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: कृत्रिम संकुचन। (क) ब्लास्टोसिस्ट को उन्मुख करें ताकि आंतरिक कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) ट्रोफीक्टोडरम (टीई) के लक्षित खंड से दूर हो; (ख) टीई कोशिकाओं के बीच जंक्शनों पर एक पंक्ति में 2-3 लेजर शॉट्स को आग लगाना और बाहर की ओर बढ़ रहा है; (ग) विरुकेश शुरू करने से पहले ब्लास्टोसिस्ट के पतन की प्रतीक्षा करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: ब्लास्टोसिस्ट अध: पतन के उदाहरण (क), क्रायो-सर्वाइवल लेकिन कोई पुन: विस्तार (ख) और क्रायो-सर्वाइवल और पूर्ण पुनः विस्तार (ग) 1.5 एच पोस्ट-वार्मिंग। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: ट्रोप्टोडर्म बायोप्सी के विभिन्न परिणामों का सारांश जिसका उपयोग ऑपरेटर के प्रदर्शन की निगरानी करने और प्रत्येक प्रयोगशाला के आंतरिक मुख्य निष्पादन संकेतकों को परिभाषित करने के लिए किया जा सकता है। मुख्य प्रक्रियात्मक परिणाम बायोप्सी का समय है। मुख्य तकनीकी परिणाम निर्णायक की दर है (यूप्लॉयड या एयुप्लॉयड) और अनिर्णायक निदान (पुन: बायोप्सी आवश्यक) प्राप्त; बाद डीएनए प्रवर्धन या कम गुणवत्ता आणविक डेटा के कारण हो सकता है, दोनों नहीं व्याख्या योग्य गुणसूत्र प्रतिलिपि संख्या प्रोफ़ाइल भूखंडों में जिसके परिणामस्वरूप. मुख्य जैविक परिणाम बायोप्सी, vitrification और वार्मिंग के बाद क्रायो-सर्वाइवल और फिर से विस्तार या अध: पतन की दर है। मुख्य नैदानिक परिणाम vitrified-warmed blastcyst हस्तांतरण के बाद प्राप्त जीवित जन्मों या नकारात्मक गर्भावस्था परिणामों की दर है। नोट की, जबकि प्रक्रियात्मक परिणाम विशेष रूप से ऑपरेटर और प्रक्रिया प्रति बायोप्सी के लिए blastcysts की संख्या पर निर्भर है, अन्य सभी परिणाम बायोप्सी ऑपरेटर से स्वतंत्र अन्य confounders से प्रभावित हो सकता है (उदाहरण के लिए, कदम और ऑपरेटरों आणविक विश्लेषण में शामिल, ब्लास्टोसिस्ट की आकृतिक गुणवत्ता, बायोप्सी के दिन) जिसे उसके प्रदर्शन का ठीक से मूल्यांकन करने के लिए जिम्मेदार होना चाहिए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: 8 अध्ययन तिमाही भर में प्रति ऑपरेटर बायोप्सी का मतलब समय. तालिका प्रक्रियाओं की संबंधित संख्या और 8 अध्ययन trimesters में प्रत्येक ऑपरेटर द्वारा प्रक्रिया के अनुसार blastcysts बायोप्सी की माध्य संख्या को संक्षेप में प्रस्तुत करता है। प्रत्येक ग्राफ के भीतर डॉटेड लाल रेखा बायोप्सी (8.24 मिनट) के समग्र मतलब समय का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र8: बायोप्सी और vitrification के बीच समय बनाम वार्मिंग के बाद फिर से विस्तार. (ए) वार्मिंग के बाद 1.5 घंटा ब्लास्टोसिस्टों को पुन विस्तारित और पुन विस्तारित नहीं दिखाता है। प्रत्येक ब्लास्टोसिस्ट बढ़ती समय भर में एक काले वृत्त द्वारा प्रतिनिधित्व किया है। ऊर्ध्वाधर सतत काले लाइनों 30 मिनट जल्दी सीमा के रूप में सेट और 90 मिनट देर से सीमा के रूप में सेट का प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी) तीन समूहों में पुनः विस्तार दरों से पता चलता है (बायोप्सी और vitrification के बीच समय: $ 30 मिनट, 31-90 मिनट, और 90 मिनट) आगे blastcyst गुणवत्ता और बायोप्सी के दिन के अनुसार संकुल. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रक्रियाओं के एन एन ब्लास्टोसिस्ट्स बायोप्सी प्रति प्रक्रिया बायोप्सी के मतलब समय - एसडी, रेंज (मिनट)
ऑपरेटर 1 443 २.०१- १.०९, १-९ 7-4-41 िे िे िे िीिे 3-22
195 1 4.75 ] 1.96, 3-16
111 २ 7.83 ] 2.45, 3-18
71 3 10.27 ] 2.41, 4-16
66 4 11.48 ] 3.81, 6-22
ऑपरेटर 2 290 1.81 ] 0.98, 1-4 7.87 ] 4.13, 3-22
142 1 5.69 ] 3.32, 3-16
89 २ 8-4-18
30 3 11.37 ] 3.72, 4-20
29 4 13.1 ] 3.89, 9-22
ऑपरेटर 3 287 1.98 ] 1.05, 1-4 9.10 - 4.65, 3-22
121 1 6 ] 2.19, 3-15
89 २ 9.6 ] 3.87, 3-22
38 3 12.66 ] 4.55, 4-22
39 4 14.13 ] 4.8, 6-22
ऑपरेटर 4 217 1.66 ] 0.87, 1-4 7.58 ] 3.45, 3-22
118 1 5.58 ] 1.96, 3-14
66 २ 8.92 ] 2.91, 4-22
21 3 11.48 ] 2.34, 5-16
12 4 13 ] 4.26, 6-19
ऑपरेटर 5 144 2.03 ] 1.08, 1-4 9.43 ] 4.24, 3-22
59 1 6.15 ] 2.5, 3-16
43 २ 10.07 ] 2.73, 6-16
20 3 12.6 ] 2.89, 9-18
22 4 14.09 ] 4.43, 6-22
ऑपरेटर 6 121 1.67 ] 0.94, 1-4 7.79 ] 3.93, 3-22
70 1 6.19 ] 2.95, 3-16
32 २ 8-1-12 ] 1.72, 3-11
9 3 12.78 ] 3.31, 9-18
10 4 13.5 ] 6.19, 6-22
ऑपरेटर 7 42 1.62 ] 0.94, 1-4 14.19 - 4.24, 6-22
27 1 11.85 ] 5.53, 6-16
6 २ 16.5 ] 3.73, 11-22
7 3 19.86 ] 3.34, 13-22
२ 4 19 ] 4.24, 16-22
कुल 1544 1.89 ] 1.03, 1-4 8-2-24 4-23, 3-22
732 1 5.78 ] 2.94, 3-16
436 २ 8-2-85 िे िे िे िीिे िे िे िे िी
196 3 11.72 ] 3.70, 4-22
180 4 12.93 ] 4.43, 6-22

तालिका 1: बायोप्सी के कुल मतलब समय और बायोप्सी ऑपरेटर के अनुसार प्रत्येक प्रक्रिया में blastcysts बायोप्सी की औसत संख्या। बायोप्सी का औसत समय भी प्रक्रिया प्रति ब्लास्टोसिस्टबायोप्सी की प्रत्येक अनुक्रमिक संख्या के अनुसार दिखाया गया है। एक सामान्यीकृत रैखिक मॉडल है कि दोनों "बायोप्सी ऑपरेटर" और "विस्फोटों की संख्या प्रक्रिया प्रति बायोप्सी" चर पूरी तरह से "बायोप्सी के समय" के साथ संबंधित (आर2 $ 0.48, शक्ति ] 1) शामिल हैं।

अनुपूरक चित्र 1: मुख्य डिवाइस और प्रक्रिया के लिए आवश्यक समर्थन करता है. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: लॉजिस्टिक प्रतिगमन विश्लेषण बायोप्सी ऑपरेटर और vitrified-warmed eupoid blastcyst हस्तांतरण के बाद जीवित जन्म के बीच कोई महत्वपूर्ण संबंध नहीं दिखाता है। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

केवल अच्छी तरह से अनुभवी कुशल भ्रूण विज्ञानी जिन्होंने अपनी प्रशिक्षण अवधि पूरी कर ली है, उन्हें ते बायोप्सी और ब्लास्टोसिस्ट विट्रीफिकेश दोनों को करना चाहिए। इसके अलावा, एक गवाह प्रक्रियाओं की निगरानी और i के दौरान एक कुशल पता लगाने की क्षमता की गारंटी की आवश्यकता है) बायोप्सी डिश से बायोप्सी ब्लास्टोसिस्ट के आंदोलनों (पूरक चित्र 1) पोस्ट बायोप्सी डिश के लिए ( अनुपूरक चित्र 1 ) ), तो विपरिकरण प्लेट (अनुपूरक चित्र 1) और अंत में विरीकरण समर्थन ( अनुपूरक चित्र1) के लिए ; ii) बायोप्सी टी कोशिकाओं को बायोप्सी डिश से पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करना (पूरकचित्र 1); iii) निदान के बाद वार्मिंग और स्थानांतरण कदम। सभी साक्षी चरणों का विस्तृत विवरण के लिए विफलता मोड और प्रभाव विश्लेषण (FMEA) पहले प्रकाशित14को संदर्भित करता है।

इस पत्र में वर्णित सभी तरीकों स्थानीय विनियमन का सम्मान (इतालवी कानून 40/ कानून के अनुसार, वास्तव में, जोड़े को वे आईवीएफ चक्र के दौरान उत्पादित भ्रूण के स्वास्थ्य की स्थिति के बारे में सूचित करने के लिए अनुरोध कर सकते हैं. इस संबंध में, पीजीटी के लिए एक विस्तृत सूचित सहमति दोनों भागीदारों से हस्ताक्षर किए जाने चाहिए।

इस पत्र में हमने बताया कि कैसे एक व्यस्त प्रयोगशाला दिनचर्या में पीजीटी के लिए blastcyst बायोप्सी को लागू करने के लिए. blastcyst बायोप्सी दृष्टिकोण के आवेदन आईवीएफ में पिछले दशक में एक महत्वपूर्ण प्रगति की गई है. सबसे पहले डी बोअर और उनके सहयोगियों द्वारा 200417में रिपोर्ट की गई , इसे शीघ्र ही क्लीवेज चरण और ध्रुवीय शरीर बायोप्सी दृष्टिकोण3की तुलना में अधिक प्रभावी और जानकारीपूर्ण प्रक्रिया के रूप में मान्यता दी गई है . इस प्रक्रिया का मूल्य मुख्य रूप से तकनीकी बोझ में कमी में रहता है , लेकिन यह भी विकास के इस स्तर पर गुणसूत्र मोज़ेकता की कम घटना में18,19. इसके अलावा, एक ब्लास्टोसिस्ट से कुछ टीई कोशिकाओं को हटाने के लिए एक दरार चरण भ्रूण से एक blastomere को हटाने की तुलना में एक सुरक्षित प्रक्रिया के रूप में सुझाव दिया गया है. दरअसल, एक यादृच्छिक गैर चयन अध्ययन में पूर्व दृष्टिकोण भ्रूण प्रत्यारोपण क्षमता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, जबकि बाद में एक महत्वपूर्ण शामिल $20% कमी20.

प्रोटोकॉल ज्यादातर दुनिया भर में इस्तेमाल किया लेजर की मदद से zona दिन 3 के बाद गर्भाधान में खोलने पर जोर देता है. विभिन्न ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी दृष्टिकोण की तुलना करने के लिए आज तक कोई यादृच्छिक नियंत्रित परीक्षण आयोजित नहीं किया गया है। हालांकि, यह उचित है कि जोड़तोड़ और बढ़ते भ्रूण के जोखिम की संख्या कम suboptimal पर्यावरण की स्थिति के लिए, प्रोटोकॉल के संभावित आक्रामकता कम है. इसके अलावा, विकास के 3 दिन से जोना पेलुसिडा में एक छेद की उपस्थिति ब्लास्टोसिस्ट विस्तार को प्रभावित कर सकती है और टीई कोशिकाओं के साथ आईसीएम कोशिकाओं के हर्निया का कारण बन सकती है। इन कारणों के लिए, हमने यहां वर्णित प्रोटोकॉल को सेट और कार्यान्वित किया जो अनुक्रमिक लेजर-सहायता वाले ज़ोना उल्लंघन और टीई कोशिकाओं को पुनः प्राप्ति पर जोर देता है जैसे ही ब्लास्टोसिस्ट पूर्ण विस्तार तक पहुंचता है। इसके अलावा एक अलग प्रोटोकॉल मौजूद है , जिसमें एक दिन 5 या 6 सहायता प्राप्त है ,5,7. विशेष रूप से, zona की ड्रिलिंग ICM के संबंध में विपरीत पक्ष पर preimplantation विकास के दिन 5 या 6 पर किया जाता है; blastcyst तो टीई कोशिकाओं के सहज हर्निया के लिए इंतजार कर इनक्यूबेटर के लिए वापस ले जाया जाता है। जाहिर है, ब्लास्टोसिस्ट की आवधिक निगरानी निम्नलिखित घंटों में प्रदान की जानी चाहिए, जैसे ही टीई हर्निया लगाना शुरू कर देगा, साथ ही भ्रूण को पूरी तरह से पैदा होने से रोकने के लिए इसे बायोप्सी करने के लिए। यदि एक तरफ अकुशल चिकित्सकों को आसानी से इस वैकल्पिक बायोप्सी रणनीति को लागू कर सकते हैं, दूसरी ओर यह एक व्यस्त प्रयोगशाला प्रति दिन कई प्रक्रियाओं प्रदर्शन के लिए उपयुक्त नहीं है. अनुक्रमिक zona खोलने और blastcyst बायोप्सी प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित बजाय कम समय लेने वाली है और एक छोटे हाथ पर समय और एक उच्च लचीलापन प्रयोगशाला में दैनिक गतिविधि अनुसूची करने के लिए इतनी समय सीमा के लिए समर्पित समन्वय करने की अनुमति देता है बायोप्सी और vitrification प्रक्रियाओं के लिए.

खराब गुणवत्ता blastcysts बायोप्सी के लिए और अधिक जटिल हो सकता है के बाद से टीई कोशिकाओं चिपचिपा हो सकता है, लेकिन अधिक लेजर शॉट्स टुकड़े की खींच के साथ समन्वित कोशिकाओं के बीच जंक्शनों को बेनकाब करने के लिए यह blastcyst के शरीर से हटाने के लिए पर्याप्त हैं. पूरी तरह से रचित ब्लास्टोसिस्ट को जोना पेलुसिडा में संलग्न ब्लास्टोसिस्ट की तरह बायोप्सी किया जा सकता है, लेकिन वे विकराल और गर्म करने के लिए मुश्किल हो सकता है। बायोप्सी के बाद अनिर्णायक निदान के मामले में, आज तक के आंकड़ों में इस बात का खंडन किया गया है कि पुन: बायोप्सी और निम्नलिखित विचालकीकरण-गर्मी चक्र16,21से कोई नुकसान नहीं होता है।

Vitrification वर्तमान में केंद्र में blastcyst cryopservation प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह लगातार सुरक्षित, अधिक कुशल और कम समय लेने वाली एक समीक्षा और सबसे हाल ही में साहित्य के मेटा विश्लेषण से धीमी ठंड प्रोटोकॉल की तुलना में सूचित किया गया है 10|

एक बार प्रक्रिया अच्छी तरह से स्थापित किया गया था और ऑपरेटरों ठीक से प्रशिक्षित किया गया था, हम दोनों blastcyst बायोप्सी और vitrification प्रक्रियाओं के लिए आदर्श प्रक्रियात्मक समय को परिभाषित करने के लिए एक पूर्वव्यापी विश्लेषण प्रदर्शन किया (प्रतिनिधि परिणामों में यहाँ संक्षेप). अंतिम परिणामों के रूप में, हमने वार्मिंग के बाद 1.5 एच पर मूल्यांकन की गई इउपाइड ब्लास्टोसिस्ट की पुनः विस्तार दर का मूल्यांकन किया है और काचन-गर्म सुगुणित एकल भ्रूण हस्तांतरण के बाद प्राप्त जीवित जन्म दर का मूल्यांकन किया है। बायोप्सी के बाद ब्लास्टोसिस्ट अध: पतन का कोई मामला नहीं देखा गया था, और सिर्फ 0.2% (एन $ 1/572) जने के बाद गिरावट दर की सूचना दी गई थी, बायोप्सी और vitrification दृष्टिकोण की विश्वसनीयता की पुष्टि अपनाया. विश्लेषण के अनुसार, ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी करने के लिए आवश्यक समय या तो ईउपलाइड ब्लास्टोसिस्ट की व्यवहार्यता को फिर से विस्तार दर के रूप में परिभाषित वार्मिंग के बाद प्रभावित नहीं करता है, या प्रजनन क्षमता को जीवित जन्म दर के रूप में परिभाषित किया गया है। हालांकि विभिन्न समय विभिन्न विशेषज्ञता के साथ ऑपरेटरों भर में मनाया जा सकता है, हम ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी सुरक्षित विचार कर सकते हैं जब प्रक्रिया के बारे में 8 मिनट में पूरा हो गया है, एक सीमा में से 3 से 22 मिनट प्रति प्रक्रिया भ्रूण की संख्या के आधार पर (हालांकि कोई डेटा कर रहे हैं बायोप्सी प्रक्रियाओं के लिए उपलब्ध लंबे अंतराल में प्रदर्शन किया). प्रत्येक एकल ऑपरेटर से ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी के लिए खर्च किया गया औसत समय समय-समय पर होना चाहिए (कम से कम हर तीन महीने) KPI के रूप में निगरानी की जानी चाहिए। साथ ही, अनिर्णायक निदान की दर और कोटि-गर्म euploid blastcyst हस्तांतरण के बाद जीवित जन्म दर को भी संबोधित किया जाना चाहिए। अंत में, हम बायोप्सी और vitrification के बीच आदर्श समय रेखांकित किया. चूंकि हमने वार्मिंग के बाद उच्चतम पुनः विस्तार दर देखी जब ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी से 30 मिनट के भीतर काटे गए थे, हम इस मूल्य को आदर्श सीमा के रूप में सुझाते हैं। विशेष रूप से, अब बायोप्सी और vitrification के बीच समय, अधिक बायोप्सी blastcyst cryopreserved होने से पहले फिर से विस्तार होगा. यह क्रायो-सर्वाइवल के लिए हानिकारक हो सकता है, खासकर जबखराब गुणवत्ता और / फिर भी, नैदानिक परिणामों पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं देखा गया था, भले ही vitrification 90 मिनट से परे देरी हो गई थी. इसलिए, छिटपुट अवसरों में, ऐसे समय की अनुमति दी जा सकती है।

PGT के लिए एक नमूना पुनः प्राप्त करने के लिए चुना विधि भ्रूण व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करना चाहिए, विश्वसनीय और जानकारीपूर्ण परिणाम शामिल होना चाहिए, चिकित्सकीय प्रभावी होना चाहिए और इस तरह लागत और प्रयोगशाला के कार्यभार को कम करने को लागू करने के लिए आसान होना चाहिए. ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी इन सभी आवश्यकताओं को पूरा करती है। फिर भी, यह अभी भी एक आक्रामक प्रक्रिया है कि एक अच्छी तरह से सुसज्जित प्रयोगशाला में कुशल ऑपरेटरों द्वारा किया जाना चाहिए है. वर्तमान में, एक गैर इनवेसिव पीजीटी (एनआईपीजीटी) दृष्टिकोण के अवंत-गार्डे की जांच की जा रही है। शायद, भविष्य में, आईवीएफ के बाद खर्च संस्कृति मीडिया गुणसूत्र और / यह एक पेचीदा भविष्य के परिप्रेक्ष्य के बाद से आईवीएफ क्लिनिक के लिए लागत कम हो जाएगा और सभी काम का बोझ भ्रूण बायोप्सी द्वारा जरूरत पर जोर दिया sidestepped होगा. हालांकि, आनुवंशिक परीक्षण के लिए खर्च किए गए मीडिया विश्लेषण की विश्वसनीयता और पुन: उत्पादनीयता का अभी भी मूल्यांकन किया जाना है22,23,24, इसलिए एक प्रोटोकॉल को परिभाषित करने और मान्य करने के लिए और अधिक प्रयास किए जाने चाहिए जो कि कर सकता है दुनिया भर में पीजीटी प्रदर्शन सभी आईवीएफ क्लीनिक सूट।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

एजी और आरएम ने आंकड़े एकत्र किए और पांडुलिपि का मसौदा तैयार किया। डीसी ने आंकड़ों का विश्लेषण किया, प्रतिनिधि परिणामों का मसौदा तैयार किया, आंकड़ों का प्रदर्शन किया और पांडुलिपि को संशोधित किया। एफएमयू और एलआर ने परिणामों और पूरी पांडुलिपि की समीक्षात्मक चर्चा प्रदान की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Cold tube rack Biocision XTPCR96
Electronic pipette controller Fisher Scientific 710931
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
IVF Electronic Witness System CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions RI Witness ART Management System
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Laser objective RI Saturn 5
Microinjectors Nikon Narishige NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes Eppendorf CSLQSPIN for 0.2 mLl PCR tubes
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermostat Panasonic MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Consumables
Biopsy pipette RI 7-71-30FB35720 30 µm ID, flat 35 °C
Cryolock Cryolock CL-R-CT
CSCM complete Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter Cook G17934
Flexipet pipette Cook G26712 140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette Cook G46020 300µm stripping pipette tips
Holding pipette RI 7-71-IH35/20 30 µm ID, flat 35 °C
Human Serum Albumin Irvine Scientific 9988
IVF One well dish Falcon 353653
Mineral Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Irvine Scientific 90126 Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface Thermofisher scientific 176740 IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish Corning 353802 60 mm x15 mm
Reproplate Kitazato 83016
Serological pipette Falcon 357551 10ml
Sterile disposable Gilson tips Eppendorf 0030 075.021 200 µL
Tubing Kit Provided by the genetic lab PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media Kitazato VT801 Equilibration and vitrification solutions
Warming media Kitazato VT802 Thawing and dilution solutions

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References

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Maggiulli, R., Giancani, A., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human Blastocyst Biopsy and Vitrification. J. Vis. Exp. (149), e59625, doi:10.3791/59625 (2019).

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