Summary
Blastocystbiopsi och förglasning krävs för att effektivt genomföra preimplantatorisk genetisk testning. Ett tillvägagångssätt som innebär en sekventiell öppning av zona pellucida och hämtning av 7-8 trophectoderm-celler i dag 5-7 efter insemination begränsar både antalet manipulationer som krävs och embryots exponering för att under optimala miljöförhållanden.
Abstract
Blastocystbiopsi utförs för att erhålla en tillförlitlig genetisk diagnostik under IVF-cykler med preimplantatorisk genetisk testning. Sedan, det ideala arbetsflödet innebär en säker och effektiv förglasning protokoll, på grund av handläggningstiden för diagnostiska tekniker och att överföra de valda embryot (s) på en fysiologisk endometriet i en följande naturlig cykel. En biopsi metod som omfattar den sekventiella öppnandet av zona pellucida och hämtning av 5-10 trophectoderm celler (helst 7-8) begränsar både antalet manipulationer som krävs och exponeringen av embryot till suboptimala miljöförhållanden. Efter ordentlig träning, var tekniken reproducerbar mellan olika aktörer när det gäller tidpunkten för biopsi (~ 8 min, som sträcker sig 3-22 min baserat på antalet embryon till biopsi per maträtt), avgörande diagnoser erhålls (~ 97,5%) och levande födelsetalen efter förglasad-värmde euploid blastocyststadiet överföring (> 40%). Överlevnaden efter biopsi, förglasning och uppvärmningen var så hög som 99,8%. Den re-expansion på 1,5 h från uppvärmningen var så hög som 97%, till stor del beroende av tidpunkten mellan biopsi och förglasning (helst ≤ 30 min), blastocyststadiet morfologisk kvalitet och dag av biopsi. I allmänhet är det bättre att vitrify en kollapsad blastocyst; i icke-PGT-cykler kan därför laserassisterad konstgjord krympning utföras för att inducera embryokollaps före frysförvaring. Det mest lovande framtidsperspektivet är den icke-invasiva analysen av IVF-kulturmedierna efter blastocystkulturen som en förmodad källa till embryonala DNA. Detta potentiella Avant-Garde är dock fortfarande under utredning och ett tillförlitligt protokoll måste ändå definieras och valideras.
Introduction
Det huvudsakliga målet med modern mänsklig embryologi är att maximera antalet levande födda per stimulerad cykel och minska kostnader, tid och ansträngningar för att uppnå en graviditet. För att uppnå detta mål bör validerade metoder för embryoval användas för att identifiera reproduktivt kompetenta embryon inom en kohort som erhållits under en IVF-cykel. Enligt de senaste bevisen, blastocyststadiet kultur1 kombinerat med omfattande kromosomala tester och förglasad-värmda euploid Embryo Transfer (et) är den mest effektiva ramen för att öka IVF effektivitet2. Det är uppenbart att aneuploidi-tester kräver ett embryonala preparat, som för närvarande huvudsakligen representeras av få celler som hämtats från trophectoderm (te), det vill säga den del av blastocysten som ger ursprung till embryobilagor (t. ex. moderkakan) under graviditet . Bortom karyotypanalysen kan även enstaka genmutationer bedömas från en vävnads analys som en del av en klinisk strategi som kallas preimplantatorisk genetisk testning (PGT;-A för aneuploidier,-SR för strukturella kromosom rekonstruktioner,-M för monogena sjukdomar). Andra äggocyter/embryo biopsi metoder har teoretiserade och antas kliniskt under de senaste decennierna, nämligen Polar organ biopsi och biopsi biopsi. Deras användning minskar dock nuförtiden eftersom deras processuella nackdelar (t. ex. högre arbetsbörda och risk för reproduktionseffekter) och diagnostiska begränsningar (t. ex. problem med enstaka cell analyser) implicit hindrar en tillräcklig balans mellan kostnader, risker och förmåner (för en översyn se3).
I detta papper, en av de viktigaste protokollen för TE biopsi är grundligt beskrivs tillsammans med efterföljande förglasning, uppvärmning och förfaranden för överföring krävs. Arbetsflödet här som beskrivs är perfekt för en upptagen PGT-enhet.
Som redan beskrivits tidigare av vår grupp4,5, innebär förfarandet den sekventiella öppnandet av zona pellucida av fullt expanderade blastocyster och avlägsnande av några te celler (i genomsnitt 7-8). Jämfört med den dag 3 Laser-assisted kläcknings-baserade blastocyststadiet biopsi metod6, detta förfarande kan lindra det dagliga schemat för en IVF-enhet där känsliga förfaranden, såsom blastocyststadiet biopsi och förglasning, måste utföras i tid. Så snart blastocysten når sin fulla expansion, kan biopsi utföras genom att välja te celler att ta bort, vilket förhindrar risken för diskbråck av inre cellmassan (ICM), som annars skulle göra förfarandet utmanande. I litteraturen har även ett tredje protokoll med blastocystbiopsi beskrivits, vilket innebär att laser assisterad kläckning utförs när embryot redan har nått blastocyststadiet, några timmar före förfarandet5,7. Men detta tillvägagångssätt är mer tidskrävande och främst passar IVF-enheter som genomför TE biopsi i händerna på Limit erfarna operatörer och med utsikt över en måttlig-låg daglig arbetsbelastning.
Intracytoplasmatisk spermie injektion (ICSI)8 bör vara en konsoliderad teknik om syftet är att utföra genetiska analyser inom IVF. På samma sätt är ett lämpligt kultur system för att på ett säkert sätt skörda embryon till blastocyststadiet avgörande för genomförandet av strategin för TE-biopsi. Ett tillräckligt antal inkubatorer, liksom användningen av låg syre spänning är viktiga förutsättningar för detta ändamål, inte för att äventyra blastocysthastigheten9. Samtidigt, ett effektivt kryopreservation program behövs för att säkert hantera en PGT cykel. Under det senaste decenniet har genomförandet av förglasning ökat embryo Cryo-överlevnaden ända upp till > 99%10,11. Detta gav tillräckligt med tid för att utföra genetisk testning och skjuta embryoöverföring till följande menstruationscykeln, på en icke-stimulerad och förmodligen mer mottaglig endometriet12.
Både TE biopsi och förglasning är krävande uppgifter som kräver strikta färdigheter och deras effektivitet kan variera mellan oerfaren aktörer. En särskild utbildningsperiod förordas därför innan varje verksamhetsutövare ges möjlighet att utföra dessa förfaranden kliniskt. Dessutom bör bibehållandet av operatörernas kompetens bedömas regelbundet genom övervakning av nyckeltal (KPI) för kryopreservering och biopsiprocedurer. Varje IVF-klinik bör ställa interna nyckeltal i detta syfte, som måste approximera de som publicerats av internationella konsortium och/eller de resultat som publicerats av referenslaboratorier.
TE biopsi, förglasning-uppvärmningen och bevittnande förfaranden är validerade tekniker på vår enhet, som har standardiserats i alla inblandade aktörer som rapporterats i tre tidigare publikationer11,13,14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet för Human blastocyststadiet biopsi, här beskrivs, följer riktlinjerna i G. EN. miljöriskbedömning Human Research etikkommittén.
Anmärkning: Se tabellen med material för material som krävs. Ytterligare material som krävs innebär laboratorie skor och kläder, kirurgisk ansiktsmask, hår skydd, kirurgiska handskar, en permanent giftfri markör, pinps och desinfektionsmedel. Användningen av kirurgisk klänning, engångskirurgiska handskar, ansiktsmask, hår skydd är obligatoriskt för att förhindra risken för kontaminering. Alla arbetsområden, liksom den utrustning som ingår i processen, måste rengöras grundligt med laboratoriets desinfektionsmedel (t. ex. Oosafe) innan något förfarande påbörjas. Alla förbrukningsmaterial och medier som används ska vara sterila och individuellt förpackade eller aliciterade. Det föreslås att använda en dedikerad arbetsstation för biopsi och slangar och begränsa åtkomsten av området endast till de aktörer som deltar i förfarandet (embryolog och vittne).
1. förberedelsedagen före Biopsiförfarandet
-
Förbered post biopsi kultur skålen.
- Placera 6 droppar 20 μL IVF kultur medium (tabell över material) i en IVF kultur skålen och overlay med 6 ml förvärmda mineralolja för embryo kultur (tabell över material).
- Tillsätt ytterligare 10 μL IVF odlingsmedium till varje droppe. Inkubera över natten vid 37 ° c i kontrollerad atmosfär (5% O2, 6% Co2).
-
Förbered en IVF maträtt 4-bra tallrik för sköljning av blastocyststadiet efter biopsi.
- Placera 600 μL av IVF-kulturmediet i de två första brunnarna och överlagra med 300 μL förvärmda mineralolja för embryokulturen.
- Inkubera över natten vid 37 ° c i kontrollerad atmosfär (5% O2, 6% Co2).
- Fördela 1,5 μL laddningslösning (tabell över material) i varje PCR-rör som ska användas för te-cellslangar, snurra den och behåll den vid 4 ° c.
2. beredning på dagen för biopsi förfarandet
-
Förbered biopsi skålen.
- Placera 3 droppar 10 μL HEPES-buffrat medium (kompletteras med humant serumalbumin) (tabell över material) i rad i en IVF kultur maträtt.
- Upprepa steg 1.1.1 enligt antalet tillgängliga blastocyster (upp till 4 blastocyster per fat) och överlagra med 6 mL förvärmda mineralolja för embryokulturen.
- Inkubera skålen vid 37 ° c i minst 1 h innan du utför biopsi förfarandet.
3. blastocyst urval och gradering
-
Gradera blastocysten enligt dess expansion och det morfologiska utseendet av ICM och TE (figur 1).
Obs: bedömningskriterierna har anpassats från Gardner och Schoolcraft15 och tidigare beskrivits av capalbo et al. och cimadomo et al.4,11.- Definiera storlek och expansions grad som: a för en fullt kläckt blastocyststadiet, B för en kläckning blastocyststadiet, C för en fullt expanderad blastocyststadiet, och D för en inte expanderad blastocyststadiet (dessa embryon är biopsier endast om de inte expandera ytterligare upp till dag 7).
- Definiera ICM-grad: 1 för märkbar ICM med flera strikt packade celler; 2 för urskiljbar med flera men grovt packade celler; 3 för svårt att urskilja med mycket få låg kvalitet celler.
- Definiera TE grad enligt följande: 1 för välorganiserat epitel med flera celler; 2 för löst epitel med få celler; 3 för få och/eller stora låg kvalitet celler.
4. trophectoderm biopsi
- Utför TE biopsi på alla livskraftiga fullt expanderade blastocyster (företrädesvis C grade för storlek och expansion).
- Set Holding och biopsipipetter för varje biopsi förfarande. Rekommendationerna för biopsipipetten är följande: 30 μm innerdiameter, 35 ° Böj vinkel, 0,75 mm avstånd spets för att böja.
- Märk biopsin skålen med patientens uppgifter (kvinnans namn och efternamn, födelsedatum och ID) och sedan numrera varje droppe med embryo och cykel IDs. Använd en permanent giftfri markör.
- Överför blastocysten med en 300 μm strippning pipett till den första droppen av biopsi skålen och skölj den för att ta bort överskottet av odlingssubstrat. Flytta sedan blastocysten i den andra droppen av biopsi skålen.
- Flytta skålen till inverterad Mikroskop och Prime biopsin pipett aspirera några medium från den tredje droppe av biopsi skålen.
- Vid 20x förstoring, orientera blastocysten att ha en klar bild av ICM. När det visualiseras vid 7-tiden (mitt emot det område som kommer att riktas för att ta bort TE-cellerna), säkra embryot på hållavpipetten (figur 2A).
- Fokusera på zona pellucida och förvissa sig om att både pipetter och blastocysten finns på samma fokalplan.
- Byt till laser målet (puls tid 0,3 MS, 6,5 μm) och placera laserpekaren på zona pellucida på motsatt sida av ICM. Borra zona pellucida genom 2 − 3 laserpulser (figur 2b).
- Tryck försiktigt på biopsipipetten mot zona pellucida och blås något medium genom överträdelsen för att lossa TE-cellerna från dess inre yta och påskynda blastocystkollaps (figur 2C).
- När te är frånkopplad (figur 2D), in genom hålet (om det behövs, göra det bredare med en sista laserpuls) och aspirera några te celler (helst 7 − 813,16) i biopsi pipetten med mild sug (figur 2e).
- Flytta biopsispipetten något bakåt medan du applicerar en måttlig sug för att sträcka ut målcellerna (figur 2F).
- Rikta lasern mot den tunnaste delen av de aspirerade cellerna och avfyra 2 − 5 laserpulser vid korsningarna mellan cellerna för att separera målcellerna från embryots kropp (figur 2g). Tidpunkten för laserpulser och antalet pulser kan justeras enligt kvaliteten på blastocysten; Försök dock att minimera dem för att undvika cell Lys.
- Efter separationen av TE-fragmentet från blastocysten (figur 2H), släpp den i samma biopsi droppe långt från blastocysten. Detta behövs för att förhindra dem från att sugas igen i biopsi pipetten (figur 2i).
- Frigör blastocysten från hållandepipetten och Höj omgående båda pipetter för att förhindra att fragmentet fastnar på dem.
- Ta en bild av det biopsierade fragmentet för kvalitetskontroll ändamål (figur 3).
Anmärkning: om mer än en enda blastocyststadiet ska biopsieras per förfarande (upp till fyra per biopsi skålen), ändra biopsin pipett med en ny för att förhindra korskontaminering mellan embryon. - Upprepa steg 4.1 − 4.13.
- Flytta biopsi skålen tillbaka till laminärt Flow Hood.
- Märk post-biopsi kultur skålen med paret ID, och varje droppe med embryot och cykel-ID.
- I närvaro av ett vittne, skölj blastocysten i ren IVF-medium, och slutligen flytta den till sin motsvarande droppe av post-biopsi skålen.
- Flytta post-biopsi skålen till inkubatorn i en kontrollerad atmosfär (37 ° c, 6% CO2,5% O2) tills förglasning. Det är tillrådligt att utföra förglasning inom 30 min från biopsi förfarandet, för att förhindra blastocyststadiet åter expansion.
5. slangar
Anmärkning: Hela förfarandet måste utföras i närvaro av ett vittne och inuti laminär flöde huven vid rumstemperatur. Under förfarandet håller du PCR-rören i ett kallt rör rack på is (kompletterande figur 1).
- Märk PCR-rören med en permanent giftfri markör.
Anmärkning: Märkningen ska utföras på begäran av det genetiska laboratoriet. Generellt, patientens namn och efternamn (initialer), par ID, embryo och cykel-ID (till exempel: JD 12345 1,2 för embryot N. 1 av 2: a cykel som tillhör Jane Doe vars par ID är 12345). Embryoid bör rapporteras också i bokstäver på kroppen av röret. - Märk locket på en 60 mm x 15 mm odlings fat (rörskål) med de biopsierade embryona ID (kompletterande figur 1) och förbereda 2 10 μl droppar biopsi tvättlösning (tabell över material) i den.
- Prime den 140 μm strippning pipett (kompletterande figur 1) med några biopsi tvättlösning från den andra droppe av slangen skålen.
- Placera biopsi skålen under stereomikroskop för att enkelt visualisera TE fragment (s).
- Försiktigt släppa några biopsi tvättlösning på TE fragmentet; sedan, Fyll på den i stripppipetten.
- Flytta TE fragment till den andra droppe biopsi tvättlösning i slangen skålen och skölj försiktigt den 2 − 3 gånger.
- Överför TE-fragmentet till botten av PCR-röret (tidigare märkt efter det) med laddningslösning, uppmärksamma att undvika att vidröra dess väggar med spetsen av strippningspipetten.
- Upprepa proceduren från steg 5,3 till steg 5,7 för varje TE fragment, att uppmärksamma att använda en ny kapillär för varje TE fragment.
- I slutet av slangen förfarande, sätta alla PCR rören i en mini centrifug, och snurra dem för några sekunder.
- Förvara proverna vid-20 ° c tills de fraktas till det remitterande genetiska laboratoriet för testning.
6. vitrifiering av blastocyst
- Vitrify kollapsade blastocyster inom 30 min från TE biopsi att förhindra deras åter expansion.
- Märk vitrifikationsplattan med kvinnans detaljer och ID: n för de blastocyster som måste förglasas.
- Märk förglasnings stödet (s) med kvinnans namn och för namn, par ID, ID för det embryo som kommer att lastas på det, samt datum för förfarandet. Särskilda cryolabels används som bevarar deras integritet även vid mycket låg temperatur (-196 ° c).
- Vid rumstemperatur, fördela 0,3 ml jämvikts Solution (ES) (tabell över material) för varje blastocyststadiet som kommer att förglasas.
- I närvaro av ett vittne, flytta blastocysten i ES med hjälp av 300 μm strippning pipett.
- Lämna blastocysten i ES för 13 − 15 min. Efter en initial krympning av volymen, en gradvis återexpansion kommer att observeras.
- Fyll ett litet kylställ med flytande kväve (LN2) och placera det under laminärt flödes huven.
- Fördela 300 μL av vitrifikationslösningen (VS) (tabell över material) i den andra brunnen. Efter blastocysten Complete re-expansion, överför den i VS-lösningen i 1 min och skölj den för att späda ut ES.
- I närvaro av ett vittne, Ladda blastocysten på förglasning stöd och ta hand om att ta bort överskottet av VS. En subtil film av lösning bör omger blastocysten.
- Doppa förglasnings stödet i LN2 och flytta det energiskt för att minska risken för bubbelbildning nära preparatet.
- Placera skyddslocket samtidigt som förglasnings stödet hålls nedsänkt i LN2.
- I närvaro av ett vittne, flytta förglasning stöd i en lång sikt LN2 lagringstank.
7. konstgjord krympning av icke-biopsierade blastocyster
-
Om ingen TEBIOPSI utförs, artificiellt komprimera blastocyster omedelbart före vitrifiering (figur 4).
- Flytta kultur skålen från inkubatorn till det inverterade mikroskopet och fokusera på det valda embryot.
- Byt till laser målet (förinställd puls: 0,3 MS, 6,5 μm), rikta in zona pellucida på motsatta sidan av ICM, sedan direkt 1 – 2 laserpulser till korsningar mellan TE-celler på ett säkert avstånd från ICM. Blastocysterna bör kollapsa på mindre än 5 min.
- Fortsätt med förglasning av den kollapsade blastocysten som beskrivs i avsnitt 6.
8. överförbar blastocyst uppvärmningen
- På dagen för ET, Förbered ET 4-brunn plattan genom att placera 600 μL av pre-equilibrated IVF odlingssubstrat för varje brunn. Inkubera vid 37 ° c i kontrollerad atmosfär (5% O2, 6% Co2), medan du utför blastocystuppvärmningen.
- Märk den värmande skålen med kvinnans namn och för namn, par ID, ID för embryot som kommer att värmas i den.
- Fördela 1 mL av upptinningslösningen (TS) (tabell över material) i en IVF en-brunn skålen (kompletterande figur 1) och värm den till 37 ° c i en termostat för minst 1 h innan förfarandet påbörjas.
- Fyll ett litet kyl stöd med LN2 och placera det i laminärt flödeshuv i närheten av arbetsområdet.
- Innan du påbörjar förfarandet, kontrollera den blastocyststadiet information som rapporteras om förglasning stöd. Alla ID: n ska matcha den genetiska rapporten och blastocysten att värma måste väljas bland de överförbara. Ett vittne krävs under förfarandet.
- Ta en-väl skålen innehåller värms TS ut ur termostaten och placera den på en uppvärmd etapp under stereomikroskopet.
- Dra över skyddslocket i LN2 med hjälp av tång.
- Doppa snabbt spetsen av förglasning stöd i 37 ° c TS.
- Under mikroskopisk observation, försiktigt flytta förglasning stöd tills blastocysten släpps från spetsen.
- Lämna blastocysten för totalt 1 min i TS, uppmärksamma att hålla den på botten av TS.
- Vid rumstemperatur dispensera 200 μL spädnings lösning (DS) (tabell över material) på den första brunnen av förglasnings plattan.
- Överför blastocysten till DS och placera den på botten av brunnen samtidigt släppa några TS på toppen av den för att skapa en sorts gradient. Låt den vara i 3 minuter.
- Fördela 200 μL tvättlösning (WS) i 2 olika brunnar (WS1 och WS2).
- Överför blastocysten till WS1 och placera den på botten av brunnen samtidigt släppa några DS medium på toppen av den. Överför sedan blastocysten till WS2 och lämna den ostörd i 1 min.
- Märk den eftervärmande ET-plattan med kvinnans och efter namnet, par-ID, ID för embryot som kommer att odlas i den.
- I närvaro av ett vittne, överföra den värmda blastocysten till pre-equilibrated odlingssubstrat i efter uppvärmningen ET plattan.
- Skölj blastocysten i den första brunnen av ET plattan och placera den i den andra brunnen.
- Överför den eftervärmande kultur skålen till inkubatorn i en kontrollerad atmosfär (37 ° c, 6% CO2,5% O2) och odla blastocysten för minst 1,5 h innan du kontrollerar dess överlevnad och åter expansion.
Anmärkning: Figur 5 visar exempel på degenererade, Cryo-överlevde men inte åter expanderat och Cryo-överlevde och fullt expanderade blastocyster.
9. EmbryoTransfer
- För att utföra ET, placera skålen på den uppvärmda etappen av laminär Flow Hood, så embryot är synlig under mikroskopet vid en låg förstoring.
- Ta ca 0,4 mL av IVF kultur medium. Fäst sprutspetsen ordentligt i mottagar änden av den inre katetern och släpp sedan upp mediet upp till 0,1 mL.
- Aspirera odlingssubstrat tills man observerar de embryon som kommer in i katetern (minimal mängd media: 10 − 15 μL).
- Placera katetern i plasthöljet och gå till operationssalen och placera den interna katetern i den externa guiden.
- När du nått livmodern, tryck på sprutkolven för att frigöra embryot (s). Släpp mycket långsamt mediet tills kolven läser 0,1 mL.
- Ta katetern tillbaka till labbet och kontrollera under mikroskopet att embryot har överförts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6 är ett system av alla utfall av en biopsi förfarande som kan antas för att standardisera protokollet och övervaka prestandan hos varje aktör. Den viktigaste processuella resultatet är tidpunkten för att slutföra biopsi/biopsier; Det viktigaste tekniska resultatet är kvaliteten på den tomt som produceras efter genetiska tester som kan resultera i antingen en avgörande eller tveksam diagnos, varav den senare kräver en ny biopsi av odiagnostiserade blastocyst; Det viktigaste biologiska resultatet är graden av Cryo-överlevnad och åter expansion kontra degeneration efter uppvärmningen; Slutligen, det huvudsakliga kliniska resultatet är den levande nativiteten efter förglasad-värmde blastocyststadiet överföring. I tre tidigare studier rapporterade vi de nyckeltal som definierats i centrum för de tekniska, biologiska och kliniska utfall11,13,16. Hädanefter rapporterar vi i stället hur KPI för tidpunkten för biopsi definierades. Dessutom utreddes den förmodade inverkan av tidpunkten mellan biopsi och förglasning på efter värmnings beteendet hos euploid blastocyster också.
Under en 2-års period genomfördes sammanlagt 1 544 trophectoderm-biopsiprocedurer av 7 operatörer (tabell 1). Alla biopsier blastocyster flyttades sedan tillbaka till inkubatorn i en post-biopsi kultur skålen tills förglasning. Alla relevanta data samlades in i en relationsdatabas. Alla tider av biopsi och mellan biopsi och förglasning var retrospektivt erhållits från programvaran i IVF Electronic vittnande system. Uppgifterna exporterades sedan och analyserades för statistik.
Cryo-överlevnaden av euploid blastocyster efter trophectoderm biopsi och förglasning-uppvärmningen var N = 571/572, 99,8%. Re-expansionen ränta på 1,5 h efter uppvärmningen var N = 556/571, 97,4%. Bland de 15 inte återexpanderade blastocyster, resulterade en i en levande födelse efter att överföras i livmodern. Den levande nativitet efter förglasad-värmde euploid enda blastocyststadiet överföring var N = 227/572, 39,7%.
Definition av den idealiska tidpunkten för biopsi
Tabell 1 sammanfattar relevanta data om de biopsiprocedurer som utförts. Sammantaget 1,89 ± 1,03 (intervall 1-4) blastocyster var biopsierade per förfarande i 8,24 ± 4,23 min (intervall 3-22). Den genomsnittliga tidpunkten för biopsi varierade på grund av både antalet blastocyster biopsier per förfarande, från ett minimum av 5,78 ± 2,94 min (intervall 3-16) när endast ett embryo lades i skålen till högst 12,93 ± 4,43 min (intervall 6-22) när embryona sekventiellt biopsier vi Re 4. En annan relevant parameter var den operatör som deltog i förfarandet: den mest avancerade (N = 443 förfaranden) var den snabbaste (7,41 ± 3,6 min, intervall 3-22), medan den minst erfarna (N = 42) var den långsammaste (14,19 ± 4,24 min, intervall 6-22). Faktum är att en generaliserad linjär modell som innebär både "antal blastocyster biopsier per förfarande" och "Operator" variabler perfekt förklarar "tidpunkten för biopsi" med en R2 = 0,48 och en effekt = 1. Denna analys var användbar för att definiera att helst ~ 6 min är tillräckligt för en blastocyststadiet biopsi förfarande när endast ett embryo läggs i skålen, medan ~ 9 min, ~ 12 min och ~ 13 min för 2, 3 och 4 blastocyster, respektive. Uppenbarligen innebär hela förfarandet också flytta embryon från kulturen till biopsi skålen och från den senare till post-biopsi kultur skålen efter ingreppet, samt ändra biopsin pipett mellan sekventiella biopsier.
Figur 7 ritar den genomsnittliga tidpunkten för biopsi för varje aktör längs studie trimestern (från 1 till 8: e). Den streckade röda linjen identifierar medelvärdet av det totala värdet på 8,24 min. En sådan graf är användbar för att övervaka den genomsnittliga prestandan för varje utövare. Till exempel visade de mest sakkunniga operatörerna (1 och 2) en konstant minskning av denna timing, vilket tyder på en trend som är typisk för en inlärningskurva. Alla operatörer från 3 till 6 var i stället tillräckligt konstanta i sin prestation runt medelvärdet för hela trimestern. När som helst de visade en topp i medelvärdet från en given trimester (t. ex., operatör 3 i 7: e trimestern, operatör 4 i 6: e trimestern, operatör 5 i 3-trimestern), de var varnade för att revidera sina prestationer. Operatör 7 (dvs, den minst erfarna) visade timings typiskt för en embryolog som just har avslutat sin utbildning. Möjligen, han/hon kommer att uppfylla de normer interna till labbet som kompetensen skulle öka.
Viktigt, tiden för biopsi var liknande över re-expanderat och inte åter expanderat euploid blastocyster på 1,5 h från uppvärmningen (9,52 ± 4,23 min, intervall 3-22 jämfört med 10,5 ± 5,68 min, intervall 4-22; t-test = 0,37). Sannolikt, implanterade (N = 229) och inte implanteras (N = 343) förglasade-värmde euploid blastocyster visade också jämförbara biopsi timings (9,77 ± 4,15 min, intervall 3-22 kontra 9,41 ± 4,36 min, intervall 3-22, t-test = 0,39). Möjligen då, en timing ≤ 22 min till biopsi upp till 4 blastocyster påverkar inte embryots beteende efter uppvärmningen. Därför definierade vi detta värde som högsta tröskelvärde.
På samma sätt visades ingen skillnad i termer av levande nativitet mellan de olika biopsioperatörerna, som redan rapporterats tidigare13 (kompletterande tabell 1).
En annan viktig parameter för att övervaka varje operatörs prestanda är graden av ofullständiga resultat efter diagnos, som bör vara så nära som möjligt till den allmänna prestandan hos varje laboratorium. Helst denna hastighet bör inte överstiga 2,5% och kan minska med tiden på grund av en ökad expertis inom biopsi och slangar förfaranden16. Målantalet te-celler att hämta är 7-8 enligt två tidigare studier13,16. För detta ändamål föreslås det att man tar en bild av det biopsierade fragmentet för kvalitetskontroll ändamål (se några exempel i figur 3). En sådan bild kan kontrolleras i händelse av ofullständiga diagnoser för att bedöma om orsaken kunde tillskrivas dimensionen/kvaliteten på fragmentet (dvs. låg kvalitet på den molekylära analysen), till slangen (dvs. fel på DNA-amplifiering) eller till vissa problem i bearbetningen av provet i det genetiska laboratoriet.
Definition av den idealiska tidpunkten mellan biopsi och förglasning
Under studieperioden var 572 euploid blastocyster värmdes att genomgå en embryoöverföring efter en diagnos av euploidi. Figur 8a visar varje värmda blastocyststadiet som en svart cirkel fördelas över den ökande timing mellan biopsi och förglasning och grupperade i två grupper enligt resultatet under utredning: åter utvidgas eller inte åter utvidgas inom 1,5 h från Uppvärmningen. Alla blastocyster (N = 117/117) som förglasades inom 30 min, 97,6% (N = 245/251) av blastocysterna förglasade mellan 31-90 min och 95,1% (N = 194/204) av blastocysterna förglasade efter 90 min återexpanderade, respektive (ingen re-expansion priser: 0%, 2,4% och 4,9%). Därför sätter vi 30 min och 90 min som de tidiga och sena tröskelvärden för tid mellan biopsi och förglasning.
Figur 8b visar åter expansionstakten i de tre grupperna (≤ 30 min, 31-90 min, > 90 min) ytterligare undergrupperade enligt blastocystkvalitet och dag för preimplantatorisk utveckling. Speciellt för dålig kvalitet och/eller dag 7 blastocyster, tidpunkten mellan biopsi och förglasning verkar avgörande för att uppnå åter expansion efter uppvärmningen. Specifikt odds-kvoten av åter expansion efter uppvärmningen korrigeras för både blastocyststadiet kvalitet och dag av biopsi i blastocyster förglasade inom 30 min från biopsi kontra blastocyster förglasat bortom 90 min var 3,05 (95% CI 1.01-9.4, p = 0,05). I stället motsvarade perioden mellan dessa två tröskelvärden (31-90 min) en gråzon som kanske eller kanske inte har någon inverkan.
Endast 1 av 15 inte återexpanderade blastocyster resulterade i en levande födelse efter överföring. Därför har vi slutligen undersökt levande födelse takt uppnås efter värmde euploid enda blastocyststadiet överföring klustrade i de tre grupperna enligt tidpunkten mellan biopsi och förglasning. Det högsta levande födelse värdet uppnåddes genom överföring av euploid blastocyster förglasat ≤ 30 min från trophectoderm biopsi (N = 56/117, 47,9%). Detta resultat nådde dock inte statistisk signifikans jämfört med samma utfall som erhållits antingen med blastocyster som förglasats mellan 31 och 90 min (N = 92/251, 36,7%; Fisher ' s Exact test = 0,06), eller med blastocyster förglasade > 90 min från biopsi (N = 81/204, 39,7%; Fisher ' s exakta test = 0,16). Därför är antingen en negativ effekt på den reproduktiva kompetensen hos blastocysten försumbar eller så är urvalsstorleken i denna dataset (N = 572) otillräcklig för att uppnå statistisk signifikans.
Figur 1: parametrar för klassificering av blastocyststadiet. Expansion: (a) helt kläckts, (B) i kläckning, (C) helt expanderat, och (D) inte utvidgas. Den ideala scenen är C, medan en blastocyststadiet D bör ges mer tid för att uppnå full expansion, om inte detta skede nås i dag 7; Inre cellmassa (ICM) morfologisk kvalitet: 1 (märkbar med flera strikt packade celler), 2 (discernable med flera men grovt packade celler) och 3 (svårt att urskilja med mycket få låg kvalitet celler); trophectoderm (te) morfologisk kvalitet: 1 (välorganiserat epitel med flera celler), 2 (löst epitel med få celler) och 3 (få och/eller stora låg kvalitets celler). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Sammanfattning av den sekventiella zona pellucida (ZP) öppning och trophectoderm (te) celler Hämta metod för blastocyststadiet biopsi. (a) orientera blastocysten med den inre cellmassan (ICM) nära hållningspipetten och långt ifrån den plats där de valda te-cellerna kommer att hämtas. Säkra blastocysten på hållpipetten. (b) öppna ZP genom 2-3 laser skott; (c) blåsa vissa odlingsmedier genom hålet; d) blastocysten kommer att lossna från ZP. (e) ange ZP och suga 5-10 te celler i biopsi pipett; (f) flytta bakåt med biopsipipetten för att sträcka ut det valda fragmentet och exponera korsningar mellan cellerna; g) brand vid korsningarna mellan cellerna och fortsätt att sträcka ut fragmentet tills te-cellerna släpps ut från kroppen av blastocysten. h) blastocysten efter tebiopsi är kollapsad. (i) ta en bild av biopsifragmentet för kvalitetskontroll och överföra den till PCR-röret som kommer att skickas till det genetiska laboratoriet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: exempel på biopsifragment: (a-c) önskvärda fragment; d) lyserat fragment. e) litet fragment med degenererade celler. f) litet, delvis lyserat och urartat fragment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: konstgjord krympning. a) orientera blastocysten så att den inre cellmassan (ICM) är långt ifrån den riktade delen av trophectoderm (te), (b) brand 2-3 laser skott i rad vid korsningar mellan te celler och flytta utåt; c) vänta tills blastocysten kollapsar innan förglasning påbörjas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: exempel på blastocystdegeneration (a), kryoöverlevnad men ingen återexpansion (b) och kryo-överlevnad och fullständig återexpansion (c) 1,5 h efter uppvärmningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Sammanfattning av de olika resultaten av den trophectoderm biopsi som kan användas för att övervaka en operatörs prestanda och fastställa de nyckeltal som är interna för varje laboratorium. Det viktigaste förfarandemässiga resultatet är tidpunkten för biopsi. Det viktigaste tekniska resultatet är graden av avgörande (euploid eller aneuploid) och ofullständiga diagnoser (Re-biopsi krävs) erhålls; den senare kan orsakas av DNA-amplifiering eller låg kvalitet molekylära data, båda resulterar i inte-interpretable kromosom Kopiera nummer profil tomter. Det viktigaste biologiska resultatet är graden av Cryo-överlevnad och åter expansion eller degeneration efter biopsi, förglasning och uppvärmning. Det huvudsakliga kliniska resultatet är andelen levande födda eller negativa graviditetsutfall uppnås efter förglasad-värmda blastocyststadiet överföring. Observera, medan det processuella resultatet är uteslutande beroende av operatören och antalet blastocyster till biopsi per förfarande, alla andra resultat kan påverkas från andra störfaktorer oberoende av biopsi operatören (t. ex. steg och operatorer involverad i den molekylära analysen, den morfologiska kvaliteten på blastocysten, dagen för biopsi) som bör redovisas för att korrekt utvärdera hans/hennes prestation. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: genomsnittlig timing av biopsi per operatör över 8 studie trimestern. Tabellen sammanfattar det relaterade antalet procedurer och det genomsnittliga antalet blastocyster som var biopsierat per förfarande av varje aktör i 8 studie trimestern. Den prickade röda linjen i varje graf representerar den totala genomsnittliga tidpunkten för biopsi (8,24 min). Felstaplarna är standardavvikelserna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: återexpansion efter uppvärmningen kontra timing mellan biopsi och förglasning. (A) visar inte återexpanderat och återexpanderat blastocyster 1,5 HR efter uppvärmningen. Varje blastocyststadiet representeras av en svart cirkel över de ökande timings. Vertikala kontinuerliga svarta linjer representerar 30 min inställd som tidig tröskel och 90 min inställd som sen tröskel. (B) visar återexpansions takten i de tre grupperna (timing mellan biopsi och förglasning: ≤ 30 min, 31-90 min, > 90 min) ytterligare grupperade enligt blastocyststadiet kvalitet och dag av biopsi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| N av förfaranden | N blastocyster biopsier per förfarande | Genomsnittlig timing av biopsi ± SD, intervall (min) | |
| Operatör 1 | 443 | 2,01 ± 1,09, 1-4 | 7,41 ± 3,6, 3-22 |
| 195 | 1 | 4,75 ± 1,96, 3-16 | |
| 111 | 2 | 7,83 ± 2,45, 3-18 | |
| 71 | 3 | 10,27 ± 2,41, 4-16 | |
| 66 | 4 | 11,48 ± 3,81, 6-22 | |
| Operatör 2 | 290 | 1,81 ± 0,98, 1-4 | 7,87 ± 4,13, 3-22 |
| 142 | 1 | 5,69 ± 3,32, 3-16 | |
| 89 | 2 | 8,48 ± 2,79, 3-18 | |
| 30 | 3 | 11,37 ± 3,72, 4-20 | |
| 29 | 4 | 13,1 ± 3,89, 9-22 | |
| Operatör 3 | 287 | 1,98 ± 1,05, 1-4 | 9,10 ± 4,65, 3-22 |
| 121 | 1 | 6 ± 2,19, 3-15 | |
| 89 | 2 | 9,6 ± 3,87, 3-22 | |
| 38 | 3 | 12,66 ± 4,55, 4-22 | |
| 39 | 4 | 14,13 ± 4,8, 6-22 | |
| Operatör 4 | 217 | 1,66 ± 0,87, 1-4 | 7,58 ± 3,45, 3-22 |
| 118 | 1 | 5,58 ± 1,96, 3-14 | |
| 66 | 2 | 8,92 ± 2,91, 4-22 | |
| 21 | 3 | 11,48 ± 2,34, 5-16 | |
| 12 | 4 | 13 ± 4,26, 6-19 | |
| Operatör 5 | 144 | 2,03 ± 1,08, 1-4 | 9,43 ± 4,24, 3-22 |
| 59 | 1 | 6,15 ± 2,5, 3-16 | |
| 43 | 2 | 10,07 ± 2,73, 6-16 | |
| 20 | 3 | 12,6 ± 2,89, 9-18 | |
| 22 | 4 | 14,09 ± 4,43, 6-22 | |
| Operatör 6 | 121 | 1,67 ± 0,94, 1-4 | 7,79 ± 3,93, 3-22 |
| 70 | 1 | 6,19 ± 2,95, 3-16 | |
| 32 | 2 | 8,12 ± 1,72, 3-11 | |
| 9 | 3 | 12,78 ± 3,31, 9-18 | |
| 10 | 4 | 13,5 ± 6,19, 6-22 | |
| Operatör 7 | 42 | 1,62 ± 0,94, 1-4 | 14,19 ± 4,24, 6-22 |
| 27 | 1 | 11,85 ± 5,53, 6-16 | |
| 6 | 2 | 16,5 ± 3,73, 11-22 | |
| 7 | 3 | 19,86 ± 3,34, 13-22 | |
| 2 | 4 | 19 ± 4,24, 16-22 | |
| Totala | 1544 | 1,89 ± 1,03, 1-4 | 8,24 ± 4,23, 3-22 |
| 732 | 1 | 5,78 ± 2,94, 3-16 | |
| 436 | 2 | 8,85 ± 3,14, 3-22 | |
| 196 | 3 | 11,72 ± 3,70, 4-22 | |
| 180 | 4 | 12,93 ± 4,43, 6-22 |
Tabell 1: Total genomsnittlig timing av biopsi och Genomsnittligt antal blastocyster biopsier i varje förfarande enligt biopsi operatör. Den genomsnittliga tidpunkten för biopsi har också visats enligt varje sekventiellt antal blastocyster biopsier per förfarande. En generaliserad linjär modell som innehåller både "biopsi Operator" och "antal blastocyster biopsier per förfarande" variabler perfekt korrelerar med "tidpunkten för biopsi" (R2 = 0,48, effekt = 1).
Kompletterande figur 1: huvudenheter och stöd som krävs för förfarandet. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande tabell 1: Logistic regressionsanalys visar inte någon signifikant Association mellan biopsi operatören och levande födelse efter förglasad-värmde euploid blastocyststadiet överföring. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endast väl erfarna skickliga embryologer som har avslutat sin träningsperiod bör utföra både TE biopsi och blastocyststadiet vitrifiering. Dessutom krävs ett vittne för att övervaka förfarandena och garantera en effektiv spårbarhet under i) förflyttning av biopsier blastocysten från biopsi skålen (kompletterande figur 1) till post-biopsi skålen (kompletterande figur 1 ), därefter till förglasnings plattan (kompletterande figur 1) och slutligen till förglasnings stödet (kompletterande figur 1). II) överföring av biopsierade TE-celler från biopsi skålen till PCR-röret (kompletterande figur 1); III) uppvärmningen och överföring steg efter diagnos. För en detaljerad beskrivning av alla bevittnar steg hänvisar till ett misslyckande lägen och effekter analys (FMEA) tidigare publicerade14.
Alla metoder som beskrivs i detta dokument respekterar den lokala regleringen (italiensk lag 40/2004). Enligt lagen, i själva verket kan paret begära att få information om hälsotillståndet för de embryon som de producerade under IVF-cykeln. I detta avseende måste ett detaljerat informerat samtycke för PGT undertecknas av båda parter.
I detta dokument beskrev vi hur man implementerar blastocyststadiet biopsi för PGT i en upptagen laboratorie rutin. Tillämpningen av blastocyststadiet biopsi strategi har varit en viktig avancemang under det senaste decenniet i IVF. Först rapporteras av de Boer och kollegor i 200417, har det snart erkänts som ett mer effektivt och informativt förfarande jämfört med klyvning skede och Polar Body biopsi metoder3. Värdet av detta förfarande är främst bosatt i en minskning av de tekniska bördorna, men också i en lägre incidens av kromosomala mosaicism i detta skede av utvecklingen18,19. Dessutom har avlägsnandet av få TE-celler från en blastocyststadiet föreslagits som ett säkrare förfarande än avlägsnandet av en blastomeren från en klyvning skede embryo. Faktum är att i en randomiserad icke-urvals undersökning den tidigare metoden inte leder till någon inverkan på embryoimplantationspotential, medan den senare innebar en betydande ~ 20% minskning20.
Det protokoll som mest används över hela världen innebär Laser-assisted Zona öppning i dag 3 efter insemination. Ingen randomiserad kontrollerad studie har genomförts hittills för att jämföra de olika blastocystbiopsimetoderna. Det är dock rimligt att det lägre antalet manipulationer och exponeringar av de växande embryona till suboptimala miljöförhållanden, desto lägre potentiell invasivitet av protokollet. Dessutom kan närvaron av ett hål i zona pellucida från dag 3 i utvecklingen påverka blastocystexpansion och orsaka bråck av ICM-celler tillsammans med TE-celler. Av dessa skäl, vi sätta och genomfört det protokoll som beskrivs här som innebär den sekventiella laserassisterad Zona bryta och TE celler hämtning så snart blastocysten når full expansion. Det finns också ett annat protokoll som innebär en dag 5 eller 6 assisterad kläckning5,7. Specifikt utförs borrning av Zona på dag 5 eller 6 av preimplantatorisk utveckling på motsatt sida med avseende på ICM; blastocysten flyttas sedan tillbaka till inkubatorn väntar på spontan diskbråck av te celler. Det är tydligt att regelbunden övervakning av blastocysten måste tillhandahållas under följande timmar, för att biopsi det så snart som TE kommer att börja bråck, samt för att förhindra embryot från kläckningen helt. Om å ena sidan okvalificerade utövare kan enkelt genomföra denna alternativa biopsi strategi, å andra sidan är det inte lämpligt för en upptagen laboratorium utföra flera förfaranden per dag. Den sekventiella Zona öppning och blastocyststadiet biopsi protokollet beskrivs här är istället mindre tidskrävande och ger en kortare hands-on tid och en högre flexibilitet att schemalägga den dagliga verksamheten i laboratoriet så att samordna tidsramarna ägnas åt biopsi och att förglasning förfaranden.
Dålig kvalitet blastocyster kan vara mer komplicerat att biopsi eftersom TE-celler kan vara klibbiga, men mer laserbilder samordnas med sträckningen av fragmentet för att exponera korsningar mellan cellerna är tillräckliga för att ta bort den från kroppen av blastocysten. Fullt kläckt blastocyststadiet kan biopsier som blastocyster inneslutna i zona pellucida, men de kan vara svårare att vitrify och varm. I händelse av ofullständiga diagnoser efter biopsi, de uppgifter som rapporteras hittills är konkordans att ingen skada verkar härröra från en ny biopsi och en följande förglasning-uppvärmningen cykel16,21.
Förglasning används för närvarande i centrum för att utföra blastocyststadiet frysförvaring eftersom det har konsekvent rapporterats säkrare, effektivare och mindre tidskrävande än långsam frysning protokoll från en översyn och meta-analys av den senaste litteraturen 10.
När förfarandet var väl etablerad och operatörerna ordentligt utbildade, utförde vi en retrospektiv analys för att definiera den idealiska förfarande tidsinställningar för både blastocyststadiet biopsi och förglasning förfaranden (sammanfattas här i representativa resultat). Som slutresultat har vi bedömt återexpansions takten för euploid blastocyststadiet utvärderas vid 1,5 h efter uppvärmningen och levande födelse takt uppnås efter förglasade-värmde euploid enda embryo överföring. Inget fall av blastocyststadiet degeneration observerades efter biopsi, och bara 0,2% (N = 1/572) av degeneration frekvens rapporterades efter uppvärmningen, bekräftar tillförlitligheten av biopsi och förglasning metoder som antagits. Enligt analysen, den timing som krävs för att utföra blastocyststadiet biopsi påverkar inte antingen euploid blastocysts lönsamhet efter uppvärmningen definieras som återexpansion hastighet, eller reproduktionspotential definieras som levande nativitet. Även om olika tidsinställningar kan observeras mellan operatörer med olika expertis, kan vi överväga blastocyststadiet biopsi säker när förfarandet är klar i ca 8 min, i ett intervall från 3 till 22 min beroende på antalet embryon per förfarande (men inga data är tillgängliga för biopsiprocedurer som utförs i längre intervaller). Den genomsnittliga tid som tillbringas för blastocystbiopsi från varje enskild aktör bör regelbundet (minst var tredje månad) övervakas som KPI. Vid sidan av, bör graden av tveksam diagnos och levande födelse frekvens efter förglasad-värmde euploid blastocyststadiet överföring också åtgärdas. Slutligen, vi skisserat den idealiska timing mellan biopsi och förglasning. Eftersom vi observerade den högsta re-expansion takt efter uppvärmningen när blastocyster var förglasade inom 30 min från biopsi, vi föreslår detta värde som den ideala tröskeln. Närmare bestämt, ju längre tid mellan biopsi och förglasning, desto mer biopsier blastocyststadiet kommer att åter expandera innan de kryopreserved. Detta kan vara skadligt för Cryo-överlevnad, särskilt när det handlar om dålig kvalitet och/eller dag 7 blastocyster11. Icke desto mindre observerades ingen signifikant påverkan på de kliniska resultaten även om vitrifiering fördröjdes efter 90 min. Vid sporadiska tillfällen kan sådana tidsinställningar tillåtas.
Den metod som valts för att hämta ett prov för PGT bör inte påverka embryots lönsamhet, bör innefatta tillförlitliga och informativa resultat, bör vara kliniskt effektiva och bör vara lätt att genomföra därmed minska kostnaderna och laboratorie arbetsbördan. Blastocyst biopsi uppfyller alla dessa förutsättningar. Ändå är det fortfarande ett invasivt förfarande som måste utföras av skickliga operatörer i ett välutrustat laboratorium. För närvarande är avant-garde av en icke-invasiv PGT (niPGT) tillvägagångssätt utreds. Kanske, i framtiden, kan den förbrukade kulturen media efter IVF analyseras för att utföra kromosomala och/eller genetiska tester. Detta är ett spännande framtidsperspektiv eftersom kostnaderna för IVF-kliniken skulle vara lägre och alla arbetsbörda som orsakas av embryobiopsi skulle kringgås. Tillförlitligheten och reproducerbarheten hos förbrukade medieanalyser för genetisk testning bedöms dock fortfarande vara22,23,24, och därför måste fler insatser investeras för att definiera och validera ett protokoll som kan passar alla IVF-kliniker som utför PGT över hela världen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
AG och RM samlade in uppgifterna och utarbetade manuskriptet. DC analyserade uppgifterna, utarbetade de representativa resultaten, utförde statistiken och reviderade manuskriptet. FMU och LR gav kritisk diskussion om resultaten och hela manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B. Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. Jansen, R., Mortimer, D. , Parthenon Press. 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
