Summary
La biopsia e la vitrificazione della blastocisti sono necessarie per condurre in modo efficiente i test genetici preimpianto. Un approccio che prevede l'apertura sequenziale della zona pellucida e il recupero di 7-8 cellule di trectodermi nel giorno 5-7 post-inseminazione limita sia il numero di manipolazioni necessarie sia l'esposizione dell'embrione a condizioni ambientali non ottimali.
Abstract
La biopsia Blastocyst viene eseguita per ottenere una diagnosi genetica affidabile durante i cicli di fecondazione in vitro con test genetici preimpianto. Quindi, il flusso di lavoro ideale comporta un protocollo di vitrificazione sicuro ed efficiente, a causa dei tempi di consegna delle tecniche diagnostiche e per trasferire l'embrione o gli embrioni selezionati su un endometrio fisiologico in un ciclo naturale successivo. Un approccio di biopsia che comprende l'apertura sequenziale della zona pellucida e il recupero di 5-10 cellule trophectoderm (idealmente 7-8) limita sia il numero di manipolazioni necessarie sia l'esposizione dell'embrione a condizioni ambientali non ottimali. Dopo un'adeguata formazione, la tecnica è stata riproducibile tra diversi operatori in termini di tempistica della biopsia (8 min, che vanno da 3 a 22 min in base al numero di embrioni alla biopsia per piatto), diagnosi conclusive ottenute (97,5%) e tassi di natalità vivi dopo il trasferimento di blastocisti euploidi vetrificati (>40%). Il tasso di sopravvivenza dopo la biopsia, la vitrificazione e il riscaldamento è stato del 99,8%. Il tasso di riespansione a 1,5 h dal riscaldamento era alto come 97%, in gran parte dipende dalla tempistica tra biopsia e vitrificazione (idealmente , 30 min), qualità morfologica blastocista e giorno della biopsia. In generale, è meglio vitrificare una blastocisti collassata; pertanto, nei cicli non PGT, potrebbe essere eseguito un restringimento artificiale assistito al laser per indurre il collasso dell'embrione prima della crioconservazione. La prospettiva futura più promettente è l'analisi non invasiva dei media di coltura della fecondazione in vitro dopo la coltura della blastocisti come fonte putativa di DNA embrionale. Tuttavia, questa potenziale avanguardia è ancora in fase di studio e un protocollo affidabile deve ancora essere definito e convalidato.
Introduction
L'obiettivo principale dell'embriologia umana moderna è quello di massimizzare il numero di nascite vive per ciclo stimolato e ridurre i costi, i tempi e gli sforzi per raggiungere una gravidanza. Per raggiungere questo obiettivo, dovrebbero essere utilizzati approcci convalidati per la selezione degli embrioni per identificare gli embrioni competenti riproduttivi all'interno di una coorte ottenuta durante un ciclo di fecondazione in vitro. Secondo le ultime evidenze, la cultura blastocisti1 combinata con test cromosomici completi e il trasferimento di embrioni euploidi vetrificati (ET) è il quadro più efficiente per aumentare l'efficienza della fecondazione in vitro2. Chiaramente, il test di aneuploidità richiede un campione embrionale, che attualmente è per lo più rappresentato da poche cellule recuperate dal trhectoderm (TE), cioè la sezione del blastocisti che dà origine agli annessi embrionali (ad esempio, la placenta) durante la gravidanza . Oltre all'analisi del cariotipo, anche le mutazioni genetiche singole potrebbero essere valutate da una biopsia TE come parte di una strategia clinica nota come test genetico preimpianto (PGT; -A per le aneuploidies, -SR per riarrangiamento cromosomiche strutturali, -M per le malattie monogeniche). Altri metodi di biopsia oocite/embrione sono stati teorizzati e adottati clinicamente negli ultimi decenni, vale a dire biopsia di corpi polari e biopsia blastomeri. Tuttavia, il loro uso è ancora ridotto al giorno d'oggi, poiché i loro inconvenienti procedurali (ad esempio, maggiore carico di lavoro e rischio di impatto riproduttivo) e le limitazioni diagnostiche (ad esempio, problemi di analisi a cella singola) ostacolano implicitamente un equilibrio sufficiente tra costi, rischi e benefici (per una revisione vedere3).
In questo documento, uno dei principali protocolli per la biopsia TE è accuratamente descritto insieme alle successive procedure di vitrificazione, riscaldamento e trasferimento necessarie. Il flusso di lavoro qui descritto è ideale per un'unità PGT occupata.
Come già descritto in precedenza dal nostro gruppo4,5, la procedura prevede l'apertura sequenziale della zona pellucida di blastocisti completamente espansi e la rimozione di poche cellule TE (in media 7-8). Rispetto al giorno 3 metodo di biopsia di schiusa-assistita da raggi6, questa procedura potrebbe facilitare l'orario giornaliero di un'unità di fecondazione in vitro in cui devono essere eseguite tempestivamente procedure delicate, come la biopsia blastocisti e la vitrificazione. Non appena la blastocisti raggiunge la sua piena espansione, la biopsia può essere effettuata selezionando le cellule TE da rimuovere, impedendo così il rischio di ernia della massa cellulare interna (ICM), che altrimenti renderebbe la procedura impegnativa. In letteratura, è stato descritto anche un terzo protocollo di biopsia di blastocisti, che comporta la schiusa assistita dal laser eseguita una volta che l'embrione ha già raggiunto lo stadio di blastocisti, poche ore prima della procedura5,7. Tuttavia, questo approccio richiede più tempo e si adatta principalmente alle unità di fecondazione in vitro che implementano la biopsia TE nelle mani di operatori con esperienza limitata e in considerazione di un carico di lavoro giornaliero moderato-basso.
L'iniezione intracitoplasmatica di spermatoi (ICSI)8 dovrebbe essere una tecnica consolidata se si mira a condurre analisi genetiche nella fecondazione in vitro. Allo stesso modo, un sistema di coltura adeguato per raccogliere in modo sicuro gli embrioni allo stadio di blastocisti è fondamentale per l'attuazione della strategia di biopsia TE. Un numero adeguato di incubatori, così come l'uso di bassa tensione di ossigeno sono prerequisiti fondamentali a tal fine, per non compromettere il tasso di blastocisti9. Allo stesso tempo, è necessario un programma di crioconservazione efficiente per gestire in modo sicuro un ciclo PGT. Nell'ultimo decennio, l'attuazione della vetrificazione ha aumentato i tassi di crio-sopravvivenza degli embrioni anche fino a >99%10,11. Ciò ha fornito tempo sufficiente per eseguire test genetici e rinviare il trasferimento dell'embrione al successivo ciclo mestruale, su un endometrio non stimolato e probabilmente più ricettivo12.
Sia la biopsia TE che la vitrificazione richiedono attività rigorose e la loro efficacia può variare a seconda degli operatori non esperti. Si propongono pertanto un periodo di formazione specifico prima di consentire a ciascun operatore di eseguire clinicamente queste procedure; inoltre, il mantenimento delle competenze degli operatori dovrebbe essere valutato periodicamente monitorando gli indicatori chiave di prestazione (KPI) per le procedure di crioconservazione e biopsia. Ogni clinica di fecondazione in vitro dovrebbe fissare KPI interni a tal fine, che deve approssimare quelli pubblicati dai consorzi internazionali e/o i risultati pubblicati dai laboratori di riferimento.
La biopsia TE, il riscaldamento della vitrificazione e le procedure di testimonianza sono tecniche convalidate presso la nostra unità, che sono state standardizzate in tutti gli operatori coinvolti come riportato in tre precedenti pubblicazioni11,13,14 .
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Protocol
Il protocollo per la biopsia della blastocisti umana, qui descritto, segue le linee guida del Comitato Etico della ricerca umana G.EN.E.R.A.
NOT: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i materiali necessari. Ulteriori materiali necessari riguardano calzature e abiti da laboratorio, maschera chirurgica, copertura per capelli, guanti chirurgici, un marcatore permanente non tossico, pinze e disinfettante. L'uso di abito chirurgico, guanti chirurgici usa e getta, maschera per il viso, copertura dei capelli è obbligatorio per prevenire il rischio di contaminazione. Tutte le aree di lavoro, così come le attrezzature coinvolte nel processo, devono essere pulite accuratamente con disinfettante di laboratorio (ad esempio, Oosafe) prima di iniziare qualsiasi procedura. Tutti i materiali di consumo e i supporti utilizzati devono essere sterili e confezionati singolarmente o a pacchetto. Si consiglia di utilizzare una postazione di lavoro dedicata per la biopsia e i tubi e limitare l'accesso dell'area solo agli operatori coinvolti nella procedura (embriologo e testimone).
1. Preparazione il giorno prima della procedura di biopsia
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Preparare il piatto di cultura post biopsia.
- Mettere 6 gocce di 20 - Vesso medio (Tabella dei materiali) in un piatto di coltura fecondazione in vitro e sovrapporre con 6 mL di olio minerale preriscaldato per la coltura embrionale ( Tabella deimateriali).
- Aggiungere altri 10 -L di supporto di coltura FIV ad ogni goccia. Incubare durante la notte a 37 gradi centigradi in un'atmosfera controllata (5% O2, 6% CO2).
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Preparare un piatto di fecondazione in vitro a 4 pozzetti per il risciacquo della blastocisti dopo la biopsia.
- Posizionare 600 -L di mezzo di coltura fiocco nei primi due pozzi e sovrapporli con 300 l di olio minerale preriscaldato per la coltura embrionale.
- Incubare durante la notte a 37 gradi centigradi in un'atmosfera controllata (5% O2, 6% CO2).
- Distribuisce 1,5 - di soluzione di carico (Tabella dei materiali) in ogni tubo PCR da utilizzare per il tubing delle cellule TE, ruotarlo e tenerlo a 4 gradi centigradi.
2. Preparazione il giorno della procedura di biopsia
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Preparare il piatto di biopsia.
- Mettete 3 gocce di 10L di mezzo tampone HEPES (integrato con albumina siero umano) (Tabella dei materiali) in fila in un piatto di coltura di fecondazione in vitro.
- Ripetere il passaggio 1.1.1 in base al numero di blastocisti disponibili (fino a 4 blastocisti per piatto) e sovrapporli con 6 mL di olio minerale preriscaldato per la coltura embrionale.
- Incubare il piatto a 37 gradi centigradi per almeno 1 h prima di eseguire la procedura di biopsia.
3. Selezione e gradazione Blastocyst
-
Classificare la blastocisti in base alla sua espansione e all'aspetto morfologico di ICM e TE (Figura 1).
NOTA: I criteri di classificazione sono stati adattati da Gardner e Schoolcraft15 e precedentemente descritti da Capalbo et al. e Cimadomo et al.4,11.- Definire le dimensioni e il grado di espansione come: A per una blastocisti completamente tratteggiata, B per una blastocisti di schiusa, C per una blastocisti completamente espansa e D per una blastocisti non espansa (questi embrioni vengono biopsiati solo se non si sono espansi ulteriormente fino al giorno 7).
- Definire il grado ICM: 1 per iCM evidente con diverse celle rigorosamente imballate; 2 per distinguibili con diverse cellule ma grossolanamente imballate; 3 per difficile distinguere con pochissime cellule di bassa qualità.
- Definire il grado TE come segue: 1 per l'epitelio ben organizzato con diverse cellule; 2 per epitelio sciolto con poche cellule; 3 per poche e/o grandi celle di bassa qualità.
4. Biopsia del tristoderlo
- Esegui la biopsia TE su tutte le blastociti completamente espanse (preferibilmente di grado C per le dimensioni e l'espansione).
- Set pipette di detenzione e biopsia per ogni procedura di biopsia. Le raccomandazioni per la pipetta biopsia sono le seguenti: diametro interno di 30 m, angolo di piegatura di 35 gradi, punta di distanza di 0,75 mm da piegare.
- Etichettare il piatto di biopsia con i dettagli del paziente (nome e cognome della donna, data di nascita e ID) e quindi numerare ogni goccia con ID embrionale e ciclo. Utilizzare un marcatore permanente non tossico.
- Trasferire la blastocisti con una pipetta di stripping di 300 m alla prima goccia del piatto di biopsia e sciacquarla per rimuovere l'eccesso di mezzo di coltura. Quindi spostare la blastocisti nella seconda goccia del piatto di biopsia.
- Spostare il piatto al microscopio invertito e innescare la pipetta biopsia aspirando qualche mezzo dalla terza goccia del piatto di biopsia.
- Con un ingrandimento di 20 x, orientare la blastocisti per avere una visione chiara dell'ICM. Quando viene visualizzato a ore 7 (opposto all'area che sarà mirata a rimuovere le cellule TE), fissare l'embrione sulla pipetta di contenimento (Figura 2a).
- Concentrarsi sulla zona pellucida e verificare che sia le pipette che la blastocisti siano sullo stesso piano focale.
- Passare all'obiettivo laser (tempo di impulso 0,3 ms, 6,5 m) e posizionare il puntatore laser sulla zona pellucida sul lato opposto di ICM. Perforare la zona pellucida attraverso 2-3 impulsi laser (Figura 2b).
- Premere delicatamente la pipetta biopsia contro la zona pellucida e soffiare qualche mezzo attraverso la breccia per staccare le cellule TE dalla sua superficie interna e accelerare il crollo blastocisti (Figura 2c).
- Una volta che il TE è staccato (Figura 2d), entrare attraverso il foro (se necessario, renderlo più ampio con un ultimo impulso laser) e aspirare poche cellule TE (idealmente 7-813,16) nella pipetta biopsia con aspirazione delicata (Figura 2e).
- Spostare leggermente la pipetta biopsia all'indietro applicando un'aspirazione moderata per allungare le celle bersaglio (Figura 2f).
- Dirigere il laser verso la parte più sottile delle cellule aspirate e sparare impulsi laser 2-5 alle giunzioni tra le cellule per separare le cellule bersaglio dal corpo dell'embrione (Figura 2g). La tempistica degli impulsi laser e il numero di impulsi possono essere regolati in base alla qualità della blastocisti; tuttavia, cercare di minimizzarli per evitare la lisi cellulare.
- Dopo la separazione del frammento di TE dalla blastocisti (Figura 2h), rilasciarlo nella stessa biopsia goccia lontano dalla blastocisti. Ciò è necessario per evitare che vengano risucchiati nella pipetta biopsia (Figura 2i).
- Rilasciare la blastocisti dalla pipetta di possesso e sollevare prontamente entrambe le pipette per evitare che il frammento si attacchi a loro.
- Scattare una foto del frammento biopsiato a scopo di controllo di qualità (Figura 3).
NOTA: Se si vuole biopsia su più di una blastocisti per procedura (fino a quattro per piatto di biopsia), modificare la pipetta di biopsia con una nuova per evitare la contaminazione incrociata tra embrioni. - Ripetere i passaggi 4.1/4.13.
- Riportare il piatto della biopsia sul cappuccio del flusso laminare.
- Etichettare il piatto di coltura post-biopsia con l'ID coppia, e ogni goccia con l'embrione e l'ID del ciclo.
- In presenza di un testimone, sciacquare la blastocisti nel mezzo di fecondazione in vitro pulito e, infine, spostarlo nella corrispondente goccia del piatto post-biopsia.
- Spostare il piatto post-biopsia sull'incubatrice in un'atmosfera controllata (37 gradi centigradi, 6% CO2, 5% O2) fino alla vitrificazione. Si consiglia di eseguire la vetrificazione entro 30 min dalla procedura di biopsia, per evitare la riespansione della blastocisti.
5. Tubing
NOT: L'intera procedura deve essere eseguita in presenza di un testimone e all'interno del cofano a flusso laminare a temperatura ambiente. Durante la procedura, tenere i tubi PCR in un rack di tubi freddi sul ghiaccio (Figurasupplementare 1).
- Etichettare i tubi PCR con un marcatore permanente non tossico.
NOT: L'etichettatura deve essere eseguita come richiesto dal laboratorio genetico. Generalmente, il nome e il cognome del paziente (iniziali), l'ID coppia, l'embrione e l'ID ciclo (ad esempio: JD 12345 1.2 per l'embrione N.1 del secondo ciclo appartenente a Jane Doe il cui ID coppia è 12345). Id embrionale deve essere riportato anche in lettere sul corpo del tubo. - Etichettare il coperchio di un piatto di coltura da 60 mm x 15 mm (piatto di tubazione) con gli ID degli embrioni biopsied ( Figura supplementare1) e preparare due gocce da 10 gocce di soluzione di lavaggio della biopsia ( Tableof Materials) in esso.
- Prime la pipetta di strappo di 140 m (Figura supplementare 1) con qualche soluzione di lavaggio biopsia dalla seconda goccia del piatto di tubi.
- Posizionare il parabola di biopsia sotto lo stereoscopio per visualizzare facilmente i frammenti te.
- Rilasciare delicatamente qualche soluzione di lavaggio biopsia sul frammento TE; quindi, caricarlo nella pipetta di stripping.
- Spostare il frammento di TE alla seconda goccia di soluzione di lavaggio biopsia nella tubazione e sciacquarlo con attenzione 2-3 volte.
- Trasferire il frammento di TE sul fondo del tubo PCR (precedentemente etichettato dopo di esso) con la soluzione di carico, prestando attenzione a non toccare le pareti con la punta della pipetta di stripping.
- Ripetere la procedura dal passaggio 5.3 al passaggio 5.7 per ogni frammento di TE, prestando attenzione all'uso di un nuovo capillare per ogni frammento di TE.
- Alla fine della procedura di tubazione, mettere tutti i tubi PCR in una mini centrifuga e ruotarli per alcuni secondi.
- Conservare i campioni a -20 gradi centigradi fino a quando non li spedirà al laboratorio genetico di riferimento per i test.
6. Vitrificazione di Blastocyst
- Le blastocisti collassate vitrificate entro 30 min dalla biopsia TE per impedirne la riespansione.
- Etichettare la piastra di vetrificazione con i dettagli della donna e gli ID delle blastocisti che devono essere vetrificati.
- Etichettare il supporto o i supporti di vetrificazione con il nome e il cognome della donna, l'ID della coppia, l'ID dell'embrione che verrà caricato su di esso, nonché la data della procedura. Vengono utilizzate etichette speciali che ne conservano l'integrità anche a temperature molto basse (-196 gradi centigradi).
- A temperatura ambiente, erogare 0,3 mL di soluzione di equilibratura (ES) (Tabella dei materiali) per ogni blastocisti che sarà vetrificata.
- In presenza di un testimone, spostare la blastocisti in ES utilizzando la pipetta di stripping di 300 m.
- Lascia la blastocisti nell'ES per 13-15 min. Dopo un primo restringimento del volume, si osserverà una graduale riespansionee.
- Riempire un piccolo rack di raffreddamento con azoto liquido (LN2) e posizionarlo sotto il cofano a flusso laminare.
- Distribuisci 300 l di soluzione di vitrificazione (VS) (Tabella dei materiali) nel secondo pozzo. Dopo che la blastocisti completa ri-espansione, trasferirla nella soluzione VS per 1 min e risciacquarla per diluire l'ES.
- In presenza di un testimone, caricare la blastocisti sul supporto di vitrificazione e prendersi cura di rimuovere l'eccesso di VS. Un sottile film di soluzione dovrebbe circondare la blastocisti.
- Immergere il supporto della vetrificazione in LN2 e spostarlo energicamente al fine di ridurre il rischio di formazione di bolle vicino al campione.
- Posizionare il tappo protettivo mantenendo il supporto di vitrificazione immerso nella LN2.
- In presenza di un testimone, spostare il supporto di vitrificazione in un serbatoio di stoccaggio LN2 a lungo termine.
7. Restringimento artificiale delle Blastocisti non biopsied
-
Se non viene eseguita alcuna biopsia TE, comprimere artificialmente le blastocisti immediatamente prima della vitrificazione (Figura 4).
- Spostare il piatto di coltura dall'incubatrice al microscopio invertito e concentrarsi sull'embrione selezionato.
- Passare all'obiettivo laser (impulso preimpostato: 0,3 ms, 6,5 m), prendere di mira la zona pellucida sul lato opposto dell'ICM, quindi dirigere 1–2 impulsi laser verso le giunzioni tra le celle TE a una distanza di sicurezza dall'ICM. Le blastocisti dovrebbero collassare in meno di 5 min.
- Procedere con la vetrificazione della blastocisti collassata come descritto nella sezione 6.
8. Riscaldamento Blastocisti trasferibili
- Il giorno dell'ET, preparare la piastra ET 4 pozzetti mettendo per ogni pozzo 600 gradi di supporto di coltura in fecondazione in vitro pre-equilibrato. Incubare a 37 gradi centigradi in un'atmosfera controllata (5% O2, 6% CO2),durante l'esecuzione del riscaldamento blastocisti.
- Etichettare il piatto riscaldante con il nome della donna e cognome, coppia ID, ID dell'embrione che sarà riscaldato in esso.
- Distribuisci 1 mL della soluzione di scongelamento (TS) (Tabella dei materiali) in un piatto di fecondazione in vitro ( Figura supplementare1) e riscaldarlo a 37 gradi centigradi in un termostato per almeno 1 h prima di iniziare la procedura.
- Riempire un piccolo supporto di raffreddamento con LN2 e posizionarlo nella cappa di flusso laminare nelle immediate vicinanze dell'area di lavoro.
- Prima di iniziare la procedura, controllare le informazioni sulla blastocisti riportate sul supporto della vetrificazione. Tutti gli ID devono corrispondere al rapporto genetico e la blastocisti al caldo deve essere scelta tra quelle trasferibili. Durante la procedura è necessario un testimone.
- Prendere il piatto di un pozzo contenente TS riscaldato dal termostato e posizionarlo su un palco riscaldato sotto lo stereoscopio.
- Tirare sopra il tappo protettivo all'interno della LN2 usando i pinze.
- Immergete rapidamente la punta del supporto per la vetrificazione nel 37 .
- Sotto osservazione microscopica, spostare delicatamente il supporto di vitrificazione fino a quando la blastocisti non viene rilasciata dalla punta.
- Lasciare la blastocisti per un totale di 1 min nel TS, prestando attenzione a tenerlo in fondo al TS.
- A temperatura ambiente erogare 200 - L di soluzione di diluizione (DS) (Tabella dei materiali) sul primo pozzo della piastra di vitrificazione.
- Trasferire la blastocyst a DS e posizionarla nella parte inferiore del pozzo mentre si rilascia no, mentre si rilasciano alcuni TS sulla parte superiore di esso per creare una sorta di gradiente. Lasciare per 3 min.
- Distribuisci 200 - L di soluzione di lavaggio (WS) in 2 pozzi diversi (WS1 e WS2).
- Trasferire la blastocisti a WS1 e posizionarla sul fondo del pozzo mentre si rilascia un po 'di supporto DS sulla parte superiore di esso. Quindi trasferire la blastocisti a WS2 e lasciarlo indisturbato per 1 min.
- Etichettare la piastra ET post-riscaldamento con il nome e il cognome della donna, id coppia, ID dell'embrione che verrà coltivato in esso.
- In presenza di un testimone, trasferire la blastocisti riscaldata al mezzo culturale pre-equilibrato nella piastra ET post-riscaldamento.
- Sciacquare la blastocisti nel primo pozzo della piastra ET e posizionarlo nel secondo pozzo.
- Trasferire il piatto di coltura post-riscaldamento all'incubatrice in un'atmosfera controllata (37 gradi centigradi, 6% CO2, 5% O2) e la coltura della blastocisti per almeno 1,5 h prima di controllarne la sopravvivenza e la riespansione.
NOT: La figura 5 mostra esempi di blastocisti degenerati, crio-sopravvissuti ma non riespansi e crio-sopravvissuti e completamente espansi.
9. EmbryoTransfer
- Per eseguire ET, posizionare il piatto sullo stadio riscaldato della cappa di flusso laminare, in modo che l'embrione sia visibile al microscopio a un basso ingrandimento.
- Prendere circa 0,4 mL di fecondazione in vitro medio di coltura. Fissare saldamente la punta della siringa nell'estremità ricevente del catetere interno e quindi rilasciare il supporto fino a 0,1 mL.
- Mezzo di coltura aspirato fino all'osservazione degli embrioni che entrano nel catetere (quantità minima di supporti: 10-15 L).
- Posizionare il catetere nella custodia di plastica e andare in sala operatoria e posizionare il catetere interno nella guida esterna.
- Una volta raggiunto l'utero, spingere lo stantuffo della siringa per rilasciare l'embrione(s). Rilasciare molto lentamente il mezzo fino a quando lo stantuffo legge 0,1 mL.
- Riportare il catetere in laboratorio e controllare al microscopio che l'embrione sia stato trasferito.
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Representative Results
La figura 6 rappresenta uno schema di tutti i risultati di una procedura di biopsia che può essere adottata per standardizzare il protocollo e monitorare le prestazioni di ciascun operatore. Il principale risultato procedurale è la tempistica per completare la biopsia/biopsia; il principale risultato tecnico è la qualità della trama prodotta dopo i test genetici che potrebbero portare a una diagnosi conclusiva o inconcludente, quest'ultima delle quali richiede una ribiodella blastocia non diagnosticata; il principale risultato biologico è il tasso di crio-sopravvivenza e riespansione rispetto alla degenerazione dopo il riscaldamento; infine, il principale risultato clinico è il tasso di natalità vivo dopo il trasferimento di blastocisti calvo-riscaldato. In tre studi precedenti abbiamo riportato i KPI definiti al centro(s) per gli esiti tecnici, biologici e clinici11,13,16. In seguito, segnaliamo invece come è stato definito il KPI per la tempistica della biopsia. Inoltre, è stata studiata anche l'influenza putativa dei tempi tra biopsia e vetrificazione sul comportamento post-riscaldamento delle blastocisti euploidi.
In un periodo di 2 anni, un totale di 1.544 procedure di biopsia sui troectodermi sono state condotte da 7 operatori (tabella1). Tutte le blastocisti biopsied sono state poi spostate nell'incubatrice in un piatto di coltura post-biopsia fino alla vitrificazione. Tutti i dati rilevanti sono stati raccolti in un database relazionale. Tutti i tempi di biopsia e tra biopsia e vitrificazione sono stati retrospettivamente ottenuti dal software del sistema di testimonianza elettronica della fecondazione in vitro. I dati sono stati poi esportati e analizzati per le statistiche.
Il tasso di crio-sopravvivenza delle blastocisti euploidi dopo la biopsia del troferodermi e il riscaldamento della vetrificazione è stato di N - 571/572, 99,8%. Il tasso di riespansione a 1,5 h dopo il riscaldamento è stato di N 556/571, 97,4%. Tra le 15 blastocisti non espanse, una ha portato a una nascita viva dopo essere stata trasferita in utero. Il tasso di natalità dal vivo dopo il trasferimento di blastocisti euploidi riscaldato dal vitrificato è stato di N.227/572, 39,7%.
Definizione della tempistica ideale della biopsia
La tabella 1 riassume i dati rilevanti delle procedure di biopsia condotte. Complessivamente, le blastocisti (gamma 1-4) sono state biopsied per procedura in 8,24 x 4,23 min (gamma 3-22). La tempistica media della biopsia variava sia a causa sia del numero di blastocisti biopsied per procedura, da un minimo di 5,78 x 2,94 min (intervallo 3-16) quando nel piatto è stato posato un solo embrione fino a un massimo di 12,93 x 4,43 min (intervallo 6-22) quando gli embrioni re 4. Un altro parametro rilevante è stato l'operatore coinvolto nella procedura: la più esperta (procedure N - 443) è stata la più veloce (7.411 - 3,6 min, gamma 3-22), mentre il meno esperto (N - 42) è stato il più lento (14.19 - 4.24 min, gamma 6-22). Infatti, un modello lineare generalizzato che prevede sia il "numero di blastocisti biopsied per procedura" che le variabili "operatore" spiega perfettamente la "timing di biopsia" con una R2 e una potenza . Questa analisi è stata utile per definire che idealmente 6 min è sufficiente per una procedura di biopsia blastocisti quando solo un embrione viene posato nel piatto, mentre 9 min, 12 min e 13 min per 2, 3 e 4 blastocisti, rispettivamente. Chiaramente, l'intera procedura comporta anche lo spostamento degli embrioni dalla coltura al piatto di biopsia e da quest'ultimo al piatto di coltura post-biopsia dopo la procedura, oltre a cambiare la pipetta biopsia tra biopsie sequenziali.
La figura 7 traccia la tempistica media della biopsia per ciascun operatore lungo i trimestri dello studio (da 1st a 8th). La linea rossa tratteggiata identifica il valore medio complessivo di 8,24 min. Tale grafico è utile per monitorare le prestazioni medi di ogni praticante. Ad esempio, gli operatori più esperti (1 e 2) hanno mostrato una diminuzione costante di questo tempismo, il che suggerisce una tendenza tipica di una curva di apprendimento. Tutti gli operatori da 3 a 6 erano invece sufficientemente costanti nelle loro prestazioni intorno al valore complessivo medio in tutti i trimestri. Ogni volta che hanno mostrato un picco nel valore medio da un determinato trimestre (ad esempio, operatore 3 nel 7th trimester, operatore 4 nel 6th trimestre, operatore 5 nel terzo trimestre), sono stati avvertiti al fine di rivedere le loro prestazioni. Operatore 7 (cioè il meno esperto) ha mostrato tempi tipici di un embriologo che ha appena terminato il suo addestramento. Forse, lui / lei soddisferà gli standard interni al laboratorio come l'esperienza aumenterebbe.
È importante sottolineare che il tempo della biopsia è stato simile tra le blastocie euploidi riespanse e non espanse a 1,5 h dal riscaldamento (9,52 x 4,23 min, gamma 3-22 contro 10,5 x 5,68 min, gamma 4-22; t-test - 0,37). Probabilmente, le blastocisti euploidi vetrificati impiantati (N - 229) e non impiantati (N - 343) hanno mostrato tempi di biopsia comparabili (9,77 x 4,15 min, gamma 3-22 contro 9,41 - 4,36 min, gamma 3-22; t-test - 0,39). Forse allora, un tempismo da 22 min alla biopsia fino a 4 blastocisti non influisce sul comportamento dell'embrione dopo il riscaldamento. Pertanto, abbiamo definito questo valore come soglia massima.
Analogamente, non è stata dimostrata alcuna differenza in termini di tasso di natalità vivo tra i diversi operatori di biopsia, come già riportato in precedenza13 ( tabella supplementare1).
Un altro parametro importante per monitorare le prestazioni di ogni operatore è il tasso di risultati inconcludenti dopo la diagnosi, che dovrebbe essere il più vicino possibile alle prestazioni generali di ogni laboratorio. Idealmente questo tasso non dovrebbe superare il 2,5% e potrebbe diminuire con il tempo a causa di una crescente esperienza nelle procedure di biopsia e tubing16. Il numero di celle TE da recuperare è 7-8 secondo due studi precedenti13,16. A tal fine, si consiglia di scattare una foto del frammento biopsied ascopo di controllo di qualità (vedere alcuni esempi in Figura 3). Tale quadro potrebbe essere controllato in caso di diagnosi inconcludenti per valutare se la causa fosse imputabile alla dimensione/qualità del frammento (cioè, bassa qualità dell'analisi molecolare), al tubo (cioè, al guasto dell'amplificazione del DNA) o ad alcuni problemi in l'elaborazione del campione nel laboratorio genetico.
Definizione della tempistica ideale tra biopsia e vetrificazione
Nel periodo di studio, 572 blastocisti euploidi sono stati riscaldati per sottoporsi a un trasferimento di embrioni dopo una diagnosi di euploidia. La figura 8A mostra ogni blastocisti riscaldata come un cerchio nero distribuito tra i tempi crescenti tra biopsia e vitrificazione e raggruppato in due gruppi in base al risultato in esame in esame: ri-espanso o non ri-espanso entro 1,5 h da Riscaldamento. Tutte le blastocisti (N - 117/117) vetrificate entro 30 min, Il 97,6% (N - 245/251) delle blastocisti vetrificate tra i 31 e i 90 min e il 95,1% (N - 194/204) delle blastocisti vetrificate oltre i 90 min si riespansero, rispettivamente (nessun tasso di riespansione: 0%, 2,4% e 4,9%). Pertanto, abbiamo impostato 30 min e 90 min come le soglie di tempo precoce e tardiva tra biopsia e vitrificazione.
La figura 8B mostra il tasso di riespansione nei tre gruppi (30 min, 31-90 min, >90 min) ulteriormente sotto-raggruppati in base alla qualità del blastocisti e al giorno dello sviluppo preimpianto. Soprattutto per le blastocisti di scarsa qualità e/o il giorno 7, i tempi tra biopsia e vetrificazione sembrano cruciali per ottenere una riespansione dopo il riscaldamento. In particolare, il rapporto quote-di riespansione dopo il riscaldamento corretto sia per la qualità della blastocisti che per il giorno della biopsia nelle blastocisti vetrificate entro 30 min dalla biopsia contro le blastocisti vetrificate oltre i 90 min era di 3,05 (95% CI 1,01-9,4, p.0,05). Al contrario, il periodo tra queste due soglie (31-90 min) rappresentava un'area grigia che poteva o meno avere un impatto.
Solo 1 blastocisti non espansi non espansi ha portato a una nascita dal vivo dopo il trasferimento. Pertanto, abbiamo infine studiato il tasso di natalità dal vivo raggiunto dopo il trasferimento di blastocisti euploidi riscaldati raggruppati nei tre gruppi in base alla tempistica tra biopsia e vitrificazione. Il più alto tasso di natalità vivo è stato raggiunto trasferendo blastocisti euploidi vitrificati 30 min dalla biopsia del tristoderlo (N - 56/117, 47,9%). Tuttavia, questo risultato non ha raggiunto la significatività statistica rispetto allo stesso risultato ottenuto sia con blastocisti vetrificati tra 31 e 90 min (N - 92/251, 36,7%; Il test esatto di Fisher 0,06), o con blastocisti vitrificati >90 min dalla biopsia (N.81/204, 39,7%; Il test esatto di Fisher è 0,16). Pertanto, o un effetto negativo sulla competenza riproduttiva della blastocisti è trascurabile o la dimensione del campione in questo set di dati (N - 572) non era sufficiente per raggiungere la rilevanza statistica.
Figura 1: Parametri per la classificazione di blastocisti. Espansione: (A) completamente tratteggiata, (B) nel tratteggio, (C) completamente espansa e (D) non espansa. Lo stadio ideale è C, mentre una blastocisti D dovrebbe avere più tempo per ottenere la piena espansione, a meno che questo stadio non venga raggiunto nel giorno 7; Massa cellulare interna (ICM) qualità morfologica: 1 (evidente con diverse celle strettamente imballate), 2 (distinguibili con diverse ma grossolanamente imballate) e 3 (difficile da distinguere con pochissime cellule di bassa qualità); trophectoderm (TE) qualità morfologica: 1 (epitelio ben organizzato con diverse cellule), 2 (epitelio sciolto con poche cellule) e 3 (poche e/o grandi cellule di bassa qualità). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Riepilogo della zona delatrice pellucida apertura e troectoderm (TE) approccio di recupero delle cellule per la biopsia della blastocisti. (a) Orientare la blastocisti con la massa della cellula interna (ICM) vicino alla pipetta di contenimento e lontano dal punto in cui verranno recuperate le celle TE selezionate. Fissare la blastocisti sulla pipetta di possesso; (b) aprire il colpo laser da zP a 2-3; (c) soffiare alcuni mezzi di coltura attraverso il foro; (d) la blastocisti si staccherà dalla P; (e) inserire il P e succhiare 5-10 celle TE nella pipetta di biopsia; (f) muoversi all'indietro con la pipetta di biopsia per allungare il frammento selezionato ed esporre le giunzioni tra le cellule; (g) si attivano alle giunzioni tra le cellule e continuano ad allungare il frammento fino a quando le cellule TE non vengono rilasciate dal corpo della blastocisti; (h) la blastocisti dopo il collasso della biopsia TE; (i) scattare una foto del frammento di biopsia per il controllo di qualità e trasferirlo al tubo PCR che verrà inviato al laboratorio genetico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempi di frammenti di biopsia: (a-c) frammenti desiderabili; (d) frammento lizzato; (e) piccolo frammento con celle degenerate; (f) frammento piccolo, parzialmente lizzato e degenerato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: restringimento artificiale. (a) Orientare la blastocisti in modo che la massa cellulare interna (ICM) sia lontana dalla sezione mirata del trhectoderm (TE); (b) Sparare 2-3 colpi laser di fila alle giunzioni tra le celle TE e lo spostamento verso l'esterno; (c) Attendere il collasso della blastocisti prima di iniziare la vitrificazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Esempi di degenerazione della blastocisti (a), crio-sopravvivenza ma nessuna riespansione (b) e crio-sopravvivenza e piena riespansione (c) 1,5 h dopo il riscaldamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Riepilogo dei diversi risultati della biopsia trophectoderm che potrebbero essere utilizzati per monitorare le prestazioni di un operatore e definire gli indicatori di prestazioni chiave interni a ciascun laboratorio. Il principale risultato procedurale è la tempistica della biopsia. Il principale risultato tecnico è il tasso di diagnosi conclusive (euploidi o aneuploidi) e inconcludenti (riepsia necessaria); ottenute; quest'ultimo potrebbe essere causato dall'amplificazione del DNA o da dati molecolari di bassa qualità, con conseguenti trame del profilo del numero di copia cromosomica non interpretabili. Il principale risultato biologico è il tasso di crio-sopravvivenza e riespansione o degenerazione dopo la biopsia, la vitrificazione e il riscaldamento. Il principale risultato clinico è il tasso di nascite vive o gli esiti negativi della gravidanza ottenuti dopo il trasferimento di blastocisti calzolati. Da notare che, sebbene l'esito procedurale dipenda esclusivamente dall'operatore e dal numero di blastocisti biopsidipersia per procedura, tutti gli altri esiti potrebbero essere influenzati da altri confondenti indipendenti dall'operatore di biopsia (ad esempio, i passi e gli operatori coinvolti nell'analisi molecolare, la qualità morfologica della blastocisti, il giorno della biopsia) che dovrebbe essere presa in considerazione per valutare correttamente le sue prestazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Tempistica media della biopsia per operatore negli 8 trimestri dello studio. La tabella riassume il relativo numero di procedure e il numero medio di blastocisti biopsied per procedura da ciascun operatore negli 8 trimestri dello studio. La linea rossa tratteggiata all'interno di ogni grafico rappresenta la tempistica media complessiva della biopsia (8,24 min). Le barre di errore sono le deviazioni standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Riespansione dopo il riscaldamento rispetto ai tempi tra biopsia e vitrificazione. (A) mostra non ri-espanso e ri-espanso blastocisti 1,5 ora dopo il riscaldamento. Ogni blastocisti è rappresentata da un cerchio nero attraverso i tempi crescenti. Le linee nere verticali continue rappresentano 30 min impostato come soglia precoce e 90 min impostato come soglia di ritardo. (B) indica i tassi di riespansione nei tre gruppi (timing tra biopsia e vitrificazione: 30 min, 31-90 min, >90 min) ulteriormente raggruppati in base alla qualità della blastocisti e al giorno della biopsia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| N di procedure | N blastocisti biopsied per procedura | Tempi medi di biopsia : SD, gamma (min) | |
| Operatore 1 | 443 | 2,01 - 1,09, 1-4 | 7.41 - 3,6, 3-22 |
| 195 del sistema | 1 : il nome del | 4,75 x 1,96, 3-16 | |
| 111 del sistema | 2 Il nome del sistema | 7,83 x 2,45, 3-18 | |
| 71 del sistema di | 3 (COM del nome | 10,27 : 2,41, 4-16 | |
| 66 del sistema di | 4 DEL psu' | 11.48 - 3,81, 6-22 | |
| Operatore 2 | 290 | 1,81 - 0,98, 1-4 | 7.87 - 4,13, 3-22 |
| 142 del sistema | 1 : il nome del | 5,69 x 3,32, 3-16 | |
| 89 (in questo stato del sistema | 2 Il nome del sistema | 8.48 - 2,79, 3-18 | |
| 30 milio | 3 (COM del nome | 11,37 : 3,72, 4-20 | |
| 29 del 22 221 | 4 DEL psu' | 13,1 - 3,89, 9-22 | |
| Operatore 3 | 287 del sistema | 1,98 x 1,05, 1-4 | 9.10 - 4,65, 3-22 |
| 121 | 1 : il nome del | 6 x 2,19, 3-15 | |
| 89 (in questo stato del sistema | 2 Il nome del sistema | 9,6 - 3,87, 3-22 | |
| 38 Mi lasa | 3 (COM del nome | 12,66 : 4,55, 4-22 | |
| 39 mila: l'altro | 4 DEL psu' | 14.13 - 4,8, 6-22 | |
| Operatore 4 | 217 del sistema di | 1,66 - 0,87, 1-4 | 7.58 - 3,45, 3-22 |
| 118 del sistema di | 1 : il nome del | 5,58 x 1,96, 3-14 | |
| 66 del sistema di | 2 Il nome del sistema | 8,92 - 2,91, 4-22 | |
| 21 Mieto | 3 (COM del nome | 11.48 - 2,34, 5-16 | |
| 12 mila | 4 DEL psu' | 13 : 4,26, 6-19 | |
| Operatore 5 | 144 del sistema | 2,03 - 1,08, 1-4 | 9.43 - 4,24, 3-22 |
| 59 (di cinità) | 1 : il nome del | 6,15 x 2,5, 3-16 | |
| 43 (di cine) | 2 Il nome del sistema | 10.07 - 2,73, 6-16 | |
| 20 anni | 3 (COM del nome | 12,6 - 2,89, 9-18 | |
| 22 Milia | 4 DEL psu' | 14.09 - 4,43, 6-22 | |
| Operatore 6 | 121 | 1,67 x 0,94, 1-4 | 7.79 - 3,93, 3-22 |
| 70 del sistema di | 1 : il nome del | 6,19 x 2,95, 3-16 | |
| 32 Milia risse | 2 Il nome del sistema | 8.12 - 1,72, 3-11 | |
| 9 (in vie | 3 (COM del nome | 12,78 : 3,31, 9-18 | |
| 10 del sistema | 4 DEL psu' | 13,5 - 6,19, 6-22 | |
| Operatore 7 | 42 o più | 1,62 x 0,94, 1-4 | 14.19 - 4,24, 6-22 |
| 27 mi lapiùdel | 1 : il nome del | 11.85 - 5,53, 6-16 | |
| 6 È possibile: | 2 Il nome del sistema | 16,5 - 3,73, 11-22 | |
| 7 (in questo stato | 3 (COM del nome | 19.86 - 3,34, 13-22 | |
| 2 Il nome del sistema | 4 DEL psu' | 19 : 4,24, 16-22 | |
| totale | 1544 | 1,89 x 1,03, 1-4 | 8,24 x 4,23, 3-22 |
| 732 (in questo | 1 : il nome del | 5,78 x 2,94, 3-16 | |
| 436 | 2 Il nome del sistema | 8,85 - 3,14, 3-22 | |
| 196 del sistema | 3 (COM del nome | 11,72 : 3,70, 4-22 | |
| 180 del sistema | 4 DEL psu' | 12.93 - 4,43, 6-22 |
Tabella 1: La tempistica media totale della biopsia e il numero medio di blastocisti biopsisied in ogni procedura secondo l'operatore di biopsia. La tempistica media della biopsia è stata mostrata anche in base a ogni numero sequenziale di blastocisti biopsied per procedura. Un modello lineare generalizzato che include sia l'"operatore di biopsia" che il "numero di immagini di blastocisti biopsied per procedura" correla perfettamente con la "timing di biopsia" (R2 - 0,48, potenza - 1).
Figura supplementare Figura 1: Dispositivi principali e supporti necessari per la procedura. Fare clic qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 1: L'analisi della regressione logistica non mostra alcuna associazione significativa tra l'operatore di biopsia e il parto dal vivo dopo il trasferimento di blastocisti euploidi a caldo vetrificato. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Solo gli embriologi esperti di esperti che hanno completato il loro periodo di formazione dovrebbero eseguire sia la biopsia TE che la vitrificazione della blastocisti. Inoltre, un testimone è tenuto a monitorare le procedure e garantire un'efficiente tracciabilità durante i) i movimenti della blastocisti biopsied dal piatto di biopsia ( Figura supplementare1) alla parabola post-biopsia (Figurasupplementare 1 ), quindi alla targhetta di vitrificazione (figura supplementare 1) e infine al sostegno alla vetrificazione (Figura supplementare 1); ii) il trasferimento di cellule TE biopsied dal piatto biopsia al tubo PCR (Figura supplementare1); iii) le fasi di riscaldamento e trasferimento post-diagnosi. Per una descrizione dettagliata di tutte le fasi di testimonianza, fare riferimento a un'analisi delle modalità di errore e degli effetti (FMEA) pubblicata in precedenza14.
Tutti i metodi descritti in questo documento rispettano il regolamento locale (legge italiana 40/2004). Secondo la legge, infatti, la coppia può chiedere di essere informata sullo stato di salute degli embrioni prodotti durante il ciclo di fecondazione in vitro. A questo proposito, un consenso informato dettagliato per il PGT deve essere firmato da entrambi i partner.
In questo articolo abbiamo descritto come implementare la biopsia della blastocisti per la PGT in una routine di laboratorio intensa. L'applicazione dell'approccio alla biopsia della blastocisti è stato un importante progresso nell'ultimo decennio nella fecondazione in vitro. Riportata per la prima volta da de Boer e colleghi nel 200417,è stata presto riconosciuta come una procedura più efficace e informativa rispetto allo stadio di scissione e alla biopsia del corpo polare si avvicina3. Il valore di questa procedura risiede principalmente in una riduzione degli oneri tecnici, ma anche in una minore incidenza di mosaicismo cromosomico in questa fase di sviluppo18,19. Inoltre, la rimozione di poche cellule TE da una blastocisti è stata suggerita come una procedura più sicura rispetto alla rimozione di un blastomer da un embrione dello stadio di scissione. Infatti, in uno studio randomizzato non a selezione, il primo approccio non ha comportato alcun impatto sul potenziale di impianto dell'embrione, mentre il secondo ha comportato una significativa riduzione del 20% di20.
Il protocollo utilizzato principalmente in tutto il mondo comporta l'apertura zona assistita dal laser nel giorno 3 post-inseminazione. Finora non è stato condotto alcuno studio controllato randomizzato per confrontare i diversi approcci di biopsia della blastocisti. Tuttavia, è ragionevole che minore è il numero di manipolazioni e esposizioni degli embrioni in crescita a condizioni ambientali non ottimali, minore è la potenziale invasività del protocollo. Inoltre, la presenza di un buco nella zona pellucida dal terzo giorno di sviluppo potrebbe influenzare l'espansione della blastocisti e causare l'ernia delle cellule ICM insieme alle cellule TE. Per questi motivi, abbiamo impostato e implementato il protocollo qui descritto che comporta la rottura sequenziale della zona assistita dal laser e il recupero delle celle TE non appena la blastocisti raggiunge la piena espansione. Esiste anche un protocollo diverso che comporta un giorno 5 o 6 schiusa assistita5,7. In particolare, la perforazione della zona viene eseguita il giorno 5 o 6 dello sviluppo preimpianto sul lato opposto rispetto all'ICM; la blastocisti viene poi spostata di nuovo nell'incubatrice in attesa dell'ernia spontanea delle cellule TE. Chiaramente, il monitoraggio periodico della blastocisti deve essere fornito nelle ore successive, per biopsia non appena il TE inizierà l'ernia, così come per evitare che l'embrione si schiude completamente. Se da un lato i professionisti non qualificati possono facilmente attuare questa strategia di biopsia alternativa, dall'altro non è adatto per un laboratorio occupato che esegue diverse procedure al giorno. Il protocollo di biprimione di apertura e biopsia di zona e blastocisti sequenziali qui descritto è invece meno dispendioso in termini di tempo e consente un tempo di hands-on più breve e una maggiore flessibilità per programmare l'attività quotidiana in laboratorio in modo da coordinare i tempi dedicati biopsia e alle procedure di vitrificazione.
Blastocisti di scarsa qualità potrebbero essere più complessi alla biopsia poiché le cellule TE possono essere appiccicose, ma più colpi laser coordinati con lo stiramento del frammento per esporre le giunzioni tra le cellule sono sufficienti per rimuoverlo dal corpo della blastocisti. La blastocisti completamente schiusa può essere biopsied come blastocisti racchiusi nella zona pellucida, ma potrebbero essere più difficili da vitrificare e riscaldare. In caso di diagnosi inconcludenti dopo la biopsia, i dati riportati fino ad oggi sono concordanti sul fatto che nessun danno sembra derivare da una biopsia di ri-biopsia e da un seguente ciclo di vitrificazione-riscaldamento16,21.
La vetrificazione è attualmente utilizzata nel centro per eseguire la crioconservazione della blastocisti poiché è stata costantemente segnalata più sicura, più efficiente e meno dispendiosa in termini di tempo rispetto al protocollo di congelamento lento da una revisione e meta-analisi della letteratura più recente 10.
Una volta che la procedura è stata ben consolidata e gli operatori adeguatamente addestrati, abbiamo eseguito un'analisi retrospettiva per definire i tempi procedurali ideali sia per la biopsia blastocista che per le procedure di vitrificazione (riassunte qui nei risultati rappresentativi). Come risultati finali, abbiamo valutato il tasso di riespansione della blastocite euploide valutato a 1,5 h dopo il riscaldamento e il tasso di natalità vivo raggiunto dopo il trasferimento di embrioni singoli caldi a vista. Non è stato osservato alcun caso di degenerazione della blastocisti dopo la biopsia, e solo lo 0,2% (N - 1/572) del tasso di degenerazione è stato segnalato dopo il riscaldamento, confermando l'affidabilità degli approcci di biopsia e vitrificazione adottati. Secondo l'analisi, i tempi necessari per eseguire la biopsia della blastocisti non influiscono sulla vitalità delle blastocisti euploidi dopo il riscaldamento definito come tasso di riespansione, o il potenziale riproduttivo definito come tasso di natalità vivo. Sebbene si possano osservare vari tempi tra operatori con competenze diverse, possiamo considerare sicura la biopsia della blastocisti quando la procedura viene completata in circa 8 min, in un intervallo compreso tra 3 e 22 min a seconda del numero di embrioni per procedura (tuttavia nessun dato è per le procedure di biopsia eseguite a intervalli più lunghi). Il tempo medio impiegato per la biopsia della blastocisti di ogni singolo operatore deve essere periodicamente (almeno ogni tre mesi) monitorato come KPI. Oltre, dovrebbe essere affrontato anche il tasso di diagnosi inconcludente e il tasso di natalità dal vivo dopo il trasferimento di blastocisti euploidi riscaldato dal vitrificato. Infine, abbiamo delineato la tempistica ideale tra biopsia e vetrificazione. Dal momento che abbiamo osservato il più alto tasso di riespansione dopo il riscaldamento quando le blastocisti sono state vetrificate entro 30 min dalla biopsia, suggeriamo questo valore come soglia ideale. In particolare, più lungo è il tempo tra la biopsia e la vetrificazione, più la blastocisti biopsied si riespanderà prima di essere crioconservata. Questo potrebbe essere dannoso per la crio-sopravvivenza, soprattutto quando si tratta di scarsa qualità e/ o giorno 7 blastocisti11. Tuttavia, non è stato osservato alcun impatto significativo sugli esiti clinici, anche se la vitrificazione è stata ritardata oltre i 90 min. Pertanto, in occasioni sporadiche, tali tempi potrebbero essere consentiti.
Il metodo scelto per recuperare un campione per il PGT non dovrebbe compromettere la vitalità dell'embrione, dovrebbe comportare risultati affidabili e informativi, deve essere clinicamente efficace e dovrebbe essere facile da implementare riducendo così i costi e il carico di lavoro di laboratorio. La biopsia blastocista soddisfa tutti questi prerequisiti. Tuttavia, è ancora una procedura invasiva che deve essere eseguita da operatori qualificati in un laboratorio ben attrezzato. Attualmente, l'avanguardia di un approccio PGT non invasivo (niPGT) è in fase di studio. Forse, in futuro, i mezzi di coltura spesi dopo la fecondazione in vitro potrebbero essere analizzati per condurre test cromosomici e/o genetici. Si tratta di una prospettiva futura intrigante, poiché i costi per la clinica di fecondazione in vitro sarebbero inferiori e tutto il carico di lavoro comportato dalla biopsia embrionale verrebbe evitato. Tuttavia, l'affidabilità e la riproducibilità dell'analisi dei media spesi per i test genetici devono ancora essere valutate22,23,24, quindi occorre investire di più sforzi per definire e convalidare un protocollo che potrebbe soddisfare tutte le cliniche di fecondazione in vitro che eseguono PGT in tutto il mondo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
AG e RM hanno raccolto i dati e redatto il manoscritto. La DC analizzò i dati, redasse i risultati rappresentativi, eseguì le statistiche e rivedeva il manoscritto. FMU e LR hanno fornito una discussione critica dei risultati e dell'intero manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
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