Summary
胚盤胞生検およびガラス化は、移植前遺伝子検査を効率的に行うために必要とされる。5-7日目のゾナ・ペルシダの順次開きと7-8型栄養細胞の検索を伴うアプローチは、必要な操作の数と、最適でない環境条件への胚の暴露の両方を制限する。
Abstract
胚盤胞生検は、移植前遺伝子検査を伴うIVFサイクル中に信頼性の高い遺伝子診断を得るために行われる。次に、理想的なワークフローは、診断技術のターンアラウンドタイムに起因する安全で効率的なガラス化プロトコルを伴い、選択した胚を以下の自然サイクルで生理学的子宮内膜上に移す。ゾーナ・ペルシダの順次開きと5-10型血球細胞の検索(理想的には7-8)を包含する生検アプローチは、必要な操作の数と胚の暴露の両方を最適でない環境条件に制限する。適切なトレーニングの後、この技術は、生検のタイミング(約8分、1皿当たりの生検に基づく胚数に基づく3〜22分の範囲)、決定的な診断(約97.5%)の点で、異なるオペレータ間で再現可能であった。ガラス化された温められたユープロイド胚盤胞転移後の出生率(>40%)。生検、ガラス化および温暖化後の生存率は99.8%と高かった。温暖化から1.5時間での再膨張率は97%と高く、生検とガラス化(理想的には≤30分)、胚盤胞形態の質および生検の日の間のタイミングに大きく依存した。一般に、崩壊した胚盤胞を活性化する方が良い。したがって、非PGTサイクルでは、レーザー支援人工収縮が凍結保存前に胚の崩壊を誘発するために行われる可能性がある。最も有望な将来の視点は、胚性DNAの移植源としての胚盤胞培養後のIVF培養培地の非侵襲的分析である。しかし、この潜在的な前衛的な可能性はまだ調査中であり、信頼性の高いプロトコルを定義し、検証する必要があります。
Introduction
現代の人間発生学の主な目標は、刺激されたサイクルあたりの出生数を最大化し、妊娠を達成するためのコスト、時間、努力を削減することです。この目標を達成するためには、IVFサイクル中に得られたコホート内の生殖能力のある胚を同定するために、胚選択のための検証されたアプローチを採用すべきである。最新の証拠によると、胚盤胞培養1は、包括的な染色体試験およびガラス化温温化胚移植(ET)と組み合わされ、IVF効率を高めるための最も効率的なフレームワーク2である。明らかに、無気力検査は胚標本を必要とし、現在のところ、現在は、妊娠中に胚附属書(例えば、胎盤)に起源を与える胚盤胞のセクションから取り出される少数の細胞から主に表される。.核型解析を超えて、単一遺伝子変異も、移植前遺伝子検査(PGT;-A、構造染色体再配列のための-SR、単原性疾患の-M)として知られている臨床戦略の一部としてTE生検から評価される可能性があります。他の卵母細胞/胚生検法は、過去数十年にわたって理論的に採用され、すなわち極性体生検および胚盤胞生検を採用している。しかし、その手続き上の欠点(例えば、より高いワークロードと生殖への影響のリスク)と診断の制限(例えば、単一細胞分析の問題)が暗黙的にコスト、リスクとリスクの間の十分なバランスを妨げるので、その使用は、今日では減少しています。利点 (レビューについては、3を参照してください)。
本論文では、TE生検の主なプロトコルの1つを、その後のガラス化、温暖化および転送手順と共に徹底的に説明する。ここで概説されているワークフローは、ビジーな PGT ユニットに最適です。
我々のグループ4、5によって既に述べたように、手順は完全に膨張した胚盤胞のゾナ・ペルシダの逐次開きおよび少数のTE細胞の除去を含む(平均7-8)。3日目のレーザーアシストハッチングベースの胚盤胞生検法6と比較して、この手順は、胚盤胞生検やガラス化などの繊細な手順をタイムリーに行わなければならないIVFユニットの毎日のスケジュールを容易にする可能性があります。胚盤胞が完全な拡張に達するとすぐに、生検は除去するTE細胞を選択することによって行うことができ、それによって内細胞塊(ICM)のヘルニアのリスクを防ぎ、それ以外の場合は手順を困難にするであろう。文献では、胚盤胞生検の第3のプロトコルも記載されており、これは、胚が既に胚盤胞期に達した後に行われるレーザー支援孵化を伴い、手順5、7の数時間前に行われる。しかし、このアプローチはより時間がかかり、主に経験豊富なオペレータの手にTE生検を実装しているIVFユニットに適しており、適度に低い毎日のワークロードを考慮しています。
細胞内血漿中精子注射(ICSI)8は、IVFで遺伝子解析を行うことを目指す場合の統合技術であるべきである。同様に、胚盤胞段階に胚を安全に収穫するための適切な培養システムは、TE生検戦略の実施にとって極めて重要である。十分な数のインキュベーター、ならびに低酸素張力の使用は、この目的のために重要な前提条件であり、胚盤胞率9を損なわない。同時に、PGTサイクルを安全に管理するためには、効率的な凍結保存プログラムが必要です。過去10年間で、ガラス化の実施は、胚の凍結生存率を最大>99%10、11まで高めました。これは、遺伝子検査を行い、次の月経周期への胚移植を延期するのに十分な時間を提供し、非刺激的でおそらくより受容性の子宮内膜12に。
TE生検とガラス化の両方が厳しいスキルを必要とするタスクを要求しており、その有効性は経験の浅いオペレータによって異なる可能性があります。したがって、特定のトレーニング期間は、各オペレータが臨床的にこれらの手順を実行できるようにする前に提唱されます。さらに、凍結保存および生検手順の主要業績評価指標(KPI)を監視することにより、オペレータのスキルの維持を定期的に評価する必要があります。各IVFクリニックは、この目的に内部KPIを設定する必要があり、これは国際コンソーシアムによって公開されたものや参照ラボによって発表された結果を概算する必要があります。
TE生検、ガラス化温暖化および目撃手順は、3つの以前の出版物11、13、14で報告されているように関与するすべてのオペレータ間で標準化された私達の単位で検証された技術である。.
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Protocol
ここで説明するヒト胚盤胞生検のプロトコルは、G.EN.E.R.A. 人間研究倫理委員会のガイドラインに従う。
注:必要な材料については、材料の表を参照してください。さらに必要な材料は、実験室の履物および衣装、外科フェイスマスク、ヘアカバー、外科手袋、永久的な非毒性マーカー、鉗子および消毒剤を伴う。外科ガウン、使い捨て外科手袋、フェイスマスク、ヘアカバーの使用は汚染の危険を防ぐために必須である。すべての作業領域、およびプロセスに関与する機器は、任意の手順を開始する前に、実験室の消毒剤(例えば、Oosafe)で徹底的に洗浄する必要があります。使用されるすべての消耗品および媒体は無菌で、個別に包装されるか、または引用符で囲まれるべきである。生検およびチューブ用の専用ワークステーションを使用し、手順に関与するオペレータ(胚学者および目撃者)にのみエリアへのアクセスを制限することが示唆されています。
1. 生検手順前日の準備
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生検後の培養皿を準備します。
- IVF培養皿に20μL IVF培養培地(材料表)の6滴を置き、胚培養用の予め温められた鉱物油を6mLでオーバーレイする(材料の表)。
- 各滴にさらに10μLのIVF培養培地を加えます。制御された雰囲気で37°Cで一晩インキュベートする(5%O 2、6%CO2)。
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生検後に胚盤胞をすすいで用するIVF皿4ウェルプレートを調製する。
- 最初の2つのウェルに600 μLのIVF培養培地を配置し、胚培養用の予め温められた鉱物油を300μLでオーバーレイします。
- 制御された雰囲気で37°Cで一晩インキュベートする(5%O 2、6%CO2)。
- TEセルチューブに使用する各PCRチューブに1.5 μLのローディング溶液(材料の表)を分配し、それを回転させ、4°Cに保ちます。
2. 生検手術当日の準備
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生検皿を準備します。
- IVF培養皿に10μL HEPESバッファー培地(ヒト血清アルブミンを補充)(材料の表)を3滴を連続して置きます。
- 利用可能な胚盤胞の数に応じてステップ1.1.1を繰り返し(1皿あたり最大4回の胚盤胞)、胚培養用の予め温められた鉱物油の6 mLでオーバーレイする。
- 生検手順を行う前に、少なくとも1時間37°Cで皿をインキュベートします。
3. 胚盤胞の選択とグレーディング
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その拡張とICMおよびTEの形態学的外観に従って胚盤胞を等級付けする(図1)。
注:採点基準はガードナーとスクールクラフト15から適応されており、以前にCapalboらとCimadomoら4,11によって説明されています。- サイズと拡張グレードを定義します:完全に孵化した胚盤胞の場合はA、ハッチング胚盤胞の場合はB、完全に膨張した胚盤胞の場合はC、拡張されていない胚盤胞の場合はD(これらの胚は7日目までさらに拡張しなかった場合にのみ生検されます)。
- ICM グレードを定義する: いくつかの厳密にパックされたセルを持つ顕著な ICM の場合は 1。2 は、いくつかのが、大まかにパックされたセルで識別可能です。3 非常に少数の低品質の細胞と区別するのが難しい場合。
- TE グレードを次のように定義します: 1 複数の細胞を持つ適切に組織化された上皮;少数の細胞を持つ緩い上皮のための2;少数および/または大きい低品質の細胞のための3。
4. トロフェクトーダーム生検
- すべての実行可能な完全に拡張された胚盤胞(好ましくはサイズおよび拡張のためのC等級)にTE生検を行う。
- 各生検手順の保持と生検ピペットを設定します。生検ピペットのための推薦は次のとおりです:30 μmの内部直径、35°曲がる角度、曲がる0.75 mmの間隔の先端。
- 患者の詳細(女性の名前と姓、生年月日とID)で生検皿にラベルを付け、胚とサイクルIDで各ドロップに番号を付けます。永久的な非毒性マーカーを使用してください。
- 300 μmストリッピングピペットで胚盤胞を生検皿の最初の滴に移し、培養培地の過剰を除去するためにそれをすすいでください。その後、生検皿の2番目の滴で胚盤胞を動かす。
- 皿を反転顕微鏡に移動し、生検皿の3番目の滴からいくつかの媒体を吸引する生検ピペットをプライム。
- 20倍の倍率で、胚盤胞を向いてICMを明確に見る。7時に可視化すると(TE細胞を除去する対象となる領域とは反対)、保持ピペット上の胚を固定する(図2a)。
- ゾーナ・ペルシダに焦点を当て、ピペットと胚盤胞の両方が同じ焦点面上にあることを確認します。
- レーザーの目的(パルス時間0.3ミリ秒、6.5 μm)に切り替え、レーザーポインタをICMの反対側のゾーナ・ペルシダに置きます。2-3レーザーパルス(図2b)を通してゾーナペルシダをドリルします。
- 生検ピペットをゾナ・ペルシダに対して静かに押し、TE細胞を内部表面から切り離し、胚盤胞崩壊を促進するために、違反を通していくつかの媒体を吹き飛ばす(図2c)。
- TE が取り外されると(図 2d)、穴を通して入力し(必要に応じて、最後のレーザーパルスで広くする)、少数のTE細胞(理想的には7−8 13、16)を穏やかな吸引で生検ピペットに吸引する(図2e)。
- 標的細胞を伸ばすために適度な吸引を加えながら、生検ピペットを後方に少し動かす(図2f)。
- 吸引細胞の最も薄い部分にレーザーを向け、細胞間の接合部で2-5レーザーパルスを発射し、標的細胞を胚の体内から分離する(図2g)。レーザーパルスのタイミングとパルス数は、胚盤胞の品質に応じて調整することができます。しかし、細胞のリシスを避けるためにそれらを最小限に抑えるようにしてください。
- 胚盤胞からTE断片を分離した後(図2h)、胚盤胞から遠く離れた同じ生検滴に放出する。これは、生検ピペットに再び吸い込まれるのを防ぐために必要です(図2i)。
- 保持ピペットから胚盤胞を解放し、フラグメントがそれらに付着するのを防ぐために、速やかに両方のピペットを上げます。
- 品質管理を目的とした生検断片の写真を撮る(図3)。
注:単一の胚盤胞が手順ごとに生検される場合(生検皿ごとに4つまで)、胚間のクロスコンタミネーションを防ぐために新しいピペットで生検ピペットを変更します。 - 手順 4.1−4.13を繰り返します。
- 生検皿を層状の流れフードに戻します。
- 生検後の培養皿にカップルIDを付け、各ドロップに胚とサイクルIDを付けます。
- 目撃者の存在下で、きれいなIVF培地で胚盤胞をすすいで、最後に生検後の皿の対応する滴に移動します。
- 生検後の皿を制御された雰囲気(37°C、6%CO2、5%O2)でガラス化するまでインキュベーターに移動します。胚盤胞の再膨張を防ぐために、生検手順から30分以内にガラス化を行うことをお勧めします。
5. チューブ
注:全体の手順は、目撃者の存在下で、室温で層流フード内で行う必要があります。手順中は、PCRチューブを氷上の冷たいチューブラックに保管してください(補足図1)。
- PCRチューブに永久的な非毒性マーカーを貼ります。
注:ラベリングは、遺伝実験室の要求に応じて行われるべきである。一般に、患者の名前と姓(イニシャル)、カップルID、胚およびサイクルID(例えば、JD 12345 1.2の2番目のサイクルの胚N.1の場合、そのカップルIDは12345である)。胚IDは、チューブの本体上の文字でも報告されるべきです。 - 60mm x 15mm培養皿(チューブ皿)の蓋に生検胚の本状(補足図1)を貼り付け、生検洗浄液(材料表)を2回2回用意します。
- 140 μm ストリッピングピペット(補足図1)を、チューブ皿の2滴目から生検洗浄液でプライムする。
- TE 断片を簡単に視覚化するために、立体顕微鏡の下に生検皿を置きます。
- TE フラグメント上のいくつかの生検洗浄溶液を穏やかに放出します。その後、ストリッピングピペットにロードします。
- TE フラグメントをチューブ皿の生検洗浄液の 2 滴目に移動し、慎重に 2~3 回すすいでください。
- TE フラグメントを PCR チューブの底部 (以前は後にラベル付け) にローディング ソリューションで転送し、ストリッピング ピペットの先端で壁に触れないように注意してください。
- TE フラグメントごとにステップ 5.3 からステップ 5.7 までの手順を繰り返し、TE フラグメントごとに新しい毛細血管を使用するように注意してください。
- チューブ手順の最後に、すべてのPCRチューブをミニ遠心分離機に入れ、数秒間回転させます。
- 検体を-20°Cで保管し、検査のために参照遺伝子実験室に出荷します。
6. 胚盤胞ガラス化
- TE生検から30分以内に破傷球体を破壊し、再膨張を防ぐ。
- ガラス化プレートに女性の詳細とガラス化する必要がある胚盤胞の本証をラベル付けします。
- 女性の名前と姓、カップルID、それにロードされる胚のID、および手順の日付とガラス化サポートにラベルを付けます。非常に低い温度(-196 °C)でも完全性を維持する特別な凍結ラベルが使用されます。
- 室温で、ガラス化される各胚盤胞に対して0.3mLの平衡溶液(ES)(材料表)を分配する。
- 証人の存在下で、300 μmストリッピングピペットを使用してESで胚盤胞を動かします。
- 胚盤胞をESに13~15分間放置します。ボリュームの最初の収縮後、徐々に再膨張が観察されます。
- 液体窒素(LN2)で小さな冷却ラックを充填し、層流フードの下に置きます。
- 第2井戸に300μLのガラス化溶液(VS)(材料表)を分配する。胚盤胞が完全に再膨張した後、VS溶液中に1分間移し、ESを希釈するためにそれをすすいで下す。
- 証人の存在下で、ガラス化支持体に胚盤胞をロードし、VSの過剰を除去する世話をする。溶液の微妙なフィルムは、胚盤胞を囲む必要があります。
- LN2にガラス化支持体を突入させ、試料に近い気泡形成のリスクを低減するために精力的に動かします。
- ガラス化支持体をLN2に沈めたまま保護キャップを置き、保護キャップを設置します。
- 目撃者の存在下で、長期LN2貯蔵タンクでガラス化支持体を移動する。
7. 非生検胚盤胞の人工収縮
-
TE生検が行われなかった場合は、ガラス化の直前に胚盤胞を人工的に崩壊する(図4)。
- 培養皿をインキュベーターから反転顕微鏡に移動し、選択した胚に焦点を当てます。
- レーザー目的(あらかじめ設定されたパルス:0.3ミリ秒、6.5 μm)に切り替え、ICMの反対側にあるゾーナ・ペルシダをターゲットにしてから、ICMから安全な距離でTE細胞間の接合部に1~2のレーザーパルスを向けます。胚盤胞は5分以内に崩壊する必要があります。
- セクション6に記載されているように崩壊した胚盤胞のガラス化を進めます。
8. 転移性胚盤胞温暖化
- ETの日に、各ウェルに予め平衡化されたIVF培地の600μLを配置してET4ウェルプレートを調製する。制御された雰囲気で37°Cでインキュベート(5%O 2、6%CO2)、胚盤胞の温暖化を行います。
- 女性の名前と姓、カップルID、その中で温める胚のIDで暖かい料理にラベルを付けます。
- IVFワンウェル皿(補助図1)に解凍液(TS)の1mLを分配し、手順を開始する前に少なくとも1時間サーモスタットで37°Cに温めます。
- LN2で小さな冷却サポートを充填し、作業領域の近くに層流フードに置きます。
- 手順を開始する前に、ガラス化サポートに報告された胚盤胞情報を確認してください。すべての暗号は遺伝的報告書と一致し、温める胚盤胞は転移可能なものの中から選択されなければならない。手順中にミラーリング監視が必要です。
- 温めたTSを含むワンウェル皿をサーモスタットから取り出し、立体顕微鏡の下で加熱されたステージに置きます。
- 鉗子を使用してLN2内の保護キャップを引っ張ります。
- ガラス化サポートの先端を37°C TSに素早く突っ込む。
- 顕微鏡観察では、胚盤胞が先端から放出されるまで、ガラス化支持体を穏やかに動かす。
- 胚盤胞をTSで合計1分間放置し、TSの下部に保つことに注意を払います。
- 室温でガラス化板の最初の井戸に200μLの希釈溶液(DS)(材料の表)を分配する。
- 胚盤胞をDSに移し、ウェルの下部に置き、その上にいくつかのTSを放出してグラデーションの一種を作成します。3分間放置してください。
- 2つの異なった井戸(WS1およびWS2)の洗浄液(WS)の200 μLを分配する。
- 胚盤胞をWS1に移し、その上にいくつかのDS媒体を放出しながら、井戸の底に置きます。その後、胚盤胞をWS2に移し、1分間邪魔しないままにしておきます。
- 女性の名前と姓、カップルID、その中で培養される胚のIDで、温暖化後のETプレートにラベルを付けます。
- 証人の存在下で、温めた胚盤胞を、温暖化後ETプレートの予め平衡培養培地に移す。
- ETプレートの最初のウェルで胚盤胞をすすいで、2番目の井戸に入れます。
- 制御された雰囲気(37°C、6%CO 2、5%O2)で温めた後培養皿をインキュベーターに移し、その生存と再膨張を確認する前に、少なくとも1.5時間胚盤胞を培養する。
注:図5は、退化した、クライオが生き残ったが、再膨張および凍結生き残った、完全に拡張された胚盤胞の例を示す。
9. 胚移植
- ETを実行するには、層流フードの加熱された段階に皿を置き、胚が低倍率で顕微鏡の下に見えるようにする。
- IVF培養培地の約0.4mLを取る。シリンジ先端を内部カテーテルの受け入れ側にしっかりと固定し、0.1 mLまで培地を放出します。
- カテーテルに入る胚を観察するまで培養培地を吸引する(培地の最小量:10−15μL)。
- カテーテルをプラスチックケースに入れ、手術室に行き、内部カテーテルを外部ガイドに入します。
- 子宮に達したら、注射器プランジャーを押して胚を放出します。プランジャーが0.1 mLを読み取るまで、培地を非常にゆっくりと放出します。
- カテーテルを研究室に持ち帰り、胚が移されたことを顕微鏡で確認します。
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Representative Results
図6は、プロトコルを標準化し、各オペレータのパフォーマンスを監視するために採用することができる生検手順のすべての結果のスキームを表す。主な手続き上の結果は、生検/生検を完了するタイミングです。主な技術的結果は、決定的または決定的な診断をもたらす可能性のある遺伝子検査後に生成されたプロットの品質であり、後者は未診断の胚盤胞の再生検を必要とする。主な生物学的結果は、凍結生存と再膨張と温暖化後の変性の割合である。最後に、主な臨床結果は、ガラス化された温められた胚盤胞転移後の出生率である。3つの以前の研究では、技術、生物学的および臨床的成果11、13、16のセンターで定義されたKPIを報告しました。以下、生検のタイミングに関するKPIがどのように定義されたかを報告する。さらに、ユープロイド胚盤胞の温暖化後の挙動に対する生検とガラス化の間のタイミングのプテュートの影響も調べた。
2年間で、7人のオペレーターが合計1,544件の対流皮生検を実施しました(表1)。すべての生検胚盤胞は、ガラス化するまで生検後培養皿にインキュベーターに戻された。関連するすべてのデータは、リレーショナル データベースで収集されました。生検と生検とガラス化の間のすべてのタイミングは、IVF電子証人システムのソフトウェアから遡及的に得られた。その後、データがエクスポートされ、統計のために分析されました。
栄養刺激性生検およびガラス化温暖化後のユープロイド胚盤胞の凍結生存率は、N=571/572,99.8%であった。温暖化後1.5時間での再膨張率はN=556/571、97.4%であった。再拡張されていない15人の胚盤胞のうち、1つは子宮内で転移した後に生まれた出産をもたらした。ガラス化されたユープロイド単一胚盤胞転移後の出生率は、N=227/572,39.7%であった。
生検の理想的なタイミングの定義
表1は、実施された生検手順の関連データをまとめたものである。全体として、1.89±1.03(範囲1〜4)胚盤胞は、8.24±4.23分(範囲3〜22)の手順ごとに生検した。生検の平均タイミングは、1回の処置につき生検した胚盤胞の数の両方によって異なり、1つの胚だけを皿に置いた場合の最低5.78±2.94分(範囲3-16)から、胚が順次生検した場合の最大12.93±4.43分(範囲6-22)まで変化した。再4.もう一つの関連パラメータは、手順に関与するオペレータでした:最も専門家(N = 443手順)が最も速かった(7.41±3.6分、範囲3-22)、最も経験の少ない(N =42)が最も遅かった(14.19 ±4.24分、範囲6-22)。実際、「プロシージャごとに生検された胚盤胞の数」と「演算子」変数の両方を伴う一般化線形モデルは、R2 = 0.48とパワー=1の「生検のタイミング」を完全に説明します。 この分析は、胚だけが皿に置かれた場合に胚盤胞生検の手順に理想的に〜6分、2、3および4の胚盤胞に対して約9分、約12分、〜13分をそれぞれ定義するのに有用であった。明らかに、全体の手順はまた、胚を培養から生検皿に、後者から手術後の生検後の培養皿に移動し、順次生検間間で生検ピペットを変更することを伴う。
図7は、研究の学期に沿って各オペレータの生検の平均タイミングをプロットする(第1から第8)。点線の赤い線は、8.24 分の平均全体値を識別します。このようなグラフは、各開業医の平均性能を監視するのに有用である。例えば、最も専門家の演算子(1と2)は、このタイミングの一定の減少を示し、これは学習曲線の典型的な傾向を示唆しています。3から6までのすべての演算子は、代わりに、三半期全体の平均全体的な値の周りのパフォーマンスで十分に一定でした。彼らは所定の学期(例えば、7学期のオペレータ3、第6学期のオペレータ4、3rd学期のオペレータ5)からの平均値のピークを示したときはいつでも、彼らは彼らの性能を修正するために警告されました。オペレータ7(すなわち、最も経験の少ない)は、彼/彼女の訓練を終えたばかりの胚学者の典型的なタイミングを示した。おそらく、専門知識が増えるにつれて、ラボ内部の標準を満たす可能性があります。
重要なことに、生検の時間は、再拡張され、温暖化から1.5時間で再拡張されたユープロイド胚盤胞間で同様であった(9.52 ±4.23分、範囲3-22対10.5±5.68分、範囲4-22;t検定=0.37)。可能性が高い、移植された(N=229)および移植されていない(N=343)ガラス化温めたユープロイド胚盤胞はまた同等の生検タイミングを示した(9.77 ±4.15分、範囲3-22対9.41±4.36分、範囲3-22;t-test= 0.39)。おそらく、最大4人の胚盤胞を生検するタイミング≤22分は、温暖化後の胚の行動に影響を与えない。したがって、この値を最大しきい値として定義しました。
同様に、以前に報告された13(補足表1)のように、異なる生検演算子間の生体出生率に関して差は示されなかった。
各オペレータの性能を監視するためのもう一つの重要なパラメータは、診断後の決定的な結果の割合であり、各実験室の一般的な性能に可能な限り近い必要があります。理想的には、この率は2.5%を超えてはならないし、生検およびチューブ手順16の専門性の増加のために時間とともに減少する可能性があります。取り出すTE細胞の目標数は、2つの以前の研究13、16に従って7〜8である。この目的のために、品質管理の目的のために生検された断片の写真を撮ることをお勧めします(図3のいくつかの例を参照)。このような画像は、原因が断片の寸法/品質(すなわち、分子分析の低品質)、チューブ(すなわち、DNA増幅不良)またはいくつかの問題に対して、原因が有するかどうかを評価するために決定的な診断の場合にチェックされるかもしれません。遺伝実験室でのサンプルの処理。
生検とガラス化の理想的なタイミングの定義
研究期間において、572人のユープロイド胚盤胞は、ユープロイディの診断後に胚移植を受けるために温められた。図8Aは、生検とガラス化の間の増加するタイミングに分布する黒い円として各温められた胚盤胞を示し、調査中の結果に従って2つのグループに集積した:再膨張または再拡張から1.5時間以内に再膨張しない温暖 化。全ての胚盤胞(N= 117/117)は30分以内にガラス化し、 胚盤胞の97.6%(N=245/251)は31〜90分の間でガラス化し、95.1%(N=194/204)は、それぞれ90分を超えて再膨張した(再膨張率:0%、2.4%および4.9%)。したがって、生検とガラス化の間の時間の早期および後期閾値として30分と90分を設定しました。
図8Bは、3つの群(≤30分、31〜90分、>90分)の再膨張率を、胚盤胞の品質および移植前の発達の日に従ってさらにサブクラスタ化することを示す。特に質の悪い7日目筋細胞では、生検とガラス化の間のタイミングは、温暖化後の再膨張を達成するために重要なようです。具体的には、90分を超えてガラス化した胚盤胞と胚盤胞の生検日の両方について、温暖化後の再膨張のオッズ比は3.05(95%CI 1.01-9.4、p=0.05)であった。代わりに、これら 2 つのしきい値の間の期間 (31 ~ 90 分) は、影響を与える可能性がある灰色の領域を表していました。
再拡張されていない胚盤胞の15人中1人だけが転移後に生まれた。そこで、生検とガラス化の間のタイミングに応じて3群に集結した温めた単一胚盤胞転移後に達成された生体出生率を最後に調べた。最も高い生存率は、対ゲツトーダー生検から≤30分をガラス化したユープロイド胚盤胞を移すことによって達成された(N= 56/117,47.9%)。しかし、この結果は、31分から90分の間にガラス化された胚盤胞と比較した場合、統計的有意性に達しなかった(N = 92/251,36.7%;フィッシャーの正確なテスト = 0.06)、または胚盤胞が生検から90分(N=81/204、39.7%;フィッシャーの正確なテスト = 0.16)。したがって、胚盤胞の生殖能力に対する負の影響はごくわずかであるか、またはこのデータセット内のサンプルサイズ(N=572)が統計的有意性に達するには不十分であった。
図1:胚盤胞グレーディングのパラメータ。拡張:(A) 完全にハッチング、(B) ハッチングで、(C) 完全に展開され、(D)は展開されません。理想的な段階はCであり、この段階が7日目に達しない限り、胚盤胞Dは完全な拡張を達成するためにより多くの時間を与えられるべきである。内細胞質量(ICM)形態学的品質:1(いくつかの厳密にパックされた細胞で顕著)、2(いくつかのが、おおよそパックされた細胞で識別可能)および3(非常に少数の低品質の細胞で区別することは困難)。トロフィークトーダーム (TE)形態学的品質:1(複数の細胞を持つよく組織化された上皮)、2(少数の細胞を持つ緩い上皮)および3(少数および/または大きい低品質の細胞)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:順次ゾナ・ペルシダ(ZP)の概要開口部および対流皮(TE)胚盤胞生検のための細胞検索アプローチ。(a) 内細胞質量(ICM)を保持ピペットに近づけ、選択したTE細胞が取り出される場所から遠く離れた場所で胚盤胞をオリエンテします。保持ピペット上の胚盤胞を確保します。(b) 2-3 レーザーショットを通してZPを開きます。(c) 穴を通していくつかの文化メディアを吹き飛ばす;(d) 胚盤胞はZPから切り離される。(e)ZPを入力し、生検ピペットに5-10 TE細胞を吸引;(f) 生検ピペットを使用して後方に移動して、選択したフラグメントをストレッチし、細胞間の接合部を露出させます。(g) 細胞間の接合部で火災を起こし、TE細胞が胚盤胞の体内から放出されるまで断片を伸ばし続ける。(h) TE生検後の胚盤胞が崩壊した。(i) 品質管理のための生検断片の写真を撮り、遺伝実験室に送られるPCRチューブに移す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:生検断片の例:(a-c) 望ましいフラグメント;(d) lysed フラグメント;(e) 細胞の退化を伴う小さな断片;(f) 小さく、部分的に分解され、退化したフラグメント。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:人工収縮。(a) 内細胞塊(ICM)が対流細胞(TE)の標的部から遠く離れるように胚盤胞を向ける。(b) TE細胞間の接合部と外側に移動する2-3レーザーショットを連続して発射する。(c) 胚盤胞が崩壊するのを待ってから、ガラス化を開始する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:胚盤胞変性(a)の例は、凍結生存が、再拡張(b)およびクライオ生存および完全再拡張(c)1.5h後温暖化の例である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:オペレータのパフォーマンスを監視し、各実験室の内部の主要な業績指標を定義するために使用される可能性のある対ゲクトーダーム生検の異なる結果の概要。主な手続き上の結果は、生検のタイミングです。主な技術的結果は、得られた決定的な(ユーロイドまたは無気力)および決定的な診断(再生検が必要)の割合である。後者は、DNA増幅または低品質の分子データによって引き起こされる可能性があり、いずれも解釈不能な染色体コピー数プロファイルプロットをもたらす。主な生物学的結果は、生検、ガラス化および温暖化後の凍結生存および再膨張または変性の速度である。主な臨床結果は、ガラス化温められた胚盤胞転移後に達成される生出生または陰性妊娠の結果の割合である。注意して、手続き上の結果は、オペレータと手順ごとの生検に対する胚盤胞の数に排他的に依存するが、他のすべての結果は、生検オペレータから独立した他の結合者(例えば、ステップおよび演算子)から影響を受ける可能性がある。分子分析に関与し、胚盤胞の形態学的品質、生検の日)は、彼/彼女のパフォーマンスを適切に評価するために考慮されるべきである。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:8つの研究の学期全体でオペレータごとの生検の平均タイミング。この表は、8つの研究学期における各オペレータが手順ごとに生検した関連する手順数と胚盤胞の平均数をまとめたものです。各グラフ内の点線の赤い線は、生検の全体的な平均タイミング(8.24分)を表します。誤差余数は標準偏差です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:生検とガラス化の間の温暖化後の再膨張。(A)は、再膨張および再膨張した胚盤胞を1.5時間後に示す。各胚盤胞は、増加するタイミングにわたって黒い円で表される。垂直連続黒線は、早期しきい値として設定された 30 分、遅延しきい値として設定された 90 分を表します。(B)は、3つの群(生検とガラス化の間のタイミング:≤30分、31-90分、>90分)の再膨張率を、胚盤胞の質および生検の日に従ってさらにクラスター化することを示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| N の手順 | N胚盤胞は、手順ごとに生検 | 生検の平均タイミング ± SD, 範囲 (分) | |
| 演算子 1 | 443の | 2.01 ± 1.09、 1-4 | 7.41 ± 3.6、 3-22 |
| 195年 | 1 | 4.75 ± 1.96、 3-16 | |
| 111の | 2 | 7.83 ± 2.45、 3-18 | |
| 71歳 | 3 | 10.27 ± 2.41、 4-16 | |
| 66歳 | 4 | 11.48 ± 3.81, 6-22 | |
| 演算子 2 | 290の | 1.81 ± 0.98、 1-4 | 7.87 ± 4.13, 3-22 |
| 142の | 1 | 5.69 ± 3.32, 3-16 | |
| 89歳 | 2 | 8.48 ± 2.79, 3-18 | |
| 30歳 | 3 | 11.37 ± 3.72、 4-20 | |
| 29歳 | 4 | 13.1 ± 3.89, 9-22 | |
| 演算子 3 | 287の | 1.98 ± 1.05、 1-4 | 9.10 ± 4.65、 3-22 |
| 121の | 1 | 6 ± 2.19, 3-15 | |
| 89歳 | 2 | 9.6 ± 3.87, 3-22 | |
| 38歳 | 3 | 12.66 ± 4.55、 4-22 | |
| 39歳 | 4 | 14.13 ± 4.8、 6-22 | |
| 演算子 4 | 217の | 1.66 ± 0.87, 1-4 | 7.58 ± 3.45、 3-22 |
| 118の | 1 | 5.58 ± 1.96, 3-14 | |
| 66歳 | 2 | 8.92 ± 2.91, 4-22 | |
| 21歳 | 3 | 11.48 ± 2.34、 5-16 | |
| 12歳 | 4 | 13 ± 4.26, 6-19 | |
| オペレータ 5 | 144の | 2.03 ± 1.08、1-4 | 9.43 ± 4.24, 3-22 |
| 59歳 | 1 | 6.15 ± 2.5、 3-16 | |
| 43歳 | 2 | 10.07 ± 2.73、 6-16 | |
| 20歳 | 3 | 12.6 ± 2.89, 9-18 | |
| 22歳 | 4 | 14.09 ± 4.43、 6-22 | |
| オペレータ 6 | 121の | 1.67 ± 0.94、 1-4 | 7.79 ± 3.93, 3-22 |
| 70歳 | 1 | 6.19 ± 2.95、 3-16 | |
| 32歳 | 2 | 8.12 ± 1.72, 3-11 | |
| 9 | 3 | 12.78 ± 3.31, 9-18 | |
| 10歳 | 4 | 13.5 ± 6.19, 6-22 | |
| オペレータ 7 | 42歳 | 1.62 ± 0.94、 1-4 | 14.19 ± 4.24, 6-22 |
| 27歳 | 1 | 11.85 ± 5.53, 6-16 | |
| 6 | 2 | 16.5 ± 3.73, 11-22 | |
| 7 | 3 | 19.86 ± 3.34, 13-22 | |
| 2 | 4 | 19 ± 4.24, 16-22 | |
| 合計 | 1544年 | 1.89 ± 1.03、 1-4 | 8.24 ± 4.23, 3-22 |
| 732の | 1 | 5.78 ± 2.94, 3-16 | |
| 436の | 2 | 8.85 ± 3.14, 3-22 | |
| 196年 | 3 | 11.72 ± 3.70、4-22 | |
| 180年 | 4 | 12.93 ± 4.43, 6-22 |
表 1:生検オペレータによる各手順で生検した胚盤胞の総平均タイミングおよび平均数。生検の平均タイミングは、手順ごとに生検された胚盤胞の各連続数に従って示されている。「生検演算子」と「プロシージャごとに生検された胚盤胞数」変数の両方を含む一般化線形モデルは、「生検のタイミング」(R2 = 0.48、パワー=1)と完全に相関します。
補足図 1: 手順に必要な主なデバイスとサポート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表 1:ロジスティック回帰分析は、ガラス化温めたユープロイド胚盤胞転移後の生検オペレータと生誕との間に有意な関連を示さない。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
訓練期間を修了した経験豊富な熟練した胚学者のみが、TE生検と胚盤胞ガラス化の両方を行う必要があります。さらに、生検皿(補助図1)から生検後皿への生検胚盤胞の動き(補足図1)の手順を監視し、効率的なトレーサビリティを保証するために証人が必要です(補足図1))、次にガラス化プレート(補足図1)に、最後にガラス化支持体(補足図1)へ。ii) 生検皿からPCR管への生検TE細胞の移植(補足図1);iii)温暖化および転移ステップは診断後である。すべての監視手順の詳細については、以前に公開された障害モードおよび効果分析 (FMEA)14を参照してください。
本論文に記載されているすべての方法は、現地の規制(イタリア法40/2004)を尊重します。法律によると、実際には、カップルは、IVFサイクル中に生成した胚の健康状態について通知を要求することができます。この点に関して、PGT に関する詳細なインフォームド コンセントは、両方のパートナーから署名する必要があります。
本論文では、忙しい実験室ルーチンにおけるPGT用胚盤胞生検の実施方法について述べた。胚盤胞生検アプローチの適用は、IVFにおける過去10年間の重要な進歩であった。2004年17年にde Boerと同僚によって最初に報告され、切断段階および極性体生検アプローチ3と比較して、より効果的で有益な手順としてすぐに認識されている。この手順の価値は、主に技術的負担の低減に存在するが、開発18、19のこの段階で染色体モザイクの発生率が低いこともある。さらに、胚盤胞からの少数のTE細胞の除去は、切断段階胚からの1つの胚盤胞の除去よりも安全な手順として示唆されている。実際、無作為化非選択研究では、前者のアプローチは胚移植の可能性に影響を及ぼさなかったが、後者は有意〜20%の減少20を伴った。
主に世界的に使用されるプロトコルは、3日目の授精後にレーザー支援ゾナ開口部を伴います。異なる胚盤胞生検アプローチを比較するために、現在までに無作為化対照試験は行われていない。しかし、成長する胚の操作および暴露の数が最適でない環境条件に対して低いほど、プロトコルの潜在的な侵襲性が低くなることは合理的である。さらに、発症3日目からゾナ・ペルシダに穴が開くと、胚盤胞の増殖に影響を与え、TE細胞と共にICM細胞のヘルニアを引き起こす可能性があります。これらの理由から、我々は、胚盤胞が完全な拡張に達するとすぐに、シーケンシャルレーザー支援ゾナ違反とTE細胞の検索を伴うプロトコルを設定し、実装しました。また、1日5または6アシストハッチング5、7を伴う別のプロトコルが存在します。具体的には、ゾーナの掘削は、ICMに対して反対側の移植前開発の5日目または6日目に行われる。胚盤胞は、TE細胞の自発的なヘルニアを待ってインキュベーターに戻されます。明らかに、胚盤胞の定期的なモニタリングは、TEがヘルニアを開始するとすぐに生検し、ならびに胚が完全に孵化するのを防ぐために、次の時間に提供されなければならない。一方で、熟練していない開業医が簡単にこの代替生検戦略を実装できる場合、一方で、1日に複数の手順を実行する忙しい実験室には適していません。ここで説明する順次ゾナ開口部および胚盤胞生検プロトコルは、代わりに時間が短く、より短いハンズオン時間と実験室での毎日の活動をスケジュールする柔軟性を高め、専用の時間枠を調整することができます。生検とガラス化手順。
TE細胞は粘着性があるので生検に対して質の悪い胚盤胞はより複雑であるかもしれませんが、細胞間の接合部を露出させるフラグメントの伸張と調整されたレーザーショットが多いほど、胚盤胞の体内から除去するのに十分です。完全に孵化した胚盤胞は、ゾナ・ペルシダに囲まれた胚盤胞のように生検することができるが、彼らは活性化し、暖かくするのが難しいかもしれない。生検後の決定的な診断の場合、これまでに報告されたデータは、再生検および次のガラス化温暖化サイクル16、21から害が生じないように見えるという一致している。
ガラス化は、最新の文献のレビューとメタ分析から遅い凍結プロトコルよりも一貫して安全で、より効率的で、時間のかかる時間が報告されているので、胚盤胞凍結保存を行うために現在センターで使用されています。10.
手順が確立され、オペレータが適切に訓練されると、我々は胚盤胞生検とガラス化手順の両方のための理想的な手続き的タイミングを定義するために遡及分析を行いました(代表的な結果にここに要約)。最終的な結果として、我々は、温暖化後1.5時間で評価されたユーロイド胚盤胞の再膨張率と、ガラス化温めたユーロイド単一胚移植後に達成された生体出生率を評価した。生検後に胚盤胞変性の症例は認められず、温暖化後にわずか0.2%(N=1/572)の変性率が報告され、生検およびガラス化アプローチの信頼性が確認された。分析によると、胚盤胞生検を行うために必要なタイミングは、再膨張率として定義された温暖化後のユープロイド胚盤胞の生存率、または生きている出生率として定義される生殖電位のいずれにも影響を与えない。異なる専門知識を持つオペレーター間で様々なタイミングが観察されますが、手順が約8分で完了すると、プロシージャあたりの胚の数に応じて3~22分の範囲で、胚盤胞生検は安全であると考えることができます(ただし、データはありません。より長い間隔で行われる生検手順のために利用できる)。各単一のオペレータからの胚盤胞生検に費やされた平均時間は、KPIとして定期的に(少なくとも3ヶ月ごとに)監視されるべきである。それと共に、ガラス化された温めたユープロイド胚盤胞移植後の決定的な診断率および出生率も対処されるべきである。最後に、生検とガラス化の理想的なタイミングを概説した。胚盤胞が生検から30分以内にガラス化された場合、温暖化後の最も高い再膨張率を観察したので、この値を理想的な閾値として示唆する。具体的には、生検とガラス化の間の時間が長いほど、生検された胚盤胞は凍結保存される前に再膨張する。これは、特に質の悪いおよび/または日7胚盤胞11を扱う場合、クライオ生存に有害である可能性があります。それにもかかわらず、ガラス化が90分を超えて遅れても、臨床結果に有意な影響は認められなかった。したがって、散発的な場合には、このようなタイミングが許可される場合があります。
PGTの標本を取り出すために選択された方法は、胚の生存率に影響を与えるべきではなく、信頼性と有益な結果を伴うべきであり、臨床的に有効であるべきであり、それによってコストおよび実験室の作業負荷を減らすことを容易にする必要がある。胚盤胞生検は、これらすべての前提条件を満たす。それにもかかわらず、それはまだ設備の整った実験室で熟練したオペレータによって行われなければならない侵略的なプロシージャである。現在、非侵襲的PGT(niPGT)アプローチの前衛的なアプローチは調査中である。おそらく、将来的には、IVF後に使用された培養培養培養培養培養を分析して染色体や遺伝子検査を行う可能性があります。IVFクリニックのコストは低く、胚生検に伴うすべての作業負荷が回避されるので、これは興味深い将来の視点です。しかし、遺伝子検査のための使用済みメディア分析の信頼性と再現性は、まだ22、23、24を評価する必要がありますので、可能なプロトコルを定義し、検証するために、より多くの努力を投資する必要があります。世界中のPGTを行うすべてのIVFクリニックに適しています。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
AGとRMはデータを収集し、原稿を作成しました。DCはデータを分析し、代表的な結果を起草し、統計を行い、原稿を改訂した。FMUとLRは、結果と原稿全体の批判的な議論を提供しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
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