Summary
La biopsia de blastocisto y la vitrificación son necesarias para realizar pruebas genéticas preimplantacionales de manera eficiente. Un enfoque que implica la apertura secuencial de la zona pellucida y la recuperación de 7-8 células de trophectoderm en el día 5-7 post-inseminación limita tanto el número de manipulaciones requeridas como la exposición del embrión a condiciones ambientales subóptimas.
Abstract
La biopsia de blastocisto se realiza para obtener un diagnóstico genético fiable durante los ciclos de FIV con pruebas genéticas preimplantacionales. A continuación, el flujo de trabajo ideal implica un protocolo de vitrificación seguro y eficiente, debido al tiempo de respuesta de las técnicas de diagnóstico y para transferir el embrión o embriones seleccionados en un endometrio fisiológico en un siguiente ciclo natural. Un enfoque de biopsia que abarca la apertura secuencial de la zona pellucida y la recuperación de 5-10 células de trophectoderm (idealmente 7-8) limita tanto el número de manipulaciones requeridas como la exposición del embrión a condiciones ambientales subóptimas. Después del entrenamiento adecuado, la técnica fue reproducible entre diferentes operadores en términos de sincronización de la biopsia (8 min, que van 3-22 min en función del número de embriones a biopsia por plato), diagnósticos concluyentes obtenidos (97,5%) y las tasas de nacimientos vivos después de la transferencia de blastocisto euploide vitriloide (>40%). La tasa de supervivencia después de la biopsia, vitrificación y calentamiento fue tan alta como 99.8%. La tasa de reexpansión a 1,5 h del calentamiento fue tan alta como 97%, dependiendo en gran medida del momento entre la biopsia y la vitrificación (idealmente 30 min), la calidad morfológica del blastocisto y el día de la biopsia. En general, es mejor vitrifiar un blastocisto colapsado; por lo tanto, en ciclos no-PGT, la contracción artificial asistida por láser podría realizarse para inducir el colapso embrionario antes de la criopreservación. La perspectiva de futuro más prometedora es el análisis no invasivo de los medios de cultivo de FIV después del cultivo del blastocisto como fuente putativa de ADN embrionario. Sin embargo, esta vanguardia potencial todavía está en investigación y todavía es necesario definir y validar un protocolo fiable.
Introduction
El objetivo principal de la embriología humana moderna es maximizar el número de nacimientos vivos por ciclo estimulado y reducir los costos, el tiempo y los esfuerzos para lograr un embarazo. Para lograr este objetivo, se deben emplear enfoques validados para la selección de embriones para identificar embriones reproductivos competentes dentro de una cohorte obtenida durante un ciclo de FIV. Según las últimas pruebas, el cultivo de blastocisto1 combinado con pruebas cromosómicas exhaustivas y transferencia de embriones euploide (ET) calentada vitrificada es el marco más eficiente para aumentar la eficiencia de la FIV2. Claramente, las pruebas de aneuploidía requieren un espécimen embrionario, que en la actualidad se representa principalmente a partir de pocas células recuperadas del trophectoderrm (TE), es decir, la sección del blastocisto que da origen a los anexos embrionarios (por ejemplo, la placenta) durante el embarazo . Más allá del análisis del cariotipo, también se podrían evaluar mutaciones genéticas únicas a partir de una biopsia TE como parte de una estrategia clínica conocida como pruebas genéticas preimplantacionales (PGT; -A para aneuploidías, -SR para reordenamientos cromosómicos estructurales, -M para enfermedades monogénicas). Otros métodos de biopsia de ovocitos/embriones han sido teorizados y adoptados clínicamente a lo largo de las últimas décadas, a saber, biopsia de cuerpos polares y biopsia de blastomero. Sin embargo, su uso se reduce hoy en día, ya que sus inconvenientes procesales (por ejemplo, mayor carga de trabajo y riesgo de impacto reproductivo) y las limitaciones diagnósticas (por ejemplo, cuestiones de análisis de una sola célula) obstaculizan implícitamente un equilibrio suficiente entre los costos, los riesgos y beneficios (para una revisión ver3).
En este artículo, uno de los principales protocolos para la biopsia de TE se describe a fondo junto con los procedimientos posteriores de vitrificación, calentamiento y transferencia requeridos. El flujo de trabajo aquí descrito es ideal para una unidad PGT ocupada.
Como ya ha descrito anteriormente nuestro grupo4,5, el procedimiento implica la apertura secuencial de la zona pellucida de blastocistos completamente expandidos y la eliminación de pocas células TE (en promedio 7-8). En comparación con el método de biopsia de blastocisto basada en el sombreado asistida por láserdeldía 3, este procedimiento podría facilitar el horario diario de una unidad de FIV donde se deben realizar oportunamente procedimientos delicados, como la biopsia de blastocisto y la vitrificación. Tan pronto como el blastocisto alcanza su expansión completa, la biopsia se puede llevar a cabo seleccionando las células TE para extraer, evitando así el riesgo de hernia de la masa celular interna (ICM), lo que de otra manera haría que el procedimiento fuera un reto. En la literatura, también se ha descrito un tercer protocolo de biopsia de blastocisto, que implica la eclosión asistida por láser que se realiza una vez que el embrión ya ha alcanzado la etapa de blastocisto, pocas horas antes del procedimiento5,7. Sin embargo, este enfoque consume más tiempo y se adapta principalmente a las unidades de FIV que están implementando la biopsia TE en manos de operadores con experiencia limitada y en vista de una carga de trabajo diaria moderada-baja.
La inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)8 debe ser una técnica consolidada si se trata de realizar análisis genéticos en ficticia. Del mismo modo, un sistema de cultivo adecuado para cosechar embriones de forma segura en la etapa de blastocisto es crucial para la implementación de la estrategia de biopsia TE. Un número adecuado de incubadoras, así como el uso de baja tensión de oxígeno son requisitos previos clave para este fin, no comprometer la tasa de blastocisto9. Al mismo tiempo, se necesita un programa de criopreservación eficiente para gestionar de forma segura un ciclo de PGT. En la última década, la implementación de la vitrificación ha impulsado las tasas de criosupervivencia embrionaria hasta >99%10,11. Esto proporcionó tiempo suficiente para realizar pruebas genéticas y posponer la transferencia de embriones al siguiente ciclo menstrual, en un endometrio no estimulado y probablemente más receptivo12.
Tanto la biopsia de TE como la vitrificación son tareas exigentes que requieren habilidades estrictas y su eficacia puede variar entre operadores sin experiencia. Por lo tanto, se aboga un período de formación específico antes de permitir que cada operador realice estos procedimientos clínicamente; además, el mantenimiento de las habilidades de los operadores debe evaluarse periódicamente mediante el seguimiento de indicadores clave de rendimiento (KPI) para los procedimientos de criopreservación y biopsia. Cada clínica de FIV debe establecer KPI internos para este fin, que deben aproximarse a los publicados por consorcios internacionales y/o los resultados publicados por los laboratorios de referencia.
La biopsia TE, el calentamiento de la vitrificación y los procedimientos de testimonio son técnicas validadas en nuestra unidad, que se han estandarizado en todos los operadores involucrados según se informó en tres publicaciones anteriores11,13,14 .
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Protocol
El protocolo para la biopsia de blastocisto humano, aquí descrito, sigue las directrices del Comité Ético de Investigación Humana de G.EN.E.R.A.
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para conocer los materiales necesarios. El material adicional requerido incluye calzado y atuendo de laboratorio, mascarilla quirúrgica, cubierta capilar, guantes quirúrgicos, un marcador permanente no tóxico, fórceps y desinfectante. El uso de bata quirúrgica, guantes quirúrgicos desechables, máscara facial, cubierta del cabello es obligatorio para prevenir el riesgo de contaminación. Todas las áreas de trabajo, así como el equipo involucrado en el proceso, deben limpiarse a fondo con desinfectante de laboratorio (por ejemplo, Oosafe) antes de iniciar cualquier procedimiento. Todos los consumibles y medios utilizados deben ser estériles y envasados o alícuotas individualmente. Se sugiere utilizar una estación de trabajo dedicada para biopsia y tubos y limitar el acceso de la zona sólo a los operadores involucrados en el procedimiento (embriólogo y testigo).
1. Preparación el día antes del procedimiento de biopsia
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Prepare el plato de cultivo posterior a la biopsia.
- Colocar 6 gotas de medio de cultivo de FIV de 20 l (Tablade materiales)en un plato de cultivo de FIV y superponer con 6 ml de aceite mineral precalentado para el cultivo embrionario (Tablade materiales).
- Agregue otros 10 l de medio de cultivo de FIV a cada gota. Incubar durante la noche a 37oC en una atmósfera controlada (5% O2, 6% CO2).
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Prepare una placa de 4 pocillos de FIV para enrredar el blastocisto después de la biopsia.
- Colocar 600 l de medio de cultivo de FIV en los dos primeros pozos y superponer con 300 l de aceite mineral precalentado para el cultivo embrionario.
- Incubar durante la noche a 37oC en una atmósfera controlada (5% O2, 6% CO2).
- Dispensar 1,5 l de solución de carga (Tablade materiales)en cada tubo de PCR que se utilizará para tubos de células TE, girarlo y mantenerlo a 4 oC.
2. Preparación el día del procedimiento de biopsia
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Prepare el plato de la biopsia.
- Colocar 3 gotas de medio tampón HEPES de 10 ol (complementado con albúmina sérica humana) (Tablade materiales)en una fila en un plato de cultivo de FIV.
- Repita el paso 1.1.1 según el número de blastocistos disponibles (hasta 4 blastocistos por plato) y superponga con 6 ml de aceite mineral precalentado para el cultivo embrionario.
- Incubar el plato a 37 oC durante al menos 1 h antes de realizar el procedimiento de biopsia.
3. Selección y calificación de blastocistos
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Calificar el blastocisto según su expansión y la apariencia morfológica de ICM y TE (Figura1).
NOTA: Los criterios de calificación han sido adaptados de Gardner y Schoolcraft15 y descritos previamente por Capalbo et al. y Cimadomo et al.4,11.- Defina el tamaño y el grado de expansión como: A para un blastocisto completamente rayado, B para un blastocisto de eclosión, C para un blastocisto completamente expandido y D para un blastocisto no expandido (estos embriones se biopsian solo si no se expandieron más hasta el día 7).
- Definir grado ICM: 1 para ICM notable con varias células estrictamente empaquetadas; 2 para discernible con varias células pero aproximadamente embaladas; 3 para difícil de distinguir con muy pocas células de baja calidad.
- Definir el grado TE de la siguiente manera: 1 para epitelio bien organizado con varias células; 2 para epitelio suelto con pocas células; 3 para pocas y/o grandes células de baja calidad.
4. Biopsia de trofhectoderm
- Realizar una biopsia de TE en todos los blastocistos completamente expandidos viables (preferiblemente grado C para el tamaño y la expansión).
- Establezca pipetas de sujeción y biopsia para cada procedimiento de biopsia. Las recomendaciones para la pipeta de biopsia son las siguientes: diámetro interno de 30 m, ángulo de curvatura de 35o, punta de distancia de 0,75 mm para doblar.
- Etiquete el plato de biopsia con los detalles del paciente (nombre y apellidos de la mujer, fecha de nacimiento e identificación) y luego numera cada gota con embriones e identificaciones de ciclo. Utilice un marcador permanente no tóxico.
- Transfiera el blastocisto con una pipeta de decapado de 300 m a la primera gota de la placa de biopsia y enjuáguelo para eliminar el exceso de medio de cultivo. A continuación, mueva el blastocisto en la segunda gota de la placa de biopsia.
- Mueva el plato al microscopio invertido y prepare la pipeta de biopsia que aspira algún medio de la tercera gota de la placa de biopsia.
- Con aumento 20x, oriente el blastocisto para tener una visión clara del MIC. Cuando se visualice a las 7 en punto (frente al área que se dirigirá para eliminar las células TE), fije el embrión en la pipeta de retención (Figura2a).
- Concéntrese en la zona pellucida y compruebe que tanto las pipetas como el blastocisto están en el mismo plano focal.
- Cambie al objetivo láser (tiempo de pulso 0,3 ms, 6,5 m) y coloque el puntero láser en la zona pellucida en el lado opuesto de ICM. Taladre la zona pellucida a través de 2 x 3 pulsos láser (Figura2b).
- Presione suavemente la pipeta de biopsia contra la zona pellucida y sople algún medio a través de la brecha para separar las células TE de su superficie interna y acelerar el colapso del blastocisto (Figura2c).
- Una vez que el TE se separa (Figura2d), entrar a través del agujero (si es necesario, hacerlo más ancho con un último pulso láser) y aspirar algunas células TE (idealmente 7-813,16) en la pipeta con succión suave (Figura2e).
- Mueva ligeramente la pipeta de biopsia hacia atrás mientras aplica una succión moderada para estirar las células diana (Figura2f).
- Dirija el láser hacia la parte más delgada de las células aspiradas y dispare 2 x 5 pulsos láser en las uniones entre las células para separar las células diana del cuerpo del embrión (Figura2g). El tiempo de los pulsos láser y el número de pulsos se pueden ajustar de acuerdo con la calidad del blastocisto; sin embargo, trate de minimizarlos para evitar la lisis celular.
- Después de la separación del fragmento de TE del blastocisto (Figura2h),suéltelo en la misma caída de biopsia lejos del blastocisto. Esto es necesario para evitar que se succionen de nuevo en la pipeta de biopsia (Figura2i).
- Suelte el blastocisto de la pipeta de sujeción y levante rápidamente ambas pipetas para evitar que el fragmento se pegue a ellas.
- Tome una foto del fragmento biopsiado para el control de calidad (Figura 3).
NOTA: Si se va a biopsiar más de un blastocisto por procedimiento (hasta cuatro por plato de biopsia), cambie la pipeta de biopsia por una nueva para evitar la contaminación cruzada entre embriones. - Repita los pasos 4.1 a 4.13.
- Mueva la antena de biopsia de nuevo a la capucha de flujo laminar.
- Etiquete el plato de cultivo post-biopsia con la identificación de la pareja, y cada gota con el embrión y la identificación del ciclo.
- En presencia de un testigo, enjuague el blastocisto en un medio limpio de FIV y, por último, muévalo a su correspondiente gota de la placa post-biopsia.
- Mover la placa post-biopsia a la incubadora en una atmósfera controlada(37 oC, 6% CO 2, 5% O2) hasta la vitrificación. Es aconsejable realizar vitrificación dentro de los 30 minutos del procedimiento de biopsia, para evitar la reexpansión del blastocisto.
5. Tubos
NOTA: Todo el procedimiento debe llevarse a cabo en presencia de un testigo y en el interior de la campana de flujo laminar a temperatura ambiente. Durante el procedimiento, mantenga los tubos PCR en un estante de tubo frío sobre hielo (Figurasuplementaria 1).
- Etiquete los tubos PCR con un marcador permanente no tóxico.
NOTA: El etiquetado debe realizarse según lo solicitado por el laboratorio genético. Generalmente, el nombre y apellidodel del paciente (iniciales), la identificación de pareja, el embrión y la identificación del ciclo (por ejemplo: JD 12345 1.2 para el embrión N.1 del 2o ciclo perteneciente a Jane Doe cuya identificación de pareja es 12345). La identificación del embrión debe notificarse también en letras en el cuerpo del tubo. - Etiquete la tapa de un plato de cultivo de 60 mm x 15 mm (plato de tubo) con los ID de los embriones biopsiados (Figurasuplementaria 1) y prepare dos gotas de 10 ol de solución de lavado de biopsia (Tablade materiales)en ella.
- Prepara la pipeta de desmontaje de 140 m (FiguraSuplementaria 1) con una solución de lavado de biopsia de la segunda gota de la placa de tubo.
- Coloque la antena de biopsia debajo del estereomicroscopio para visualizar fácilmente los fragmentos de TE.
- Suelte suavemente alguna solución de lavado de biopsia sobre el fragmento de TE; luego, cárguelo en la pipeta de desmontaje.
- Mueva el fragmento de TE a la segunda gota de solución de lavado de biopsia en la placa de tubo y enjuáguelo cuidadosamente de 2 a 3 veces.
- Transfiera el fragmento de TE a la parte inferior del tubo PCR (previamente etiquetado después de él) con solución de carga, prestando atención para evitar tocar sus paredes con la punta de la pipeta de desmontaje.
- Repita el procedimiento del paso 5.3 al paso 5.7 para cada fragmento de TE, prestando atención a utilizar un nuevo capilar para cada fragmento de TE.
- Al final del procedimiento de tubería, poner todos los tubos PCR en una mini centrífuga, y girarlos durante unos segundos.
- Almacene las muestras a -20 oC hasta que las envíe al laboratorio genético de referencia para su análisis.
6. Vitrificación de Blastoquistes
- Vitrify congeló blastocistos en un radio de 30 minutos de la biopsia de TE para evitar su reexpansión.
- Etiquete la placa de vitrificación con los detalles de la mujer y los documentos de identificación de los blastocistos que deben ser vitrificados.
- Etiquetar los soportes de vitrificación con el nombre y apellidos de la mujer, el documento de identidad de pareja, el documento de identidad del embrión que se cargará en él, así como la fecha del procedimiento. Se utilizan crioetiquetas especiales que preservan su integridad incluso a muy baja temperatura (-196 oC).
- A temperatura ambiente, dispensar 0,3 ml de solución de equilibrio (ES) (Tablade materiales)para cada blastocisto que se vitrifique.
- En presencia de un testigo, mueva el blastocisto en ES utilizando la pipeta de desmontaje de 300 m.
- Deje el blastocisto en el ES durante 13-15 min. Después de una contracción inicial del volumen, se observará una re-expansión gradual.
- Llene un pequeño estante de enfriamientocon nitrógeno líquido (LN 2) y colóquelo debajo de la campana de flujo laminar.
- Dispensar 300 l de solución de vitrificación (VS) (Tablade materiales)en el segundo pozo. Después de la reexpansión completa del blastocisto, transfiéralo en la solución VS durante 1 min y enjuáguelo para diluir el ES.
- En presencia de un testigo, cargue el blastocisto en el soporte de vitrificación y encárguese de eliminar el exceso de VS. Una película sutil de solución debe rodear el blastocisto.
- Sumergir el soporte de vitrificación en LN2 y moverlo enérgicamente con el fin de reducir el riesgo de formación de burbujas cerca de la muestra.
- Coloque la tapa protectora mientras mantiene el soporte de vitrificación sumergido en el LN2.
- En presencia de un testigo, mueva el soporte de vitrificación en un tanque de almacenamiento LN2 a largo plazo.
7. Contracción artificial de blastocistos no biopsiados
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Si no se realiza ninguna biopsia te, colapse artificialmente los blastocistos inmediatamente antes de la vitrificación (Figura4).
- Mueva el plato de cultivo de la incubadora al microscopio invertido y concéntrese en el embrión seleccionado.
- Cambie al objetivo láser (pulso preconfigurado: 0,3 ms, 6,5 m), apunte a la zona pellucida en el lado opuesto del MIC y, a continuación, dirija 1–2 pulsos láser a las uniones entre las células TE a una distancia segura del MIC. Los blastocistos deben colapsar en menos de 5 min.
- Proceda con la vitrificación del blastocisto colapsado como se describe en la sección 6.
8. Calentamiento transferible de blastocisto
- El día del ET, prepare la placa ET de 4 pocillos colocando 600 ml de medio de cultivo de FIV preequilibrado para cada pocal. Incubar a 37oC en una atmósfera controlada (5% O2, 6% CO2), mientras se realiza el calentamiento del blastocisto.
- Etiqueta el plato de calentamiento con el nombre y apellido de la mujer, identificación de pareja, identificación del embrión que se calentará en él.
- Dispensar 1 ml de la solución de descongelación (TS) (Tablade materiales)en un plato de un solo pozo de FIV (Figurasuplementaria 1) y calentarla a 37 oC en un termostato durante al menos 1 h antes de iniciar el procedimiento.
- Llene un pequeño soporte de refrigeración con LN2 y colóquelo en la campana de flujo laminar cerca del área de trabajo.
- Antes de iniciar el procedimiento, compruebe la información de blastocisto que se indica en el soporte de vitrificación. Todos los ID deben coincidir con el informe genético y el blastocisto para calentar debe ser elegido entre los transferibles. Se requiere un testigo durante el procedimiento.
- Saque el plato de un solo pozo que contiene TS caliente del termostato y colóquelo en un escenario calentado bajo el estereomicroscopio.
- Tire de la tapa protectora dentro del LN2 usando fórceps.
- Sumérgete rápidamente en la punta del soporte de vitrificación en el TS de 37oC.
- Bajo observación microscópica, mueva suavemente el soporte de vitrificación hasta que el blastocisto se libere de la punta.
- Deje el blastocisto durante un total de 1 min en el TS, prestando atención para mantenerlo en la parte inferior del TS.
- A temperatura ambiente dispensa 200 l de solución de dilución (DS) (Tablade materiales)en el primer pozo de la placa de vitrificación.
- Transfiera el blastocisto a DS y colóquelo en la parte inferior del pozo mientras libera un poco de TS en la parte superior del mismo para crear una especie de gradiente. Déjalo durante 3 min.
- Dispensar 200 l de solución de lavado (WS) en 2 pozos diferentes (WS1 y WS2).
- Transfiera el blastocisto a WS1 y colóquelo en la parte inferior del pozo mientras libera algún medio DS en la parte superior del mismo. A continuación, transfiera el blastocisto a WS2 y déjelo sin perturbaciones durante 1 min.
- Etiquetar la placa ET post-calentamiento con el nombre y apellido de la mujer, identificación de pareja, identificación del embrión que se cultivará en ella.
- En presencia de un testigo, transfiera el blastocisto calentado al medio de cultivo preequilibrado en la placa ET post-calentamiento.
- Enjuague el blastocisto en el primer poceto de la placa ET y colóquelo en el segundo pozo.
- Transfiera el plato de cultivo post-calentamiento a la incubadora en una atmósfera controlada (37 oC, 6% CO2, 5% O2) y escene el blastocisto durante al menos 1,5 horas antes de comprobar su supervivencia y reexpansión.
NOTA: La Figura 5 muestra ejemplos de blastocistos degenerados, crio-sobrevividos pero no re-expandidos y crio-sobrevividos y completamente expandidos.
9. EmbryoTransfer
- Para realizar ET, coloque el plato en la etapa calentada de la campana de flujo laminar, para que el embrión sea visible bajo el microscopio con un aumento bajo.
- Tome aproximadamente 0,4 ml de medio de cultivo de FIV. Fije firmemente la punta de la jeringa en el extremo receptor del catéter interno y luego suelte el medio hasta 0,1 ml.
- Aspirar el medio de cultivo hasta observar los embriones que entran en el catéter (cantidad mínima de medios: 10-15 l).
- Coloque el catéter en la caja de plástico y vaya al quirófano y coloque el catéter interno en la guía externa.
- Una vez que haya llegado al útero, empuje el émbolo de la jeringa para liberar el embrión. Suelte muy lentamente el medio hasta que el émbolo esté leyendo 0,1 ml.
- Lleve el catéter de vuelta al laboratorio y compruebe bajo el microscopio que el embrión ha sido transferido.
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Representative Results
La Figura 6 representa un esquema de todos los resultados de un procedimiento de biopsia que se puede adoptar para estandarizar el protocolo y monitorear el rendimiento de cada operador. El principal resultado procedimental es el momento para completar la biopsia/biopsias; el principal resultado técnico es la calidad de la trama producida después de pruebas genéticas que podrían resultar en un diagnóstico concluyente o no concluyente, el último de los cuales requiere una nueva biopsia del blastocisto no diagnosticado; el principal resultado biológico es la tasa de criosupervivencia y reexpansión frente a la degeneración después del calentamiento; por último, el principal resultado clínico es la tasa de nacimientos vivos después de la transferencia de blastocisto vitrito. En tres estudios anteriores informamos de los KPI definidos en los centros para los resultados técnicos, biológicos y clínicos11,13,16. A partir de ahora, informamos cómo se definió el KPI para el momento de la biopsia. Además, también se investigó la influencia putativa del tiempo entre la biopsia y la vitrificación en el comportamiento post-calentamiento de los blastocistos euploides.
En un período de 2 años, 7 operadores llevaron a cabo un total de 1.544 procedimientos de biopsia de trofoctoderm (Tabla 1). Todos los blastocistos biopsiados fueron trasladados de nuevo a la incubadora en un plato de cultivo post-biopsia hasta la vitrificación. Todos los datos relevantes se recopilaron en una base de datos relacional. Todos los tiempos de la biopsia y entre la biopsia y la vitrificación se obtuvieron retrospectivamente del software del sistema de testimonio electrónico de FIV. Los datos se exportaron y analizaron para obtener estadísticas.
La tasa de criosupervivencia de los blastocistos euploides después de la biopsia de trophectodermo y el calentamiento de la vitrificación fue de N a 571/572, 99,8%. La tasa de re-expansión a 1,5 h después del calentamiento fue de N a 556/571, 97,4%. Entre los 15 blastocistos no re-expandidos, uno resultó en un nacimiento vivo después de ser transferido en el útero. La tasa de natalidad en vivo después de la transferencia de blastocisto de euploide vitriloide vitrificada fue de N.o 227/572, 39,7%.
Definición del momento ideal de la biopsia
La Tabla 1 resume los datos relevantes de los procedimientos de biopsia realizados. En general, se biopsiaron 1,89 a 1,03 (rango 1-4) por procedimiento en 8,24 a 4,23 min (rango 3-22). El momento medio de la biopsia varió tanto por el número de blastocistos biopsiados por procedimiento, de un mínimo de 5,78 a 2,94 min (rango 3-16) cuando sólo se colocó un embrión en el plato hasta un máximo de 12,93 x 4,43 min (rango 6-22) cuando los embriones biopsiamos secuencialmente re 4. Otro parámetro relevante fue el operador implicado en el procedimiento: el más experto (procedimientos N 443) fue el más rápido (7,41 a 3,6 min, rango 3-22), mientras que el menos experimentado (N 42) fue el más lento (14,19 a 4,24 min, rango 6-22). De hecho, un modelo lineal generalizado que implica tanto el "número de blastocistos biopsiados por procedimiento" como las variables de "operador" explica perfectamente el "timing de la biopsia" con un R2 a 0,48 y una potencia 1. Este análisis fue útil para definir que idealmente 6 min es suficiente para un procedimiento de biopsia de blastocisto cuando sólo se coloca un embrión en el plato, mientras que 9 min, 12 min y 13 min para 2, 3 y 4 blastocistos, respectivamente. Claramente, todo el procedimiento implica también mover los embriones del cultivo al plato de biopsia y de este último a la placa de cultivo post-biopsia después del procedimiento, así como cambiar la pipeta de biopsia entre biopsias secuenciales.
La Figura 7 traza el momento medio de la biopsia para cada operador a lo largo de los trimestres del estudio (del 1 o al 8o). La línea roja punteada identifica el valor total medio de 8,24 min. Este gráfico es útil para supervisar el rendimiento medio de cada practicante. Por ejemplo, los operadores más expertos (1 y 2) mostraron una disminución constante de este tiempo, lo que sugiere una tendencia típica de una curva de aprendizaje. Todos los operadores de 3 a 6 fueron en cambio lo suficientemente constantes en su desempeño en torno al valor global medio en los trimestres. Cada vez que mostraban un pico en el valor medio de un trimestre dado (por ejemplo, el operador 3 en el 7o trimestre, el operador 4 en 6trimestre, el operador 5 en el tercertrimestre), se les advirtió con el fin de revisar su rendimiento. El operador 7 (es decir, el menos experimentado) mostró tiempos típicos de un embriólogo que acaba de terminar su formación. Posiblemente, cumplirá con los estándares internos del laboratorio a medida que la experiencia aumentaría.
Es importante destacar que el tiempo de la biopsia fue similar a través de blastocistos euploides re-expandidos y no re-expandidos a 1,5 h del calentamiento (9,52 x 4,23 min, rango de 3-22 frente a 10,5 a 5,68 min, rango 4-22; prueba t a 0,37). Es probable que las biopsias de euploide suploide sin implantación (N-229) y no implantadas (N a 343) también mostraron biopsias comparables (9,77 x 4,15 min, rango 3-22 frente a 9,41 a 4,36 min, rango 3-22; prueba t a 0,39). Posiblemente entonces, un tiempo de 22 minutos para biopsiar hasta 4 blastocistos no afecta el comportamiento embrionario después del calentamiento. Por lo tanto, definimos este valor como umbral máximo.
Del mismo modo, no se mostró ninguna diferencia en términos de tasa de natalidad en vivo entre los diferentes operadores de biopsia, como ya se informó anteriormente13 (TablaSuplementaria 1).
Otro parámetro importante para monitorear el rendimiento de cada operador es la tasa de resultados no concluyentes después del diagnóstico, que debe ser lo más cerca posible del rendimiento general de cada laboratorio. Idealmente, esta tasa no debe exceder el 2,5% y podría disminuir con el tiempo debido a una creciente experiencia en biopsia y procedimientos de tuberías16. El número objetivo de células TE a recuperar es 7-8 según dos estudios anteriores13,16. Con este fin, se sugiere tomar una foto del fragmento biopsiado con fines de control de calidad (véanse algunos ejemplos de la Figura3). Dicho cuadro podría comprobarse en caso de diagnósticos no concluyentes para evaluar si la causa era imputable a la dimensión/calidad del fragmento (es decir, baja calidad del análisis molecular), al tubo (es decir, fallo de amplificación del ADN) o a algunos problemas en el el procesamiento de la muestra en el laboratorio genético.
Definición del momento ideal entre biopsia y vitrificación
En el período de estudio, 572 blastocistos euploides se calentaron para someterse a una transferencia de embriones después de un diagnóstico de euploidía. La Figura 8A muestra cada blastocisto calentado como un círculo negro distribuido a través del tiempo creciente entre biopsia y vitrificación y agrupado en dos grupos de acuerdo con el resultado bajo investigación: re-ampliado o no re-expandido dentro de 1.5 h de Calentamiento. Todos los blastocistos (N 117/117) vitrificados en 30 min, 97,6% (N -245/251) de los blastocistos vitrificados entre 31-90 min, y 95,1% (N -194/204) de los blastocistos vitrificados más allá de 90 min re-ampliados, respectivamente (sin tasas de reexpansión: 0%, 2,4% y 4,9%). Por lo tanto, establecemos 30 min y 90 min como los umbrales temprano y tardío de tiempo entre biopsia y vitrificación.
La Figura 8B muestra la tasa de re-expansión en los tres grupos (30 min, 31-90 min, >90 min) subagrupados según la calidad del blastocisto y el día del desarrollo preimplantacional. Especialmente para la mala calidad y/o el día 7 blastocistos, el momento entre la biopsia y la vitrificación parece crucial para lograr una reexpansión después del calentamiento. Específicamente, la relación de probabilidades de reexpansión después del calentamiento corregida tanto para la calidad del blastocisto como para el día de la biopsia en blastocistos vitrificados en 30 minutos de biopsia frente a blastocistos vitrificados más allá de 90 min fue de 3,05 (95% CI 1,01-9,4, p-0,05). En su lugar, el período entre estos dos umbrales (31-90 min) representaba un área gris que podría o no tener un impacto.
Sólo 1 de cada 15 blastocistos no re-expandidos resultó en un nacimiento vivo después de la transferencia. Por lo tanto, por último investigamos la tasa de natalidad en vivo alcanzada después de la transferencia de blastocisto de euploide calentado agrupado en los tres grupos de acuerdo con el momento entre la biopsia y la vitrificación. La tasa de nacimientos vivos más alta se logró mediante la transferencia de blastocistos euploides vitrificados a 30 min de la biopsia de trofoctoderm (N 56/117, 47,9%). Sin embargo, este resultado no alcanzó significación estadística en comparación con el mismo resultado obtenido, ya sea con blastocistos vitrificados entre 31 y 90 min (N a 92/251, 36,7%; La prueba exacta de Fisher es 0,06), o con blastocistos vitrificados >90 min de la biopsia (N-81/204, 39.7%; Prueba exacta de Fisher 0,16). Por lo tanto, o bien un efecto negativo sobre la competencia reproductiva de blastocisto es insignificante o el tamaño de la muestra en este conjunto de datos (N -572) fue insuficiente para alcanzar la significación estadística.
Figura 1: Parámetros para la clasificación de blastocistos. Expansión: (A) completamente sombreada, (B) en sombreado, (C) completamente expandida y (D) no expandida. La etapa ideal es C, mientras que un blastocisto D debe tener más tiempo para lograr la expansión completa, a menos que esta etapa se alcance en el día 7; Masa celular interna (ICM) calidad morfológica: 1 (notable con varias células estrictamente embaladas), 2 (discernible con varias células pero aproximadamente embaladas) y 3 (difícil de distinguir con muy pocas células de baja calidad); trofoctodermo (TE) calidad morfológica:1 (epitelio bien organizado con varias células), 2 (epitelio suelto con pocas células) y 3 (pocas y/o grandes células de baja calidad). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resumen de la zona pellucida secuencial (ZP) apertura y trofoctodermo (TE) método de recuperación de células para la biopsia de blastocisto. (a ) Oriente el blastocisto con la masa celular interna (ICM) cerca de la pipeta de retención y lejos del punto donde se recuperarán las células TE seleccionadas. Fije el blastocisto en la pipeta de sujeción; (b) abrir el ZP a través de 2-3 tomas láser; (c) soplar algunos medios de cultivo a través del agujero; (d) el blastocisto se separará del ZP; (e) entrar en el ZP y chupar 5-10 células TE en la pipeta de biopsia; (f) retroceder con la pipeta de biopsia para estirar el fragmento seleccionado y exponer las uniones entre las células; (g) disparar en las uniones entre las células y continuar estirando el fragmento hasta que las células TE se liberan del cuerpo del blastocisto; (h) el blastocisto después de la biopsia de TE se colapsa; (i) tomar una foto del fragmento de biopsia para el control de calidad y transferirlo al tubo de PCR que se enviará al laboratorio genético. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de fragmentos de biopsia: (a-c) fragmentos deseables; (d) fragmento lysed; (e) pequeño fragmento con células degeneradas; (f) fragmento pequeño, parcialmente lysed y degenerado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Contracción artificial. (a ) Orientar el blastocisto de modo que la masa celular interna (ICM) esté lejos de la sección objetivo del trophectoderm (TE); (b) Disparar 2-3 disparos láser en una fila en las uniones entre las células TE y moverse hacia afuera; (c) Espere a que el blastocisto se derrumbe antes de iniciar la vitrificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplos de degeneración de blastocisto (a), criosupervivencia pero sin reexpansión (b) y criosupervivencia y reexpansión completa (c) 1,5 h despuésdel calentamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Resumen de los diferentes resultados de la biopsia de trofoctodermo que podrían utilizarse para monitorear el rendimiento de un operador y definir los indicadores clave de rendimiento internos de cada laboratorio. El principal resultado procedimental es el momento de la biopsia. El principal resultado técnico es la tasa de diagnósticos concluyentes (euploide o aneuploide) e inconclusos (se requiere rebiopsia) obtenidos; esto último podría ser causado por amplificación del ADN o datos moleculares de baja calidad, lo que resulta en gráficas de perfil de número sómómero no interpretables. El principal resultado biológico es la tasa de criosupervivencia y reexpansión o degeneración después de la biopsia, vitrificación y calentamiento. El principal resultado clínico es la tasa de nacimientos vivos o resultados negativos del embarazo logrados después de la transferencia de blastocisto vitrito sorcido. Cabe destacar que, si bien el resultado del procedimiento depende exclusivamente del operador y del número de blastocistos a la biopsia por procedimiento, todos los demás resultados podrían verse afectados por otros confundistas independientes del operador de la biopsia (por ejemplo, los pasos y los operadores implicado en el análisis molecular, la calidad morfológica del blastocisto, el día de la biopsia) que debe ser contabilizado para evaluar adecuadamente su rendimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Tiempo medio de la biopsia por operador en los 8 trimestres de estudio. El cuadro resume el número relacionado de procedimientos y el número medio de blastocistos biopsiados por procedimiento por cada operador en los 8 trimestres de estudio. La línea roja punteada dentro de cada gráfico representa el momento medio general de la biopsia (8,24 min). Las barras de error son las desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Reexpansión después del calentamiento frente al tiempo entre la biopsia y la vitrificación. (A) muestra que no se vuelven a expandir y se vuelven a expandir los blastocistos 1,5 horas después del calentamiento. Cada blastocisto está representado por un círculo negro a través de los tiempos crecientes. Las líneas negras continuas verticales representan 30 min establecidos como umbral temprano y 90 min establecidos como umbral tardío. (B) muestra las tasas de re-expansión en los tres grupos (timing entre biopsia y vitrificación: 30 min, 31-90 min, >90 min) agrupados según la calidad del blastocisto y el día de la biopsia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| N de procedimientos | N blastocistos biopsiados por procedimiento | Tiempo medio de la biopsia - SD, rango (min) | |
| Operador 1 | 443 | 2,01 a 1,09, 1-4 | 7,41 x 3,6, 3-22 |
| 195 | 1 | 4,75 x 1,96, 3-16 | |
| 111 | 2 | 7,83 x 2,45, 3-18 | |
| 71 | 3 | 10,27 x 2,41, 4-16 | |
| 66 | 4 | 11,48 x 3,81, 6-22 | |
| Operador 2 | 290 | 1,81 x 0,98, 1-4 | 7,87 x 4,13, 3-22 |
| 142 | 1 | 5,69 x 3,32, 3-16 | |
| 89 | 2 | 8,48 x 2,79, 3-18 | |
| 30 | 3 | 11,37 x 3,72, 4-20 | |
| 29 | 4 | 13,1 a 3,89, 9-22 | |
| Operador 3 | 287 | 1,98 x 1,05, 1-4 | 9,10 x 4,65, 3-22 |
| 121 | 1 | 6 x 2,19, 3-15 | |
| 89 | 2 | 9,6 x 3,87, 3-22 | |
| 38 | 3 | 12,66 x 4,55, 4-22 | |
| 39 | 4 | 14,13 x 4,8, 6-22 | |
| Operador 4 | 217 | 1,66 x 0,87, 1-4 | 7,58 x 3,45, 3-22 |
| 118 | 1 | 5,58 x 1,96, 3-14 | |
| 66 | 2 | 8,92 x 2,91, 4-22 | |
| 21 | 3 | 11,48 x 2,34, 5-16 | |
| 12 | 4 | 13 x 4,26, 6-19 | |
| Operador 5 | 144 | 2,03 a 1,08, 1-4 | 9,43 x 4,24, 3-22 |
| 59 | 1 | 6,15 x 2,5, 3-16 | |
| 43 | 2 | 10,07 x 2,73, 6-16 | |
| 20 | 3 | 12,6 x 2,89, 9-18 | |
| 22 | 4 | 14,09 x 4,43, 6-22 | |
| Operador 6 | 121 | 1,67 x 0,94, 1-4 | 7,79 x 3,93, 3-22 |
| 70 | 1 | 6,19 x 2,95, 3-16 | |
| 32 | 2 | 8,12 x 1,72, 3-11 | |
| 9 | 3 | 12,78 x 3,31, 9-18 | |
| 10 | 4 | 13,5 x 6,19, 6-22 | |
| Operador 7 | 42 | 1,62 x 0,94, 1-4 | 14,19 x 4,24, 6-22 |
| 27 | 1 | 11,85 x 5,53, 6-16 | |
| 6 | 2 | 16,5 x 3,73, 11-22 | |
| 7 | 3 | 19,86 x 3,34, 13-22 | |
| 2 | 4 | 19 x 4,24, 16-22 | |
| Total | 1544 | 1,89 x 1,03, 1-4 | 8,24 x 4,23, 3-22 |
| 732 | 1 | 5,78 x 2,94, 3-16 | |
| 436 | 2 | 8,85 x 3,14, 3-22 | |
| 196 | 3 | 11,72 x 3,70, 4-22 | |
| 180 | 4 | 12,93 x 4,43, 6-22 |
Tabla 1: Tiempo medio total de biopsia y número medio de blastocistos biopsiados en cada procedimiento según el operador de la biopsia. El momento medio de la biopsia también se ha demostrado de acuerdo con cada número secuencial de blastocistos biopsiados por procedimiento. Un modelo lineal generalizado que incluye tanto las variables "operador de biopsia" como "número de blastocistos biopsiados por procedimiento" se correlaciona perfectamente con el "timing of biopsy" (R2 a 0,48, potencia n.o 1).
Figura suplementaria 1: Dispositivos principales y soportes necesarios para el procedimiento. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Cuadro Suplementario 1: El análisis de regresión logística no muestra ninguna asociación significativa entre el operador de la biopsia y el nacimiento vivo después de la transferencia de blastocisto de euploide vitrifido. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Sólo los embriólogos experimentados que hayan completado su período de entrenamiento deben realizar tanto la biopsia TE como la vitrificación del blastocisto. Además, se requiere un testigo para monitorear los procedimientos y garantizar una trazabilidad eficiente durante i) los movimientos del blastocisto biopsiado desde la antena de biopsia (FiguraSuplementaria 1) a la antena post-biopsia (FiguraSuplementaria 1 ), a continuación a la placa de vitrificación (Figurasuplementaria 1) y, por último, al soporte de vitrificación (Figurasuplementaria1); ii) la transferencia de células TE biopsiadas de la antena de biopsia al tubo de PCR (FiguraSuplementaria1); iii) los pasos de calentamiento y transferencia después del diagnóstico. Para obtener una descripción detallada de todos los pasos de presencia, consulte un análisis de efectos y modos de error (FMEA) publicado anteriormente14.
Todos los métodos descritos en este documento respetan la normativa local (Ley italiana 40/2004). De acuerdo con la Ley, de hecho, la pareja puede solicitar ser informada sobre el estado de salud de los embriones que produjeron durante el ciclo de FIV. A este respecto, debe firmarse un consentimiento informado detallado para el PGT de ambos socios.
En este artículo describimos cómo implementar la biopsia de blastocisto para PGT en una rutina de laboratorio ocupada. La aplicación del enfoque de biopsia de blastocisto ha sido un avance importante en la última década en la FIV. Reportado por primera vez por de Boer y sus colegas en 200417, pronto ha sido reconocido como un procedimiento más eficaz e informativo en comparación con la etapa de escisión y la biopsia del cuerpo polar se acercaa 3. El valor de este procedimiento reside principalmente en una reducción de las cargas técnicas, pero también en una menor incidencia de mosaico cromosómico en esta etapa de desarrollo18,19. Además, la eliminación de pocas células TE de un blastocisto se ha sugerido como un procedimiento más seguro que la eliminación de un blastomero de un embrión en etapa de escote. De hecho, en un estudio aleatorizado de no selección, el primer enfoque no tuvo lugar en ningún impacto en el potencial de implantación de embriones, mientras que el segundo implicó una reducción significativa del 20 %20.
El protocolo utilizado principalmente en todo el mundo implica la apertura de zona asistida por láser en el día 3 después de la inseminación. Hasta la fecha no se ha realizado ningún ensayo controlado aleatorizado para comparar los diferentes enfoques de biopsia de blastocisto. Sin embargo, es razonable que cuanto menor sea el número de manipulaciones y exposiciones de los embriones en crecimiento a condiciones ambientales subóptimas, menor será la posible invasividad del protocolo. Además, la presencia de un agujero en la zona pellucida desde el día 3 de desarrollo podría afectar la expansión del blastocisto y causar la hernia de las células de ICM junto con las células TE. Por estas razones, establecemos e implementamos el protocolo descrito aquí que implica la violación secuencial de la zona asistida por láser y la recuperación de células TE tan pronto como el blastocisto alcanza la expansión completa. También existe un protocolo diferente que implica un día5 o 6 de eclosión asistida 5,7. Específicamente, la perforación de la zona se realiza en el día 5 o 6 del desarrollo preimplantacional en el lado opuesto con respecto al MIC; el blastocisto se traslada de nuevo a la incubadora a la espera de la hernia espontánea de células TE. Claramente, se debe proporcionar un monitoreo periódico del blastocisto en las siguientes horas, para biopsiarlo tan pronto como la TE comience a herniarse, así como para evitar que el embrión eclosione por completo. Si por un lado los profesionales no calificados pueden implementar fácilmente esta estrategia de biopsia alternativa, por otro lado no es adecuado para un laboratorio ocupado que realiza varios procedimientos por día. El protocolo secuencial de apertura de zona y biopsia de blastocisto descrito aquí es en cambio menos lento y permite un tiempo de práctica más corto y una mayor flexibilidad para programar la actividad diaria en el laboratorio para coordinar los plazos dedicados a biopsia y a los procedimientos de vitrificación.
Los blastocistos de mala calidad pueden ser más complejos para la biopsia, ya que las células TE pueden ser pegajosas, pero más disparos láser coordinados con el estiramiento del fragmento para exponer las uniones entre las células son suficientes para extraerlo del cuerpo del blastocisto. El blastocisto completamente eclosionado se puede biopsiar como blastocistos encerrados en la zona pellucida, pero podrían ser más complicados de vitrifir y calentar. En caso de diagnósticos no concluyentes después de la biopsia, los datos notificados hasta la fecha son concordantes de que ningún daño parece derivar de una rebiopsia y un siguiente ciclo de calentamiento de vitrificación16,21.
La vitrificación se utiliza actualmente en el centro para realizar criopreservación de blastocisto, ya que se ha reportado constantemente más seguro, más eficiente y menos lento que el protocolo de congelación lenta de una revisión y metanálisis de la literatura más reciente 10.
Una vez que el procedimiento estaba bien establecido y los operadores debidamente capacitados, realizamos un análisis retrospectivo para definir los tiempos de procedimiento ideales para los procedimientos de biopsia de blastocisto y vitrificación (resumidos aquí en los resultados representativos). Como resultados finales, hemos evaluado la tasa de reexpansión del blastocisto euploide evaluada a 1,5 h después del calentamiento y la tasa de nacimientos en vivo alcanzada después de la transferencia de embriones únicos euploides vitrifidos. No se observó ningún caso de degeneración de blastocisto después de la biopsia, y sólo 0.2% (N -1/572) de la tasa de degeneración fue reportado después del calentamiento, confirmando la fiabilidad de la biopsia y los enfoques de vitrificación adoptados. Según el análisis, el tiempo necesario para realizar la biopsia de blastocisto no afecta la viabilidad de los blastocistos euploides después del calentamiento definido como tasa de reexpansión, o el potencial reproductivo definido como tasa de natalidad viva. Aunque se pueden observar varios tiempos entre operadores con diferentes conocimientos especializados, podemos considerar la biopsia de blastocisto segura cuando el procedimiento se completa en aproximadamente 8 min, en un rango de 3 a 22 min dependiendo del número de embriones por procedimiento (sin embargo, no hay datos son procedimientos de biopsia realizados en intervalos más largos). El tiempo medio dedicado a la biopsia de blastocisto de cada operador debe ser monitoreado periódicamente (al menos cada tres meses) como KPI. Además, también debe abordarse la tasa de diagnóstico no concluyente y la tasa de natalidad en vivo después de la transferencia de blastocisto euploide vitriloide vitrificada. Por último, describimos el momento ideal entre la biopsia y la vitrificación. Dado que observamos la tasa de reexpansión más alta después del calentamiento cuando los blastocistos fueron vitrificados dentro de los 30 minutos de la biopsia, sugerimos este valor como el umbral ideal. Específicamente, cuanto más tiempo entre la biopsia y la vitrificación, más se volverá a expandir el blastocisto biopsiado antes de ser crioconservado. Esto podría ser perjudicial para la criosupervivencia, especialmente cuando se trata de la mala calidad y / o día 7 blastocistos11. Sin embargo, no se observó un impacto significativo en los resultados clínicos, incluso si la vitrificación se retrasó más allá de 90 minutos. Por lo tanto, en ocasiones esporádicas, tales tiempos podrían ser permitidos.
El método elegido para recuperar una muestra para PGT no debe afectar a la viabilidad de los embriones, debe implicar resultados fiables e informativos, debe ser clínicamente eficaz y debe ser fácil de implementar reduciendo así los costes y la carga de trabajo de laboratorio. La biopsia de blastocisto cumple todos estos requisitos previos. No obstante, sigue siendo un procedimiento invasivo que deben realizar operadores cualificados en un laboratorio bien equipado. Actualmente, se está investigando la vanguardia de un enfoque pGT no invasivo (niPGT). Tal vez, en el futuro, los medios de cultivo gastados después de la FIV podrían ser analizados para llevar a cabo pruebas cromosómicas y/o genéticas. Esta es una perspectiva futura intrigante, ya que los costos de la clínica de FIV serían más bajos y toda la carga de trabajo que implica la biopsia de embriones se se vería marginada. Sin embargo, la fiabilidad y reproducibilidad del análisis de medios gastados para las pruebas genéticas aún deben evaluarse22,23,24, por lo tanto, se deben invertir más esfuerzos para definir y validar un protocolo que podría todas las clínicas de FIV que realizan PGT en todo el mundo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
AG y RM recopilaron los datos y redactaron el manuscrito. DC analizó los datos, redactó los resultados representativos, realizó las estadísticas y revisó el manuscrito. FMU y LR proporcionaron una discusión crítica de los resultados y de todo el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
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