Summary
Preimplantasyon Genetik testlerini verimli bir şekilde yürütmek için blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon gereklidir. Zona pellucida ve 7-8 troectoderm hücrelerinin alma gün 5-7 Post-döllenme sıralı açılışı gerektiren bir yaklaşım, hem gerekli manipülasyonlar sayısını ve alt optimum çevresel koşullara embriyonun maruz kalma sınırlar.
Abstract
Preimplantasyon genetik testleri ile ıVF döngüleri sırasında güvenilir bir genetik tanı elde etmek için blastosist biyopsisi gerçekleştirilir. Daha sonra, ideal iş akışı, teşhis tekniklerinin dönüş süresi nedeniyle ve seçilen embriyo (lar) ı aşağıdaki doğal döngüde fizyolojik endometriyum üzerine aktarmak için güvenli ve verimli bir vitrifikasyon Protokolü gerektirir. Zona pellucida 'nın sıralı açılmasını ve 5-10 troektoderm hücrelerinin (ideal 7-8) alınmasını kapsayan bir biyopsi yaklaşımı, hem gerekli manipülasyon sayısını hem de embriyonun alt-optimum çevresel koşullara maruz kalmasını sınırlar. Uygun eğitim sonra, teknik biyopsi zamanlaması açısından farklı operatörler arasında tekrarlanabilir oldu (~ 8 dakika, değişen 3-22 min embriyoların sayısına bağlı olarak biyopsi için tabak), kesin tanı elde (~ 97,5%) ve canlı Doğum oranları sonra vitrifiye-ısıtılmış euploid blastosist transfer (> 40%). Biyopsi sonrası hayatta kalma oranı, vitrifikasyon ve ısınma% 99,8 kadar yüksek oldu. Isınma 1,5 h yeniden genişleme oranı gibi yüksek oldu 97%, büyük ölçüde biyopsi ve vitrifikasyon arasındaki zamanlamaya bağlı (ideal ≤ 30 dk), blastosist morfolojik kalite ve biyopsi günü. Genel olarak, çökmüş bir blastokist vitrify daha iyidir; Bu nedenle, PGT olmayan döngüleri, lazerle destekli suni daralma embriyo çöküşü önce ağoprezervasyon için yapılabilir. En umut verici gelecek perspektif, blastosist kültürden sonra, embriyonik DNA 'nın bir kaynağı olarak ıVF kültür ortamının non-invaziv analizidir. Ancak, bu potansiyel Avant-garde hala soruşturma altında ve güvenilir bir protokol henüz tanımlanması ve doğrulanması gerekir.
Introduction
Modern insan EMBRİYOLOJİSİ ana amacı, uyarı döngüsü başına sayı canlı doğumları maksimize etmek ve maliyetleri azaltmak için, zaman ve çabaları bir hamilelik elde etmek. Bu hedefi başarmak için, bir IVF döngüsü sırasında elde edilen bir kohort içinde üreme yetkin embriyoları belirlemek için embriyo seçimi için onaylanmış yaklaşımlar kullanılmalıdır. Son kanıtlara göre, blastosist kültür1 kapsamlı kromozomal test ve vitrifiye-ısıtılmış euploid embriyo transferi ile KOMBINE (et) IVF verimliliği artırmak için en verimli çerçeve2. Belli ki, aneuploidyen testi, günümüzde çoğunlukla troektoderm 'den (TE) alınan birkaç hücreden temsil edilen bir embriyonik numune gerektirir, yani gebelikte embriyo eklerine (örn. plasenta) kökeni veren blastosist bölümü . Karyotip analizinin ötesinde, aynı zamanda tek gen mutasyonları, preimplantasyon genetik testleri (PGT;-aneuploidies için A-SR, yapısal kromozomal yeniden düzenlemeleri için-M monojenik hastalıklar için) olarak bilinen bir klinik strateji parçası olarak bir TE biyopsisi ile değerlendirilebilir. Diğer ooksit/embriyo biyopsisi yöntemleri teorik olarak son yıllarda klinik olarak benimsenmiştir, yani kutup organları biyopsisi ve plastomer biyopsisi. Ancak, günümüzde prosedürel dezavantajları (örn. daha yüksek iş yükü ve üreme etkisi riski) ve tanı sınırlamaları (örn. tek hücreli analiz sorunları) dolaylı olarak maliyetler, riskler ve (bir inceleme için bkz:3).
Bu yazıda, TE biyopsisi için ana protokollerden biri, sonraki vitrifikasyon, ısınma ve Transfer prosedürleri ile birlikte iyice tarif edilir. Burada özetlenen iş akışı, yoğun bir PGT ünitesi için idealdir.
Zaten bizim grup4,5tarafından önceden açıklanan, prosedür tam genişletilmiş blastosist ve birkaç te hücrelerinin kaldırılması zona pellucida sıralı açılış içerir (ortalama 7-8). Günde 3 lazer destekli hatching tabanlı blastosist biyopsi yöntemi6ile karşılaştırıldığında, bu prosedür blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon gibi hassas prosedürlerin zamanında gerçekleştirilmesi gereken bir IVF biriminin günlük zamanlamasını kolaylaştırabilir. Blastokist tam genişlemesine ulaştığında biyopsi, kaldırmak için TE hücrelerini seçerek, böylece iç hücre kütlesinin (ICM) herniasyon riskini önleyerek, aksi takdirde prosedürü zorlu hale getiren bir şekilde yapılabilir. Literatürde, embriyo zaten blastosist aşamaya ulaştığında, prosedür5,7' den birkaç saat önce, lazer destekli hatching gerçekleştirilmesini içeren, Blastokist biyopsinin üçüncü bir protokolü de tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım daha zaman alıcı ve ağırlıklı olarak deneyimli operatörler ve orta-düşük günlük iş yükü görünümünde TE biyopsisi uygulayan ıVF ünitelerinde kullanılır.
Intrakyasmatik sperm enjeksiyonu (ıCSı)8 , IVF 'de genetik analizler yapmaya nişan alırsanız konsolide bir teknik olmalıdır. Benzer şekilde, blastosist aşamaya güvenli bir şekilde embriyolar toplamak için uygun bir kültür sistemi, TE biyopsi stratejisinin uygulanması için çok önemlidir. Düşük oksijen geriliminin kullanımı, yeterli sayıda kulkısım, Blastokist oranını tehlikeye atmayın, bu amaçla anahtar önkoşullardır9. Aynı zamanda, bir PGT döngüsünü güvenli bir şekilde yönetmek için etkili bir ağoprezervasyon programı gereklidir. Son on yılda, vitrifikasyon uygulanması embriyo Cryo-hayatta kalma oranları bile > 99%10,11artırdı. Bu, genetik testler yapmak ve embriyo transferini aşağıdaki menstrüel döngüye ertelemek için yeterli zaman sağladı, uyarılamayan ve muhtemelen daha fazla reseptif endometrium12.
Her iki TE biyopsi ve vitrifikasyon sıkı becerileri gerektiren görevleri talep ve etkinliğini olmayan operatörler arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, her operatörün bu prosedürleri klinik olarak gerçekleştirmesine izin vermeden önce belirli bir eğitim süresi savunulmuş; Dahası, operatörün becerilerini bakım, ağoprezervasyon ve biyopsi prosedürleri için anahtar performans göstergelerini (KPI) izleyerek periyodik olarak değerlendirilmelidir. Her bir ıVF Kliniği, uluslararası konsorsiyum ve/veya referans laboratuvarları tarafından yayımlanan sonuçlar tarafından yayımlanan olanları yaklaşık olmalıdır bu amaçla iç KPI 'Leri ayarlamanız gerekir.
TE biopsi, vitrifikasyon-ısınma ve tanık prosedürleri bizim ünitede, bu üç önceki yayınlarda bildirilen gibi tüm operatörler arasında standardize edilmiş teknikler doğrulandı11,13,14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan blastosist biyopsisi için protokol, burada açıklanan, G. EN. E.R.A. Insan araştırma etiği Komitesi yönergelerine uyur.
Not: Gerekli malzemeler için malzeme tablosuna bakın. Daha fazla malzeme gerekli laboratuvar Ayakkabı ve kıyafet, cerrahi facemask, saç örtüsü, cerrahi eldiven, kalıcı olmayan toksik Marker, forseps ve dezenfektan gerektirir. Cerrahi elbisesi, tek kullanımlık cerrahi eldiven, facemask, saç örtüsü kullanımı kontaminasyon riskini önlemek için zorunludur. Tüm çalışma alanlarının yanı sıra, işlemde yer alan ekipman, herhangi bir prosedür başlatmadan önce laboratuvar dezenfektan (örn., Oosafe) ile iyice temizlenmelidir. Kullanılan tüm sarf malzemeleri ve ortamlar steril ve ayrı olarak paketlenmiş veya alaşağı edilmelidir. Bu biyopsi ve boru için adanmış bir iş istasyonu kullanmak ve yalnızca prosedüre katılan operatörler (embriyolog ve tanık) için bölgenin erişimini sınırlamak için önerilmektedir.
1. biyopsi Işleminden önceki gün hazırlığı
-
Biyopsi kültürü yemeği hazırlayın.
- Bir ıVF kültür çanak içinde 20 μL ıVF kültür orta (malzeme tablosu) 6 damla yerleştirin ve embriyo kültürü Için 6 ml prewarmed mineral yağı ile bindirme (malzeme tablosu).
- Her damla için başka bir 10 μL ıVF kültür ortamı ekleyin. Bir gecede 37 °C ' de kontrollü bir atmosferde (% 5 O2, 6% Co2) inküye yapın.
-
Biyopsi sonrası blastosist durulama için bir ıVF çanak 4-kuyu plakası hazırlayın.
- İlk iki Kuyudaki ıVF kültür ortamının 600 μL 'yi ve embriyo kültürü için 300 μL ön ısıtılmış mineral yağıyla bindirmeyi yerleştirin.
- Bir gecede 37 °C ' de kontrollü bir atmosferde (% 5 O2, 6% Co2) inküye yapın.
- TE hücre boruları için kullanılmak üzere her PCR tüpünde yükleme çözeltisi (malzeme tablosu) μl 1,5 dispense, döndürme ve 4 °c ' de tutun.
2. biyopsi prosedürü gününde hazırlık
-
Biyopsi tabağı hazırlayın.
- 3 damla 10 μL HEPES-tamponlu Orta (insan serum albümin ile tamamlayıcı) (malzeme tablosu) BIR IVF kültür çanak satırda yerleştirin.
- (Çanak başına 4 blastosist kadar) ve embriyo kültürü için 6 ml önceden ısıtılmış mineral yağı ile bindirme-mevcut blastosist sayısına göre 1.1.1 adımı tekrarlayın.
- Biyopsi prosedürünü yapmadan önce 37 °C ' de en az 1 saat boyunca çanak inküye yapın.
3. Blastokist seçimi ve sınıflandırma
-
Blastosist 'in genişlemesine ve ICM ve TE 'nin morfolojik görünümüne göre Not (Şekil 1).
Not: notlama kriterleri Gardner ve Schoolcraft15 ve daha önce capalbo et al. ve cimadomo ve al.4,11tarafından açıklanan uyarlanmıştır.- Boyut ve genişleme notu olarak tanımlayın: a tam hatlı blastosist için, B bir hatching blastosist için, C tam genişletilmiş blastosist için, ve D genişletilmiş olmayan bir blastosist için (Bu embriyolar sadece onlar gün kadar daha fazla genişleme vermedi biyopsi 7).
- ICM notu tanımla: 1 belirgin ICM için birkaç kesinlikle paketlenmiş hücreler; birkaç ancak kabaca paketlenmiş hücreler ile ayırt edilebilir için 2; 3 çok az düşük kaliteli hücreler ile ayırt etmek zor.
- TE notu aşağıdaki gibi tanımlayın: 1 çeşitli hücrelerle iyi organize epitelyum için; birkaç hücreli gevşek epitelyum için 2; birkaç ve/veya büyük düşük kaliteli hücreler için 3.
4. troektoderm biyopsisi
- Tüm uygulanabilir tam genişletilmiş blastosist üzerinde te biyopsi gerçekleştirin (boyut ve genişleme için tercihen C Grade).
- Her biyopsi prosedürü için tutma ve biyopsi pipetleri ayarlayın. Biyopsi pipet için öneriler şunlardır: 30 μm iç çapı, 35 ° büküm açısı, 0,75 mm mesafe ucu bend.
- Biyopsi tabağını hastanın detayları ile etiketleyin (kadının adı ve soyadı, Doğum tarihi ve KIMLIĞI) ve sonra her damla embriyo ve döngü kimlikleri ile sayı yapın. Kalıcı toksik olmayan Marker kullanın.
- Biyopsi çanağın ilk damlası için 300 μm sıyırma pipet ile blastosist transfer ve kültür orta aşan kaldırmak için durulayın. Sonra biyopsi çanak ikinci damla Blastokist taşıyın.
- Tabak ters mikroskopla taşıyın ve biyopsi tabak üçüncü damla bazı orta duman çekiş biyopsi pipet Prime.
- 20X büyütme, Blastokist yönlendirmek ICM net bir görünüme sahip. Saat 7 ' de (TE hücrelerini çıkarmak için hedeflenen alanın tersi) görselleştirildiğinde, embriyonun tutan pipet üzerine sabitlenmelidir (Şekil 2a).
- Zona pellucida odaklanmak ve hem Pipetler ve blastosist aynı odak düzleminde olduğunu tespit.
- Lazer hedefe geçiş (darbe süresi 0,3 MS, 6,5 μm) ve lazer işaretçisini ICM 'nin karşı tarafındaki zona pellucida üzerine konumlandırın. Zona pellucida 2 − 3 lazer darbeleri ile matkap (Şekil 2B).
- Biyopsi pipetine yavaşça zona pellucida 'ya basın ve TE hücrelerini iç yüzeyinden ayırın ve blastosist çöküşü hızlandırın (Şekil 2C).
- TE ayrıldıktan sonra (Şekil 2D), delik üzerinden girin (gerekirse, son bir lazer nabız ile daha geniş yapmak) ve birkaç te hücreleri Aspire (ideal 7 − 813,16) yumuşak emiş biyopsi pipet içine (Şekil 2e).
- Hedef hücreleri uzatmak için ılımlı bir emiş uygularken biyopsi Pipeti biraz geriye doğru hareket ettirin (Şekil 2F).
- Lazeri, emişli hücrelerin en ince kısmına doğru yönlendirin ve hücre arasındaki kavşada 2 − 5 lazer darbeleri ateş ederek, hedef hücreleri embriyonun gövdesine ayırın (Şekil 2G). Lazer darbeleri ve darbe sayısı zamanlaması blastosist kalitesine göre ayarlanabilir; Ancak, hücre liziz önlemek için onları en aza indirmek deneyin.
- TE parçasının Blastokist 'den ayrılması (Şekil 2H) sonra, Blastokist 'den çok uzağa aynı biyopsi düşüşü içine bırakın. Bu, biyopsi pipet içine tekrar sucked önlemek için gereklidir (Şekil 2i).
- Blastokist 'i tutma pipetinden bırakın ve parçanın onlara yapışmasını önlemek için her iki pipeti hemen kaldırın.
- Kalite kontrol amacı için biyopsi parçanın bir resmini çekin (Şekil 3).
Not: tek bir blastosist daha fazla prosedür başına biyopsi (biyopsi çanak başına en fazla dört) ise, embriyo arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için yeni bir ile biyopsi pipet değiştirin. - 4.1 − 4.13 arasındaki adımları yineleyin.
- Biyopsi tabağı laminar akış kaputu geri taşıyın.
- Çift KIMLIĞI ile biyopsi sonrası kültür çanak etiket ve embriyo ve döngü KIMLIĞI ile her damla.
- Bir tanık varlığı, temiz ıVF ortamında Blastokist durulayın ve son olarak post-biopsi çanak karşılık gelen damla taşıyın.
- Biyopsi sonrası tabağı kontrollü bir atmosferde (37 °C,% 6 CO2, 5% O2) vitrifikasyon kadar kuluçta taşıyın. Blastokist yeniden genişlemeyi önlemek için biyopsi işleminden 30 dakika içinde vitrifikasyon yapılması tavsiye edilir.
5. boru borusu
Not: Tüm prosedür, bir tanık ve oda sıcaklığında laminar akış kaput içinde bulunması gerekir. Prosedür sırasında, PCR tüpleri buz üzerinde soğuk bir tüp raf içinde tutun (Tamamlayıcı Şekil 1).
- PCR tüpleri kalıcı toksik olmayan Marker ile etiketleyin.
Not: Etiketleme, genetik laboratuar tarafından istendiği şekilde yapılmalıdır. Genel olarak, hastanın adı ve Soyadı (baş harfleri), Çift KIMLIĞI, embriyo ve döngü KIMLIĞI (örneğin: JD 12345, 2. döngüsünün, Çift KIMLIĞI 12345 olan Jane Doe 'ya ait olan embriyo N. 1 için 1,2). Embriyo KIMLIĞI de tüpün gövdesinde mektuplarda rapor edilmelidir. - Bir 60 mm x 15 mm Kültür çanak (boru çanak), biyopsi embriyo kimlikleri (Tamamlayıcı Şekil 1) ile kapak etiket ve içinde 2 10 μL biyopsi yıkama solüsyonu (tablo) damla hazırlayın.
- 140 μm sıyırma pipet (Tamamlayıcı Şekil 1) ile bazı biyopsi yıkama çözeltisi ile boru çanağın ikinci damlası.
- Kolayca TE parça (ler) görselleştirmek için stereomikoskop altında biyopsi çanak yerleştirin.
- TE parçası üzerine hafifçe biyopsi yıkama çözeltisi bırakın; sonra, onu sıyırma pipet içine yükleyin.
- TE parçasını, biyopsi yıkama çözeltisinin ikinci damlasında boru çanağına taşıyın ve 2 − 3 kez dikkatle durulayın.
- Ten parçasını PCR tüpünün altına (daha önce etiketlendikten sonra) yükleme çözümüyle aktarın, duvarları sıyırma pipetin ucunu ile dokunmamak için dikkat edin.
- Her te parçası için yeni bir kapiller kullanmak için dikkat, her TE parçası için 5,7 adım 5,3 adım yordamı yineleyin.
- Boru prosedürü sonunda, bir mini santrifüjte tüm PCR tüpler koymak ve birkaç saniye onları spin.
- Örnekleri, test için başvuran genetik laboratuvara gönderene kadar-20 °C ' de saklayın.
6. Blastokist vitrifikasyon
- Vitrify yeniden genişleme önlemek için te biyopsi 30 dakika içinde blastosist çöktü.
- Vitrifikasyon plakasını kadın detayları ve vitrifiye edilmelidir blastosist kimlikleri ile etiketleyin.
- Etiket vitrifikasyon destek (ler) kadın adı ve soyadı ile, Çift KIMLIĞI, üzerinde yüklenecek embriyonun KIMLIĞI yanı sıra prosedür tarihi. Çok düşük sıcaklıklarda bile bütünlüğünü koruyan özel cryolabels kullanılır (-196 °C).
- Oda sıcaklığında, vitrifiye edilecek her blastosist için 0,3 ml dengelemesinden solüsyonu (es) (malzeme tablosu) dağıtır.
- Bir tanık varlığında, 300 μm sıyırma pipet kullanarak ES 'de blastosist taşıyın.
- Blastokist 'i 13 − 15 dakika boyunca ES 'de bırakın. Hacminin ilk daralması sonra, kademeli bir yeniden genişleme gözlenir.
- Küçük bir soğutma rafı sıvı nitrojen (LN2) ile doldurun ve laminar akış kaputu altına yerleştirin.
- İkinci kuyunda 300 μL vitrifikasyon çözeltisi (VS) (malzeme tablosu) dispense. Blastokist tam yeniden genişleme sonra, 1 dakika için VS çözüm aktarmak ve ES seyreltilmesi için durulayın.
- Bir tanık varlığında, vitrifikasyon desteği üzerinde blastosist yükleyin ve VS fazlalığının kaldırılması dikkat. Çözüm ince bir film Blastokist çevreleyen gerekir.
- Vitrifikasyon desteğini LN2 ' ye dalın ve numuneye yakın kabarcık oluşumu riskini azaltmak için enerjik bir şekilde taşıyın.
- LN 2 ' de vitrifikasyon desteğini tutarken koruyucu kapağı yerleştirin.
- Bir tanık huzurunda, uzun süreli LN2 depolama tankında vitrifikasyon desteğini taşıyın.
7. Non-biopsied Blastocysts suni daralma
-
Herhangi bir TE biyopsisi yapılırsa, vitrifikasyon öncesinde hemen blastositleri yapay olarak daraltabilirsiniz (Şekil 4).
- Kültür çanak kuluçkenden ters mikroskop için hareket ettirin ve seçilen embriyo odaklanmak.
- Lazer hedefe geçiş (Pre-set Nabız: 0,3 MS, 6,5 μm), ICM karşı tarafında zona pellucida hedef, daha sonra doğrudan 1 – 2 lazer darbeleri TE hücreler arasındaki kavşak için ICM güvenli bir mesafede. Blastositler 5 dakikadan kısa sürede çökmelidir.
- Bölüm 6 ' da açıklandığı gibi çökmüş Blastokist vitrifikasyonu ile devam edin.
8. devredilebilir Blastokist ısınma
- ET günü, her bir kuyu için 600 μL ön equilibrated ıVF kültür ortamını yerleştirerek ET 4-Well plakasını hazırlayın. 37 °C ' de kontrollü bir atmosferde (% 5 O2, 6% Co2), Blastokist ısınma yapılırken inküye yapın.
- Kadın adı ve soyadı, Çift KIMLIĞI, içinde ısınacak embriyonun KIMLIĞI ile ısınma çanak etiket.
- 1 mL çözme çözeltisi (TS) (malzeme tablosu) BIR IVF tek kuyu tabağı (Tamamlayıcı Şekil 1) ve 37 °c ' ye sıcak bir TERMOSTATIN en az 1 saat önce prosedüre başlanması için ısıtın.
- LN2 ile küçük bir soğutma desteğini doldurun ve çalışma alanının yakınında laminar akış kaputu içine yerleştirin.
- Prosedüre başlamadan önce, vitrifikasyon desteğiyle bildirilen Blastokist bilgileri kontrol edin. Tüm kimlikleri genetik rapor ile eşleşmelidir ve sıcak için blastosist devredilebilir olanlar arasında seçilmelidir. Prosedür sırasında bir tanık gereklidir.
- TERMOSTATIN dışında ısıtılan TS 'i içeren tek kuyun tabağı alın ve stereomicroscope altında ısıtmalı bir aşamaya yerleştirin.
- LN2 içindeki koruyucu kapağı forseps kullanarak çekin.
- 37 °C TS içine vitrifikasyon desteğinin ucunu hızla Dalma.
- Mikroskobik gözlem altında, Blastokist ucdan serbest bırakılıncaya kadar vitrifikasyon desteğini yavaşça hareket ettirin.
- Blastokist 'i TS 'deki toplam 1 dakika boyunca bırakın, TS 'in altında tutmak için dikkat edin.
- Oda sıcaklığında 200 μL seyreltme çözeltisi (DS) (malzeme tablosu) vitrifikasyon plakasının ilk kuyusu üzerinde dağıtılır.
- DS için Blastokist transfer ve gradyan bir tür oluşturmak için onun üstünde bazı TS bırakmadan iyi altına yerleştirin. 3 dakika bırak.
- 2 farklı kuyularda (WS1 ve WS2) 200 μL yıkama çözeltisi (WS) dispense.
- WS1 için Blastokist transfer ve onun üstünde bazı DS orta bırakmadan iyi altına yerleştirin. Sonra WS2 için Blastokist transfer ve 1 dakika boyunca bozulmamış bırakın.
- Kadın adı ve soyadı, Çift KIMLIĞI, içinde kültürlü olacak embriyonun KIMLIĞI ile sonrası ısınma ET plaka etiket.
- Bir tanığın varlığında, ısıtılmış blastosist 'i, ısınma sonrası ET plakasında önceden eşitlenebilir kültür ortamına aktarın.
- ET plakasının ilk kuyusu içinde Blastokist durulayın ve ikinci kuyu yerleştirin.
- Isınma sonrası kültür çanağını kontrollü bir atmosferde (37 °C,% 6 CO2, 5% O2) ve kültür için blastosist en az 1,5 h, hayatta kalma ve yeniden genişleme kontrol etmeden önce aktarın.
Not: Şekil 5 dejenere örnekleri gösterir, Cryo-hayatta ama yeniden genişletilmiş ve Cryo-hayatta ve tam genişletilmiş blastocysts.
9. Embriyotransfer
- ET yapmak için, laminar akış kaput ısıtmalı aşamasında çanak yerleştirin, böylece embriyo düşük büyütme mikroskop altında görünür.
- Yaklaşık 0,4 mL ıVF kültür ortamı alın. Şırınga ucunu iç kateterin alıcı ucuna sıkıca sabitleyin ve sonra orta 0,1 mL 'ye kadar bırakın.
- Katetere giren embriyoları gözlemlemeye kadar, kültür ortamını aspirate (minimum miktarda medya: 10 − 15 μL).
- Kateteri plastik kasa içine yerleştirin ve ameliyathane gidin ve dahili kateteri harici kılavuza yerleştirin.
- Bir kez rahim ulaştı, embriyo (s) serbest bırakmak için şırınga pistonu itin. Pistonlu 0,1 mL okuma kadar çok yavaş orta bırakın.
- Kateteri laboratuara geri götürün ve embriyonun aktarıldığı mikroskop altında kontrol edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 6 , protokol standartlaştırılması ve her operatörün performansını izlemek için kabul edilebilir bir biyopsi prosedürün tüm sonuçlarının bir düzenini temsil eder. Ana prosedür sonucu biyopsi/biopsilerin tamamlanması için zamanlamadır; Ana teknik sonuç, son olarak tanısı konulmamış blastosist bir yeniden biyopsi gerektiren ya bir kesin veya belirsiz tanı neden olabilir genetik test sonrası üretilen Arsa kalitesidir; Ana biyolojik sonucu ısınmadan sonra Cryo-hayatta kalma ve yeniden genişleme karşı dejenerasyon oranı; son olarak, Ana klinik sonuç, vitrifiye-ısıtılmış Blastokist transferden sonra canlı Doğum oranıdır. Önceki üç çalışmada, teknik, biyolojik ve klinik sonuçlar için orta (s) tanımlanan KPI 'ları11,13,16' ya bildirdik. Bunun yerine, biyopsi zamanlamasının KPI 'sında nasıl tanımlanmış olduğunu rapor ediyoruz. Dahası, bu zamanlamanın biyopsi ve vitrifikasyon arasındaki zamanlama sırasında euploid blastosların ısınma sonrası davranışları da incelenmiştir.
2 yıllık bir dönemde toplam 1.544 troektoderm biyopsi prosedürü 7 operatör tarafından yapılmıştır (Tablo 1). Tüm biyopsi blastosörler daha sonra vitristasyon kadar biyopsi sonrası kültür çanak içine kuluçta geri taşındı. İlgili tüm veriler ilişkisel bir veritabanında toplanır. Biyopsi ve biyopsi ve vitrifikasyon arasındaki tüm zamanlamalar, ıVF elektronik tanık sisteminin yazılımından retrospektif olarak elde edilmiştir. Veriler daha sonra istatistik için ihraç ve analiz edildi.
Troektoderm biyopsisi ve vitristasyon-ısınma sonrasında euploid blastosist Cryo-Survival oranı N = 571/572, 99,8% oldu. Isınma sonra 1,5 h yeniden genişleme oranı N = 556/571,% 97,4 oldu. 15 ' in yeniden genişletilmemiş blastositler arasında, biri utero 'ya aktarıldıktan sonra canlı bir doğumla sonuçlandı. Vitrifiye-ısıtılmış euploid tek blastosist transferinden sonra canlı Doğum oranı N = 227/572, 39,7% idi.
Biyopsi ideal zamanlaması tanımı
Tablo 1 , yapılan biyopsi prosedürlerinin ilgili verilerini özetler. Genel olarak 1,89 ± 1,03 (Range 1-4) blastositler her prosedür için% 8,24 ± 4,23 dk (Aralık 3-22) biyopsiyelilmiş. Her iki prosedür başına biyopsi blastosist sayısı nedeniyle farklı biyopsi ortalama zamanlaması, en az 5,78 ± 2,94 dk (Aralık 3-16) ne zaman sadece bir embriyo en fazla için yemek koydu 12,93 ± 4,43 dk (Aralık 6-22) embriyo sırayla biyopsi biz yeniden 4. Başka bir ilgili parametre yordamda yer operatör oldu: en uzman (N = 443 prosedürler) hızlı (7,41 ± 3,6 dk, Aralık 3-22), en az deneyimli iken (N = 42) en yavaş (14,19 ± 4,24 dk, Aralık 6-22). Nitekim, hem "prosedür başına biyopsi blastosist sayısı" ve "operatör" değişkenleri mükemmel bir R2 = 0,48 ve bir güç = 1 ile "biyopsi zamanlaması" açıklıyor Genelleştirilmiş Doğrusal model. Bu analiz ideal tanımlamak için yararlıdır ~ 6 min bir blastosist biyopsi prosedürü için yeterli olduğunda sadece bir embriyo çanak yerleştirilir, süre ~ 9 dakika, ~ 12 dakika ve ~ 13dk 2, 3 ve 4 blastocysts, sırasıyla. Belli ki, tüm prosedür embriyoları kültürden biyopsi tabağına ve ikincisi de prosedürden sonra biyopsi sonrası kültür yemine taşımayı ve sıralı biopsilerin arasında biyopsi Pipetinin değiştiğini de kapsar.
Şekil 7 , çalışma trimesterlerde (1St 'den 8 ' e kadar) her operatör için biyopsi ortalama zamanlamasını çizer. Noktalı kırmızı çizgi 8,24 min ortalama genel değerini tanımlar. Böyle bir grafik her uygulayıcının ortalama performansını izlemek için yararlıdır. Örneğin, en uzman operatörleri (1 ve 2) bir öğrenme eğrisi tipik bir eğilim öneriyor bu zamanlamanın sürekli bir düşüş gösterdi. 3 ' ten 6 ' ya kadar tüm operatörler trimesterde ortalama genel değer etrafında performanslarında yeterince sabit oldular. Zaman onlar belirli bir trimester gelen ortalama değeri bir zirve gösterdi (örneğin, operatör 3 yılında 7TH trimester, operatör 4 in 6TH trimester, operatör 5 3RD trimester), onlar onların performansını revize etmek için uyarıldı. Operatör 7 (yani, en az deneyimli) sadece onun eğitim bitirdi bir embriyolog tipik zamanlamaları gösterdi. Muhtemelen, o/o uzmanlık artacaktır olarak laboratuar iç standartları buluşuyor.
Daha da önemlisi, biyopsi süresi tekrar genişletilmiş ve yeniden genişletilmemiş euploid blastositlerin ısınmadan 1,5 h 'de (9,52 ± 4,23 dk, Aralık 3-22 karşı 10,5 ± 5,68 dk, Aralık 4-22; t-test = 0,37) benzerdi. Muhtemelen, implante (n = 229) ve implante değil (n = 343) vitrifiye-ısıtılmış euploid blastosist aynı zamanda karşılaştırılabilir biyopsi zamanlamaları gösterdi (9,77 ± 4,15 dk, Aralık 3-22 VERSUS 9,41 ± 4,36 dk, Aralık 3-22; t-test = 0,39). Muhtemelen o zaman, bir zamanlama ≤ 22 dakika biyopsi kadar 4 blastosist ısınmadan sonra embriyo davranışını etkilemez. Bu nedenle, bu değer en büyük eşik olarak tanımlanır.
Benzer şekilde, daha önce13 (Tamamlayıcı Tablo 1) raporlandığı gibi, farklı biyopsi operatörleri genelinde canlı Doğum oranı açısından hiçbir fark gösterilmemiştir.
Her operatörün performansını izlemek için başka bir önemli parametre, teşhis sonrası belirsiz sonuçlar oranıdır, bu da her bir laboratuvarda genel performansa mümkün olduğunca yakın olmalıdır. İdeal olarak bu oran% 2,5 ' ı aşmamalıdır ve biyopsi ve boru prosedürleri16artan bir uzmanlık nedeniyle zaman azalabilir. Almak için te hücrelerin hedef sayısı 7-8 önceki iki çalışmada13,16göre. Bu amaçla, kalite kontrol amacı için biyopsi parçanın bir resmini çekmek için tavsiye edilir ( Şekil 3' te bazı örneklere bakın). Bu tür resim, nedenin parça boyutunun/kalitesine (yani moleküler analizinin düşük kalitesinden), tüpe (örn., DNA amplifikasyonu başarısızlığı) veya bazı sorunlara aksaklıklarından olup olmadığını değerlendirmek için kontrol edilebilir genetik laboratuvarda numunenin işlenmesi.
Biyopsi ve vitrifikasyon arasındaki ideal zamanlamanın tanımı
Çalışma döneminde, 572 euploid blastositlerin bir ayıpinin tanısı ile embriyo transferi geçmesi için ısıtıldı. Şekil 8A her bir siyah daire biyopsi ve vitrifikasyon arasında artan zamanlama arasında dağıtılmış ve araştırma altında sonuca göre iki grupta kümelenmiş olarak sıcak Blastokist gösterir: yeniden genişletilmiş ya da yeniden genişletilebilir değil 1,5 h ısınma. Tüm blastosist (N = 117/117) 30 dakika içinde vitrifiye, 97,6% (n = 245/251), 31-90 dk arasında vitrifiye edilen blastositlerin% 95,1 (n = 194/204) ve blastositlerin 90 dakika ötesinde vitrifiye edilen (yeniden genişleme oranları:% 0,% 2,4 ve% 4,9). Bu nedenle, biyopsi ve vitrifikasyon arasındaki zamanın erken ve geç eşikleri olarak 30 dk ve 90 dk ayarlayın.
Şekil 8B üç grupta yeniden genişleme hızını gösterir (≤ 30 dk, 31-90 dak, > 90 dk) daha fazla alt kümelenme blastosist kalitesine ve Preimplantasyon gelişimi gününe göre. Özellikle düşük kalite ve/veya gün 7 blastocysts, biyopsi ve vitrifikasyon arasındaki zamanlama ısınma sonra yeniden genişleme elde etmek için çok önemli görünüyor. Özellikle, 90 dk ötesinde vitrifiye karşı biyopsi karşı blastoslar 30 dakika içinde vitrifiye ve blastosist kalite ve biyopsinin her iki blastokör kalitesi için düzeltilmiş ısınmadan sonra yeniden genişleme oran-oranı 3,05 oldu (95% CI 1.01-9.4, p = 0.05). Bunun yerine, bu iki eşik (31-90 dk) arasındaki dönem, etkisi olabilecek veya olmayabilir gri bir alanı temsil ediyor.
15 ' den sadece 1 ' i yeniden genişletilmemiş blastositler transferden sonra canlı bir doğumla sonuçlandı. Bu nedenle, biyopsi ve vitrisifikasyon arasındaki zamanlamaya göre üç grupta kümelenmiş, ısıtılmış euploid tek blastosist transferin ardından elde edilen canlı Doğum oranını son araştırdık. En yüksek canlı Doğum oranı, ektoderm biyopsisi (N = 56/117,% 47,9) arasında ≤ 30 dk olan euploid blastositlerin vitrifiye aktarılması ile elde edilmiştir. Ancak bu sonuç, 31 ile 90 dk arasında vitrifiye edilen blastositler ile elde edilen aynı sonuca kıyasla istatistiksel öneme ulaşmadı (N = 92/251,% 36,7; Fisher 'ın tam test = 0,06), veya blastosist ile biyopsi > 90 dakika Vitrifiye (N = 81/204, 39,7%; Fisher 'ın tam testi = 0,16). Bu nedenle, blastosist üreme yetkinliği üzerinde olumsuz bir etki ihmal edilebilir veya bu veri kümesindeki örnek boyutu (N = 572) istatistiksel öneme ulaşmak için yetersiz kalmıştı.
Şekil 1: blastosist sınıflandırma parametreleri. Genişletme: (A) tam olarak hatched, (B) hatching, (C) tamamen genişletilmiş ve (D) genişletilmemiş. İdeal aşama C, bir blastosist D tam genişleme elde etmek için daha fazla zaman verilmelidir iken, bu aşama 7 gün içinde ulaşılmadıkça; İç hücre kütlesi (ICM) morfolojik kalite: 1 (birkaç kesinlikle paketlenmiş hücreler ile fark), 2 (birkaç ama kabaca paketlenmiş hücreler ile ayırt) ve 3 (çok az düşük kaliteli hücreler ile ayırt etmek zor); troectoderm (te) morfolojik kalite: 1 (çeşitli hücreler ile iyi organize epitelyum), 2 (birkaç hücreli gevşek epitelyum) ve 3 (az ve/veya büyük düşük kaliteli hücreler). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: sıralı zona pellucida (Zp) Özeti açılış ve troectoderm (te) blastosist biyopsisi için hücreler alma yaklaşımı. (a) blastosist 'i, tutma pipetine yakın iç hücre kütlesine (ICM) ve seçilen te hücrelerinin alınabileceği yerden uzak bir yere yönlendirin. Blastokist 'i tutan pipette koruyun; (b) 2-3 lazer çekimleri ile ZP açın; (c) delikten bazı kültür medyasını üfleyin; (d) BLASTOSIST ZP 'den ayrılacaktır; (e) biyopsi pipetinde ZP ve suck 5-10 te hücrelerini girin; (f) Seçilen parçayı uzatmak ve hücreler arasındaki kavşları açığa çıkarmak için biyopsi pipetiyle geriye doğru hareket etmek; (g) hücreler arasındaki kavşalar ateş ve te hücreleri blastosist gövdesinde serbest kadar parça germe devam; (h) te biyopsisi sonrasında blastosist çökmüştür; (i) kalite kontrol için biyopsi parçasının bir resmini çekin ve genetik laboratuvara gönderilecek PCR tüpüne aktarın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: biyopsi parçalarının örnekleri: (a-c) arzu edilen parçalar; (d) lysed parçası; (e) dejenere hücrelerle küçük parça; (f) küçük, kısmen lysed ve dejenere parça. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Suni daralma. (a) blastosist 'e yöneltir, böylece iç hücre kütlesi (ICM) troectoderm 'nın (te) hedeflenen bölümünden çok uzaktır; (b) Yangın 2-3 te hücreler ve dışarı hareketli arasındaki kavşalar bir satırda lazer çekim; (c) vitrifikasyon başlamadan önce Blastokist 'in çökmesine bekleyin. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: blastosist dejenerasyon (a), Cryo-hayatta kalma ancak yeniden genişleme (b) ve Cryo-hayatta kalma ve tam Re-Expansion (c) 1,5 h sonrası ısınma örnekleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: bir operatörün performansını izlemek ve her laboratuvarda dahili anahtar performans göstergelerini tanımlamak için kullanılabilecek troektoderm biyopsisi farklı sonuçların Özeti. Ana prosedür sonucu biyopsi zamanlamadır. Ana teknik sonuç, kesin (euploid veya aneuploid) ve belirsiz tanır (yeniden biyopsi gerekli) oranıdır; İkincisi DNA amplifikasyonu veya düşük kaliteli Moleküler veriler nedeniyle olabilir, her ikisi de değil-yorumlanabilir kromozom kopya numarası profil çizimleri sonuçlanan. Ana biyolojik sonuç, biyopsi, vitrifikasyon ve ısınma sonrası Cryo-hayatta kalma ve yeniden genişleme veya dejenerasyonun oranıdır. Ana klinik sonuç, canlı doğumlar veya vitrifiye-ısıtılmış blastosist transferinden sonra elde edilen negatif gebelik sonuçları oranıdır. Not, prosedür sonucu sadece operatör ve blastosist uygulama başına biyopsi sayısına bağımlı iken, diğer tüm sonuçlar biyopsi operatörü (örn., adımlar ve operatörler bağımsız diğer patlamalar etkilenebilir moleküler analiz dahil, blastosist morfolojik kalitesi, biyopsi günü) düzgün onun performansını değerlendirmek için muhasebeleştirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 7:8 çalışma trimesterinde operatör başına ortalama biyopsi zamanlaması. Tablo, 8 çalışma trimesterdeki her operatör tarafından işlem başına biyopsi yapılan ilgili prosedür sayısını ve ortalama blastositlerin sayısını özetler. Her grafikte noktalı kırmızı çizgi, biyopsinin genel ortalama zamanlamasını (8,24 dk) temsil eder. Hata çubukları standart sapmaları vardır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 8: yeniden genişleme biyopsi ve vitrifikasyon arasında zamanlama karşı ısınma sonra. (A) yeniden genişletilmemiş ve yeniden Genişletilebilir blastosist 1,5 hr ısınmadan sonra gösterir. Her blastosist, artan zamanlamalar boyunca siyah bir daire ile temsil edilir. Dikey sürekli siyah çizgiler, erken eşik olarak ayarlanan 30 dakika ve geç eşik olarak ayarlanmış 90 dk temsil eder. (B) üç grupta yeniden genişleme oranlarını gösterir (biyopsi ve vitrifikasyon arasındaki zamanlama: ≤ 30 dk, 31-90 dak, > 90 dk) daha fazla blastosist kalitesine ve biyopsi gününe göre kümelenir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| N prosedürleri | Prosedür başına biyopsi N blastosist | Biyopsi ± SD, Aralık (min) ortalama zamanlaması | |
| Operatör 1 | 443 | 2,01 ± 1,09, 1-4 | 7,41 ± 3,6, 3-22 |
| 39W | 1 | 4,75 ± 1,96, 3-16 | |
| 111 | 2 | 7,83 ± 2,45, 3-18 | |
| 71 | 3 | 10,27 ± 2,41, 4-16 | |
| 66 | 4 | 11,48 ± 3,81, 6-22 | |
| Operatör 2 | 290 | 1,81 ± 0,98, 1-4 | 7,87 ± 4,13, 3-22 |
| 142 | 1 | 5,69 ± 3,32, 3-16 | |
| 89 | 2 | 8,48 ± 2,79, 3-18 | |
| 30 | 3 | 11,37 ± 3,72, 4-20 | |
| 29 | 4 | 13,1 ± 3,89, 9-22 | |
| Operatör 3 | 287 | 1,98 ± 1,05, 1-4 | 9,10 ± 4,65, 3-22 |
| 121 | 1 | 6 ± 2,19, 3-15 | |
| 89 | 2 | 9,6 ± 3,87, 3-22 | |
| 38 | 3 | 12,66 ± 4,55, 4-22 | |
| 39 | 4 | 14,13 ± 4,8, 6-22 | |
| Operatör 4 | 217 | 1,66 ± 0,87, 1-4 | 7,58 ± 3,45, 3-22 |
| 118 | 1 | 5,58 ± 1,96, 3-14 | |
| 66 | 2 | 8,92 ± 2,91, 4-22 | |
| 21 | 3 | 11,48 ± 2,34, 5-16 | |
| 12 | 4 | 13 ± 4,26, 6-19 | |
| Operatör 5 | 144 | 2,03 ± 1,08, 1-4 | 9,43 ± 4,24, 3-22 |
| 59 | 1 | 6,15 ± 2,5, 3-16 | |
| 43 | 2 | 10,07 ± 2,73, 6-16 | |
| 20 | 3 | 12,6 ± 2,89, 9-18 | |
| 22 | 4 | 14,09 ± 4,43, 6-22 | |
| Operatör 6 | 121 | 1,67 ± 0,94, 1-4 | 7,79 ± 3,93, 3-22 |
| 70 | 1 | 6,19 ± 2,95, 3-16 | |
| 32 | 2 | 8,12 ± 1,72, 3-11 | |
| 9 | 3 | 12,78 ± 3,31, 9-18 | |
| 10 | 4 | 13,5 ± 6,19, 6-22 | |
| Operatör 7 | 42 | 1,62 ± 0,94, 1-4 | 14,19 ± 4,24, 6-22 |
| 27 | 1 | 11,85 ± 5,53, 6-16 | |
| 6 | 2 | 16,5 ± 3,73, 11-22 | |
| 7 | 3 | 19,86 ± 3,34, 13-22 | |
| 2 | 4 | 19 ± 4,24, 16-22 | |
| Toplam | 1544 | 1,89 ± 1,03, 1-4 | 8,24 ± 4,23, 3-22 |
| 732 | 1 | 5,78 ± 2,94, 3-16 | |
| 436 | 2 | 8,85 ± 3,14, 3-22 | |
| 196 | 3 | 11,72 ± 3,70, 4-22 | |
| 180 | 4 | 12,93 ± 4,43, 6-22 |
Tablo 1: Biyopsi operatörüne göre her prosedürün biyopsi ve ortalama blastositlerin toplam ortalama zamanlaması. Biyopsi işleminin ortalama zamanlaması, prosedür başına biyopsi edilen her sıralı blastosit sayısına göre de gösterilmiştir. Hem "biyopsi operatörü" ve "prosedür başına biyopsi blastosist sayısı" değişkenlerini içeren genelleştirilmiş bir doğrusal model "biyopsi zamanlaması" ile mükemmel bir şekilde ilişkilidir (R2 = 0,48, güç = 1).
Tamamlayıcı Şekil 1: prosedür için gerekli ana aygıtlar ve destekler. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Tamamlayıcı Tablo 1: Logistic regresyon analizi, biyopsi operatörü ile canlı Doğum arasında, vitrifiye-ısıtılmış euploid blastosist transferinden sonra önemli bir ilişki göstermez. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sadece iyi tecrübeli embriyologlar, eğitim süresini tamamlamış ve hem biyopsi hem de blastosist vitrifikasyonu gerçekleştirmelidir. Ayrıca, bir tanık, prosedürleri izlemek ve i sırasında etkili bir izlenebilirliği garanti etmek için gereklidir) biyopsi blastosist biyopsi çanak (Tamamlayıcı Şekil 1) sonrası biyopsi çanak (ek Şekil 1) hareketlerini ), ardından vitrifikasyon plakasına (Tamamlayıcı Şekil 1) ve son olarak vitrifikasyon desteğine (Tamamlayıcı Şekil 1); ii) biyopsi te hücrelerinin biyopsi çanağına PCR tüpüne aktarılması (Tamamlayıcı Şekil 1); iii) ısınma ve transfer adımları sonrası tanı. Tüm tanık adımlarının ayrıntılı bir açıklaması için daha önce14yayımlanan bir başarısızlık modları ve efektler ANALIZI (FMEA) bakın.
Bu yazıda açıklanan tüm yöntemler yerel yönetmeliğe (Italyan Hukuku 40/2004) saygı göstermeli. Yasa göre, aslında, Çift ıVF döngüsü sırasında üretilen embriyo sağlık durumu hakkında bilgilendirilmek isteyebilir. Bu bağlamda, PGT için ayrıntılı bilgilendirilmiş onay her iki ortaklardan imzalanmalıdır.
Bu yazıda, yoğun bir laboratuar rutininde PGT için Blastokist biyopsisi nasıl uygulanacağını tarif ettik. Blastosist biyopsi yaklaşımımızın uygulanması, son on yılda ıVF 'de önemli bir gelişme olmuştur. İlk olarak da Boer ve meslektaşları tarafından bildirilen172004, bu yakında daha etkili ve bilgilendirici bir prosedür ile karşılaştırıldığında, bölünme aşaması ve Polar vücut biyopsisi yaklaşımlar3tanınır. Bu prosedürün değeri esas olarak teknik yüklerin azalmasına neden olmaktadır, ayrıca kalkınma bu aşamasında kromozomal mozaikliğin daha düşük bir insidansı18,19. Dahası, bir blastosist birkaç te hücrelerinin kaldırılması bir bölünme evre embriyo bir plastomer kaldırılması daha güvenli bir prosedür olarak önerilmektedir. Nitekim, randomize olmayan bir seçim çalışmada eski yaklaşım embriyo implantasyon potansiyeli üzerinde herhangi bir etkiye neden olmadı, ikincisi önemli bir yer iken ~ 20% azalma20.
Genellikle dünya çapında kullanılan protokol, lazer destekli Zona açılışında 3 gün sonra-insemination gerektirir. Farklı blastosist biyopsi yaklaşımlarını karşılaştırmak için bugüne kadar randomize kontrollü bir deneme gerçekleştirilmiştir. Ancak, bu makul olan manipülasyonlar ve artan embriyo pozlama düşük çevresel koşullara, düşük potansiyel invaziv protokolün sayısı. Dahası, 3. günden itibaren zona pellucida bir delik varlığı blastosist genişleme etkileyebilir ve te hücreleri ile birlikte ICM hücrelerinin herniasyonu neden olabilir. Bu nedenlerden dolayı, burada açıklanan protokolün ayarlanması ve uygulanmasında, Blastokist tam genişlemeye ulaştığında sıralı lazer destekli Zona ihlali ve TE hücrelerinin alınmasını gerektirir. Ayrıca bir gün 5 veya 6 destekli hatching5,7gerektiren farklı bir protokol var. Özellikle, zona sondaj ICM ile ilgili olarak karşı tarafta 5 veya 6 Preimplantasyon gelişimi gün yapılır; blastosist daha sonra TE hücrelerinin spontan herninin beklenmesi için geri inkükobe taşınır. Açıkça, blastosist periyodik izlenmesi aşağıdaki saatlerde sağlanmalıdır, en kısa sürede TE fıtık başlayacaktır gibi biyopsi, yanı sıra tamamen hatching gelen embriyonun önlemek için. Eğer bir yandan vasıfsız uygulayıcılar kolayca bu alternatif biyopsi stratejisi uygulayabilirsiniz, öte yandan bu günlük çeşitli prosedürler gerçekleştiren yoğun bir laboratuar için uygun değildir. Burada açıklanan sıralı Zona açma ve blastosist biyopsi protokolü, bunun yerine daha az zaman alıcı ve daha kısa bir el zamanı ve laboratuarda günlük aktivite planlamak için daha yüksek bir esneklik sağlar böylece adanmış zaman dilimleri koordine etmek Biyopsi ve vitrifikasyon prosedürleri.
TE hücreleri yapışkan olabilir bu yana düşük kaliteli blastosist biyopsi için daha karmaşık olabilir, ama hücreler arasındaki kavşak ortaya çıkarmak için parça germe ile koordine daha fazla lazer çekim Blastokist vücutten kaldırmak için yeterlidir. Tam yumurtadan Blastokist zona pellucida içine blastosist gibi biyopsi olabilir, ama onlar vitrify ve sıcak yanıltıcı olabilir. Biyopsi sonrası belirsiz tanımlar durumunda, tarih bildirilen veri hiçbir zarar bir yeniden biyopsi ve aşağıdaki vitrifikasyon ısınma döngüsü16,21türetmek gibi görünüyor uyumlu olduğunu.
Vitrifikasyon Şu anda merkezi olarak sürekli daha güvenli, daha verimli ve daha az zaman alıcı bir inceleme ve meta-analiz en son literatürden daha yavaş donma protokolüne göre bildirilmiştir çünkü Blastokist koprezervasyon gerçekleştirmek için kullanılır 10' a kadar.
Prosedür iyi kurulmuş ve operatörler düzgün eğitimli olduktan sonra, hem blastosist biyopsi ve vitrifikasyon prosedürleri için ideal prosedür zamanlamaları tanımlamak için retrospektif bir analiz yapıldı (temsili sonuçlar burada özetlenmiştir). Son sonuçlar olarak, ısınmadan sonra 1,5 h 'de değerlendirilen euploid Blastokist 'in yeniden genişleme oranını ve vitrifiye-ısıtılmış euploid tek embriyo transferinden sonra elde edilen canlı Doğum oranını değerlendirdik. Biyopsi sonrası Blastokist dejenerasyonun hiçbir durumda görülmemiştir ve sadece% 0,2 (N = 1/572) dejenerasyon oranı ısıntıktan sonra rapor edildi, biyopsi ve vitribe yaklaşımlarının güvenilirliği onaylandı. Analizine göre, blastosist biyopsisi gerçekleştirmek için gereken zamanlama, yeniden genişleme oranı olarak tanımlanan ısınmadan sonra ya da canlı Doğum oranı olarak tanımlanan üreme potansiyeli olan euploid blastositlerin canlanabilirliğini etkilemez. Çeşitli zamanlamalar farklı uzmanlık ile operatörler arasında görülebilir olsa da, prosedür başına embriyo sayısına bağlı olarak 3 ila 22 dakika aralığında işlem yaklaşık 8 dakika içinde tamamlandığında Blastokist biyopsi güvenli düşünebilirsiniz (ancak hiçbir veri daha uzun aralıklarla gerçekleştirilen biyopsi prosedürleri için kullanılabilir). Her bir operatörün Blastokist biyopsisi için harcanan ortalama süre, KPI olarak izlenen periyodik olarak (en az üç ayda bir) olmalıdır. Ayrıca, vitrisif-ısıtılmış euploid blastosist transferinden sonra belirsiz tanı oranı ve canlı Doğum oranı da ele alınmalıdır. Son olarak, biyopsi ve vitrifikasyon arasında ideal zamanlaması özetlenmiştir. Biyopsi işleminden 30 dakika içinde blastoslar vitrifiye edildiğinde ısıntıktan sonra en yüksek yeniden genişleme hızını gözlemledik, bu değeri ideal eşik olarak öneriyoruz. Özellikle, biyopsi ve vitrifikasyon arasında daha uzun zaman, daha fazla biyopsi blastosist yeniden vağopreserved önce genişletmek olacaktır. Bu Cryo-hayatta kalma için zararlı olabilir, özellikle düşük kaliteli ve/veya gün 7 blastosist ile ilgili11. Yine de, vitrifikasyon 90 dakika ötesinde gecikse bile klinik sonuçlar üzerinde önemli bir etki görülmemiştir. Bu nedenle, sporadik durumlarda, bu tür zamanlamaları izin olabilir.
PGT için bir numune almak için seçilen yöntem embriyo viability etkilemez, güvenilir ve bilgilendirici sonuçlar içermelidir, klinik olarak etkili olmalıdır ve böylece maliyetleri ve laboratuar iş yükünü azaltmak uygulamak kolay olmalıdır. Blastosist biyopsisi tüm bu önkoşulları yerine getirmektedir. Yine de, hala iyi donanımlı bir laboratuvarda kalifiye operatörler tarafından gerçekleştirilmesi gereken bir invazif bir işlemdir. Şu anda, non-invaziv PGT (niPGT) yaklaşımı Avant-garde soruşturma altındadır. Belki de, gelecekte, ıVF sonra harcanan Kültür medya kromozomal ve/veya genetik test yapmak için analiz edilebilir. Bu, ıVF Kliniği için maliyetlerin daha düşük olacağını ve embriyo biyopsisi ile ilgili tüm iş yükünü sidestepped olacaktır beri ilginç bir gelecekteki perspektifindir. Ancak, genetik testler için harcanan medya analizinin güvenilirliği ve yeniden üretilebilirliği hala22,23,24değerlendirilmelidir, bu nedenle daha fazla çaba belirlemek ve bir protokol doğrulamak için yatırım yapılmalıdır Dünya çapında PGT gerçekleştiren tüm ıVF Klinikleri uygun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
AG ve RM verileri topladığımız ve taslağı tasarlanan. DC verileri analiz etti, temsili sonuçları hazırladı, istatistikleri gerçekleştirdi ve el yazması revize edildi. FMU ve LR, sonuçların ve tüm yazmanın eleştirel tartışmalarını sağladı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B. Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. Jansen, R., Mortimer, D. , Parthenon Press. 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
