Summary
Blastocyst biopsie en vitrificatie zijn vereist voor het efficiënt uitvoeren van preimplantatie genetische testen. Een aanpak die de sequentiële opening van de zona pellucida en het ophalen van 7-8 trophectoderm cellen in dag 5-7 post-inseminatie beperkt zowel het aantal benodigde manipulaties en de blootstelling van het embryo aan suboptimale omgevingscondities.
Abstract
Blastocyst biopsie wordt uitgevoerd om een betrouwbare genetische diagnose te verkrijgen tijdens IVF-cycli met pre-implantatie genetische testen. De ideale workflow omvat dan een veilig en efficiënt vitrificatie protocol, door de doorlooptijd van de diagnostische technieken en om de geselecteerde embryo (s) over een fysiologisch endometrium over te brengen in een volgende natuurlijke cyclus. Een biopsie benadering die de sequentiële opening van de zona pellucida omvat en het opvragen van 5-10 trophectoderm cellen (idealiter 7-8) beperkt zowel het aantal benodigde manipulaties als de blootstelling van het embryo aan suboptimale omgevingscondities. Na de juiste training, de techniek was reproduceerbaar over verschillende exploitanten in termen van timing van biopsie (~ 8 min, variërend 3-22 min op basis van het aantal embryo's tot biopsie per gerecht), definitieve diagnoses verkregen (~ 97,5%) en levende geboortecijfers na verglaasd-opgewarmde euploïde blastocyst overdracht (> 40%). De overlevingskans na biopsie, vitrificatie en opwarming was zo hoog als 99,8%. De re-expansie snelheid bij 1,5 uur van opwarming van de aarde was zo hoog als 97%, grotendeels afhankelijk van de timing tussen biopsie en vitrificatie (idealiter ≤ 30 min), blastocyst morfologische kwaliteit en de dag van de biopsie. In het algemeen is het beter om een ingeklapte blastocyst te vitrificeren; Daarom kan in niet-PGT-cycli lasergeassisteerde kunstmatige krimp worden uitgevoerd om embryo-instorting voorafgaand aan cryopreservation te induceren. Het meest veelbelovende toekomstperspectief is de niet-invasieve analyse van de IVF-cultuur media na de blastocyst-cultuur als een bron van embryonaal DNA. Deze potentiële avant-garde wordt echter nog steeds onderzocht en een betrouwbaar protocol moet nog worden gedefinieerd en gevalideerd.
Introduction
Het belangrijkste doel van de moderne menselijke embryologie is om het aantal levende geboorten per gestimuleerde cyclus te maximaliseren en kosten, tijd en inspanningen om een zwangerschap te bereiken te verminderen. Om dit doel te bereiken, moeten gevalideerde benaderingen voor embryoselectie worden gebruikt om reproductief bevoegde embryo's te identificeren binnen een cohort die tijdens een IVF-cyclus is verkregen. Volgens de laatste bewijzen is blastocyst Culture1 in combinatie met uitgebreide chromosomale testen en verglaasd euploïde embryo transfer (et) het meest efficiënte kader om IVF-efficiëntie2te verhogen. Het is duidelijk dat een aneuploïdie test een embryonaal specimen vereist, dat op dit moment meestal wordt weergegeven uit enkele cellen die worden opgehaald uit de trophectoderm (TE), d.w.z. het gedeelte van de blastocyst dat oorsprong geeft aan de embryonale bijlagen (bijv. de placenta) tijdens de zwangerschap . Naast de karyotype analyse, kunnen ook enkelvoudige genmutaties worden beoordeeld vanuit een TE biopsie als onderdeel van een klinische strategie die bekend staat als pre-implantatie genetische tests (PGT;-A voor aneuploidies,-SR voor structurele chromosomale herschikkingen,-M voor monogene ziekten). Andere methoden van eicel/embryo biopsie zijn theorie en de laatste decennia klinisch aangenomen, namelijk polaire lichamen biopsie en blastomere biopsie. Het gebruik ervan wordt tegenwoordig echter verminderd, omdat hun procedurele nadelen (bijv. hogere werklast en risico op reproductieve impact) en diagnostische beperkingen (bijv. problemen met één cel-analyse) impliciet een voldoende evenwicht tussen kosten, Risico's en voordelen (voor een beoordeling Zie3).
In dit document wordt een van de belangrijkste protocollen voor TE biopsie grondig beschreven, samen met de daaropvolgende verglavering, opwarming en overdrachtsprocedures vereist. De werkstroom die hier wordt geschetst is ideaal voor een drukke PGT-eenheid.
Zoals al eerder beschreven door onze groep4,5, de procedure omvat de sequentiële opening van de zona pellucida van volledig geëxpandeerde blastocysten en verwijdering van enkele te cellen (gemiddeld 7-8). Vergeleken met de dag 3 Laser-geassisteerde hatching gebaseerde blastocyst biopsie methode6, deze procedure zou kunnen verlichten het dagelijkse schema van een IVF-eenheid waar delicate procedures, zoals blastocyst biopsie en vitrificatie, moet tijdig worden uitgevoerd. Zodra de blastocyst zijn volledige expansie bereikt, kan de biopsie worden uitgevoerd door het selecteren van de TE cellen te verwijderen, waardoor het risico van herniatie van de binnenste celmassa (ICM), die anders de procedure uitdagend zou maken. In de literatuur is ook een derde Protocol van blastocyst biopsie beschreven, waarbij Laser-geassisteerde broedeieren worden uitgevoerd zodra het embryo al het blastocyst-stadium heeft bereikt, enkele uren voor de procedure5,7. Deze aanpak is echter meer tijdrovend en is vooral geschikt voor IVF-eenheden die TE biopsie uitvoeren in de handen van limitedly ervaren exploitanten en met het oog op een gematigde en lage dagelijkse werklast.
Intracytoplasmatische sperma injectie (ICSI)8 moet een geconsolideerde techniek zijn als het gaat om het uitvoeren van genetische analysen in IVF. Evenzo is een goed cultuur systeem om embryo's veilig te oogsten in de blastocyst-fase van cruciaal belang voor de uitvoering van de biopsie strategie. Een voldoende aantal incubators, evenals het gebruik van lage zuurstofspanning zijn belangrijke voorwaarden voor dit doel, niet te compromitteren de blastocyst rate9. Tegelijkertijd is een efficiënt cryopreservatie-programma nodig om een PGT-cyclus veilig te beheren. In de afgelopen tien jaar heeft de implementatie van vitrificatie de embryo Cryo-overlevingskansen zelfs tot > 99%10,11versterkt. Dit voorzag in voldoende tijd om genetische tests uit te voeren en embryo-overdracht uit te stellen naar de volgende menstruatiecyclus, op een niet-gestimuleerd en waarschijnlijk ontvankelijker endometrium12.
Zowel de biopsie als de vitrificatie zijn veeleisende taken waarvoor strenge vaardigheden nodig zijn en de effectiviteit ervan kan variëren tussen niet-ervaren operators. Een specifieke opleidingsperiode wordt daarom bepleit voordat elke exploitant deze procedures klinisch kan uitvoeren; Bovendien moet de instandhouding van de vaardigheden van de exploitanten periodiek worden geëvalueerd door monitoring van Key Performance Indicators (KPI) voor cryopreservatie en biopsie procedures. Elke IVF-kliniek moet daartoe interne Kpi's instellen, die de door internationale consortia gepubliceerde en/of de door de referentielaboratoria gepubliceerde uitkomsten moeten benaderen.
TE biopsie, vitrificatie-opwarming en getuige procedures zijn gevalideerde technieken in onze eenheid, die zijn gestandaardiseerd in alle betrokken operatoren zoals gerapporteerd in drie eerdere publicaties11,13,14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol voor humane blastocyst biopsie, hier beschreven, volgt de richtlijnen van G. EN. milieurisicobeoordeling van menselijk onderzoek.
Opmerking: Raadpleeg de materiaal tabel voor de benodigde materialen. Verder materiaal nodig omvat laboratorium schoeisel en uitrusting, chirurgische gelaatsmasker, haar deksel, chirurgische handschoenen, een permanente niet-giftige marker, Tang en ontsmettingsmiddel. Het gebruik van chirurgische Gown, wegwerp chirurgische handschoenen, Facemask, haar deksel is verplicht om het risico van besmetting te voorkomen. Alle werkgebieden, evenals de apparatuur die bij het proces betrokken is, moeten grondig worden gereinigd met een laboratorium ontsmettingsmiddel (bijv. Oosafe) voordat een procedure wordt gestart. Alle gebruikte verbruiksartikelen en media moeten steriel en afzonderlijk verpakt of aligeciteerd zijn. Er wordt voorgesteld om een speciaal werkstation voor biopsie en slangen te gebruiken en de toegang van het gebied alleen te beperken tot de exploitanten die betrokken zijn bij de procedure (embryoloog en getuige).
1. voorbereiding op de dag vóór de biopsie procedure
-
Bereid de post biopsie cultuur schotel.
- Plaats 6 druppels van 20 μL IVF-kweekmedium (tabel met materialen) in een IVF-kweek schaal en overlay met 6 ml voorverwarmde minerale olie voor de embryo cultuur (tabel met materialen).
- Voeg nog eens 10 μL IVF-kweekmedium toe aan elke druppel. Inincuberen bij een overnachting bij 37 °C in een gecontroleerde atmosfeer (5% O2, 6% co2).
-
Bereid een IVF Dish 4-well plaat voor het spoelen van de blastocyst na biopsie.
- Plaats 600 μL IVF-kweekmedium in de eerste twee putjes en bedekking met 300 μL voorverwarmde minerale olie voor de embryo cultuur.
- Inincuberen bij een overnachting bij 37 °C in een gecontroleerde atmosfeer (5% O2, 6% co2).
- Breng 1,5 μL van de ladings oplossing (tabel met materialen) in elke PCR-buis aan die voor de slang van de cellen wordt gebruikt, draai deze en houd deze op 4 °c.
2. voorbereiding op de dag van de biopsie procedure
-
Bereid de biopsie gerecht.
- Plaats 3 druppels van 10 μL HEPES-gebufferd medium (aangevuld met humaan serumalbumine) (tabel met materialen) op een rij in een IVF-kweek schaal.
- Herhaal stap 1.1.1 volgens het aantal beschikbare blastocysten (maximaal 4 blastocysten per gerecht) en overlay met 6 ml voorverwarmde minerale olie voor de embryo cultuur.
- Incuberen de schaal bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur voordat de biopsie procedure wordt uitgevoerd.
3. selectie en sortering van blastocyst
-
Graad van de blastocyst volgens de expansie en de morfologische verschijning van ICM en TE (Figuur 1).
Opmerking: de indelingscriteria zijn aangepast van Gardner and Schoolcraft15 en eerder beschreven door capalbo et al. en cimadomo et al.4,11.- Definieer de grootte en expansie graad als: A voor een volledig uitgekomen blastocyst, B voor een broed blastocyst, C voor een volledig geëxpandeerde blastocyst, en D voor een niet-geëxpandeerde blastocyst (deze embryo's worden alleen biopsied als ze niet verder uitbreiden tot dag 7).
- Definieer ICM Grade: 1 voor merkbaar ICM met verschillende strikt verpakte cellen; 2 voor zichtbaar met verschillende, maar grofweg verpakte cellen; 3 voor moeilijk te onderscheiden met zeer weinig lage kwaliteit cellen.
- Definieer TE grade als volgt: 1 voor goed georganiseerd epitheel met meerdere cellen; 2 voor losse epitheel met weinig cellen; 3 voor enkele en/of grote lage-kwaliteit cellen.
4. trophectoderm biopsie
- Voer de biopsie uit op alle levensvatbare volledig geëxpandeerde blastocysten (bij voorkeur C grade voor grootte en expansie).
- Set-en biopsie pipetten voor elke biopsie procedure. De aanbevelingen voor de pipet biopsie zijn de volgende: 30 μm inwendige diameter, 35 ° buighoek, 0,75 mm afstand tip om te buigen.
- Label de biopsie schotel met de details van de patiënt (naam en achternaam van de vrouw, geboortedatum en ID) en vervolgens nummer elke druppel met embryo en cyclus-Id's. Gebruik een permanente niet-giftige marker.
- Breng de blastocyst met een 300 μm strip pipet naar de eerste druppel van de biopsie schotel en spoel het om de overmaat van kweekmedium te verwijderen. Verplaats vervolgens de blastocyst in de tweede druppel van de biopsie schotel.
- Verplaats de schaal naar de omgekeerde Microscoop en prime de biopsie pipet aspireren sommige medium uit de derde druppel van de biopsie gerecht.
- Bij 20x vergroting, oriënteer de blastocyst om een duidelijk beeld van de ICM. Wanneer het wordt gevisualiseerd op 7 uur (tegenover het gebied dat zal worden gericht op het verwijderen van de TE cellen), zet het embryo op de Pipet (Figuur 2a).
- Concentreer u op de zona pellucida en Let er op dat zowel de pipetten als de blastocyst zich op hetzelfde brandvlak bevinden.
- Schakel over naar de laser doelstelling (pulstijd 0,3 MS, 6,5 μm) en plaats de laseraanwijzer op de zona pellucida aan de andere kant van ICM. Boor de zona pellucida door 2 − 3 laserpulsen (Figuur 2b).
- Druk zachtjes op de biopsie pipet tegen de zona pellucida en blaas wat medium door de breuk om de TE cellen los te maken van het inwendige oppervlak en versnellen blastocyst ineenstorting (figuur 2c).
- Zodra de te is losgemaakt (figuur 2D), voer door het gat (indien nodig, maak het breder met een laatste laserpuls) en aspiraat paar te cellen (idealiter 7 − 813,16) in de biopsie pipet met zachte zuigkracht (figuur 2e).
- Verplaats de biopsie pipet iets achteruit terwijl u een matige zuigkracht toepast om de doelcellen te strekken (figuur 2F).
- Richt de laser naar het dunste deel van de aanzuig cellen en brand 2 − 5 laserpulsen op de knooppunten tussen de cellen om de doelcellen te scheiden van het lichaam van het embryo (figuur 2g). De timing van laserpulsen en het aantal pulsen kan worden aangepast op basis van de kwaliteit van de blastocyst; Probeer ze echter te minimaliseren om cellysis te voorkomen.
- Na de scheiding van het TE fragment uit de blastocyst (figuur 2H), laat het in dezelfde biopsie vallen, ver van de blastocyst. Dit is nodig om te voorkomen dat ze in de biopsie pipet worden gezogen (figuur 2i).
- Laat de blastocyst los van de pipet en til beide pipetten onmiddellijk op om te voorkomen dat het fragment erop blijft plakken.
- Maak een foto van het biopsied fragment voor kwaliteitscontroledoeleinden (Figuur 3).
Let op: als meer dan één blastocyst per procedure wordt biopsied (maximaal vier per biopsie gerecht), verander de biopsie pipet met een nieuwe om kruisbesmetting tussen embryo's te voorkomen. - Herhaal stap 4.1 − 4.13.
- Verplaats de biopsie schaal terug naar de laminaire flow Hood.
- Label de post-biopsie cultuur schotel met de paar ID, en elke druppel met het embryo en de cyclus-ID.
- In aanwezigheid van een getuige, spoel de blastocyst in schone IVF medium, en tenslotte Verplaats het naar de bijbehorende druppel van de post-biopsie gerecht.
- Breng de post-biopsie schaal naar de incubator in een gecontroleerde atmosfeer (37 °C, 6% CO2,5% O2) tot vitrificatie. Het is raadzaam om de vitrificatie uit te voeren binnen 30 min van de biopsie procedure, om te voorkomen dat blastocyst re-expansie.
5. slangen
Opmerking: De hele procedure moet worden uitgevoerd in aanwezigheid van een getuige en binnen de laminaire stroom afzuigkap bij kamertemperatuur. Houd tijdens de procedure de PCR-buizen in een koudbuisrek op ijs (aanvullend figuur 1).
- Label de PCR-buisjes met een permanente niet-giftige marker.
Opmerking: Etikettering moet worden uitgevoerd zoals gevraagd door het genetisch laboratorium. In het algemeen, naam en achternaam van de patiënt (initialen), koppel-ID, embryo en cyclus-ID (bijvoorbeeld: JD 12345 1,2 voor het embryo N. 1 van de 2de cyclus behorend tot Jane Doe wiens paar ID is 12345). Embryo-ID moet ook worden gerapporteerd in letters op het lichaam van de buis. - Label de deksel van een kweek schotel van 60 mm x 15 mm (slang schaal) met de Id's van de biopsied embryo's (aanvullend figuur 1) en bereid 2 10 μL druppels biopsie wasoplossing (tabel met materialen) voor.
- Prime de 140 μm strippen Pipet (aanvullend figuur 1) met een aantal biopsie wasoplossing uit de tweede druppel van de slang schotel.
- Plaats de biopsie schotel onder de stereomicroscoop om eenvoudig het TE fragment (en) te visualiseren.
- Laat sommige biopsie wasoplossing zachtjes los op het TE fragment; Laad het vervolgens in de strip pipet.
- Verplaats het TE fragment naar de tweede druppel biopsie wasoplossing in de slang schaal en spoel het voorzichtig 2 − 3 keer.
- Breng het TE-fragment naar de onderkant van de PCR-buis (voorheen gelabeld na het) met laadoplossing, Let erop dat u de wanden niet aanraakt met de punt van de strippen pipet.
- Herhaal de procedure van stap 5,3 naar stap 5,7 voor elk TE fragment, aandacht voor het gebruik van een nieuw capillair voor elk TE fragment.
- Aan het einde van de slang procedure, zet alle PCR-buizen in een mini centrifuge, en spin ze voor een paar seconden.
- Bewaar de monsters bij-20 °C tot ze worden verzonden naar het door de verwijzende genetische laboratorium voor het testen.
6. vitrificatie van blastocyst
- Vitrify stortte blastocysten binnen 30 min van te biopsie in om hun re-expansie te voorkomen.
- Label de vitrificatie plaat met de details van de vrouw en de id's van de blastocysten die moeten worden verglaasd.
- Keur de vitrificatie-ondersteuning (en) af met de naam en achternaam van de vrouw, de id van het embryo dat erop wordt geladen, evenals de datum van de procedure. Speciale cryolabels worden gebruikt die hun integriteit behouden, zelfs bij zeer lage temperaturen (-196 °C).
- Breng bij kamertemperatuur 0,3 mL equilibratie oplossing (ES) (tabel metmaterialen) aan voor elke blastocyst die wordt verglaasd.
- In aanwezigheid van een getuige, verplaats de blastocyst in ES met behulp van de 300 μm strippen pipet.
- Laat de blastocyst in de ES voor 13 − 15 min. Na een eerste krimp van het volume zal een geleidelijke heruitzetting worden waargenomen.
- Vul een klein koel rek met vloeibaar stikstof (LN2) en plaats het onder de laminaire stroom afzuigkap.
- Breng 300 μL vitrificatie oplossing (VS) (tabel met materialen) in de tweede put aan. Na de blastocyst volledige re-expansie, breng het in de VS oplossing gedurende 1 minuut en spoel het om de ES te verdunnen.
- In aanwezigheid van een getuige, laad de blastocyst op de vitrificatie-ondersteuning en zorg voor het verwijderen van de overmaat van VS. Een subtiele film van oplossing moet de blastocyst omringen.
- Dompel de vitrificatie-ondersteuning in LN2 en beweeg deze energetisch om het risico op bellenvorming dicht bij het preparaat te verkleinen.
- Plaats de beschermdop met behoud van de vitrificatie-ondersteuning in LN2.
- In aanwezigheid van een getuige, verplaats de vitrificatie-ondersteuning in een lange termijn LN2 opslagtank.
7. kunstmatige krimp van niet-biopsied blastocysts
-
Als er geen te biopsie wordt uitgevoerd, de blastocysten kunstmatig instorten onmiddellijk voor de verglaking (Figuur 4).
- Verplaats de kweek schaal van de incubator naar de omgekeerde Microscoop en concentreer u op het geselecteerde embryo.
- Overschakelen naar de laser doelstelling (vooraf ingestelde puls: 0,3 MS, 6,5 μm), Target de zona pellucida aan de andere kant van ICM, dan direct 1 – 2 laserpulsen naar de kruisingen tussen TE cellen op een veilige afstand van de ICM. De blastocysten moeten in minder dan 5 minuten instorten.
- Ga verder met de vitrificatie van de ingeklapte blastocyst zoals beschreven in rubriek 6.
8. overdraagbare blastocyst opwarming
- Bereid op de dag van de ET de ET 4-put plaat door voor elke put 600 μL voorgeëscaleerd IVF-kweekmedium te plaatsen. Inincuberen bij 37 °C in een gecontroleerde atmosfeer (5% O2, 6% co2), terwijl de opwarming van de blastocyst wordt uitgevoerd.
- Label het verwarmende gerecht met de naam en achternaam van de vrouw, paar ID, ID van het embryo dat erin zal worden opgewarmd.
- Doseer 1 mL van de ontdooiing (TS) (tabel van de materialen) in een IVF-Éénput (aanvullend figuur 1) en verwarm het tot 37 °c in een thermostaat gedurende ten minste 1 uur voordat de procedure wordt gestart.
- Vul een kleine koelingondersteuning met LN2 en plaats deze in de laminaire flow kap in de nabijheid van het werkgebied.
- Voordat u begint met de procedure, Controleer de blastocyst informatie gerapporteerd over de vitrificatie-ondersteuning. Alle Id's moeten overeenkomen met het genetische rapport en de blastocyst naar warm moet worden gekozen tussen de overdraagbare. Een getuige is vereist tijdens de procedure.
- Neem het één-goed gerecht met opgewarmde TS uit de thermostaat en plaats het op een verwarmde podium onder de stereomicroscoop.
- Trek de beschermkap in de LN2 met behulp van de Tang.
- Dompel de punt van de vitrificatie steun snel in de 37 °C TS.
- Beweeg onder microscopische observatie de ondersteuning van de vitrificatie voorzichtig totdat de blastocyst uit de tip wordt losgelaten.
- Verlaat de blastocyst voor een totaal van 1 min in de TS, aandacht te houden aan de onderkant van de TS.
- Bij kamertemperatuur doseren 200 μL verdunnings oplossing (DS) (tabel met materialen) op de eerste put van de vitrificatie plaat.
- Breng de blastocyst over naar DS en plaats deze aan de onderkant van de put, terwijl sommige TS aan de bovenkant ervan worden vrijgegeven om een soort gradiënt te creëren. Laat het 3 min.
- Doseer 200 μL wasoplossing (WS) in 2 verschillende putjes (WS1-en WS2).
- Breng de blastocyst over naar WS1-en plaats deze op de bodem van de put, terwijl sommige DS medium op de bovenkant van het vrijgeven. Breng vervolgens de blastocyst over naar WS2 en laat het 1 minuut ongestoord.
- Label de post-warming ET plaat met de naam van de vrouw en achternaam, paar ID, ID van het embryo dat zal worden gekweekt in het.
- Breng in aanwezigheid van een getuige de opgewarmde blastocyst over naar het voorgeëormeerde kweekmedium in de post-warming ET plaat.
- Spoel de blastocyst in de eerste put van de ET-plaat en plaats deze in de tweede put.
- Breng de post-warming cultuur schotel over naar de incubator in een gecontroleerde atmosfeer (37 °C, 6% CO2,5% O2) en kweek de blastocyst gedurende ten minste 1,5 uur voordat je de overleving en heruitzetting controleert.
Opmerking: Figuur 5 toont voorbeelden van gedegenereerde, Cryo-overleefde, maar niet herbreidde en Cryo-overleefde en volledig geëxpandeerde blastocysts.
9. embryo transfer
- Voor het uitvoeren van ET, plaats het gerecht op het verwarmde podium van de laminaire stroom afzuigkap, zodat het embryo zichtbaar is onder de Microscoop bij een lage vergroting.
- Neem ongeveer 0,4 mL IVF-kweekmedium. Bevestig de punt van de spuit stevig aan het ontvangende uiteinde van de inwendige katheter en laat het medium vervolgens los tot 0,1 mL.
- Aspirate kweekmedium tot het observeren van de embryo's die de katheter binnenkomen (minimale hoeveelheid media: 10 − 15 μL).
- Plaats de katheter in de plastic behuizing en ga naar de operatiekamer en plaats de interne katheter in de externe geleider.
- Eenmaal de baarmoeder bereikt, duw de zuiger van de spuit om het embryo (s) vrij te geven. Laat zeer langzaam het medium los totdat de zuiger 0,1 mL leest.
- Neem de katheter terug naar het laboratorium en controleer onder de Microscoop of het embryo is overgebracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 6 vertegenwoordigt een schema van alle uitkomsten van een biopsie procedure die kunnen worden vastgesteld om het protocol te standaardiseren en de prestaties van elke operator te bewaken. De belangrijkste procedurele uitkomst is de timing voor het voltooien van de biopsie/biopsieën; de belangrijkste technische uitkomst is de kwaliteit van het perceel dat wordt geproduceerd na genetische tests die kunnen resulteren in een afdoende of twijfelachtige diagnose, waarvan de laatste een herbiopsie van de niet-gediagnosticeerde blastocyst vereist; de belangrijkste biologische uitkomst is de snelheid van Cryo-overleving en re-expansie versus degeneratie na opwarming van de aarde; Ten slotte is de belangrijkste klinische uitkomst de levende geboorte graad na verglaasd-opgewarmde blastocyst overdracht. In drie eerdere studies rapporteerden we de kpi's die in het centrum (s) werden gedefinieerd voor de technische, biologische en klinische uitkomsten11,13,16. Hierna rapporteren we in plaats daarvan hoe de KPI voor de timing van biopsie werd gedefinieerd. Bovendien werd ook de putatieve invloed van de timing tussen biopsie en verglavering op het post-verwarmende gedrag van euploïde blastocysten onderzocht.
In een periode van 2 jaar werden in totaal 1.544 trophectoderm biopsie procedures uitgevoerd door 7 operatoren (tabel 1). Alle biopsied blastocysten werden vervolgens terug naar de incubator verplaatst tot een cultuur gerecht na de biopsie tot vitrificatie. Alle relevante gegevens werden verzameld in een relationele database. Alle tijden van biopsie en tussen biopsie en vitrificatie werden achteraf verkregen uit de software van het IVF elektronische getuige systeem. De gegevens werden vervolgens geëxporteerd en geanalyseerd voor statistieken.
De Cryo-overlevingskans van euploïde blastocysten na trophectoderm biopsie en vitrificatie-opwarming was N = 571/572, 99,8%. De herexpansie snelheid bij 1,5 h na opwarming was N = 556/571, 97,4%. Onder de 15 niet opnieuw geëxpandeerde blastocysts resulteerde men in een levende bevalling nadat hij in utero was overgebracht. Het levend geboortecijfer na verglaasd-opgewarmde euploïde single blastocyst-overdracht was N = 227/572, 39,7%.
Definitie van de ideale timing van biopsie
Tabel 1 bevat een overzicht van de relevante gegevens van de uitgevoerde biopsie procedures. Overall, 1,89 ± 1,03 (bereik 1-4) blastocysten werden biopsied per procedure in 8,24 ± 4,23 min (bereik 3-22). De gemiddelde timing van de biopsie varieerde door zowel het aantal blastocysten biopsied per procedure, vanaf een minimum van 5,78 ± 2,94 min (bereik 3-16) wanneer slechts één embryo werd gelegd in het gerecht tot een maximum van 12,93 ± 4,43 min (bereik 6-22) wanneer de embryo's opeenvolgend biopsied we Re 4. Een andere relevante parameter was de operator die betrokken was bij de procedure: de meest deskundige (N = 443 procedures) was de snelste (7,41 ± 3,6 min, bereik 3-22), terwijl de minst ervaren (N = 42) het langzaamst was (14,19 ± 4,24 min, Range 6-22). Sterker nog, een gegeneraliseerd lineair model dat zowel het "aantal blastocysten biopsied per procedure" als de "operator"-variabelen beschrijft, verklaart perfect de "timing van de biopsie" met een R2 = 0,48 en een vermogen = 1. Deze analyse was nuttig om te definiëren dat idealiter ~ 6 min is genoeg voor een blastocyst biopsie procedure wanneer alleen een embryo wordt gelegd in het gerecht, terwijl ~ 9 min, ~ 12 min en ~ 13 min voor 2, 3 en 4 blastocysts, respectievelijk. Het is duidelijk dat de hele procedure inhoudt dat ook de embryo's van de cultuur naar de biopsie en van de laatste naar de post-biopsie cultuur schotel na de procedure worden verplaatst, en dat de biopsie pipet tussen opeenvolgende biopsies wordt gewijzigd.
Figuur 7 plots de gemiddelde timing van de biopsie voor elke exploitant langs het studie trimester (van de 1St naar de 8th). De rode stippellijn geeft de gemiddelde totale waarde van 8,24 min aan. Een dergelijke grafiek is nuttig voor het bewaken van de gemiddelde prestaties van elke beoefenaar. De meest deskundige operators (1 en 2) toonden bijvoorbeeld een constante afname van deze timing, wat een trend suggereert die kenmerkend is voor een leercurve. Alle operatoren van 3 tot 6 waren in plaats daarvan voldoende constant in hun prestaties rond de gemiddelde totale waarde over het trimester. Op elk moment toonden ze een piek in de gemiddelde waarde van een bepaald trimester (bijv. operator 3 in de 7e trimester, operator 4 in 6th trimester, operator 5 in de 3RD trimester), ze werden gewaarschuwd om hun prestaties te herzien. Operator 7 (d.w.z. de minst ervaren) toonde tijden die typerend zijn voor een embryoloog die net zijn training heeft afgerond. Eventueel zal hij/zij voldoen aan de normen intern in het Lab als de expertise zou toenemen.
Belangrijk is dat de tijd van biopsie vergelijkbaar was over opnieuw uitgebreid en niet opnieuw geëxpandeerde euploïde blastocysten op 1,5 h van opwarming van de aarde (9,52 ± 4,23 min, bereik 3-22 versus 10,5 ± 5,68 min, bereik 4-22; t-test = 0,37). Waarschijnlijk, geïmplanteerd (n = 229) en niet geïmplanteerd (n = 343) verglaasd-opgewarmde euploïde blastocysten toonde ook vergelijkbare biopsie tijden (9,77 ± 4,15 min, bereik 3-22 versus 9,41 ± 4,36 min, bereik 3-22; t-test = 0,39). Een timing van ≤ 22 min tot biopsie tot 4 blastocysten heeft dan mogelijk geen invloed op het embryo gedrag na opwarming van de aarde. Daarom hebben we deze waarde als maximale drempel gedefinieerd.
Evenzo werd geen verschil aangetoond in termen van levend geboortecijfer over de verschillende biopsie operatoren, zoals reeds eerder gerapporteerd13 (aanvullende tabel 1).
Een andere belangrijke parameter voor het bewaken van de prestaties van elke operator is de snelheid van de twijfelachtige resultaten na de diagnose, die zo dicht mogelijk bij de algemene prestaties van elk laboratorium moet zijn. Idealiter deze snelheid mag niet hoger zijn dan 2,5% en kan afnemen met de tijd als gevolg van een toenemende expertise in biopsie en tubing procedures16. Het doelaantal te halen cellen is 7-8 volgens twee eerdere studies13,16. Hiertoe wordt voorgesteld om een foto van het biopsied fragment voor kwaliteitscontrole doel te nemen (zie enkele voorbeelden in Figuur 3). Een dergelijke foto kan worden gecontroleerd in het geval van niet-overtuigende diagnoses om te beoordelen of de oorzaak is toerekenbaar aan de afmeting/kwaliteit van het fragment (d.w.z. lage kwaliteit van de moleculaire analyse), aan de slang (d.w.z. DNA-versterkings fout) of aan sommige problemen in de verwerking van het monster in het genetisch laboratorium.
Definitie van de ideale timing tussen biopsie en vitrificatie
In de studieperiode werden 572 euploïde blastocysten opgewarmd om een embryo overdracht te ondergaan na een diagnose van euploïdie. Figuur 8a toont elke opgewarmde blastocyst als een zwarte cirkel verdeeld over de toenemende timing tussen biopsie en vitrificatie en geclusterd in twee groepen volgens de onderzochte uitkomst: opnieuw uitgebreid of niet opnieuw uitgebreid binnen 1,5 h van Opwarming. Alle blastocysten (N = 117/117) worden binnen 30 minuten verglaasd, 97,6% (n = 245/251) van de blastocysten verglaasd tussen 31-90 min, en 95,1% (n = 194/204) van de blastocysten verglaasd na 90 min opnieuw geëxpandeerd, respectievelijk (geen herexpansie percentages: 0%, 2,4% en 4,9%). Daarom zetten we 30 min en 90 min als de vroege en late drempels van tijd tussen biopsie en vitrificatie.
Figuur 8b toont de re-expansie snelheid in de drie groepen (≤ 30 min, 31-90 min, > 90 min) verder sub-geclusterd volgens de blastocyst kwaliteit en dag van preimplantatie ontwikkeling. Vooral voor slechte kwaliteit en/of dag 7 blastocysts, de timing tussen biopsie en vitrificatie lijkt cruciaal om herexpansie na opwarming te bereiken. Specifiek, de quotering van re-expansie na opwarming gecorrigeerd voor zowel blastocyst kwaliteit en dag van de biopsie in blastocysten verglaasd binnen 30 minuten van biopsie versus blastocysten verglaasd na 90 min was 3,05 (95% CI 1.01-9.4, p = 0,05). In plaats daarvan vertegenwoordigde de periode tussen deze twee drempels (31-90 min) een grijs gebied dat al dan niet van invloed zou kunnen zijn.
Slechts 1 op 15 niet heruitgebreide blastocysten resulteerde in een levende geboorte na overdracht. Daarom hebben we ten slotte het levende geboortecijfer onderzocht dat werd bereikt na de opgewarmde euploïde single blastocyst Transfer geclusterd in de drie groepen op basis van de timing tussen biopsie en vitrificatie. Het hoogste levend geboortecijfer werd bereikt door overdracht van euploïde blastocysten, verglaasd ≤ 30 min van de trophectoderm biopsie (N = 56/117, 47,9%). Dit resultaat bereikte echter geen statistische significantie in vergelijking met dezelfde uitkomst, hetzij met blastocysten, verglaasd tussen 31 en 90 min (N = 92/251, 36,7%; Fisher ' s exacte test = 0,06), of met blastocysten verglaasd > 90 min van de biopsie (N = 81/204, 39,7%; Fisher ' s exacte test = 0,16). Daarom is ofwel een negatief effect op de voortplantings competentie van blastocyst verwaarloosbaar of is de steekproefgrootte in deze gegevensset (N = 572) onvoldoende om statistische significantie te bereiken.
Figuur 1: parameters voor het beoordelen van blastocyst. Expansie: (a) volledig uitgekomen, (B) in broedeieren, (C) volledig uitgevouwen en (D) niet uitgebreid. Het ideale stadium is C, terwijl een blastocyst D meer tijd moet krijgen om volledige expansie te bereiken, tenzij deze fase wordt bereikt in dag 7; Binnenste celmassa (ICM) morfologische kwaliteit: 1 (merkbaar met verschillende strikt verpakte cellen), 2 (onderscheidingsvermogen met verschillende maar grofweg verpakte cellen) en 3 (moeilijk te onderscheiden met zeer weinig lage-kwaliteit cellen); trophectoderm (te) morfologische kwaliteit: 1 (goed georganiseerd epitheel met verschillende cellen), 2 (Los epitheel met weinig cellen) en 3 (weinig en/of grote lage-kwaliteit cellen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: samenvatting van de sequentiële zona pellucida (ZP) opening en trophectoderm (te) cellen ophalen aanpak voor blastocyst biopsie. a) oriënteer de blastocyst met de binnenste celmassa (ICM) dicht bij de pipet en ver van de plaats waar de geselecteerde te cellen zullen worden teruggevonden. Bevestig de blastocyst op de Pipet van het bedrijf; b) Open de ZP via 2-3 Laser shots; (c) blaas wat cultuur media door het gat; d) de blastocyst zal loskoppelen van het ZP; (e) Voer de ZP en zuig 5-10 te cellen in de biopsie pipet; (f) beweeg achteruit met de biopsie pipet om het geselecteerde fragment uit te rekken en de knooppunten tussen de cellen bloot te leggen; g) brand op de kruisingen tussen de cellen en blijf het fragment strekken totdat de te cellen uit het lichaam van de blastocyst vrijkomen; h) de blastocyst na te biopsie is ingestort; (i) Maak een foto van het biopsie fragment voor kwaliteitscontrole en breng het over naar de PCR-buis die naar het genetische laboratorium wordt gezonden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: voorbeelden van biopsie fragmenten: a-c) gewenste fragmenten; d) het gelyseerd fragment; e) klein fragment met ontaarde cellen; f) klein, gedeeltelijk gelatiseerd en gedegenereerd fragment. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: kunstmatige krimp. a) oriënteren de blastocyst zodat de binnenste CELMASSA (ICM) ver van het beoogde deel van de trophectoderm (te) is; b) brand 2-3 Laser schoten in een rij op de knooppunten tussen te cellen en naar buiten te bewegen; (c) wacht totdat de blastocyst instort voordat de vitrificatie wordt gestart. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: voorbeelden van blastocyst degeneratie (a), Cryo-overleving maar geen re-expansie (b) en Cryo-overleving en volledige herexpansie (c) 1,5 h na de opwarming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: samenvatting van de verschillende uitkomsten van trophectoderm biopsie die kunnen worden gebruikt om de prestaties van een exploitant te bewaken en de belangrijkste prestatie-indicatoren binnen elk laboratorium te definiëren. De belangrijkste procedurele uitkomst is de timing van de biopsie. De belangrijkste technische uitkomst is de snelheid van de definitieve (euploïde of aneuploïde) en onduidelijk diagnoses (re-biopsie vereist) verkregen; Dit laatste kan worden veroorzaakt door DNA-versterking of moleculaire gegevens van lage kwaliteit, die beide resulteren in niet-interpreteerbaar chromosoom kopie profiel plots. De belangrijkste biologische uitkomst is de snelheid van Cryo-overleving en re-expansie of degeneratie na biopsie, verglavering en opwarming. De belangrijkste klinische uitkomst is de snelheid van levende geboorten of negatieve zwangerschapsuitkomsten bereikt na verglaasd-opgewarmde blastocyst overdracht. Hoewel de procedurele uitkomst uitsluitend afhankelijk is van de exploitant en het aantal blastocysten tot biopsie per procedure, kunnen alle andere uitkomsten worden beïnvloed door andere medeoprichters die onafhankelijk zijn van de exploitant van de biopsie (bijv. de stappen en de exploitanten betrokken bij de moleculaire analyse, de morfologische kwaliteit van de blastocyst, de dag van de biopsie) die moet worden verantwoord om goed te evalueren zijn/haar prestaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: gemiddelde timing van de biopsie per operator over de 8 studie trimesters. De tabel geeft een overzicht van het gerelateerde aantal procedures en het gemiddelde aantal blastocysten biopsied per procedure door elke operator in de 8 studie trimesters. De gestippelde rode lijn binnen elke grafiek vertegenwoordigt de totale gemiddelde timing van biopsie (8,24 min). De foutbalken zijn de standaarddeviaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: heruitzetting na opwarming versus timing tussen biopsie en vitrificatie. (A) toont de blastocysten 1,5 uur na het opwarmen niet opnieuw uit te breiden en opnieuw uit te breiden. Elke blastocyst wordt vertegenwoordigd door een zwarte cirkel over de toenemende timings. De verticale ononderbroken zwarte lijnen vertegenwoordigen 30 min set als vroege drempel en 90 min ingesteld als late Threshold. (B) toont de herexpansie percentages in de drie groepen (timing tussen biopsie en vitrificatie: ≤ 30 min, 31-90 min, > 90 min) verder geclusterd volgens blastocyst kwaliteit en dag van de biopsie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| N van de procedures | N blastocysten biopsied per procedure | Gemiddelde timing van biopsie ± SD, bereik (min) | |
| Operator 1 | 443 | 2,01 ± 1,09, 1-4 | 7,41 ± 3,6, 3-22 |
| 195 | 1 | 4,75 ± 1,96, 3-16 | |
| 111 | 2 | 7,83 ± 2,45, 3-18 | |
| 71 | 3 | 10,27 ± 2,41, 4-16 | |
| 66 | 4 | 11,48 ± 3,81, 6-22 | |
| Operator 2 | 290 | 1,81 ± 0,98, 1-4 | 7,87 ± 4,13, 3-22 |
| 142 | 1 | 5,69 ± 3,32, 3-16 | |
| 89 | 2 | 8,48 ± 2,79, 3-18 | |
| 30 | 3 | 11,37 ± 3,72, 4-20 | |
| 29 | 4 | 13,1 ± 3,89, 9-22 | |
| Operator 3 | 287 | 1,98 ± 1,05, 1-4 | 9,10 ± 4,65, 3-22 |
| 121 | 1 | 6 ± 2,19, 3-15 | |
| 89 | 2 | 9,6 ± 3,87, 3-22 | |
| 38 | 3 | 12,66 ± 4,55, 4-22 | |
| 39 | 4 | 14,13 ± 4,8, 6-22 | |
| Operator 4 | 217 | 1,66 ± 0,87, 1-4 | 7,58 ± 3,45, 3-22 |
| 118 | 1 | 5,58 ± 1,96, 3-14 | |
| 66 | 2 | 8,92 ± 2,91, 4-22 | |
| 21 | 3 | 11,48 ± 2,34, 5-16 | |
| 12 | 4 | 13 ± 4,26, 6-19 | |
| Operator 5 | 144 | 2,03 ± 1,08, 1-4 | 9,43 ± 4,24, 3-22 |
| 59 | 1 | 6,15 ± 2,5, 3-16 | |
| 43 | 2 | 10,07 ± 2,73, 6-16 | |
| 20 | 3 | 12,6 ± 2,89, 9-18 | |
| 22 | 4 | 14,09 ± 4,43, 6-22 | |
| Operator 6 | 121 | 1,67 ± 0,94, 1-4 | 7,79 ± 3,93, 3-22 |
| 70 | 1 | 6,19 ± 2,95, 3-16 | |
| 32 | 2 | 8,12 ± 1,72, 3-11 | |
| 9 | 3 | 12,78 ± 3,31, 9-18 | |
| 10 | 4 | 13,5 ± 6,19, 6-22 | |
| Operator 7 | 42 | 1,62 ± 0,94, 1-4 | 14,19 ± 4,24, 6-22 |
| 27 | 1 | 11,85 ± 5,53, 6-16 | |
| 6 | 2 | 16,5 ± 3,73, 11-22 | |
| 7 | 3 | 19,86 ± 3,34, 13-22 | |
| 2 | 4 | 19 ± 4,24, 16-22 | |
| Totale | 1544 | 1,89 ± 1,03, 1-4 | 8,24 ± 4,23, 3-22 |
| 732 | 1 | 5,78 ± 2,94, 3-16 | |
| 436 | 2 | 8,85 ± 3,14, 3-22 | |
| 196 | 3 | 11,72 ± 3,70, 4-22 | |
| 180 | 4 | 12,93 ± 4,43, 6-22 |
Tabel 1: Totale gemiddelde timing van biopsie en gemiddeld aantal blastocysten biopsied in elke procedure volgens biopsie operator. De gemiddelde timing van de biopsie is ook aangetoond volgens elk volgnummer van de blastocysten biopsied per procedure. Een gegeneraliseerd lineair model dat zowel de "biopsie operator" als het "aantal blastocysten biopsied per procedure"-variabelen omvat, correleert perfect met de "timing van biopsie" (R2 = 0,48, vermogen = 1).
Aanvullend figuur 1: hoofd apparaten en ondersteuningen die vereist zijn voor de procedure. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Logistieke regressieanalyse toont geen significante associatie tussen de biopsie operator en levende geboorte na verglaasd-opgewarmde euploïde blastocyst overdracht. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alleen goed ervaren, bekwame embryo logen die hun trainingsperiode hebben voltooid, moeten zowel TE biopsie als blastocyst vitrificatie uitvoeren. Bovendien is een getuige vereist om de procedures te monitoren en een efficiënte traceerbaarheid te garanderen tijdens i) de bewegingen van de biopsied blastocyst uit de biopsie schotel (aanvullend figuur 1) naar de post-biopsie schotel (aanvullend figuur 1 ), vervolgens op de vitrificatie plaat (aanvullend figuur 1) en ten slotte op de vitrificatie steun (aanvullend figuur 1); II) de overdracht van biopsied TE cellen uit de biopsie schotel naar de PCR-buis (aanvullend figuur 1); III) de opwarming en de overdracht stappen na de diagnose. Voor een gedetailleerde beschrijving van alle getuige stappen verwijzen naar een storing modi en effectenanalyse (FMEA) eerder gepubliceerd14.
Alle in dit artikel beschreven methoden respecteren de lokale regelgeving (Italiaanse wet 40/2004). Volgens de wet kan het echtpaar vragen om geïnformeerd te worden over de gezondheidstoestand van de embryo's die zij tijdens de IVF-cyclus hebben geproduceerd. In dit verband moet een gedetailleerde geïnformeerde toestemming voor PGT van beide partners worden ondertekend.
In dit artikel wordt beschreven hoe u blastocyst biopsie voor PGT in een drukke laboratorium routine implementeert. De toepassing van de blastocyst biopsie aanpak is een belangrijke vooruitgang in het laatste decennium in IVF geweest. Eerst gerapporteerd door de boer en collega's in 200417, het is al snel erkend als een meer effectieve en informatieve procedure in vergelijking met splijting stadium en Polar Body biopsie benaderingen3. De waarde van deze procedure bevindt zich voornamelijk in een vermindering van de technische lasten, maar ook in een lagere incidentie van chromosomaal mosaicisme in dit stadium van ontwikkeling18,19. Bovendien is de verwijdering van enkele TE cellen uit een blastocyst gesuggereerd als een veiligere procedure dan het verwijderen van een blastomere uit een decolleté stadium embryo. Inderdaad, in een gerandomiseerde niet-selectie-studie heeft de vroegere benadering geen invloed op het implantatie potentieel van embryo's, terwijl deze een significante reductie van ~ 20% van20omvatte.
Het protocol dat meestal wereldwijd wordt gebruikt, impliceert een door laser ondersteunde Zona opening in dag 3 na inseminatie. Geen gerandomiseerde gecontroleerde trial is tot nu toe uitgevoerd om de verschillende blastocyst biopsie benaderingen vergelijken. Het is echter redelijk dat hoe lager het aantal manipulaties en blootstellingen van de groeiende embryo's aan suboptimale omgevingscondities, hoe lager de potentiële invasiviteit van het protocol. Bovendien kan de aanwezigheid van een gat in de zona pellucida vanaf dag 3 van ontwikkeling invloed hebben op de expansie van blastocyst en de herniatie van ICM-cellen samen met de cellen veroorzaken. Om deze redenen stellen en implementeren we het protocol dat hier wordt beschreven en dat de sequentiële Laser-ondersteunde Zona schenden en te-cellen omvat zodra de blastocyst volledige expansie bereikt. Er bestaat ook een ander protocol dat een dag 5 of 6 geassisteerde broedeieren van5,7inhoudt. In het bijzonder wordt het boren van de Zona uitgevoerd op dag 5 of 6 van de ontwikkeling van preimplantatie aan de andere kant met betrekking tot de ICM; de blastocyst wordt vervolgens teruggeplaatst naar de incubator die wacht op de spontane herniatie van TE cellen. Het is duidelijk dat periodieke controle van de blastocyst moet worden gegeven in de volgende uren, om het te biopsie zodra het TE beginnen met herniating, en om te voorkomen dat het embryo volledig uitbroeden. Als aan de ene kant ongeschoolde beoefenaren gemakkelijk deze alternatieve biopsie strategie kunnen implementeren, aan de andere kant is het niet geschikt voor een drukke laboratorium uitvoeren van verschillende procedures per dag. Het hier beschreven sequentiële Zona opening-en blastocyst-biopsie protocol is in plaats daarvan minder tijdrovend en zorgt voor een kortere hands-on tijd en een hogere flexibiliteit om de dagelijkse activiteit in het laboratorium te plannen, zodat de tijdsperioden die gewijd zijn aan van de biopsie en de vitrificatie procedures.
Slechte kwaliteit blastocysten wellicht complexer tot biopsie omdat de te cellen kleverig kunnen zijn, maar meer Laser shots gecoördineerd met het uitrekken van het fragment om de knooppunten tussen de cellen bloot te leggen zijn voldoende om het uit het lichaam van de blastocyst te verwijderen. Volledig uitgekomen blastocyst kan worden biopsied zoals blastocysten ingesloten in de zona pellucida, maar ze kunnen worden lastiger om te vitrify en warm. In geval van twijfelachtige diagnoses na biopsie, zijn de tot op heden gerapporteerde gegevens overeenstemmende dat geen schade lijkt te voortvloeien uit een re-biopsie en een volgende vitrificatie-opwarming cyclus16,21.
Vitrificatie wordt momenteel in het centrum gebruikt om blastocyst cryopreservatie uit te voeren, omdat het consequent veiliger, efficiënter en minder tijdrovend is gemeld dan langzaam invriezing Protocol van een Review en meta-analyse van de meest recente literatuur 10.
Zodra de procedure goed was vastgesteld en de exploitanten goed getraind, voerden we een retrospectieve analyse uit om de ideale procedurele tijden te definiëren voor zowel de blastocyst-biopsie-als de vitrificatie procedures (samengevat hier in de representatieve resultaten). Als eindresultaat hebben we de herexpansie snelheid van euploïde blastocyst geëvalueerd op 1,5 h na de opwarming en het levende geboortecijfer bereikt na verglaasd euploïde enkelvoudige embryo overdracht. Geen enkel geval van blastocyst degeneratie werd waargenomen na biopsie, en slechts 0,2% (N = 1/572) van degeneratie tarief werd gerapporteerd na opwarming van de aarde, bevestiging van de betrouwbaarheid van de biopsie en vitrificatie benaderingen aangenomen. Volgens de analyse, de timing vereist voor het uitvoeren van blastocyst biopsie heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van de euploïde blastocysts na opwarming gedefinieerd als re-expansie tarief, of reproductieve potentieel gedefinieerd als levend geboortecijfer. Hoewel verschillende tijden kunnen worden waargenomen tussen operators met verschillende expertise, kunnen we blastocyst biopsie veilig beschouwen wanneer de procedure is voltooid in ongeveer 8 minuten, in een bereik van 3 tot 22 min afhankelijk van het aantal embryo's per procedure (er zijn echter geen gegevens beschikbaar voor biopsie procedures die in langere intervallen worden uitgevoerd). De gemiddelde tijd besteed aan blastocyst biopsie van elke enkele operator moet periodiek (ten minste elke drie maanden) worden bewaakt als KPI. Daarnaast moet ook het percentage van de twijfelachtige diagnose en het levend geboortecijfer na verglaasd-opgewarmde euploïde blastocyst-overdracht worden aangepakt. Tot slot hebben we de ideale timing geschetst tussen biopsie en vitrificatie. Omdat we na het opwarmen de hoogste re-expansie graad observeerden toen blastocysten binnen 30 minuten na de biopsie werden verglaasd, suggereren we deze waarde als de ideale drempel. Specifiek, hoe langer de tijd tussen biopsie en vitrificatie, hoe meer de biopsied blastocyst zal opnieuw uit te breiden alvorens te worden cryopreserved. Dit kan schadelijk zijn voor Cryo-overleving, vooral bij het omgaan met slechte kwaliteit en/of dag 7 blastocysten11. Niettemin werd geen significant effect op de klinische uitkomsten waargenomen, zelfs als de vitrificatie na 90 min werd vertraagd. Daarom, in sporadische gevallen, dergelijke tijden kan worden toegestaan.
De methode die wordt gekozen om een specimen voor PGT op te halen, mag de levensvatbaarheid van embryo's niet aantasten, moet betrouwbare en informatieve resultaten opleveren, moet klinisch effectief zijn en moet gemakkelijk te implementeren zijn, waardoor de kosten en de laboratorium belasting worden verminderd. Blastocyst biopsie voldoet aan al deze voorwaarden. Niettemin, het is nog steeds een invasieve procedure die moet worden uitgevoerd door bekwame exploitanten in een goed uitgerust laboratorium. Momenteel wordt de avant-garde van een niet-invasieve PGT-benadering (niPGT) onderzocht. Misschien kunnen in de toekomst de verbruikte kweekmedia na IVF worden geanalyseerd om chromosomale en/of genetische tests uit te voeren. Dit is een intrigerend toekomstperspectief, aangezien de kosten voor de IVF-kliniek lager zouden zijn en alle werklast die de embryo biopsie met zich meebrengt, zou worden afgetrapt. De betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de analyse van de verbruikte media voor genetische tests moeten echter nog worden beoordeeld22,23,24, daarom moeten er meer inspanningen worden geïnvesteerd om een protocol te definiëren en te valideren dat geschikt voor alle IVF-klinieken die wereldwijd een PGT uitvoeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
AG en RM hebben de gegevens verzameld en het manuscript opgesteld. DC analyseerde de gegevens, stelde de representatieve resultaten voor, voerde de statistieken uit en reviseerde het manuscript. FMU en LR hebben een kritische bespreking van de resultaten en van het hele manuscript gegeven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B. Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. Jansen, R., Mortimer, D. , Parthenon Press. 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
