Summary
A biópsia e a vitrificação do Blastocyst são exigidas para conduzir eficientemente o teste genético do pré-implante. Uma aproximação que implica a abertura seqüencial da zona pelúcida e a recuperação de 7-8 pilhas do trofectoderma no dia 5-7 pós-inseminação limita o número de manipulações exigidas e a exposição do embrião às condições ambientais suboptimal.
Abstract
A biópsia do Blastocyst é executada para obter um diagnóstico genético de confiança durante ciclos de IVF com teste genético do pré-implante. Em seguida, o fluxo de trabalho ideal implica um protocolo de vitrificação seguro e eficiente, devido ao tempo de resposta das técnicas diagnósticas e à transferência do (s) embrião (es) selecionado em um endométrio fisiológico em um ciclo natural seguinte. Uma aproximação da biópsia que abrange a abertura seqüencial do pelúcida da zona e a recuperação de 5-10 pilhas do trofectoderma (idealmente 7-8) limita o número de manipulações exigidas e a exposição do embrião às condições ambientais suboptimal. Após o treinamento adequado, a técnica foi reprodutível em diferentes operadores em termos de tempo de biópsia (~ 8 min, variando de 3-22 min com base no número de embriões para biópsia por prato), diagnósticos conclusivos obtidos (~ 97,5%) e taxas de natalidade ao vivo após a transferência de blastocisto de euplóide vitrificado-aquecido (> 40%). A taxa de sobrevida após biópsia, vitrificação e aquecimento foi tão alta quanto 99,8%. A taxa da re-expansão em 1,5 h do aquecimento era tão elevada quanto 97%, pela maior parte dependente do sincronismo entre a biópsia e a vitrificação (idealmente ≤ 30 minutos), a qualidade morfológica do blastocisto e o dia da biópsia. Em geral, é melhor vitrificar um blastocist colapsado; Conseqüentemente, em ciclos da não-PGT, o encolhimento artificial laser-ajudado pôde ser executado para induzir o colapso do embrião antes da criopreservação. A perspectiva futura a mais prometedora é a análise não invasora dos meios de cultura do IVF após a cultura do blastocisto como uma fonte putativo do ADN embrionário. No entanto, este potencial avant-garde ainda está investigação e um protocolo confiável ainda precisa ser definido e validado.
Introduction
O principal objetivo da embriologia humana moderna é maximizar o número de nascidos vivos por ciclo estimulado e reduzir custos, tempo e esforços para conseguir uma gravidez. Para atingir esse objetivo, devem ser empregadas abordagens validadas para a seleção de embriões para identificar embrião reproductivamente competentes dentro de uma coorte obtida durante um ciclo de FIV. De acordo com as evidências as mais atrasadas, a cultura1 do blastocisto combinada com o teste cromossomático detalhado e transferência Vitrified-aquecida do embrião do ADN (et) é a estrutura a mais eficiente para aumentar a eficiência2de IVF. Claramente, o teste de aneuploidia requer um espécime embrionário, que presentemente é representado na maior parte de poucas pilhas recuperadas do trofectoderma (te), isto é, a seção do blastocisto que dá a origem aos anexos do embrião (por exemplo, a placenta) durante a gravidez . Além da análise do karyotype, também as únicas mutações genéticas puderam ser avaliadas de uma biópsia do te como parte de uma estratégia clínica conhecida como o teste genético do preimplante (PGT;-a para aneuploidies,-Sr para rearranjos cromossomáticos estruturais,-M para doenças monogênica). Outros métodos da biópsia do oocyte/embrião foram teorized e adotados clìnica através das últimas décadas, a saber biópsia dos corpos polares e biópsia do blastômero. No entanto, a sua utilização é reduzida nos dias de hoje, uma vez que as suas desvantagens processuais (por exemplo, maior carga de trabalho e risco de impacto reprodutivo) e limitações diagnósticas (por exemplo, problemas de análise de células únicas) impedem implicitamente um equilíbrio suficiente entre custos, riscos e benefícios (para uma revisão ver3).
Neste trabalho, um dos principais protocolos para a biópsia TE é completamente descrito juntamente com os procedimentos subsequentes de vitrificação, aquecimento e transferência necessários. O fluxo de trabalho aqui descrito é ideal para uma unidade PGT ocupada.
Como já descrito anteriormente pelo nosso grupo4,5, o procedimento envolve a abertura sequencial da zona pelúcida de blastocistos totalmente expandidos e remoção de poucas células te (em média 7-8). Comparado ao dia 3 laser-ajudado a incubação-baseou o método6da biópsia do blastocisto, este procedimento pôde facilitar a programação diária de uma unidade de IVF onde os procedimentos delicados, tais como a biópsia e a vitrificação do blastocisto, devam ser executados oportuna. Assim que o blastocisto alcança sua expansão cheia, a biópsia pode ser realizada selecionando as pilhas do te a remover, assim impedindo o risco do herniation da massa interna da pilha (ICM), que de outra maneira tornaria o procedimento desafiante. Na literatura, um terceiro Protocolo da biópsia do blastocisto foi descrito igualmente, que envolva o incubação laser-ajudado que está sendo executado uma vez que o embrião já alcangou o estágio do blastocisto, poucas horas antes do procedimento5,7. Entretanto, esta aproximação é mais demorada e sere principalmente as unidades de IVF que estão implementando a biópsia do te nas mãos de operadores limitadamente experimentados e em vista de uma carga de trabalho diária moderada-baixa.
A injeção intracytoplasmatic do esperma (ICSI)8 deve ser uma técnica consolidada se visando conduzir análises genéticas em IVF. Da mesma forma, um sistema de cultura adequado para a colheita segura de embriões para o estágio de blastocist é crucial para a implementação da estratégia de biópsia de TE. Um número adequado de incubadoras, bem como o uso de baixa tensão de oxigênio são pré-requisitos chave para este fim, para não comprometer a taxa de blastocist9. Ao mesmo tempo, um programa de criopreservação eficiente é necessário para gerenciar com segurança um ciclo de PGT. Na última década, a implantação da vitrificação impulsionou as taxas de criosobrevivência embrionária até > 99%10,11. Isso proporcionou tempo suficiente para realizar testes genéticos e adiar a transferência de embriões para o seguinte ciclo menstrual, em um endométrio não estimulado e provavelmente mais receptivo12.
Tanto a biópsia de TE quanto a vitrificação são tarefas exigentes que exigem habilidades rigorosas e sua eficácia pode variar em operadores não experientes. Um período de formação específico é, portanto, defendido antes de permitir que cada operador realize estes procedimentos clinicamente; Além disso, a manutenção das competências dos operadores deve ser avaliada periodicamente através da monitorização dos indicadores-chave de desempenho (KPI) para os procedimentos de criopreservação e biópsia. Cada clínica de fertilização in vitro deve definir KPIs internos para esse fim, que devem aproximar os publicados por consórcios internacionais e/ou os resultados publicados por laboratórios de referência.
Os procedimentos de biópsia, vitrificação-aquecimento e testemunhando são técnicas validadas em nossa unidade, que foram padronizadas em todos os operadores envolvidos, conforme relatado em três publicações anteriores11,13,14 .
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Protocol
O protocolo para a biópsia humana do blastocisto, descrito aqui, segue as directrizes do Comitê de Ethic da pesquisa humana de G. en. a.r.a..
Nota: Consulte a tabela de materiais para materiais necessários. Material adicional necessário implica calçado de laboratório e equipamento, facemask cirúrgico, tampa do cabelo, luvas cirúrgicas, um marcador permanente não-tóxico, fórceps e desinfetante. O uso do vestido cirúrgico, luvas cirúrgicas descartáveis, facemask, tampa do cabelo é obrigatório para evitar o risco de contaminação. Todas as áreas de trabalho, bem como os equipamentos envolvidos no processo, devem ser cuidadosamente limpos com desinfetante laboratorial (por exemplo, Oosafe) antes de iniciar qualquer procedimento. Todos os consumíveis e meios de comunicação utilizados devem ser estéreis e embalados individualmente ou aliquotados. Sugere-se a utilização de uma estação de trabalho dedicada para biópsia e tubulação e limitar o acesso da área apenas para os operadores envolvidos no procedimento (embriologista e testemunha).
1. preparação no dia anterior ao procedimento de biópsia
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Prepare o prato de cultura pós-biópsia.
- Coloque 6 gotas de 20 μL de meio de cultura IVF (tabela de materiais) em um prato de cultura IVF e sobreposição com 6 ml de óleo mineral pré-aquecido para cultura embrionária (tabela de materiais).
- Adicione mais 10 μL de meio de cultura IVF a cada gota. Incubar durante a noite a 37 ° c numa atmosfera controlada (5% O2, 6% co2).
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Prepare uma placa do prato de IVF 4-well para enxaguar o blastocisto após a biópsia.
- Colocar 600 μL de meio de cultura de fertilização in vitro nos dois primeiros poços e sobrepor com 300 μL de óleo mineral pré-aquecido para cultura embrionária.
- Incubar durante a noite a 37 ° c numa atmosfera controlada (5% O2, 6% co2).
- Dispense 1,5 μL de solução de carga (tabela de materiais) em cada tubo de PCR a ser utilizado para tubos de células te, gire-o e mantenha-o a 4 ° c.
2. preparação no dia do procedimento de biópsia
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Prepare o prato de biópsia.
- Coloque 3 gotas de 10 μL de meio tamponado HEPES (suplementado com albumina sérica humana) (tabela de materiais) em uma fileira em um prato de cultura IVF.
- Repita o passo 1.1.1 de acordo com o número de blastocistos disponíveis (até 4 blastocistos por prato) e sobreposição com 6 mL de óleo mineral pré-aquecido para a cultura embrionária.
- Incubar o prato a 37 ° c durante pelo menos 1 h antes de realizar o procedimento de biópsia.
3. seleção e nivelamento do Blastocyst
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Classific o blastocisto de acordo com sua expansão e a aparência morfológica de ICM e de te (Figura 1).
Nota: os critérios de nivelamento foram adaptados de Gardner e Schoolcraft15 e descritos anteriormente por Capalbo et al. e Cimadomo et al.4,11.- Defina o tamanho e a classe da expansão como: a para um blastocisto inteiramente-chocado, B para um blastocisto de eclosão, C para um blastocisto inteiramente expandido, e D para um blastocisto não expandido (estes embriões são biópsia somente se não se expandiram mais até o dia 7).
- Defina a classe ICM: 1 para o ICM perceptível com diversas pilhas estritamente-embaladas; 2 para discernable com diversas mas aproximadamente-pilhas embaladas; 3 para difícil distinguir com muito poucas células de baixa qualidade.
- Definir TE grau da seguinte maneira: 1 para epitélio bem organizado com várias células; 2 para o epitélio frouxo com poucas pilhas; 3 para poucas e/ou grandes células de baixa qualidade.
4. biópsia do trophectoderm
- Realize a biópsia de TE em todos os blastocistos totalmente expandidos viáveis (preferivelmente classe de C para o tamanho e a expansão).
- Ajuste as pipetas da terra arrendada e da biópsia para cada procedimento da biópsia. As recomendações para a pipeta da biópsia são as seguintes: diâmetro interno de 30 μm, ângulo de curvatura de 35 °, ponta da distância de 0,75 milímetros à curvatura.
- Rotule o prato de biópsia com os detalhes do paciente (nome e sobrenome da mulher, data de nascimento e ID) e, em seguida, número de cada gota com embriões e IDs de ciclo. Use um marcador permanente não-tóxico.
- Transfira o blastocisto com uma pipeta de descascamento de 300 μm à primeira gota do prato da biópsia e enxague-a a fim remover o excesso de meio de cultura. Em seguida, mova o blastocisto na segunda gota do prato de biópsia.
- Mova o prato para o microscópio invertido e prime a pipeta de biópsia aspirando algum meio da terceira gota do prato de biópsia.
- Na ampliação 20x, Oriente o blastocisto para ter uma vista desobstruída do ICM. Quando é visualizado às 7 horas (oposto à área que será alvejada para remover as pilhas de TE), prenda o embrião na pipeta da terra arrendada (Figura 2a).
- Concentre-se na zona pelúcida e verificar que ambas as pipetas e o blastocist estão no mesmo plano focal.
- Mude para o objetivo do laser (tempo de pulso 0,3 ms, 6,5 μm) e posicione o ponteiro laser na zona pelúcida no lado oposto do ICM. Perfure a zona pelúcida através de pulsos laser 2 − 3 (Figura 2b).
- Pressione suavemente a pipeta de biópsia contra a zona pelúcida e soprar algum meio através da ruptura para separar as células te de sua superfície interna e acelerar o colapso do blastocisto (Figura 2C).
- Uma vez que o te é destacado (Figura 2D), incorpore através do furo (se exigido, faça-o mais largo com um último pulso do laser) e aspirado poucas pilhas do te (idealmente 7 − 813,16) na pipeta da biópsia com sucção delicada (Figura 2e).
- Mova levemente a pipeta da biópsia para trás ao aplicar uma sucção moderada para esticar as células-alvo (Figura 2F).
- Direcionar o laser para a parte mais fina das células aspiradas e disparar 2 a 5 pulsos de laser nas junções entre as células para separar as células-alvo do corpo do embrião (Figura 2G). O sincronismo de pulsos do laser e o número de pulsos podem ser ajustados de acordo com a qualidade do Blastocyst; no entanto, tente minimizá-los para evitar a lise celular.
- Após a separação do fragmento te do blastocist (Figura 2h), libere-o na mesma gota da biópsia longe do blastocisto. Isso é necessário para evitar que eles sejam sugados novamente para a pipeta de biópsia (Figura 2i).
- Libere o blastocist da pipeta da terra arrendada e levante prontamente ambas as pipetas para impedir que o fragmento fure-lhes.
- Tirar uma foto do fragmento biopsiado para fins de controle de qualidade (Figura 3).
Nota: se mais do que um único blastocisto deve ser biopsiado por procedimento (até quatro por prato de biópsia), mude a pipeta de biópsia com uma nova para evitar a contaminação cruzada entre os embriões. - Repita os passos 4.1 − 4.13.
- Mova o prato de biópsia de volta para a capa de fluxo laminar.
- Rotule o prato de cultura pós-biópsia com o ID do casal e cada gota com o embrião e o ID do ciclo.
- Na presença de uma testemunha, enxague o blastocisto no meio limpo de IVF, e mova-o por último a sua gota correspondente do prato da borne-biópsia.
- Mova o prato pós-biópsia para a incubadora em uma atmosfera controlada (37 ° c, 6% CO2,5% O2) até a vitrificação. É aconselhável realizar a vitrificação dentro de 30 minutos do procedimento da biópsia, para impedir o re-Expansion do blastocisto.
5. tubulação
Nota: O procedimento inteiro deve ser realizado na presença de uma testemunha e dentro da capa do fluxo laminar na temperatura ambiente. Durante o procedimento, mantenha os tubos do PCR em uma cremalheira fria do tubo no gelo (Figura suplementar 1).
- Rotule os tubos do PCR com um marcador não-tóxico permanente.
Nota: A rotulagem deve ser realizada conforme solicitado pelo laboratório genético. Geralmente, o nome e sobrenome do paciente (iniciais), ID do casal, embrião e ID do ciclo (por exemplo: JD 12345 1,2 para o embrião N. 1 do 2º ciclo pertencente a Jane Doe cujo par ID é 12345). A identificação do embrião deve ser relatada também nas letras no corpo do tubo. - Rotule a tampa de um prato de cultura de 60 mm x 15 mm (prato de tubos) com os IDs de embriões biopsiados (Figura complementar 1) e prepare 2 10 μL de gotas de solução de lavagem de biópsia (tabela de materiais).
- Prima a pipeta de descascamento de 140 μm (Figura complementar 1) com alguma solução de lavagem da biópsia da segunda gota do prato da tubulação.
- Coloque o prato de biópsia o estereomicroscópio para visualizar facilmente o (s) fragmento (es) TE.
- Libere delicadamente alguma solução de lavagem da biópsia em cima do fragmento do TE; em seguida, coloque-o na pipeta de decapagem.
- Mova o fragmento TE para a segunda gota da solução de lavagem da biópsia no prato da tubulação e enxague-o com cuidado 2 − 3 vezes.
- Transfira o fragmento TE para a parte inferior do tubo de PCR (previamente rotulado após ele) com a solução de carga, prestando atenção para evitar tocar suas paredes com a ponta da pipeta de decapagem.
- Repita o procedimento da etapa 5,3 para a etapa 5,7 para cada fragmento de TE, prestando atenção ao uso de um novo capilar para cada fragmento de TE.
- No fim do procedimento da tubulação, põr todos os tubos do PCR em um mini centrifugador, e gire-os por poucos segundos.
- Guarde as amostras a-20 ° c até os enviar para o laboratório genético de referência para teste.
6. vitrificação do Blastocyst
- Vitrify colapsou blastocistos dentro de 30 minutos da biópsia do te para impedir seu re-Expansion.
- Rotule a placa de vitrificação com detalhes da mulher e os IDs dos blastocistos que devem ser vitrificados.
- Rotule o suporte (s) de vitrificação com o nome e sobrenome da mulher, ID do casal, ID do embrião que será carregado nele, bem como a data do procedimento. Os cryolabels especiais são usados que preservam sua integridade mesmo na temperatura muito baixa (-196 ° c).
- À temperatura ambiente, dispensar 0,3 mL de solução de equilíbrio (ES) (tabela de materiais) para cada blastocisto que será vitrificado.
- Na presença de uma testemunha, mova o blastocist no ES usando a pipeta de descascamento de 300 μm.
- Deixe o blastocist no ES por 13 − 15 min. Após um encolhimento inicial do volume, uma re-expansão gradual será observada.
- Encha uma cremalheira refrigerando pequena com nitrogênio líquido (LN2) e coloc a a capa do fluxo laminar.
- Dispensar 300 μL de solução de vitrificação (VS) (tabela de materiais) no segundo poço. Após a re-expansão completa do blastocist, transfira-a na solução de VS por 1 minuto e enxague-a para diluir o ES.
- Na presença de uma testemunha, carregar o blastocisto sobre o suporte de vitrificação e cuidar de remover o excesso de VS. Uma película subtil da solução deve cercar o Blastocyst.
- Mergulhe o suporte de vitrificação no LN2 e mova-o energeticamente a fim de reduzir o risco de formação de bolhas perto da amostra.
- Coloque a tampa protetora enquanto mantém o suporte de vitrificação submerso no LN2.
- Na presença de uma testemunha, mova o suporte de vitrificação em um tanque de armazenamento LN2 de longo prazo.
7. encolhimento artificial de blastocistos não biopsied
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Se não for realizada biópsia de TE, colapsar artificialmente os blastocistos imediatamente antes da vitrificação (Figura 4).
- Mova o prato de cultura da incubadora para o microscópio invertido e concentre-se no embrião selecionado.
- Mude para o objetivo do laser (pulso pré-ajustado: 0,3 ms, 6,5 μm), alvo a zona pelúcida no lado oposto de ICM, a seguir dirija pulsos do laser 1 – 2 às junções entre pilhas do te a uma distância segura do ICM. Os blastocistos devem entrar em colapso em menos de 5 min.
- Proceder com a vitrificação do blastocist recolhido como descrito na secção 6.
8. aquecimento de Blastocist transferíveis
- No dia do ET, prepare a placa ET 4-well colocando 600 μL de meio de cultura de fertilização in vitro pré-equilibrados para cada poço. Incubar a 37 ° c em atmosfera controlada (5% O2, 6% co2), enquanto executa O aquecimento do blastocisto.
- Rotule o prato de aquecimento com nome e sobrenome da mulher, ID do casal, ID do embrião que será aquecido nele.
- Dispensar 1 mL da solução de descongelar (TS) (tabela de materiais) em um prato de um poço de FIV (Figura complementar 1) e aqueça-o a 37 ° c em um termostato por pelo menos 1 h antes de iniciar o procedimento.
- Encha um apoio refrigerando pequeno com LN2 e coloc o na capa do fluxo laminar na proximidade próxima da área de funcionamento.
- Antes de iniciar o procedimento, verifique a informação de blastocisto relatada no suporte de vitrificação. Todos os IDs devem combinar o relatório genético e o blastocisto ao morno deve ser escolhido entre os transferíveis. Uma testemunha é exigida durante o procedimento.
- Tome o prato de um poço que contem TS aquecido fora do termostato e coloc o em um estágio heated o stereomicroscope.
- Puxe a tampa protetora dentro do LN2 usando fórceps.
- Mergulhe rapidamente a ponta do suporte de vitrificação no TS 37 ° c.
- a observação microscópica, mova delicadamente o apoio da vitrificação até que o blastocisto esteja liberado da ponta.
- Deixe o blastocisto por um total de 1 min no TS, prestando atenção para mantê-lo na parte inferior do TS.
- À temperatura ambiente dispensar 200 μL de solução de diluição (DS) (tabela de materiais) no primeiro poço da placa de vitrificação.
- Transfira o blastocisto ao DS e coloc o na parte inferior do poço ao liberar algum TS na parte superior dele para criar uma sorte do inclinação. Deixe por 3 min.
- Dispensar 200 μL de solução de lavagem (WS) em 2 poços diferentes (WS1 e WS2).
- Transfira o blastocisto a WS1 e coloc o na parte inferior do poço ao liberar algum meio DS na parte superior dele. Em seguida, transfira o blastocisto para WS2 e deixe-o sem perturbações durante 1 min.
- Rotule a placa ET pós-aquecimento com o nome e sobrenome da mulher, ID do casal, ID do embrião que será cultivado nele.
- Na presença de uma testemunha, transfira o blastocisto aquecido ao meio de cultura pre-equilibrado na placa do et do borne-aquecimento.
- Enxague o blastocisto no primeiro poço da placa ET e coloque-o no segundo poço.
- Transfira o prato de cultura pós-aquecimento para a incubadora em uma atmosfera controlada (37 ° c, 6% CO2,5% o2) e cultura o blastocisto por pelo menos 1,5 h antes de verificar sua sobrevivência e re-expansão.
Nota: A Figura 5 mostra exemplos de blastocistos degenerados, Cryo-sobrevividos mas não re-expandidos e Cryo-sobrevividos e totalmente expandidos.
9. EmbryoTransfer
- Para executar o ET, coloque o prato no estágio aquecido da capa de fluxo laminar, de modo que o embrião é visível o microscópio em uma baixa ampliação.
- Tome aproximadamente 0,4 mL do meio de cultura de IVF. Fixe a ponta da seringa firmemente na extremidade receptora do cateter interno e, em seguida, liberte o meio até 0,1 mL.
- Aspirar meio de cultura até observar os embriões entrando no cateter (quantidade mínima de mídia: 10 − 15 μL).
- Coloque o cateter na caixa de plástico e vá para a sala de operação e coloque o cateter interno na guia externa.
- Uma vez atingido o útero, empurre o êmbolo da seringa para liberar o embrião (s). Solte muito lentamente o meio até que o êmbolo esteja lendo 0,1 mL.
- Leve o cateter de volta para o laboratório e verifique o microscópio que o embrião foi transferido.
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Representative Results
A Figura 6 representa um esquema de todos os desfechos de um procedimento de biópsia que pode ser adotado para padronizar o protocolo e monitorar o desempenho de cada operador. O resultado processual principal é o sincronismo para terminar a biópsia/biópsias; o principal resultado técnico é a qualidade do enredo produzido após o teste genético que pode resultar em um diagnóstico conclusivo ou inconclusivo, o último dos quais requer uma re-biópsia do blastocisto não diagnosticado; o principal resultado biológico é a taxa de criosobrevivência e re-expansão versus degeneração após o aquecimento; Finalmente, o resultado clínico principal é a taxa de nascimento viva após a transferência Vitrified-aquecida do blastocisto. Em três estudos prévios, foram relatados os KPIs definidos no (s) centro (es) para os resultados técnicos, biológicos e clínicos11,13,14. Doravante, em vez disso, relatamos como o KPI para o momento da biópsia foi definido. Além disso, a influência putativa do sincronismo entre a biópsia e a vitrificação no comportamento do borne-aquecimento de blastocistos do ADN foi investigada igualmente.
Em um período de 2 anos, um total de 1.544 procedimentos da biópsia do trofectoderma foi conduzido por 7 operadores (tabela 1). Todos os blastocistos biópsia foram movidos então de volta à incubadora em um prato da cultura da borne-biópsia até o Vitrification. Todos os dados relevantes foram coletados em um banco de dados relacional. Todos os horários de biópsia e entre biópsia e vitrificação foram obtidos retrospectivamente a partir do software do sistema de testemunha eletrônica da FIV. Os dados foram então exportados e analisados para as estatísticas.
A taxa de Cryo-Survival de blastocistos do ADN após a biópsia do trofectoderma e o Vitrification-aquecimento eram N = 571/572, 99,8%. A taxa de reexpansão a 1,5 h após o aquecimento foi de N = 556/571, 97,4%. Entre os 15 blastocistos não re-expandidos, um conduziu a um nascimento vivo após ser transferido dentro-Utero. A taxa de nascimento ao vivo após a transferência de blastocisto por euploide vitrificado-aquecido foi de N = 227/572, 39,7%.
Definição do sincronismo ideal da biópsia
A tabela 1 resume os dados relevantes dos procedimentos de biópsia realizados. No geral, 1,89 ± 1, 3 (intervalo 1-4) blastocistos foram biopsiados por procedimento em 8,24 ± 4,23 min (intervalo 3-22). O tempo médio de biópsia variou por causa tanto do número de blastocistos biopsiados por procedimento, de um mínimo de 5,78 ± 2,94 min (intervalo 3-16) quando apenas um embrião foi colocado no prato a um máximo de 12,93 ± 4,43 min (intervalo 6-22) quando os embriões sequencialmente biópsia nós Re 4. Outro parâmetro relevante foi o operador envolvido no procedimento: o mais experiente (N = 443 procedimentos) foi o mais rápido (7,41 ± 3,6 min, faixa 3-22), enquanto o menos experiente (N = 42) foi o mais lento (14,19 ± 4,24 min, faixa 6-22). De fato, um modelo linear generalizado que implica tanto o "número de blastocistos biopsiados por procedimento" e as variáveis "operador" explica perfeitamente o "timing da biópsia" com um R2 = 0,48 e uma potência = 1. Esta análise foi útil para definir que idealmente ~ 6 min é suficiente para um procedimento de biópsia blastocist quando apenas um embrião é colocado no prato, enquanto ~ 9 min, ~ 12 min e ~ 13 min para 2, 3 e 4 blastocistos, respectivamente. Claramente, todo o procedimento implica também mover os embriões da cultura para o prato de biópsia e do último para o prato de cultura pós-biópsia após o procedimento, bem como alterar a pipeta de biópsia entre biópsias sequenciais.
A Figura 7 plota o tempo médio de biópsia para cada operador ao longo dos trimestres do estudo (do 1St ao 8º). A linha vermelha pontilhada identifica o valor geral médio de 8,24 min. Tal gráfico é útil para monitorar o desempenho médio de cada praticante. Por exemplo, os operadores mais experientes (1 e 2) mostraram uma diminuição constante desse tempo, o que sugere uma tendência típica de uma curva de aprendizado. Todos os operadores de 3 a 6 eram em vez disso suficientemente constante em seu desempenho em torno do valor total médio através dos trimesters. Sempre que eles mostraram um pico no valor médio de um determinado trimestre (por exemplo, o operador 3 no 7º trimestre, o operador 4 no 6º trimestre, o operador 5 no 3 º trimestre), eles foram avisados a fim de rever o seu desempenho. O operador 7 (ou seja, o menos experiente) apresentou horários típicos de um embriologista que acabou de terminar seu treinamento. Possivelmente, ele/ela vai atender os padrões internos para o laboratório como a perícia iria aumentar.
É importante ressaltar que o tempo de biópsia foi semelhante em re-expandido e não re-expandido blastocistos euploides a 1,5 h do aquecimento (9,52 ± 4,23 min, intervalo 3-22 versus 10,5 ± 5,68 min, intervalo 4-22; teste t = 0,37). Provavelmente, implantado (N = 229) e não implantado (N = 343) blastocistos euplóides com aquecimento vitrificado também mostraram intervalos de biópsia comparáveis (9,77 ± 4,15 min, intervalo 3-22 versus 9,41 ± 4,36 min, intervalo 3-22; teste t = 0,39). Possivelmente então, um sincronismo ≤ 22 minutos para fazer a biópsia até 4 blastocistos não afeta o comportamento do embrião após o aquecimento. Portanto, definimos esse valor como limite máximo.
Da mesma forma, nenhuma diferença foi demonstrada em termos de taxa de natalidade ao vivo entre os diferentes operadores de biópsia, como já relatado anteriormente13 (tabela complementar 1).
Outro parâmetro importante para monitorar o desempenho de cada operador é a taxa de resultados inconclusivos após o diagnóstico, o que deve ser o mais próximo possível do desempenho geral de cada laboratório. Idealmente esta taxa não deve exceder 2,5% e pôde diminuir com o tempo devido a uma perícia crescente em procedimentos da biópsia e da tubulação16. O número alvo de células te para recuperar são 7-8 de acordo com dois estudos anteriores13,16. Para este fim, sugere-se a tirar uma foto do fragmento biopsiado para fins de controle de qualidade (ver alguns exemplos na Figura 3). Tal quadro pode ser verificado em caso de diagnósticos inconclusivos para avaliar se a causa foi imputável à dimensão/qualidade do fragmento (i.e., baixa qualidade da análise molecular), ao tubo (i.e., falha de amplificação de DNA) ou a algumas questões em o processamento da amostra no laboratório genético.
Definição do sincronismo ideal entre a biópsia e a vitrificação
No período do estudo, 572 blastocistos ADN foram aquecidos para submeter-se a uma transferência do embrião após um diagnóstico do euploidy. A figura 8a mostra cada blastocist aquecido como um círculo preto distribuído através do sincronismo crescente entre a biópsia e a vitrificação e agrupado em dois grupos de acordo com o resultado a investigação: re-expandido ou não re-expandido dentro de 1,5 h de Aquecimento. Todos os blastocistos (N = 117/117) vitrificados em 30 min, 97,6% (N = 245/251) dos blastocistos vitrificados entre 31-90 min, e 95,1% (N = 194/204) dos blastocistos vitrificados além de 90 min re-expandido, respectivamente (nenhumas taxas da re-expansão: 0%, 2,4% e 4,9%). Conseqüentemente, nós ajustaram 30 minutos e 90 minutos como os limiares adiantados e atrasados do tempo entre a biópsia e o Vitrification.
A Figura 8B mostra a taxa de reexpansão nos três grupos (≤ 30 min, 31-90 min, > 90 min) ainda mais subagrupados de acordo com a qualidade do blastocisto e o dia do desenvolvimento pré-implante. Especialmente para a má qualidade e/ou o dia 7 blastocistos, o sincronismo entre a biópsia e a vitrificação parece crucial conseguir a re-expansão após o aquecimento. Especificamente, a razão de chances de re-expansão após o aquecimento corrigido tanto para a qualidade do blastocisto quanto para o dia da biópsia em blastocistos vitrificados dentro de 30 min de biópsia versus blastocistos vitrificados além de 90 min foi 3, 5 (95% IC 1,01-9,4, p = 0,05). Em vez disso, o período entre esses dois limiares (31-90 min) representou uma área cinzenta que pode ou não ter um impacto.
Somente 1 de 15 blastocistos não re-Expanded resultou em um nascimento vivo após a transferência. Conseqüentemente, nós investigamos por último a taxa de nascimento viva conseguida após a única transferência aquecido do blastocisto do ADN aglomerada nos três grupos de acordo com o sincronismo entre a biópsia e a vitrificação. A maior taxa de natalidade ao vivo foi alcançada através da transferência de blastocistos euplóides vitrificados ≤ 30 min da biópsia do trophectoderma (N = 56/117, 47,9%). No entanto, esse resultado não obteve significância estatística quando comparado ao mesmo desfecho obtido com blastocistos vitrificados entre 31 e 90 min (N = 92/251, 36,7%; Teste exato de Fisher = 0, 6), ou com blastocistos vitrificados > 90 minutos da biópsia (N = 81/204, 39,7%; Teste exato de Fisher = 0,16). Portanto, ou um efeito negativo sobre a competência reprodutiva do blastocisto é insignificante ou o tamanho amostral neste conjunto de dados (N = 572) foi insuficiente para atingir significância estatística.
Figura 1: parâmetros para a classificação do blastocist. Expansão: (A) totalmente chocado, (B) na eclosão, (C) totalmente expandido, e (D) não expandido. O estágio ideal é C, quando um blastocisto D deve ser dado mais tempo para conseguir a expansão cheia, a menos que este estágio for alcangado no dia 7; Massa celular interna (ICM) qualidade morfológica: 1 (perceptível com várias células estritamente embaladas), 2 (discernível com várias células, mas aproximadamente embalados) e 3 (difícil de distinguir com muito poucas células de baixa qualidade); trofectoderma (te) qualidade morfológica: 1 (epitélio bem organizado com várias células), 2 (epitélio solto com poucas células) e 3 (poucas e/ou grandes células de baixa qualidade). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: síntese da zona pelúcida sequencial (ZP) abertura e trofectoderma (te) aproximação da recuperação das pilhas para a biópsia do blastocisto. (a) orientar o blastocisto com a massa celular interna (ICM) perto da pipeta de retenção e longe do local onde as células te selecionadas serão recuperadas. Fixe o blastocist na pipeta da terra arrendada; (b) Abra o ZP através de 2-3 tiros laser; (c) soprar alguns meios de cultura através do furo; (d) o blastocisto desaparecerá do ZP; (e) Insira as células ZP e Suck 5-10 te na pipeta de biópsia; (f) Mova para trás com a pipeta da biópsia para esticar o fragmento selecionado e expor as junções entre as pilhas; (g) disparar nas junções entre as células e continuar esticando o fragmento até que as células te sejam liberadas do corpo do blastocist; (h) o blastocist após a biópsia do te é recolhido; (i) tirar uma foto do fragmento de biópsia para controle de qualidade e transferi-lo para o tubo de PCR que será enviado para o laboratório genético. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: exemplos de fragmentos de biópsia: (a-c) fragmentos desejáveis; d) fragmento lisado; (e) fragmento pequeno com células degeneradas; (f) fragmento pequeno, parcialmente lisado e degerado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: encolhimento artificial. (a) orientar o blastocist de modo que a massa de pilha interna (ICM) esteja longe da seção alvejada do trofectoderma (te); (b) fogo 2-3 tiros do laser em uma fileira nas junções entre as pilhas do te e mover-se para fora; (c) aguarde o colapso do blastocisto antes de iniciar a vitrificação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: exemplos de degeneração do blastocisto (a), crio-sobrevida mas sem re-expansão (b) e criosobrevida e reexpansão completa (c) 1,5 h pós-aquecimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: síntese dos diferentes desfechos da biópsia de trofectoderma que podem ser utilizados para monitorar o desempenho de um operador e definir os principais indicadores de desempenho internos de cada laboratório. O principal desfecho processual é o momento da biópsia. O resultado técnico principal é a taxa de diagnósticos conclusivos (euploid ou aneuploid) e inconclusivos (re-biópsia exigida) Obtido; o último pôde ser causado pela amplificação do ADN ou pelos dados moleculars de baixa qualidade, resultando em parcelas não interpretáveis do perfil do número da cópia do cromossoma. O principal desfecho biológico é a taxa de criosobrevivência e reexpansão ou degeneração após biópsia, vitrificação e aquecimento. O resultado clínico principal é a taxa de nascimentos vivos ou de resultados negativos da gravidez conseguidos após a transferência vitrificada-aquecida do blastocisto. Da nota, quando o resultado processual for exclusivamente dependente do operador e do número de blastocistos à biópsia por o procedimento, todos os outros resultados puderam ser afetados de outros confundidores independentes do operador da biópsia (por exemplo, as etapas e os operadores envolvidos na análise molecular, a qualidade morfológica do blastocist, o dia da biópsia) que deve ser contabilizado para avaliar adequadamente o seu desempenho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: tempo médio de biópsia por operador nos 8 trimestres de estudo. A tabela resume o número de procedimentos relacionados e o número médio de blastocistos biopsiados por procedimento por cada operador nos 8 trimestres de estudo. A linha vermelha pontilhada dentro de cada gráfico representa o tempo médio geral de biópsia (8,24 min). As barras de erro são os desvios padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: re-expansão após o aquecimento versus tempo entre a biópsia e a vitrificação. (A) não apresenta re-expandido e re-expandido blastocistos 1,5 hr após o aquecimento. Cada blastocisto é representado por um círculo preto através dos intervalos crescentes. As linhas pretas contínuas verticais representam 30 minutos ajustados como o limiar adiantado e o minuto 90 ajustado como o limiar atrasado. (B) mostra as taxas de reexpansão nos três grupos (tempo entre a biópsia e a vitrificação: ≤ 30 min, 31-90 min, > 90 min) agrupados de acordo com a qualidade do blastocist e dia da biópsia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| N de procedimentos | Blastocistos de N biopsiados por procedimento | Tempo médio de biópsia ± DP, intervalo (min) | |
| Operador 1 | 443 | 2, 1 ± 1, 9, 1-4 | 7,41 ± 3,6, 3-22 |
| 195 | 1 | 4,75 ± 1,96, 3-16 | |
| 111 | 2 | 7,83 ± 2,45, 3-18 | |
| 71 | 3 | 10,27 ± 2,41, 4-16 | |
| 66 | 4 | 11,48 ± 3,81, 6-22 | |
| Operador 2 | 290 | 1,81 ± 0,98, 1-4 | 7,87 ± 4,13, 3-22 |
| 142 | 1 | 5,69 ± 3,32, 3-16 | |
| 89 | 2 | 8,48 ± 2,79, 3-18 | |
| 30 | 3 | 11,37 ± 3,72, 4-20 | |
| 29 | 4 | 13,1 ± 3,89, 9-22 | |
| Operador 3 | 287 | 1,98 ± 1, 5, 1-4 | 9,10 ± 4,65, 3-22 |
| 121 | 1 | 6 ± 2,19, 3-15 | |
| 89 | 2 | 9,6 ± 3,87, 3-22 | |
| 38 | 3 | 12,66 ± 4,55, 4-22 | |
| 39 | 4 | 14,13 ± 4,8, 6-22 | |
| Operador 4 | 217 | 1,66 ± 0,87, 1-4 | 7,58 ± 3,45, 3-22 |
| 118 | 1 | 5,58 ± 1,96, 3-14 | |
| 66 | 2 | 8,92 ± 2,91, 4-22 | |
| 21 | 3 | 11,48 ± 2,34, 5-16 | |
| 12 | 4 | 13 ± 4,26, 6-19 | |
| Operador 5 | 144 | 2, 3 ± 1, 8, 1-4 | 9,43 ± 4,24, 3-22 |
| 59 | 1 | 6,15 ± 2,5, 3-16 | |
| 43 | 2 | 10, 7 ± 2,73, 6-16 | |
| 20 | 3 | 12,6 ± 2,89, 9-18 | |
| 22 | 4 | 14, 9 ± 4,43, 6-22 | |
| Operador 6 | 121 | 1,67 ± 0,94, 1-4 | 7,79 ± 3,93, 3-22 |
| 70 | 1 | 6,19 ± 2,95, 3-16 | |
| 32 | 2 | 8,12 ± 1,72, 3-11 | |
| 9 | 3 | 12,78 ± 3,31, 9-18 | |
| 10 | 4 | 13,5 ± 6,19, 6-22 | |
| Operador 7 | 42 | 1,62 ± 0,94, 1-4 | 14,19 ± 4,24, 6-22 |
| 27 | 1 | 11,85 ± 5,53, 6-16 | |
| 6 | 2 | 16,5 ± 3,73, 11-22 | |
| 7 | 3 | 19,86 ± 3,34, 13-22 | |
| 2 | 4 | 19 ± 4,24, 16-22 | |
| Total | 1544 | 1,89 ± 1, 3, 1-4 | 8,24 ± 4,23, 3-22 |
| 732 | 1 | 5,78 ± 2,94, 3-16 | |
| 436 | 2 | 8,85 ± 3,14, 3-22 | |
| 196 | 3 | 11,72 ± 3,70, 4-22 | |
| 180 | 4 | 12,93 ± 4,43, 6-22 |
Tabela 1: Tempo médio total de biópsia e número médio de blastocistos biopsiados em cada procedimento de acordo com o operador de biópsia. O tempo médio de biópsia também foi demonstrado de acordo com cada número seqüencial de blastocistos biopsiados por procedimento. Um modelo linear generalizado que inclui tanto o "operador de biópsia" e "número de blastocistos biopsiados por procedimento" variáveis perfeitamente correlaciona com o "timing da biópsia" (R2 = 0,48, poder = 1).
Complementar Figura 1: principais dispositivos e suportes necessários para o procedimento. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela complementar 1: A análise de regressão logística não mostra nenhuma associação significativa entre o operador da biópsia e o nascimento vivo após a transferência Vitrified-aquecida do blastocisto do ADN. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Somente os embriologistas hábeis bem experientes que concluíram seu período de treinamento devem executar a biópsia do te e a vitrificação do blastocisto. Além disso, uma testemunha é exigida para monitorar os procedimentos e para garantir uma rastreabilidade eficiente durante i) os movimentos do blastocisto biópsia do prato da biópsia (Figura complementar 1) ao prato da borne-biópsia (Figura 1 suplementar ), depois à placa de vitrificação (Figura 1 suplementar) e, por último, ao suporte de vitrificação (Figura complementar 1); II) transferência de células TE biopsiadas do prato de biópsia para o tubo de PCR (Figura complementar 1); III) as etapas de aquecimento e transferência pós-diagnóstico. Para uma descrição detalhada de todas as etapas testemunhando refira uma análise dos modos e dos efeitos da falha (FMEA) publicou previamente14.
Todos os métodos descritos neste artigo respeitam o regulamento local (lei italiana 40/2004). De acordo com a lei, de fato, o casal pode solicitar a ser informado sobre o estado de saúde dos embriões que produziram durante o ciclo da FIV. A este respeito, um consentimento informado pormenorizado para a PGT deve ser assinado por ambos os parceiros.
Neste papel nós descrevemos como executar a biópsia do blastocisto para PGT em uma rotina ocupada do laboratório. A aplicação da aproximação da biópsia do blastocisto foi um avanço importante na última década em IVF. Relatado primeiramente por de Boer e por colegas em 200417, foi reconhecido logo como um procedimento mais eficaz e mais informativo comparado ao estágio da segmentação e às aproximações polares da biópsia do corpo3. O valor deste procedimento reside principalmente na redução dos encargos técnicos, mas também em menor incidência de mosaicismo cromossômico nesta etapa do desenvolvimento18,19. Além disso, a remoção de poucas pilhas de te de um blastocisto foi sugerida como um procedimento mais seguro do que a remoção de um blastômero de um embrião do estágio da clivagem. De fato, em um estudo randomizado não-seleto, a abordagem anterior não acarretava impacto no potencial de implantação do embrião, enquanto o último envolvia uma significativa redução de ~ 20%20.
O protocolo usado principalmente em todo o mundo implica a abertura da zona assistida por laser no dia 3 pós-inseminação. Nenhum ensaio clínico randomizado controlado foi realizado até o momento para comparar as diferentes abordagens de biópsia de blastocist. No entanto, é razoável que quanto menor o número de manipulações e exposições dos embriões em crescimento para condições ambientais suboptimal, menor a potencial invasividade do protocolo. Além disso, a presença de um furo na zona pelúcida do dia 3 do desenvolvimento pôde afetar a expansão do blastocisto e causar o herniation de pilhas de ICM junto com pilhas de te. Por estas razões, nós definimos e implementamos o protocolo descrito aqui que implica a violação de zona assistida por laser sequencial e a recuperação de células TE assim que o blastocisto atinge a expansão total. Também existe um protocolo diferente que implica um dia 5 ou 6 incubação assistida5,7. Especificamente, a perfuração da zona é executada no dia 5 ou 6 do desenvolvimento do pré-implante no lado oposto com respeito ao ICM; o blastocisto é movido então de volta à incubadora que espera o herniation espontâneo de pilhas do te. Claramente, a monitoração periódica do blastocisto deve ser fornecida nas seguintes horas, para a biópsia assim que o te começará herniating, assim como para impedir o embrião da eclosão completamente. Se na uma mão os praticantes não qualificados podem facilmente executar esta estratégia alternativa da biópsia, na uma mão não é apropriado para um laboratório ocupado que executa diversos procedimentos por o dia. A abertura sequencial da zona e o protocolo da biópsia do blastocisto descritos aqui são preferivelmente menos demorados e permitem um tempo hands-on mais curto e uma flexibilidade mais elevada para programar a atividade diária no laboratório assim que para coordenar os prazos dedicados a biópsia e aos procedimentos de vitrificação.
Os blastocistos da má qualidade puderam ser mais complexos à biópsia desde que as pilhas do TE podem ser pegajosas, mas mais tiros do laser coordenados com o esticão do fragmento para expor as junções entre as pilhas são suficientes para removê-lo do corpo do Blastocyst. O blastocisto inteiramente chocado pode ser biópsia como blastocistos fechados no pellucida da zona, mas puderam ser mais complicados vitrificar e morno. Em caso de diagnósticos inconclusivos após a biópsia, os dados relatados até o momento são concordantes de que nenhum dano parece derivar de uma re-biópsia e um seguinte ciclo de vitrificação-aquecimento16,21.
A vitrificação é usada atualmente no centro para executar a criopreservação do blastocisto, uma vez que tem sido consistentemente relatado mais seguro, mais eficiente e menos demorado do que o protocolo de congelamento lento de uma revisão e meta-análise da literatura mais recente a 10.
Uma vez que o procedimento foi bem estabelecido e os operadores devidamente treinados, realizamos uma análise retrospectiva para definir os horários processuais ideais para a biópsia de blastocisto e procedimentos de vitrificação (resumidos aqui nos resultados representativos). Como resultados finais, nós avaliamos a taxa da re-expansão do blastocisto do ADN avaliado em 1,5 h após o aquecimento e a taxa de nascimento viva alcançada após a transferência Vitrified-aquecida do embrião do ADN único. Nenhum caso da degeneração do blastocisto foi observado após a biópsia, e apenas 0,2% (N = 1/572) da taxa da degeneração foram relatados após o aquecimento, confirmando a confiabilidade das aproximações da biópsia e da vitrificação adotadas. De acordo com a análise, o sincronismo exigido para executar a biópsia do blastocisto não afeta a viabilidade dos blastocysts do ADN após o aquecimento definido como a taxa da reexpansão, ou o potencial reprodutivo definido como a taxa de nascimento viva. Embora vários horários podem ser observados entre os operadores com diferentes conhecimentos, podemos considerar a biópsia de blastocist seguro quando o procedimento é concluído em cerca de 8 min, em uma faixa de 3 a 22 min, dependendo do número de embriões por procedimento (no entanto, não são dados disponíveis para procedimentos de biópsia realizados em intervalos mais longos). O tempo médio gasto para a biópsia de blastocisto de cada operador único deve ser periodicamente (pelo menos a cada três meses) monitorado como KPI. Ao lado, a taxa de diagnóstico inconclusivo e a taxa de natalidade viva após a transferência vitrificada-aquecida do blastocisto do ADN devem igualmente ser endereçadas. Por fim, Delineamos o tempo ideal entre a biópsia e a vitrificação. Uma vez que observamos a maior taxa de re-expansão após o aquecimento quando os blastocistos foram vitrificados dentro de 30 min da biópsia, sugerimos esse valor como o limiar ideal. Especificamente, quanto maior o tempo entre a biópsia e a vitrificação, mais o blastocisto biopsiado será reexpandido antes de ser criopreservado. Isso pode ser prejudicial para a criosobrevivência, especialmente quando se lida com a má qualidade e/ou dia 7 blastocistos11. No entanto, nenhum impacto significativo sobre os desfechos clínicos foi observado mesmo se a vitrificação foi adiada para além de 90 min. Conseqüentemente, em ocasiões esporádicas, tais horários puderam ser permitidos.
O método escolhido para recuperar um espécime para a PGT não deve afetar a viabilidade do embrião, deve envolver resultados confiáveis e informativos, deve ser clinicamente eficaz e deve ser fácil de implementar, reduzindo assim os custos e a carga de trabalho laboratorial. A biópsia de blastocist cumpre todos estes pré-requisitos. No entanto, ainda é um procedimento invasivo que deve ser realizado por operadores qualificados em um laboratório bem equipado. Atualmente, o avant-garde de uma aproximação não invasora de PGT (niPGT) está a investigação. Talvez, no futuro, os meios de cultura gastos após o IVF possam ser analisados para conduzir o teste cromossomático e/ou genético. Esta é uma perspectiva futura intrigante, uma vez que os custos para a clínica de fertilização in vitro seria menor e toda a carga de trabalho implicada pela biópsia do embrião seria sidestepped. No entanto, a confiabilidade e a reprodutibilidade da análise de mídia gasta para testes genéticos ainda devem ser avaliadas22,23,24, portanto, mais esforços precisam ser investidos para definir e validar um protocolo que possa atender todas as clínicas de fertilização in vitro realizando PGT em todo o mundo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A AG e a RM coletaram os dados e elaboraram o manuscrito. A DC analisou os dados, elaborou os resultados representativos, realizou as estatísticas e revisou o manuscrito. A FMU e a LR forneceram discussão crítica dos resultados e de todo o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2 mLl PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µm ID, flat 35 °C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µL |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
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