Summary
Этот протокол использует зонд на основе в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (PCR), сульфорходамин B (SRB) обзор, 3'непереведенных регионов (3' UTR) клонирования, и luciferase обзор для проверки целевых генов miRNA интереса и понять функции miRNAs.
Abstract
МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие регулятивные РНК, которые, как признается, модулируют многочисленные внутриклеточные сигнальные пути при нескольких заболеваниях, включая рак. Эти небольшие регулятивные РНК в основном взаимодействуют с 3''e'e'e'd (3' UTR) их целевых РНК-мессенджера (mRNAs), что в конечном итоге приводит к ингибированию процессов декодирования мРНК и увеличению целевых деградаций мРНК. Основываясь на уровнях экспрессии и внутриклеточных функциях, миРНК могут служить регуляторными факторами онкогенных и опухолевых мРНК. Выявление добросовестных целевых генов miRNA среди сотен или даже тысяч вычислительно прогнозируемых целей является важным шагом для определения роли и основных молекулярных механизмов miRNA интереса. Для поиска возможных взаимодействий miRNA-mRNA доступны различные целевые программы miRNA. Однако, самый сложный вопрос заключается в том, как проверить прямые гены цели miRNA интереса. Этот протокол описывает воспроизводимую стратегию ключевых методов по определению целей miRNA, связанных с функцией miRNA. Этот протокол представляет практическое руководство по пошаговым процедурам, чтобы раскрыть уровни miRNA, функции, и связанные с ними целевые мРНК с использованием зонда на основе полимеразной цепной реакции (PCR), сульфорходамин B (SRB) обзор после miRNA имитировать трансфекции , генерация кривой дозы-реакции, и luciferase асссее наряду с клонированием 3' UTR гена, который необходим для правильного понимания ролей отдельных miRNAs.
Introduction
МикроРНК (miRNAs) являются небольшие нормативные РНК, которые в основном модулировать процесс перевода и деградации посланникРН (мРНК) реагируя на 3''непереведенных регионов (3' UTR) в добросовестных целевых генов1. Выражение миРНК может регулироваться транскрипционными и посттранскрипционными механизмами. Дисбаланс таких механизмов регулирования приносит неконтролируемые и отличительные уровни выражения miRNAs во многих заболеваниях, включая рак2. Одна miRNA может иметь несколько взаимодействий с различными мРНК. Соответственно, индивидуальная мРНК может контролироваться различными миРНК. Таким образом, внутриклеточные сигнальные сети замысловато влияют на четко выраженные миРНКи, с помощью которых физиологические расстройства и заболевания могут быть инициированы и ухудшились2,3,4, 5 , 6. Хотя измененное выражение miRNAs наблюдалось в различных типах рака, молекулярные механизмы которые модулируют образы раковых клеток в сочетании с miRNAs все еще больш неизвестны.
Накопление доказательств показывает, что онкогенные или опухолевые роли миРНК зависят от видов рака. Например, таргетинг вилочного ящика o3 (FOXO3), miR-155 способствует пролиферации клеток, метастазам и химиорезу колоректального рака7,8. В отличие от этого, ограничение вторжения клеток глиомы индуцируется miR-107 через регуляцию нейрогенного локуса выемки омологического белка 2 (NOTCH2) выражение9. Оценка miRNA-целевых взаимодействий в связи с функциями miRNA является неотъемлемой частью для лучшего понимания того, как miRNAs регулировать различные биологические процессы как в здоровых, так и в больных государствах10. Кроме того, открытие добросовестных целей (ы) miRNAs может дополнительно обеспечить доработанную стратегию для miRNA основе терапии с различными противораковыми препаратами. Однако основной проблемой в области миРНК является выявление прямых целей миРНК. Здесь подробные методы представлены в качестве воспроизводимых экспериментальных подходов к определению гена миРНК. Успешный экспериментальный дизайн для идентификации цели miRNA включает в себя различные шаги и соображения(рисунок 1). Сравнение зрелых уровней миРНК в опухолевых клетках и нормальных клетках может быть одной из распространенных процедур для выбора миРНК интереса(рисунок 1A). Функциональное исследование выбранной miRNA для обнаружения влияния miRNA на пролиферацию клеток важно сузить список лучших потенциальных целей кандидата на miRNA интереса(рисунок 1B). На основе экспериментально подтвержденных функций miRNAs, систематический обзор литературы и базы данных в компании с miRNA целевой программы прогнозирования требуется для поиска наиболее релевантной информации о функциях генов(рисунок 1C). Идентификация реальных генов цели miRNA интереса может быть достигнута путем осуществления экспериментов, таких как luciferase асссе наряду с клонированием 3' UTR гена, в режиме реального времени ПЦР, и западной blotting(Рисунок 1D). Целью текущего протокола является обеспечение комплексных методов ключевых экспериментов, зонд на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), сульфорходамин B (SRB) после мирны имитировать трансфекции, доза-реакция кривой поколения, и люцифераза асссис вместе с клонированием 3' UTR гена. Нынешний протокол может быть полезен для лучшего понимания функций отдельных miRNAs и последствия miRNA в терапии рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Зрелый анализ экспрессии микроРНК (miRNA)
-
Зрелый синтез комплементарной ДНК (кДНК) miRNA
- Добавить 254 нг общей РНК и 4,5 л дезоксирибонулеi I (DNase I) смеси, а затем добавить ультрачистую воду в ПЦР полос-труб, чтобы сделать до 18 qL(Рисунок 2A). Подготовьте реакцию для каждого общего образца РНК, очищенного от нескольких клеточных линий, используя достаточное количество смесей DNase I на основе общего количества реакций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смеси DNase I состоят из DNase I (1,8 л), ингибитора рибонуклеаза (0,3 л) и 25 мМ MgCl2 (2,4 л). Для воспроизвоявления для получения общей РНК вместо использования метода извлечения на основе фенола-хлороформа был привит метод извлечения на основе половой РНК. Сообщалось, что выход из визания некоторых миРНК может быть изменен в зависимости от количества клеток при использовании метода экстракции на основе фенола11,12. - Инкубировать трубки в тепловом цикле. Выполнить трубки в течение 10 минут при температуре 37 градусов по Цельсию, и тепло-инактивировать DNase I на 5 мин инкубации при 90 градусов по Цельсию. Немедленно поместите трубки на лед после инкубации.
- Передача 7,1 Л DNase я лечила общую РНК в 2 комплекта новых труб, а затем добавить 1,5 злитромыантийных грунтов к глицеальдегиду-3-фосфатдегеназы (GAPDH) гену(рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сумма общего РНК для синтеза кДНК на этом этапе становится 100 нг. Концентрация запасов праймеров GAPDH антисмыслов составляет 10 км. Добавление антисмысловых праймеров GAPDH предназначено для генерации GAPDH cDNA с использованием генно-специфического метода праймера. - Инкубировать трубки с помощью теплового велосипеда. Начните с 80 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем реакция на 60 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Немедленно поместите трубки на лед после инкубации.
- Добавьте 3,4 л ферментных смесей (RT) в каждой реакции(рисунок 2B). Ферментные смеси RT состоят из 100 мМ дезоксирибонуклеотидных трифосфатов (0,15 л), 10-x RT-буфера (1,5 л), ингибитора рибонуклеаза (0,75 л) и фермента обратной транскрипции (1 кЛ). Приготовьте достаточное количество смесей на основе общего количества реакций.
- Добавьте 3 ЗЛ 5x RT праймеры для конкретной miRNA в каждой реакции(рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем составляет 15 л для каждой реакции. - Выполнить трубки с помощью теплового велосипеда. Начните с 16 градусов по Цельсию в течение 30 мин с последующей реакцией при 42 градусах по Цельсию в течение 30 мин, и, наконец, при 85 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Держите при 4 кв. м в течение оставшегося времени(рисунок 2B). Одноцепочечные cDNA генерируются на этом этапе как для конкретного гена miRNA, так и для гена GAPDH в одной трубке.
- Добавить 254 нг общей РНК и 4,5 л дезоксирибонулеi I (DNase I) смеси, а затем добавить ультрачистую воду в ПЦР полос-труб, чтобы сделать до 18 qL(Рисунок 2A). Подготовьте реакцию для каждого общего образца РНК, очищенного от нескольких клеточных линий, используя достаточное количество смесей DNase I на основе общего количества реакций.
-
Цепная реакция полимеразы в реальном времени (ПЦР) и анализ данных
- Разбавить каждую кДНК ультрачистой водой при соотношении 1:49.
- Подготовка реакционных смесей для конкретной miRNA и GAPDH(Таблица 1). Для обнаружения специфической miRNA и GAPDH, установите тройные реакции для каждого образца кДНК.
- Выполните в режиме реального времени ПЦР и анализ данных(рисунок 2C). Анализ данных с помощью сравнительного метода CT 13,14.
2. МимикаТрансфекция микроРНК (miRNA)
ПРИМЕЧАНИЕ: miRNA-107 выбирается из шага 1. Так как miRNA-107 регулируется в опухолевых клетках по сравнению с нормальными клетками, можно предположить, что miRNA-107 является опухолевой супрессивной миРНК. В случае миРНК, которая регулируется в опухолевых клетках посравнению с нормальными клетками (например, miRNA-301), антисмысловые олигонуклеотиды против miRNA-301 могут быть применены для шагов 2, 3 и 4.
- Подсчитайте клетки с прибором счет-камеры и плиту клетки в плите 96-наилучшим образом. Плотность клеток составляет 2 х 103 ячейки/100 Л для каждой скважины. Не используйте среду клеток, содержащий пенициллин-стрептомицин (P/S), потому что P/S может снизить эффективность трансфекции.
-
Подготовьте набор трансфекционных смесей для трансфекционного переноса клеток в нескольких конечных концентрациях мимилиты мирнки и мимилимит мимля-107 на следующий день(рисунок3).
- Из запаса (25 мМ концентрации) мирны управления имитировать или miRNA-107 имитировать, разбавить и добавить соответствующее количество контроля имитировать или miRNA-107 имитировать в сокращенной сыворотки средств наряду с трансфекционным реагентом с использованием микроцентрифуговых труб (Рисунок 3A). Аккуратно смешайте олиго, содержащие смеси, используя микропипет. Общее количество олиго (miRNA имитировать контроль miRNA-107 имитировать) должно быть одинаковым в каждом колодце. Пустые скважины включают 100 зЛ носителей клеточной культуры и сывороточный носитель, содержащий трансфекционный реагент без клеток.
- После 10 мин инкубации в клеточной культуре капот, осторожно смешать олиго, содержащих смеси снова, а затем добавить 50 зл и смесей в каждом колодце. Храните трансинфицированные клетки в инкубаторе клеточной культуры. Замените трансфекционный реагент, содержащий средства массовой информации, свежими средствами культуры клеток, содержащими как сыворотку крупного рогатого скота (FBS), так и P/S после инкубации 6-12 ч. Далее насигните клетки на 72 ч. Общая продолжительность лечения миРНК-мимики составляет 96 ч.
3. Суфоходамин B (SRB) Ассай
-
Фиксация ячеек
- Удалите клеточные культуры носителя в каждой скважине пластины и быстро заполнить 100 л 10% трихлороацетической кислоты (TCA) в каждом колодце. Тщательно аспирировать средства массовой информации клеточной культуры от каждого колодца, чтобы избежать каких-либо повреждений клеток и отрешенности от дна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 40% TCA, добавив 20 г порошка TCA в 50 мл дистиллированной воды. От 40% TCA, сделать 10% TCA путем разбавления 40% TCA с дистиллированной водой в 1:3 коэффициент разбавления. - Храните тарелку, содержащую 10% TCA, в холодильнике (4 кВ) на 1 ч.
- Вымойте тарелку несколько раз, погрузившись в ванну и высушите ее. Удалите избыток воды изнутри колодцев, нажав на тарелку, пока в колодцах не останется воды. Оставьте тарелку на лабораторной скамейке, чтобы высушить ее, прежде чем перейти к следующему шагу.
- Удалите клеточные культуры носителя в каждой скважине пластины и быстро заполнить 100 л 10% трихлороацетической кислоты (TCA) в каждом колодце. Тщательно аспирировать средства массовой информации клеточной культуры от каждого колодца, чтобы избежать каких-либо повреждений клеток и отрешенности от дна.
-
Окрашивание клеток
- Pipette 50 л 0,4% SRB решение в каждой скважине, включая пустые скважины. Аккуратно встряхните пластину до 0,4% SRB раствор последовательно охватывает дно скважин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка и использование 0,4% SRB раствор, добавив 0,4 г порошка SRB в 100 мл 1% уксусной кислоты. Встряхните раствор тщательно, чтобы смешать его. Оберните бутылку 0,4% SRB раствор в легкий защитный материал, такой как алюминиевая фольга. Храните 0,4% SRB раствор в холодильнике. - После инкубации в течение 40 мин до 60 мин, мыть тарелку, промывего его с 1% уксусной кислоты. Вымойте тарелку до тех пор, пока не связанный краситель полностью смыт(рисунок 3B).
- Оставьте тарелку на лабораторной скамейке, чтобы высушить ее, прежде чем перейти к следующему шагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина должна быть полностью высушена перед шагом 3.3.
- Pipette 50 л 0,4% SRB решение в каждой скважине, включая пустые скважины. Аккуратно встряхните пластину до 0,4% SRB раствор последовательно охватывает дно скважин.
-
Измерение абсорбции
- Pipette 100 л базового раствора Tris (10 мМ) в соответствующие скважины, включая пустые скважины. Держите тарелку на шейкере в течение 10 мин. Измерьте абсорбцию на уровне 492 нм.
4. Поколение кривой доза-реакции
- Проанализируйте данные sRB-анализа в электронной таблице. Вычесть пустое абсорбцию из значений абсорбции каждой группы и вычислить среднее (AVE) и стандартное отклонение (STD) значений абсорбции каждой группы.
- Рассчитайте процент среднего абсорбции (AVE%) и стандартное отклонение (STD%) каждой группы, используюй значения абсорбции sRB.
ПРИМЕЧАНИЕ: AVE% контроля miRNA имитировать обработанной группы составляет 100%. Рассчитайте STD% с помощью следующей формулы: STD% (STD каждой группы / AVE абсорбции управления имитировать обработанную группу) х 100. - Импортней необработанные данные, включая концентрации обработки, AVE% и STD% в программное обеспечение путем вертикального выравнивания этих данных. Поскольку журнал 0 не определен, установите первую концентрацию оси Xк значению, близкому к 0 (например, 0.01).
- Нажмите Создать вкладку графика и выбрать простые панели рассеяния ошибок. Выберите столбцы листа в качестве значений символов и нажмите далее. В панели формата данных выберите пары XY и нажмите Далее. Выберите соответствующие столбцы данных в панели избранных данных. Нажмите кнопку "Закончить", чтобы создать сюжет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ось X представляет концентрации, ось Y указывает процент среднего поглощения каждой концентрации (AVE), а бары ошибок указывают на процент стандартного отклонения каждой концентрации (STD%). - Дважды нажмите на ось X, чтобы изменить тип шкалы и масштабирование оси. Измените тип шкалы от линейного к журналу. Измените число стартового и конечных диапазонов до 0,01 и 200 соответственно.
-
Нажмите правой кнопкой мыши на любой участок рассеяния, выберите кривую подгонку, и перейдите к подкатегории Пользователь-определенный. Выберите кривую дозы ответа, нажмите кнопки «Следующие кнопки», а затем нажмите кнопку «Финиш». Кривая доза-ответ в настоящее время генерируется вместе с вкладкой отчета(рисунок 4A).
- Для ввода Equation 1 в программном обеспечении для генерации кривой дозы-реакции нажмите на вкладку «Анализ» и выберите мастер регрессии. Перейти к пользователь-определенных в категории уравнения, а затем нажмите новую кнопку. Вставьте уравнение 1, переменные, начальные параметры и ограничения в соответствующие пустые ящики(рисунок 4B,C). Нажмите Добавить в качестве кнопки и установить название уравнения, как доза-ответ кривой. Имя уравнения теперь генерируется в подкатегории Пользователь-определяется в категории уравнения. f указывает процент жизнеспособности клеток (% жизнеспособность клеток) в уравнении 1.
Уравнение 1
- Перейдите на вкладку отчета, а затем проверьте значения n, k и R.
ПРИМЕЧАНИЕ: y0 указывает 100% жизнеспособность клеток miRNA управления имитировать обработанной группы, n указывает на хилл-типа коэффициент (наклон участка), k указывает на концентрацию miRNA-107 имитировать, что производит 50% от максимального эффекта miRNA-107 (половина максимальная ингибирующая концентрация, IC50) и R указывает на остаточную нетронутую фракцию (фракцию сопротивления)15. Уравнение, используемое для создания кривой дозы-реакции, распознает диапазон от y0 до R значения (если таковые имеется) как 100%(рисунок 4A). Поэтому необходимо приобрести скорректированное значение k (IC50),рассчитанное на основе диапазона от y0 до значения ноль (рисунок4A). Скорректированный k (IC50) наряду с другими значениями ICx (например, IC10 через IC90)можно получить с помощью Equation 2, которое происходит от equation 1. Производные уравнения 2 из уравнения 1 указаны на дополнительной рисунке 1.
Уравнение 2
- Дважды щелкните левую кнопку мыши на ячейке, в которой применяется уравнение 2. Используя equation 2 и параметры из сгенерированной кривой доза-реакции, можно вычислить скорректированные значения ICx, начиная от IC10 до IC90 (рисунок4D).
- Ввейте равный знак, за которым следует формула, начинающаяся с кронштейна в ячейке. При вводе формулы, исправить значение n, k, и R в качестве абсолютной ячейки ссылки, добавив знак доллара к соответствующему столбец и строку, так что эти фиксированные значения не будут изменены при автоматическом заполнении формулы до строк (Рисунок 4D). Кроме того, скорректированные значения могут быть вычисляться вручную с помощью Equation 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значение IC90 не определяется, так как значение R превышает 10. Кроме того, если значение R выше 20, значение IC80 также не определяется(рисунок 4D).
5. Проверка непосредственного целевого гена микроРНК, представляющих интерес
ПРИМЕЧАНИЕ: После выполнения функционального эксперимента, такого как SRB-assay, miRNA-107 подтверждается как подавляющая миРНКа опухоли, и вполне возможно, что miRNA-107 непосредственно нацелен на онкогены. Проверьте список всех прогнозируемых генов-целевых целей, используя программу прогнозирования цели miRNA, такую как TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/), а затем сузить до потенциальных целей кандидатов на основе функции гена в базах данных, включая PubMed и ДжинКарты.
- Дизайн праймера для клонирования непереведенного региона 3' (UTR)
- Поместите название гена в GeneCards (https://www.genecards.org/) и нажмите Символ гена. Оцените браузер генома Ensembl, нажав На Идентификатор Гена Ensembl, а затем нажмите Transcripts ID в таблице стенограммы. После этого нажмите Exons, существовавший в списке дисплеев на основе стенограммы слева.
- Копируйте нуклеотидные последовательности 3' UTR и вставьте его в программу проектирования грунтовки. Копируйте последовательности снова из этой программы и вставьте его в текстовый процессор. Проверьте наличие последовательности связывания miRNA, а также наличие участков ферментов ограничения, используемых для клонирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если в 3' UTR нет места распознавания ферментов ограничений, ферменты ограничения, выбранные для клонирования, могут быть использованы для следующего шага. - В программе проектирования грунтовки, принять 3' UTR последовательностей и начать проектировать вперед и обратный грунтовки со следующим условием. Длина: 20-30 нуклеотидов, ТМ: 45-58 градусов по Цельсию, GC%: 40-60%. Разница между значениями ТМ двух грунтовок должна быть меньше 5 градусов по Цельсию. Основные последовательности, используемые в данном исследовании, приведены в дополнительномрисунке 2 . Добавьте в разработанные грунтовки последовательности распознавания ферментов ограничения, а также 4 случайных нуклеотидов.
- Градиент ПЦР
- Приготовьте 25 ЗЛ смесей реакции ПЦР, включая разработанные грунтовки на одну обезвреживание температуры(таблица 2). Приготовьте достаточное количество смесей на основе общего количества реакций. Смешайте раствор путем пипетки и добавьте 25 л реакционных смесей в каждую трубку. Центрифуги труб в течение нескольких секунд.
- Выполните 35-40 циклов ПЦР от шага денатурации до шага расширения. Настройка цикла ПЦР в качестве следующих шагов: 98 c для 1 мин (1 цикл, шаг активации полимераза), 95 C для 10 s (шаг денатурации), 45 C-68 C для 30 s (шаг annealing), 68 C (шаг расширения, 10 s-1 мин на 1000 bp), 68 C для 3 мин прекращения (шаг) , и, наконец, остыть до 4 градусов по Цельсию.
- Запустите продукты ПЦР и проверьте полосы на 1% агарозный гель с ДНК лестницы. Найти лучшие annealing температуры(рисунок 5A). Усиль 3' UTR гена снова, используя лучшую температуру annealing для следующего шага.
- Двойное пищеварение
- Сделать реакции смеси, включая два фермента ограничения, XhoI (или AsiSI) и NotI, в трубке (Таблица 3). Инкубировать смеси в течение 3-4 ч с помощью водяной ванны (37 градусов по Цельсию).
- Запустите двойной переваренных продуктов на 1% агарозный гель, а затем сократить полосы под ультрафиолетовым светом. В случае векторов люциферазы, перед запуском на гель, реагировать двойной переваренных векторов с 10 U щелочных фосфатаз еще 1 ч, чтобы предотвратить реcircularization во время перевязки шаг.
- Очистите двойные переваренные продукты ПЦР и векторы люциферазы из вырезанных полос.
- Лигация продуктов ПЦР в векторы люциферазы
- Сделать 20 qL перевязочной реакции смеси, включая ДНК лигазы (Таблица 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отношение молярного продукта ПЦР (вставки) к вектору люциферазы может составлять 3:1. 1:1 или 2:1. - Кратко центрифуги трубки для 10-15 s и инкубировать на 16 градусов по Цельсию ночь с помощью теплового велосипедиста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, трубка может быть инкубирована при 4 градусах По Цельсию в течение 2-3 дней для перевязки. На этом этапе вставка PCR будет клонирована в область, расположенную ниже по течению гена репортера Рениллы(рисунок 5B). Связывание miRNAs в клонированный 3' UTR гена может уменьшить активность ренильи. Светлячок люцифераза для нормализации уровня экспрессии ренилья.
- Сделать 20 qL перевязочной реакции смеси, включая ДНК лигазы (Таблица 4).
- Преобразование и колония PCR
- Добавьте перевязочные смеси (3-5 л) в трубку, содержащую компетентные клетки. Аккуратно коснитесь трубки и держите ее на льду (20 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозить компетентные клетки на льду перед добавлением перевязочных смесей. - Быстро и аккуратно перенесите трубку в теплоблок. После тепло-шока (42 градусов по Цельсию в течение 30 с-1 мин) поместите трубку на лед в течение 20 мин.
- Распространение компетентных клеток на Лурия-Бертани (LB) агар пластины. Выращивайте компетентные клетки в инкубаторе (37 градусов по Цельсию) в одночасье.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ампициллин (50-100 мкг/мл) содержится в агарной пластине. - Выберите индивидуальную колонию и повторно E. coli в одной из 8-полосных труб, содержащих ультрачистую воду. Повторите этот шаг, чтобы повторно e. coli из случайно выбранных 4-8 колоний(рисунок 5C).
- Передача 25 Л подвески кишечной палочки в другой комплект 8-полосных трубок. Теперь, Есть 2 комплекта труб E. coli подвески.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна трубка предназначена для колонии ПЦР, а другая для прививки. E. coli подвеска для прививки может быть временно храниться при 4 C (рисунок5C). - Выполните колонии PCR с помощью E. coli подвески. Этот шаг заключается в том, чтобы определить, если колонии содержат вставку. Выберите лучшие колонии, чтобы привить и изолировать векторы люциферазы укрывательство 3' UTR гена(Рисунок 5C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаг 5.1-5.5 для каждого 3' UTR выбранных генов. Следуйте состоянию реакции ПЦР, показанной в таблице 2, заменив геномную ДНК суспензией E. coli.
- Добавьте перевязочные смеси (3-5 л) в трубку, содержащую компетентные клетки. Аккуратно коснитесь трубки и держите ее на льду (20 мин).
- Люцифераза ассси
- Приготовьте 24-колодную тарелку. Используйте 1-2 х 104 ячейки в 500 мили культуры клеток для каждого хорошо. Не используйте среду клеточной среды, содержащую P/S для трансфекции, потому что использование P/S может снизить эффективность трансфекции.
- Трансфект 50 нг векторов люциферазы в клетки с контролем имитировать или конкретных miRNA имитировать с помощью трансфекционного реагента(Рисунок 5D). При скрининге эффектов конкретной миРНК имитируют более одной концентрации, сохраняйте общее количество олиго одинаковых в каждом колодце (см. шаг 2).
- Вымойте внутреннюю часть скважин дважды с помощью фосфата буферного сольника (PBS) на следующий день.
- Нанесите 200 л лисисового реагента в скважины и достаточно провести лиза клеток перед измерением активности люциферазы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите тарелку на встряхиваемая пластине не менее 15 мин. - Передача 5-10 л клеточного лисата в новую трубку и добавить 100 зл реагента I. Немедленно смешать раствор путем пайпетирования и читать светлячок деятельности с помощью светинометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Читайте светлячок люциферазы деятельности для 10-15 с. - Добавить 100 л реагента II в той же трубке, а затем смешать путем пайпеттинг дважды. Прочитайте активность рениллы люциферазы в течение 10-15 с с помощью светинометра. Повторите шаг 5.6.5 и 5.6.6 для каждой выборки.
- Рассчитайте соотношение ренильи к светлячоку(рисунок 5E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Активность светлячка представляет трансфекционную эффективность люциферазы, конструируемой в клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное и точное подтверждение уровней миРНК имеет важное значение для интерпретации данных, с помощью которых можно классифицировать миРНК на основе ожидаемой роли миРНК в развитии и прогрессировании заболевания. Уровни miRNA-107 и miRNA-301 были измерены в трех линиях клеток поджелудочной железы с помощью количественного ПЦР на основе зонда. Синтез кДНЯ как специфической миРНК, так и эталонного гена в одной и той же реакции может повысить воспроизводимость данных. PANC-1 и CAPAN-1 являются человеческими поджелудочными протокальными линиями аденокарциномы, в то время как HPNE является увековеченной линией клеток протоков поджелудочной железы, трансцированной с ретровирусным вектором экспрессии, укрывающим реверсивную транскриптазу периглазу человека (hTERT). miRNA-107 был значительно снижен в клетках PANC-1 и CAPAN-1 по сравнению с клетками HPNE(рисунок 2C). Уровни miRNA-301 были значительно регулируются в клетках PANC-1 и CAPAN-1 по сравнению с клетками HPNE. Эти результаты в соответствии с предыдущими сообщениями, что miRNA-107 является эпигенетически инактивированва в раковых клетках поджелудочной железы и что уровни miRNA-301 выше в клетках аденокарциномы поджелудочной железы, чем нормальные клетки протоков поджелудочной железы16, 17.
3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилдетразолий бромид (МТТ) отражает метаболическую активность клеток. Эта функция имеет значительно более высокую возможность приобрести отсутствие корреляции между MTT анализа и общее число клеток, поскольку условия анализа, включая своего рода реагенты лечения может серьезно повлиять на ферментативное сокращение тетразолия 18,19. Для преодоления этого ограничения был применен анализ сульфорходамина В (SRB) для измерения воздействия миРНК-107 на пролиферацию клеток для определения потенциальных биологических функций миРНК-107. Количество связанного SRB красителя в фиксированных клетках может быть использовано в качестве суррогата изменения общего количества клеток. SRB ассси в этом исследовании ясно показывает, что пролиферация PANC-1 клеток уменьшилась после miRNA-107 имитировать трансфекции(рисунок 3). Концентрация miRNA-107, вызвавшая ингибирование 50% жизнеспособности клеток (IC50) была определена генерацией кривой доза-реакции. Кроме того, применение уравнения 2 полезно для расчета всех возможных ингибирующих концентраций (ICx) для точной оценки воздействия miRNA-107 (Рисунок4).
Изучение корреляции между уровнями miRNAs и мРНК является эффективным способом идентификации миРНК, поскольку miRNAs может регулировать целевые уровни генов через деградацию мРНК2,20. Однако, поскольку miRNAs также действуют на переводном уровне, не влияя на процессы деградации мРНК, экспериментальная проверка взаимодействия генов миРНК-целевой с использованием проверки люциферазы является важным шагом. Основным преимуществом проверки люциферазы является то, что этот ассс можно исключить изменения уровней мРНК, регулируемых деградацией мРНК21. Таким образом, клонирование 3' UTR предсказанных генов-мишеней является важным шагом для выявления реальных генов цели miRNA интереса в сочетании с в режиме реального времени ПЦР и западных экспериментов по блу. Эффективное использование двойных векторов репортеров позволяет получить недвусмысленные экспериментальные данные, так как измерение уровней диспетчера может уменьшить экспериментальные вариации, такие как количество клеток. Процессы нормализации данных анализа люциферазы, полученных из векторов, содержащих 3' UTR гена синуклеина гамма (SNCG), показаны на рисунке 5E. Кроме того, скрининг 11 потенциальных прогнозируемых целей miRNA-107 ясно показывает, что только SNCG, положительный регулятор роста опухолевых клеток22,23, непосредственно взаимодействует с miRNA-107 в клетках PANC-1 (Рисунок 6). Этот вывод указывает на то, что miRNA-107 может негативно регулировать пролиферацию клеток PANC-1 путем модулирования экспрессии SNCG.
Рисунок 1: Экспериментальный дизайн для идентификации цели miRNA. На этой диаграмме показан поток экспериментальной конструкции, которая помогает определить цель miRNA. (A) Анализ зрелых уровней выражения miRNA и выбор miRNA интереса. (B) Три эксперимента, такие как miRNA имитировать трансфекцию, SRB ассссе, и поколение кривой дозы-реакции могут быть проведены для функционального исследования выбранных miRNAs. (C) Чтобы сузить целевые гены кандидата miRNA интереса, это полезно, чтобы проверить информацию и функцию прогнозируемых целевых генов в целевых программах прогнозирования, Pubmed, и GeneCard. (D) После обнаружения некоторых потенциальных целевых генов кандидата miRNA интереса, можно провести практические эксперименты, такие как клонирование 3' UTR мРНК, luciferase анализ, в режиме реального времени ПЦР, и западный пятно, чтобы, наконец, доказать прямую цель гены miRNA интереса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Зрелый анализ выражения miRNA. (A) Добавьте общую РНК из каждой клеточной линии (PANC-1, CAPAN-1 и HPNE), смеси DNase I и ультрачистую воду в маркированные полост-трубки. Общий объем в каждой трубке составляет 18 кЛ (PANC-1 и CAPAN-1 являются раковыми клетками поджелудочной железы, в то время как HPNE является нормальной линией клеток протока поджелудочной железы). (B) Передача 7,1 л DNase я лечил смеси в 2 комплекта новых полос-труб, и 1,5 л антисмысловых грунтов для гена GAPDH также добавляется в каждой трубке. Инкубировать ПЦР стриптиз-трубки при указанных условиях реакции. Затем добавьте ферментные смеси RT и 5x РТ-праймеры для конкретной миРНК (miRNA-107 или miRNA-301) в назначенные трубки, а затем повторно инкубировать трубки в указанных условиях. Одноцепочечные cDNA для конкретной miRNA и GAPDH генерируются. (C) Зрелые уровни miRNA-107 и miRNA-301 были определены зондом на основе ПЦР в реальном времени с использованием общей РНК, изолированных от PANC-1, CAPAN-1 и HPNE клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Мимик трансфекции и SRB Ассса. (A) Верхняя панель показывает разбавление мирнкуправления и miRNA-107 имитировать для подготовки трансфекционных смесей. Диапазон конечных концентраций miRNA-107 имитируют 0 нм, 1 нм, 5 нм, 10 нм, 25 нм, 50 нм и 100 нм. Общий объем в каждой колонке предназначен для перешивания клеток в одном колодце 96-колодца пластины. Нижняя панель показывает пример масштабирования трансфекционных смесей, чтобы подготовить достаточное количество смесей для трансфекции клеток в 4 скважинах в указанной концентрации. Далее, добавьте 50 юл смесей в каждую скважину, следуя предложенному формату для трансфектирования контроля miRNA, имитирующего мимикрирующую miRNA-107. Эта пластина была использована для SRB-проверки, которая включает в себя фиксацию клеток, окрашивание клеток и измерение абсорбции. (B) Фактическое изображение 96-хорошо пластины с указанием SRB окрашенных клеток. На этом снимке отчетливо видно, что количество клеток PANC-1 уменьшается по мере увеличения концентрации мирнк-107. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Поколение кривой доза-реакции. (A) Представитель дозы-ответ кривой miRNA-107 имитировать транс-инфицированных PANC-1 клеток. Трансинфицированные клетки инкубировались непрерывно в течение 96 ч. Параметры, закупленные из кривой дозы-реакции, также показаны. (B) Уравнение, переменные, начальные параметры и ограничения, а также описания определений и значений. (C) Вставьте определения и значения в соответствующие панели в программном обеспечении. "f" указывает на жизнеспособность ячейки % (например, значение "f" составляет "90" и "10" на IC10 и IC90,соответственно). Значение y0 составляет 100 и указывает на 100% жизнеспособность клеток контроля miRNA имитировать транс-инфицированных клеток. "n" указывает коэффициент типа Хилла (наклон участка). "k" указывает на концентрацию miRNA-107 имитировать, что производит 50% максимального эффекта miRNA-107 мимикрируют (IC50). "R" указывает на остаточную нетронутую фракцию (фракцию сопротивления). (D) Эта панель показывает, как рассчитать скорректированные значения ICx на основе параметров (n, k и R), приобретенных в Equation 1. Процент (%) жизнеспособность ячейки в панели представляет "f" в уравнении 1 и рассчитывается путем вычитания значения x каждого ICx от y0 (100). Уравнение 2 в формуле бар таблицы указывается как "(100-D3)/(D3-$B$5)) »(1/$B$3)»$B$4)" для расчета скорректированного значения IC10. Примените Equation 2 к другим ячейкам для расчета других значений ICx, нажав кнопку левой мыши на выбранной ячейке (красный цвет) и перетащив к ячейке значения IC90. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Проверка прямого целевого гена miRNA интереса. Эксперименты начинаются с проектирования грунтовок для клонирования 3' UTR. Праймеры используются для градиента ПЦР. (A) Лучшая температура аннулирования может быть выбрана среди шести указанных аннулирования температуры, чтобы усилить 3' UTR гена. Далее, двойное пищеварение выполняется с ограничения ферментов и ПЦР продукты ligated в векторы люциферазы. (B) Люциферазы векторы, содержащие 2 репортера генов, светлячок и ренилья luciferase, могут быть использованы для проверки взаимодействия miRNAs с 3' UTR мРНК. ПЦР-вставки клонируются в область, расположенную ниже по течению гена репортера рениллы. Ligated продукты были преобразованы в компетентные клетки и выросли клетки на пластине агар LB. (C) Индивидуальные колонии (#1 #6) были подобраны и повторно приостановлено в 50 Л ультрачистой воды. Подвеска кишечной палочки была использована для колонии ПЦР и прививки. Колония ПЦР является удобным инструментом для выбора лучших колоний для прививки и изоляции векторов люциферазы укрывательство 3' UTR гена. (D) Для проверки люциферазы, miRNA управления имитировать или miRNA-107 имитировать был трансфицирован в PANC-1 клетки с люциферазы конструкций с использованием 24-хорошо пластины. (E) Эта панель демонстрирует репрезентативные необработанные данные и расчет соотношения ренилья светлячок после выполнения анализа luciferase для проверки гена SNCG в качестве цели miRNA-107. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Скрининг предсказанных целевых генов miRNA-107. Скрининг взаимодействия между miRNA-107 и 3' UTR прогнозируемых целей был выполнен в клетках PANC-1 с использованием конструкций люциферазы. На основе негативного влияния miRNA-107 на пролиферацию клеток, потенциальные гены-кандидаты были определены для клонирования и скрининговых анализов. miRNA управления имитировать или miRNA-107 имитировать был трансфицироваться в PANC-1 клеток с люциферазы конструкций, содержащих 3' UTR каждого выбранного гена для 24 ч. Соотношение ренильи к светлячку было рассчитано и нормализовано на основе измеренных уровней обоих люциферас в клетках PANC-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Обнаружения | Mirna | GAPDH |
| Компоненты | ||
| Мастер-микс для зонда на основе ПЦР в реальном времени (2x) | 10 зл | – |
| Мастер-микс для ПЦР на основе красителя в реальном времени (2x) | – | 10 зл |
| Смесь зонда (5x) | 4 л | – |
| ПРАЙМЕРЫ GAPDH (по 1 мкм каждый) | – | 4 л |
| Разбавленная кДНК (1:49) | 6 зл | 6 зл |
| Общий объем | 20 зл | 20 зл |
Таблица 1: Условия, используемые для конкретного обнаружения miRNA и GAPDH ПЦР в режиме реального времени в данном исследовании.
| Компоненты | Реакция 1x | 7x реакция |
| 5x буфер | 5 зл | 35 зл. |
| смесь dNTP (2,5 мМ каждый) | 2 л | 14 зл. |
| Праймеры (по 10 км каждый) | 1 зл | 7 л |
| Геномная ДНК (2 нг/Л) | 16,5 л л | 115,5 л |
| Полимеразы | 0,5 л л | 3,5 л л |
| Общий объем | 25 зл. | 175 л |
Таблица 2: Состав смесей реакции ПЦР для усиления 3' UTR в данном исследовании.
| Компоненты | Реакция 1x |
| 10x буфер | 5 зл |
| Продукты ПЦР или векторы | Продукты ПЦР: 25 векторов: 1-2 мкг |
| Фермент ограничения XhoI (или AsiSI) | 2 л |
| Фермент ограничения NotI | 2 л |
| Ультрачистая вода | х Зл |
| Общий объем | 50 зл |
Таблица 3: Условия для двойного пищеварения продуктов ПЦР и векторов люциферазы с использованием XhoI (или AsiSI) и NotI ферментов в этом исследовании.
| Компоненты | Реакция 1x |
| 10x буфер | 2 л |
| Векторы (двойное переварение) | 50 нг |
| Продукты ПЦР (вставка) | х Зл |
| Лигаза | 200 U |
| Ультрачистая вода | y ЗЛ |
| Общий объем | 20 зл |
Таблица 4: Реакции лигации двойных переваренных продуктов ПЦР и люциферазы векторов с лигазой ДНК в этом исследовании.
Дополнительная диаграмма 1: Производные уравнения 2 из уравнения 1. Уравнение 2 получено из уравнения 1 для расчета скорректированных значений ICx. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная цифра 2: Информация о праймере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стратегии определения добросовестных целей miRNA с функциями miRNA интересов необходимы для понимания нескольких ролей miRNA. Идентификация генов миРНК может быть ориентиром для интерпретации событий сигнализации клеток, модулируемых миРНК в клетке. Открытие функционально важных целевых генов miRNAs может обеспечить фундаментальные знания для разработки miRNA основе терапии при раке.
Несколько методов, таких как microarrays, небольшой РНК библиотеки секвенирования, глубокое секвенирование, обратная транскрипция на месте ПЦР, и северной blotting могут быть применены для изучения уровней выражения miRNA с помощью общего РНК изолированы от клеточных линий и тканей24, 25,26. Высокое профилирование miRNAs с высокой пропускной стоимостью может дать ценную информацию о генетических основах развития рака. Анализ miRNA на основе зонда часто используется для проверки данных профилирования, а также подходит для проверки нескольких miRNAs, представляющих интерес. Тем не менее, измерение зрелых уровней miRNA с использованием зонда на основе ПЦР в режиме реального времени ограничивается, чтобы определить, являются ли зрелые miRNAs регулируются на этапе транскрипции или через регулирование созревания. Краситель основе ПЦР в режиме реального времени и северной blotting были введены для измерения miRNA уровней прекурсоров27,28. Измерение прекурсоров miRNA вместе со зрелыми уровнями miRNA может дополнительно предоставить информацию о том, как регулируются зрелые уровни миРНК. Кроме того, для разработки терапевтических подходов на основе миРНК необходимо всестороннее понимание регулирования уровней миРНК.
Пролиферация клеток, таких как тетразолий основе MTT анализ применимы для проверки последствий лечения реагентов, таких как miRNA мимики. Так как MTT-асссея отражает клеточную метаболическую активность, основанную на сокращении тетразолия клеточными оксидоредуктазами, можно наблюдать отсутствие корреляции между mtT-асса и общим номером клетки19. Кроме того, SRB-осяза доступна как наиболее воспроизводимый пересчет клеток, асссс18,19. Измерение количества sRB красителя, связанного с трихлороацетической кислотой фиксированных белков может представлять общее число клеток29. Кроме того, SRB-самосазва в этом протоколе может быть применен адля кратной мимики miRNA, а также противораковые препараты с использованием 384-колодцев. Тем не менее, SRB анализ имеет ограничения, такие как ручной скрининг. Кроме того, этот ассснет недоступен для неприсоединения клеток. Поскольку miRNAs также играют важную роль в гематологических злокачественных новообразований, таких как лимфома и миелома30, эффективный мониторинг пролиферации клеток требуется, чтобы разгадать функции miRNAs. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) может внутриклеточного ярлыка неприсоединения клеток. CFSE используется для мониторинга генерации размножающихся клеток цитометрией потока31. Кроме того, миРНК может влиять на вторжение, метастазы и запрограммированную гибель клеток. Таким образом, другие экспериментальные методы в сочетании с этим протоколом будут более практичными для правильного понимания функций miRNA, которые в конечном счете способствуют выявлению многофункциональных биологически значимых целей miRNAs.
Расчет половины максимальной ингибирующей концентрации (IC50) является важным методом не только для исследований миРНК, но и для оценки эффективности других противораковых препаратов. Значения IC50 могут быть использованы для сравнения потенциального воздействия нескольких миРНК или противораковых препаратов на пролиферацию клеток. Было продемонстрировано, что сочетание терапии на основе miRNA с противораковыми препаратами может обеспечить исключительную возможность для повышения эффективности противораковых препаратов. Кроме того, сочетание miRNAs с противораковыми препаратами может быть новым подходом к преодолению химиорезистентности32,33. Для оценки эффективности комбинации выгодно рассчитать скорректированные значения ICx на основе нашего протокола для оценки комбинированного индекса (CI), что позволяет количественно оценить синергизм или антагонизм33, 34.
Внутриклеточные сигнальные сети могут быть широко дезорганизованы аномально выраженными миРНК во многих заболеваниях, включая рак. Тем не менее, сигнальные сети, запутанные миРНК, по-прежнему в основном неизвестны, так как небольшая доля генов-мишеней была экспериментально проверена, а гены-мишени также регулируются с помощью неканонически реагирующих с miRNAs35. Тем не менее, наша стратегия и протокол являются надежными методами расшифровки клеточных механизмов миРНК. Кроме того, наш протокол может быть расширен для реализации и оценки сочетания миРНК и других противораковых препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования (2017R1D1A3B03035662); и Исследовательский фонд Галлимского университета, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6x DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8x Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1,000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
