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Genetics

ट्यूमर कोशिकाओं में MicroRNA स्तर, कार्यों, और एसोसिएटेड लक्ष्य जीन का मूल्यांकन करने के लिए एक इन विट्रो प्रोटोकॉल

Published: May 21, 2019 doi: 10.3791/59628
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Science and Research Institute for Bioscience & Biotechnology, Hallym University

Summary

इस प्रोटोकॉल एक जांच आधारित वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर), एक sulforhodamine बी (एसआरबी) परख, 3' untranslated क्षेत्रों (3' UTR) क्लोनिंग का उपयोग करता है, और एक luciferase परख ब्याज की एक miRNA के लक्ष्य जीन को सत्यापित करने के लिए और mirnas के कार्यों को समझने के लिए.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) छोटे नियामक आरएनए जो कैंसर सहित कई रोगों में कई intracellular संकेतन रास्ते मोड्यूल करने के लिए मान्यता प्राप्त कर रहे हैं. इन छोटे विनियामक आरएनए मुख्य रूप से अपने लक्ष्य दूत आरएनए (एमआरएनए) के 3' untranslated क्षेत्रों (3' UTR) के साथ बातचीत अंततः MRNAs की डिकोडिंग प्रक्रियाओं के अवरोध और लक्ष्य MRNA अवक्रमण के संवर्धन में जिसके परिणामस्वरूप. अभिव्यक्ति के स्तर और intracellular कार्यों के आधार पर, miRNAs oncogenic और ट्यूमर-suppressive mRNAs के नियामक कारकों के रूप में सेवा करने में सक्षम हैं. सैकड़ों या यहां तक कि गणना की भविष्यवाणी लक्ष्य के हजारों के बीच एक miRNA के सदाशयी लक्ष्य जीन की पहचान भूमिकाओं और ब्याज की एक miRNA के बुनियादी आणविक तंत्र विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. विभिन्न miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी कार्यक्रम संभव miRNA-mrNA बातचीत खोज करने के लिए उपलब्ध हैं. हालांकि, सबसे चुनौतीपूर्ण सवाल यह है कि कैसे ब्याज की एक miRNA के प्रत्यक्ष लक्ष्य जीन को मान्य करने के लिए. यह प्रोटोकॉल miRNA के कार्य से संबंधित miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के तरीके पर महत्वपूर्ण विधियों की एक पुन: उत्पादनीय रणनीति का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल जांच आधारित वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर), sulforhodamine बी (एसआरबी) एक miRNA नकल transfection के बाद का उपयोग कर miRNA स्तर, कार्यों, और संबंधित लक्ष्य mRNAs को उजागर करने के लिए कदम दर कदम प्रक्रियाओं पर एक व्यावहारिक गाइड प्रस्तुत करता है , खुराक प्रतिक्रिया वक्र पीढ़ी, और luciferase परख एक जीन के 3 ' UTR की क्लोनिंग के साथ, जो व्यक्तिगत miRNAs की भूमिकाओं की उचित समझ के लिए आवश्यक है.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) छोटे नियामक RNAs है कि मुख्य रूप से अनुवाद और दूत RNAs (mRNAs) की गिरावट की प्रक्रिया को संजोना कर रहे हैं 3' untranslated क्षेत्रों (3' UTR) सदाशयी लक्ष्य जीन1में प्रतिक्रिया द्वारा. miRNAs की अभिव्यक्ति प्रतिलेखन और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र द्वारा विनियमित किया जा सकता है। इस तरह के विनियामक तंत्रों के असंतुलन से कैंसर2सहित अनेक रोगों में अनियंत्रित और विशिष्ट मिराना अभिव्यक्ति का स्तर उत्पन्न होता है . एक एकल miRNA विविध mRNAs के साथ कई बातचीत हो सकती है. संगत, एक व्यक्ति MRNA विभिन्न mirnaद्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. अतः इंट्रासेल्यूलर संकेतन नेटवर्क विशिष्ट रूप से व्यक्त मिराना से जटिल रूप से प्रभावित होते हैं जिसके द्वारा शारीरिक विकारों और रोगों को आरंभ किया जा सकता है और2,3,4, 5 , 6.यद्यपि मिरानए की परिवर्तित अभिव्यक्ति विभिन्न प्रकार के कैंसरों में देखी गई है, फिर भी मिर्नेस के साथ संयोजन के रूप में कैंसर कोशिकाओं के शिष्टाचार को परिवर्तित करने वाले आणविक तंत्र अभी भी काफी हद तक अज्ञात हैं।

एकत्र सबूत दिखा रहा है कि miRNAs के oncogenic या ट्यूमर-संपीड़ित भूमिकाओं कैंसर के प्रकार पर निर्भर करते हैं. उदाहरण के लिए, फोर्कहेड बॉक्स ओ 3 (FOXO3) को लक्षित करके, miR-155 कोशिका प्रसार,मेटास्टेसिस, और कोलोरेक्टल कैंसर 7,8के chemoresistance को बढ़ावा देता है। इसके विपरीत, ग्लियोमा सेल आक्रमण के प्रतिबंध neurogenic टिड्डी पायदान homolog प्रोटीन 2 (NOTCH2) अभिव्यक्ति9के विनियमन के माध्यम से miR-107 द्वारा प्रेरित है। miRNA कार्यों के संबंध में miRNA-लक्ष्य बातचीत का मूल्यांकन बेहतर समझने के लिए एक अनिवार्य हिस्सा है कि कैसे miRNAs दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित10. इसके अलावा, miRNAs के सदाशयी लक्ष्य (ओं) की खोज आगे विभिन्न विरोधी कैंसर दवाओं के साथ एक miRNA आधारित चिकित्सा के लिए एक ठीक tuned रणनीति प्रदान कर सकते हैं. तथापि, मिरानए के क्षेत्र में मुख्य चुनौती मिरानए के प्रत्यक्ष लक्ष्यों की पहचान है। यहाँ, विस्तृत तरीकों miRNA लक्ष्य जीन निर्धारण के लिए reproduible प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. मिर्ना लक्ष्य पहचान के लिए सफल प्रायोगिक डिजाइन में विभिन्न चरण और विचार शामिल हैं (चित्र 1)। ट्यूमर कोशिकाओं और सामान्य कोशिकाओं में परिपक्व miRNA स्तर की तुलना ब्याज की एक miRNA का चयन करने के लिए आम प्रक्रियाओं में से एक हो सकता है (चित्र 1A) . सेल प्रसार पर एक miRNA के प्रभाव का पता लगाने के लिए एक चयनित miRNA के कार्यात्मक अध्ययन के लिए ब्याज की एक miRNA के सर्वश्रेष्ठ संभावित उम्मीदवार लक्ष्यों की सूची को संकीर्ण करने के लिए महत्वपूर्ण है (चित्र 1B) . miRNAs के प्रायोगिक रूप से मान्य कार्यों के आधार पर, एक miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी कार्यक्रम के साथ कंपनी में साहित्य और डेटाबेस की एक व्यवस्थित समीक्षा जीन कार्यों पर सबसे अधिक प्रासंगिक जानकारी खोज करने के लिए आवश्यक है (चित्र 1C)। ब्याज की एक miRNA के वास्तविक लक्ष्य जीन की पहचान इस तरह के एक जीन की 3 'UTR की क्लोनिंग के साथ luciferase परख के रूप में प्रयोगों को लागू करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, वास्तविक समय पीसीआर, और पश्चिमी सोख्ता (चित्र 1D)। वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य प्रमुख प्रयोगों के व्यापक तरीकों प्रदान करने के लिए है, जांच आधारित वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर), sulforhodamine बी (एसआरबी) परख एक miRNA नकल transfection के बाद, खुराक प्रतिक्रिया वक्र पीढ़ी, और एक जीन के 3 ' UTR की क्लोनिंग के साथ luciferase परख. वर्तमान प्रोटोकॉल व्यक्तिगत miRNAs के कार्यों की एक बेहतर समझ और कैंसर चिकित्सा में एक miRNA के निहितार्थ के लिए उपयोगी हो सकता है.

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Protocol

1. परिपक्व MicroRNA (miRNA) अभिव्यक्ति विश्लेषण

  1. परिपक्व miRNA पूरक डीएनए (cDNA) संश्लेषण
    1. कुल आरएनए के 254 एनजी और deoxyribonuclease I (DNase I) मिश्रण के 254 एनजी जोड़ें, और फिर पीसीआर स्ट्रिप-ट्यूब में अल्ट्राप्यूरे पानी जोड़ें ताकि 18 डिग्री सेल्सियस तक बनाया जा सके (चित्र 2क)। अभिक्रियाओं की कुल संख्या के आधार पर पर्याप्त मात्रा में DNase I मिश्रण का उपयोग करके अनेक कोशिका रेखाओं से शुद्ध किए गए प्रत्येक कुल RNA नमूने के लिए अभिक्रिया कीजिए।
      नोट: DNase मैं मिश्रण DNase मैं (1.8 $L), ribonuclease अवरोध करनेवाला (0.3 $L), और 25 एमएम MgCl2 (2.4 डिग्री सेल्सियस) से बना रहे हैं. कुल आरएनए की पुनः खरीद करने के लिए, एक स्तंभ-आधारित निष्कर्षण विधि को एक फीनॉल-क्लोरोफॉर्म आधारित निष्कर्षण विधि का उपयोग करने के बजाय applicated किया गया था। यह बताया गया था कि फीनॉल-क्लोरोफॉर्म आधारित निष्कर्षण विधि11,12का उपयोग करते समय कोशिकाओं की संख्या के आधार पर कुछ मिरानए की निष्कर्षण उपज में परिवर्तन किया जा सकता है।
    2. एक थर्मल चक्र में ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ट्यूब ों, और गर्मी में निष्क्रिय DNase मैं 90 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट ऊष्मायन द्वारा। तब्ली में ट्यूब को ऊष्मायन के बाद बर्फ पर रखें।
    3. स्थानांतरण 7ण्1 डिग्री सेल्सियस DNase के मैं नई ट्यूबों के 2 सेट में कुल आरएनए इलाज किया और फिर ग्लिसरैल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) जीन (चित्र 2B) के लिए antisense प्राइमर के 1.5 $ L जोड़ें।
      नोट: CDNA संश्लेषण के लिए कुल आरएनए की राशि इस चरण में 100 एनजी हो जाता है। GAPDH antisense प्राइमर की स्टॉक एकाग्रता 10 डिग्री सेल्सियस है. GAPDH antisense प्राइमर जोड़ना एक जीन-विशिष्ट प्राइमर विधि का उपयोग कर GAPDH सीडीएएनएस की पीढ़ी के लिए है।
    4. एक थर्मल साइकिलर का उपयोग कर ट्यूबों इनक्यूबेट। 5 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर शुरू करें और इसके बाद 5 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया के बाद, तुरंत इनक्यूबेशन के बाद ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
    5. प्रत्येक अभिक्रिया में रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) एंजाइम मिश्रण का 3ण्4 र्ल जोड़ें (चित्र 2ख)। आरटी एंजाइम मिश्रण 100 एमएम deoxyribonucleotide ट्राइफॉस्फेट (0.15 $L), 10x आरटी बफर (1.5 $L), राइबोन्यूक्लिज अवरोधक (0.75 डिग्री सेल्सियस) से बना है, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन एंजाइम (1 $L)। अभिक्रियाओं की कुल संख्या के आधार पर पर्याप्त मात्रा में मिश्रण तैयार की जाइए।
    6. प्रत्येक अभिक्रिया में एक विशिष्ट मिर्ना के लिए 5x आरटी प्राइमर का 3 डिग्री ल जोड़ें (चित्र 2ख)
      नोट: प्रत्येक अभिक्रिया के लिए कुल आयतन 15 डिग्री सेल्सियस है।
    7. एक थर्मल साइकिलर का उपयोग कर ट्यूब चलाएँ. 30 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस से शुरू करें जिसके बाद 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया होती है, और अंत में 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर रुकिए। किसी भी शेष समय के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रुको (चित्र 2बी)। एकल-संक्षिप्त CDNAs दोनों एक ही ट्यूब में एक विशिष्ट miRNA और GAPDH जीन के लिए इस कदम में उत्पन्न कर रहे हैं.
  2. वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) और डेटा विश्लेषण
    1. 1:49 अनुपात में अल्ट्राप्यूर पानी के साथ प्रत्येक cDNA को पतला करें।
    2. किसी विशिष्ट मिर्ना तथा गपध (सारणी1) के लिए अभिक्रिया मिश्रण तैयार की जाइए। एक विशिष्ट miRNA और GAPDH का पता लगाने के लिए, प्रत्येक cDNA नमूने के लिए triplicate प्रतिक्रियाओं की स्थापना की.
    3. रीयल-टाइम PCR और डेटा विश्लेषण निष्पादित करें (चित्र 2C). तुलनात्मक सीटी विधि13,14का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें .

2. माइक्रोरना (miRNA) MimicTransfection

नोट: miRNA-107 चरण 1 से चुना गया है। चूंकि miRNA-107 सामान्य कोशिकाओं की तुलना में ट्यूमर कोशिकाओं में नीचे विनियमित है, यह अनुमान लगाया जा सकता है कि miRNA-107 एक ट्यूमर दमनकारी miRNA है. एक miRNA के मामले में जो सामान्य कोशिकाओं (उदाहरण केलिए, miRNA-301), miRNA-301 के खिलाफ antisense oligonucleotides कदम के लिए लागू किया जा सकता है के साथ तुलना में ट्यूमर कोशिकाओं में विनियमित 2, 3, और 4.

  1. एक गिनती कक्ष डिवाइस के साथ कोशिकाओं की गणना और एक 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं थाली. कोशिका घनत्व है 2 x 103 कोशिकाओं / पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) युक्त सेल कल्चर मीडिया का उपयोग न करें क्योंकि P/
  2. मिरना नियंत्रण नकल के कई अंतिम सांद्रता में कोशिकाओं को ट्रांसफेक्शन मिश्रण का एक सेट तैयार करें और अगले दिन मिर्ना-107 नकल करें (चित्र 3)।
    1. मिर्ना नियंत्रण नकल या miRNA-107 नकल के स्टॉक (25 डिग्री सेल्सियस एकाग्रता) से, पतला और कम-सीरम मीडिया में नियंत्रण नकल या miRNA-107 नकल की इसी राशि जोड़ने के साथ एक transfection अभिकर्मक microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग कर (चित्र 3A)। माइक्रोपिपेट का उपयोग करके मिश्रण युक्त अल्पाउना को धीरे-धीरे मिलाएं। अल्पान्मूलक (miRNA mimic control + miRNA-107 नकल) की कुल राशि प्रत्येक कुएं में समान होनी चाहिए। रिक्त कुओं सेल संस्कृति मीडिया के 100 डिग्री सेल्सियस और कोशिकाओं के बिना एक transfection अभिकर्मक युक्त कम सीरम मीडिया शामिल हैं.
  3. एक सेल संस्कृति हुड में एक 10 मिनट ऊष्मायन के बाद, धीरे मिश्रण युक्त ओलिगो मिश्रण फिर से और फिर प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रण के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में transfected कोशिकाओं रखें. 6-12 एच इनक्यूबेशन के बाद दोनों भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और पी/एस युक्त ताजा सेल संस्कृति मीडिया के साथ मीडिया युक्त ट्रांसफेक्शन रिएजेंट को बदलें। इसके अलावा 72 ज के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। मिर्ना नकल की कुल उपचार अवधि 96 ज है।

3. Sulforhodamine बी (SRB) परख

  1. कक्ष निर्धारण
    1. थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से सेल संस्कृति मीडिया निकालें और तुरंत प्रत्येक अच्छी तरह से में 10% trichloroacetic एसिड (TCA) के 100 $L भरें. ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से सेल संस्कृति मीडिया aspirate नीचे से किसी भी सेल क्षति और टुकड़ी से बचने के लिए.
      नोट: 50 एमएल आसुत जल में 20 ग्राम टीसीए पाउडर डालकर 40% टीसीए तैयार करें। 40% टीसीए से, 1:3 कमजोर पड़ने के अनुपात में आसुत पानी के साथ 40% टीसीए को कम करके 10% टीसीए बनाएं।
    2. 1 h के लिए एक रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में 10% टीसीए युक्त प्लेट रखें।
    3. प्लेट को पानी के टब में डुबाकर कई बार धो लें और उसे सुखा लें। प्लेट को टैप करके कुओं के अंदर से अतिरिक्त पानी निकालें जब तक कि कुओं में पानी नहीं बचा हो। अगले चरण में जाने से पहले प्लेट को प्रयोगशाला की बेंच पर छोड़ दें ताकि इसे सूखने के लिए छोड़ दें।
  2. सेल धुंधला
    1. खाली कुओं सहित प्रत्येक कुएं में 0.4% एसआरबी समाधान के 50 डिग्री एल। धीरे 0.4% SRB समाधान लगातार कुओं के नीचे शामिल किया गया जब तक थाली हिला.
      नोट: 1% एसिटिक एसिड के 100 एमएल में 0.4 ग्राम एसआरबी पाउडर डालकर 0.4% एसआरबी घोल तैयार करें और उपयोग करें। इसे मिश्रण करने के लिए समाधान को सावधानी से हिलाएं। एल्यूमीनियम पन्नी के रूप में एक प्रकाश सुरक्षात्मक सामग्री में 0.4% SRB समाधान की बोतल लपेटें. एक रेफ्रिजरेटर में 0.4% SRB समाधान स्टोर.
    2. 40 मिनट से 60 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद, प्लेट को 1% एसिटिक एसिड के साथ धोने से धो लें। प्लेट को तब तक धोएं जब तक कि असीम डाई पूरी तरह से बह न जाए (चित्र 3ख)
    3. अगले चरण में जाने से पहले प्लेट को प्रयोगशाला की बेंच पर छोड़ दें ताकि इसे सूखने के लिए छोड़ दें।
      नोट: थाली 3.3 कदम जाने से पहले पूरी तरह से सूख जाना चाहिए.
  3. अवशोषण माप
    1. त्रिस आधार विलयन (10 उम) के पिपेट 100 डिग्री सेल्सियस रिक्त कुओं सहित संगत कुओं में। 10 मिनट के लिए एक शेकर पर प्लेट रखें. 492 एनएम पर अवशोषण उपाय.

4. एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र की पीढ़ी

  1. एक स्प्रेडशीट में SRB परख डेटा का विश्लेषण करें. प्रत्येक समूह के अवशोषण मानों से रिक्त अवशोषण को घटाएं और प्रत्येक समूह के अवशोषण मानों के औसत (एवी) और मानक विचलन (एसटीडी) की गणना करें।
  2. औसत अवशोषण के प्रतिशत की गणना (AVE%) और मानक विचलन की है कि (एसटीडी%) प्रत्येक समूह के SRB परख के अवशोषण मूल्यों का उपयोग कर.
    नोट: MIRNA नियंत्रण नकल समूह के AV% 100% है. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करएसटीडी% की गणना करें: एसटीडी% ] (प्रत्येक समूह के एसटीडी / नियंत्रण नकल उपचारित समूह के अवशोषण) x 100।
  3. उपचार सांद्रता सहित कच्चे डेटा आयात, AVE%, और एसटीडी% सॉफ्टवेयर में खड़ी उन डेटा aligning द्वारा. चूंकि लॉग 0 परिभाषित नहीं है, इसलिए X अक्ष की पहली सांद्रता0 (उदा. 0 के करीब है जो किसी मान के लिए सेट करें ( उदा. 0.01).
  4. ग्राफ़ टैब बनाएँ क्लिक करें और साधारण स्कैटर-त्रुटि पट्टियाँचुनें. कार्यपत्रक स्तंभों को प्रतीक मानों के रूप में चुनें और अगलाक्लिक करें. डेटा स्वरूप फलक में, XY युग्मों का चयन करें और अगलाक्लिक करें. चयन डेटा फलक में संगत डेटा स्तंभों का चयन करें. प्लॉट बनाने के लिए समाप्त करें बटन क्लिक करें.
    नोट: एक्स अक्ष सांद्रता का प्रतिनिधित्व करता है, Y अक्ष प्रत्येक एकाग्रता के औसत अवशोषण का प्रतिशत इंगित करता है (AVE%), और त्रुटि सलाखों के बाहर प्रत्येक एकाग्रता के मानक विचलन का प्रतिशत बिंदु (एसटीडी%).
  5. स्केल के प्रकार और अक्ष की स्केलिंग को संशोधित करने के लिए X अक्ष पर डबल-क्लिक करें. पैमाने का प्रकार रेखीय से लॉग करने के लिए परिवर्तित करें. प्रारंभ और समाप्ति श्रेणी संख्या को क्रमशः 0.01 और 200 तक संशोधित करें.
  6. किसी भी स्कैटर प्लॉट पर राइट-क्लिक करें, वक्र फिट चुनें, और परिभाषित उप-श्रेणी उपयोगकर्ता-पर जाएँ. खुराक-प्रतिक्रिया वक्र का चयन करें, अगला बटन क्लिक करें, और तब समाप्त करें बटन क्लिक करें. खुराक-प्रतिक्रिया वक्र अब एक रिपोर्ट टैब के साथ उत्पन्न होता है (चित्र 4A) .
    1. एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र के उत्पादन के लिए सॉफ़्टवेयर में इनपुट समीकरण 1 के लिए, विश्लेषण टैब क्लिक करें और प्रतिक्रमण विज़ार्डका चयन करें। समीकरण श्रेणी में यूज़र-डिफ़ाइंड पर जाएँ और फिर नया बटन क्लिक करें. समीकरण 1, चर, प्रारंभिक पैरामीटर, और बाधाओं को संगत रिक्त बक्सों में सम्मिलित करें (चित्र 4B,C). बटन के रूप में जोड़ें क्लिक करें और समीकरण का नाम खुराक-प्रतिक्रिया वक्रके रूप में सेट करें. समीकरण नाम अब समीकरण श्रेणी में उप-श्रेणी उपयोगकर्ता-निर्धारित में जनरेट किया गया है। च समीकरण 1 में सेल व्यवहार्यता (% सेल व्यवहार्यता) का प्रतिशत इंगित करता है।

समीकरण 1
Equation 1

  1. रिपोर्ट टैब पर जाएँ और तब n, k, और R मानों की जाँच करें.
    नोट: y0 miRNA नियंत्रण नकल इलाज समूह के 100% सेल व्यवहार्यता इंगित करता है, n हिल-प्रकार गुणांक इंगित करता है (एक साजिश की ढलान), कश्मीर miRNA-107 नकल की एकाग्रता इंगित करता है कि miRNA-107 नकल अधिकतम प्रभाव का एक 50% का उत्पादन (आधा अधिकतम निरोधात्मक सांद्रता, आईसी50), और त् अवशिष्ट अप्रभावित अंश (प्रतिरोध अंश)15को इंगित करता है। एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र जनरेट करने के लिए उपयोग किया जाने वाला समीकरण y0 से R मान (यदि कोई हो) तक की श्रेणी को 100% (चित्र 4A) के रूप में पहचानता है। अतः समायोजित k (IC50) मान प्राप्त करना आवश्यक है, जिसकी गणना y0 से शून्य के मान तक की गई श्रेणी के आधार पर की जाती है (चित्र 4क)। समायोजित k (IC50) अन्य ICx मानों के साथ (जैसे-I10 से IC90) समीकरण 2 का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, जो समीकरण 1 से व्युत्पन्न है। समीकरण 2 से समीकरण 2 का व्युत्पत्ति अनुपूरक चित्र 1में दर्शाया गया है।

समीकरण 2
Equation 2

  1. उस कक्ष पर बाएँ माउस बटन को डबल-क्लिक करें जिसमें समीकरण 2 लागू किया गया है. उत्पन्न खुराक-प्रतिक्रिया वक्र से समीकरण 2 और पैरामीटर का उपयोग करके, यह आईसी10 से IC 90 (चित्र4D)तक के समायोजित मानों की गणना करने के लिए उपलब्ध है।
  2. सूत्र के बाद बराबर का चिह्न इनपुट करें जो कक्ष में कोष्ठक से शुरू होता है. सूत्र दर्ज करते समय, संगत स्तंभ और पंक्ति में डॉलर चिह्न जोड़कर n, k, और R का मान निरपेक्ष कक्ष संदर्भों के रूप में ठीक करें, ताकि सूत्र को पंक्तियों में स्वत: भरने पर ये निश्चित मान परिवर्तित न किए जा सकें (चित्र 4D). वैकल्पिक रूप से, समायोजित मान मैन्युअल रूप से समीकरण 2 का उपयोग कर गणना की जा सकती है।
    नोट: R मान 10 से अधिक है, क्योंकि IC90 मान निर्धारित नहीं है। इसके अतिरिक्त, यदि त् मान 20 से अधिक है, तो IC80 का मान भी निर्धारित नहीं किया जाता है (चित्र 4D)।

5. ब्याज की एक MicroRNA के प्रत्यक्ष लक्ष्य जीन का सत्यापन

नोट: इस तरह के एसआरबी परख के रूप में कार्यात्मक प्रयोग प्रदर्शन करने के बाद, miRNA-107 एक ट्यूमर दमनकारी miRNA के रूप में पुष्टि की है और यह अत्यधिक संभव है कि miRNA-107 सीधे oncogenes लक्ष्य. ऐसे TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/) के रूप में एक miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी कार्यक्रम का उपयोग कर सभी अनुमानित लक्ष्य जीन की सूची की जाँच करें, और फिर PubMed सहित डेटाबेस में एक जीन के समारोह के आधार पर संभावित उम्मीदवार लक्ष्य के लिए नीचे संकीर्ण और जीनकार्ड.

  1. 3' untranslated क्षेत्र (UTR) की क्लोनिंग के लिए प्राइमर डिजाइन
    1. जीनकार्ड (https://www.genecards.org/) में एक जीन का नाम रखो और एक जीन का प्रतीक क्लिक करें. जीन के Ensembl ID पर क्लिक करके Ensembl जीनोम ब्राउज़र का आकलन करें और फिर ट्रांसक्रिप्ट तालिका में ट्रांसस्क्रिप्ट ID क्लिक करें. उसके बाद, क्लिक करें Exons बाईं ओर Transcript-आधारित प्रदर्शित करता है सूची में मौजूद है।
    2. 3' यूटीआर के न्यूक्लिओटाइड दृश्यों की प्रतिलिपि बनाएँ और इसे प्राइमर डिजाइन प्रोग्राम में पेस्ट करें। इस प्रोग्राम से फिर से अनुक्रमों की प्रतिलिपि बनाएँ और उसे एक वर्ड प्रोसेसर में चिपकाएँ. miRNA बाध्यकारी दृश्यों की उपस्थिति के साथ ही क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किया प्रतिबंध एंजाइमों साइटों की उपस्थिति की जाँच करें.
      नोट: यदि 3 ' UTR के भीतर कोई प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइटों रहे हैं, क्लोनिंग के लिए चयनित प्रतिबंध एंजाइमों अगले चरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    3. प्राइमर डिजाइन प्रोग्राम में, 3' UTR दृश्यों को स्वीकार करें और निम्न लिखित स्थिति के साथ आगे और रिवर्स प्राइमर डिज़ाइन करना शुरू करें. लंबाई: 20-30 न्यूक्लिओटाइड्स, टी एम: 45-58 डिग्री सेल्सियस, जीसी%: 40-60%। दो प्राइमर के टीएम मूल्यों के बीच का अंतर 5 डिग्री सेल्सियस से कम होना चाहिए। इस अध्ययन में प्रयुक्त प्राइमर अनुक्रम अनुपूरक चित्र 2में दिए गए हैं। प्रतिबंध एंजाइम मान्यता दृश्यों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 4 यादृच्छिक न्यूक्लिओटाइड डिजाइन प्राइमर के लिए जोड़ें.
  2. ग्रेडिएंट पीसीआर
    1. पीसीआर अभिक्रिया मिश्रण का 25 डिग्री सेल्सियस तैयार कीजिए जिसमें प्रति एक अनीलन ताप पर अभिकल्पित प्राइमर शामिल हैं (सारणी2)। अभिक्रियाओं की कुल संख्या के आधार पर पर्याप्त मात्रा में मिश्रण तैयार की जाइए। पाइपिंग द्वारा विलय को मिलाकर प्रत्येक नली में अभिक्रिया मिश्रण का 25 डिग्री सेल्सियस मिलाइए। कुछ सेकंड के लिए ट्यूब ों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. विस्तार कदम के लिए विकृतीकरण चरण से 35-40 पीसीआर चक्र प्रदर्शन। निम्न चरणों के रूप में पीसीआर चक्र सेट करें: 1 मिनट (1 चक्र, पॉलिमरेज सक्रियण चरण के लिए 98 डिग्री सेल्सियस), 10 एस (विकृतीकरण चरण) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस (एनेलिंग चरण), 68 डिग्री सेल्सियस (विस्तार कदम, 10 एस-1 मिनट प्रति 1000 बीपी), 68 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस (चरण समाप्ति) , और अंत में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत हो जाओ।
    3. पीसीआर उत्पादों को चलाने और डीएनए सीढ़ी के साथ एक 1% agarose जेल पर बैंड की जाँच करें। सर्वश्रेष्ठ अनीलन ताप का पता लगाएं (चित्र 5क) एक जीन के 3 ' UTR बढ़ाना फिर से अगले चरण के लिए सबसे अच्छा अनीलन तापमान का उपयोग कर.
  3. डबल पाचन
    1. एक ट्यूब (सारणी3) में दो प्रतिबंध एंजाइमों, XhoI (या AsiSI) और NotI सहित प्रतिक्रिया मिश्रण बनाओ. पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके 3-4 एच के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    2. एक 1% agarose जेल पर डबल पचा उत्पादों चलाने के लिए और फिर यूवी प्रकाश के तहत बैंड में कटौती. लूसिफेरेज सदिशों के मामले में, जेल पर चलने से पहले, एक और 1 एच के लिए क्षारीय फॉस्फेटेज के 10 यू के साथ डबल डाइजेस्ट सदिशों को प्रतिक्रिया करें ताकि लिगेशन चरण के दौरान पुनर्वृत्तीकरण को रोका जा सके।
    3. एक्साइज्ड बैंड से डबल डाइजेस्ट पीसीआर उत्पादों और ल्यूसिफरेस वेक्टर को शुद्ध करें।
  4. ल्यूसिफेरेस वेक्टर में पीसीआर उत्पादों का लिगेशन
    1. डीएनए लिगेस (सारणी4)सहित लिगेशन अभिक्रिया के 20 डिग्री एल की व्यवस्था की है।
      नोट: luciferase वेक्टर करने के लिए PCR उत्पाद (सम्मिलित) का मोलर अनुपात 3:1 हो सकता है। 1:1 या 2:1.
    2. एक थर्मल साइकिलर का उपयोग कर रात भर 16 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को 10-15 एस के लिए संक्षिप्त अपकेंद्रण और इनक्यूबेट करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, ट्यूब लिगेशन के लिए 2-3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जा सकता है। इस चरण में, PCR सम्मिलित एक renilla रिपोर्टर जीन के नीचे तैनात क्षेत्र में क्लोन किया जाएगा (चित्र 5B). एक जीन के क्लोन 3 ' UTR में miRNAs के बंधन renilla गतिविधि में कमी कर सकते हैं. जुगनू ल्यूसिफरेज रेनिला अभिव्यक्ति स्तर के सामान्यीकरण के लिए है।
  5. परिवर्तन और कॉलोनी पीसीआर
    1. सक्षम कोशिकाओं वाले ट्यूब में लिगेशन मिश्रण (3-5 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें। धीरे से ट्यूब नल और बर्फ (20 मिनट) पर रखने के लिए।
      नोट: लिगिंग मिश्रण जोड़ने से पहले बर्फ पर सक्षम कोशिकाओं को मुक्त करें।
    2. जल्दी और धीरे एक गर्मी ब्लॉक करने के लिए ट्यूब हस्तांतरण. एक गर्मी के झटके के बाद (42 डिग्री सेल्सियस 30 s-1 मिनट के लिए), 20 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब जगह है.
    3. Luria-Bertani (एलबी) agar प्लेट पर प्रसार सक्षम कोशिकाओं. एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) में सक्षम कोशिकाओं को रात भर बढ़ाएँ।
      नोट: ऐम्पीसिलिन (50-100 ग्राम/एमएल) आगर प्लेट में समाहित है।
    4. एक व्यक्तिगत कॉलोनी उठाओ और अल्ट्रापुरे पानी युक्त 8 पट्टी ट्यूबों में से एक में ई. कोलाई resuspend. बेतरतीब ढंग से चयनित 4-8 कालोनियों से ई. कोलाई को पुन: स्टेप करने के लिए इस चरण को दोहराएं (चित्र 5ं) .
    5. 8 पट्टी ट्यूबों का एक और सेट में ई. कोलाई निलंबन के 25 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण. अब, ई. कोलाई निलंबन की ट्यूबों के 2 सेट हैं।
      नोट: एक ट्यूब कॉलोनी पीसीआर के लिए है और एक अन्य टीका के लिए है। टीका के लिए ई. कोलाई निलंबन अस्थायी रूप से 4 डिग्री सेल्सियस (चित्र 5 ब्) में संग्रहीत किया जा सकता है।
    6. ई. कोलाई निलंबन का उपयोग कर कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन करते हैं। यह चरण यह निर्धारित करने के लिए है कि कालोनियों में एक सम्मिलित होता है या नहीं। एक जीन के 3 'UTR शरण luciferase वैक्टर ोंको टीका और अलग करने के लिए सबसे अच्छा कालोनियों का चयन करें (चित्र 5C)।
      नोट: चयनित जीनों के प्रत्येक 3 'UTR के लिए चरण 5-1-5.5 दोहराएँ. ई. कोलाई निलंबन के साथ जीनोमिक डीएनए की जगह द्वारा तालिका 2 में दिखाए गए पीसीआर प्रतिक्रिया की स्थिति का पालन करें।
  6. ल्यूसिफरेस परख
    1. 24-वेल प्लेट तैयार करें। प्रत्येक कुएं के लिए 500 डिग्री सेल्सियस कोशिका संस्कृति मीडिया में 1-2 x 104 कोशिकाओं का प्रयोग करें. ट्रांसफेक्शन के लिए पी/एस युक्त सेल कल्चर मीडिया का उपयोग न करें क्योंकि पी/एस का उपयोग करने से ट्रांसफेक्शन दक्षता को कम किया जा सकता है।
    2. नियंत्रण नकल या एक विशिष्ट miRNA एक transfection अभिकर्मक का उपयोग कर नकल के साथ कोशिकाओं में luciferase वेक्टर के 50 एनजी transfect (चित्र 5D) . यदि एक विशिष्ट miRNA के प्रभाव स्क्रीनिंग एक से अधिक एकाग्रता पर नकल, प्रत्येक अच्छी तरह से में एक ही oligos की कुल राशि रखने के लिए (चरण 2 देखें).
    3. अगले दिन फास्फेट बफर ्ड नमकीन (पीबीएस) का उपयोग करके कुओं के अंदर दो बार धोएं।
    4. कुओं में 200 डिग्री सेल्सियस लाइसिस अभिकर्मक लागू करें और ल्यूसिफरेस गतिविधि को मापने से पहले पर्याप्त रूप से सेल lysis बाहर ले.
      नोट: प्लेट को कम से कम 15 मिनट मिलाते हुए प्लेट पर रखें।
    5. नई ट्यूब में सेल lysate के 5-10 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण और अभिकर्मक I के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. तुरंत pipeting द्वारा समाधान मिश्रण और एक luminometer का उपयोग कर जुगनू luciferase गतिविधि पढ़ें.
      नोट: 10-15 एस के लिए जुगनू luciferase गतिविधि पढ़ें.
    6. एक ही ट्यूब में अभिकर्मक द्वितीय के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, और फिर दो बार पाइपिंग द्वारा मिश्रण. एक luminometer का उपयोग कर 10-15 s के लिए renilla luciferase गतिविधि पढ़ें. चरण 5.6.5 और 5.6.6 प्रत्येक नमूने के लिए दोहराएँ.
    7. पुनिला के जुगनू के अनुपात की गणना कीजिए (चित्र 5ई)
      नोट: जुगनू की गतिविधि कोशिकाओं में ल्यूसिफरेजे के ट्रांसफेक्शन दक्षता का प्रतिनिधित्व करती है।

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Representative Results

miRNA स्तर के सफल और सटीक पुष्टि डेटा जिसके द्वारा miRNAs का वर्गीकरण विकास और एक रोग की प्रगति में miRNAs की प्रत्याशित भूमिकाओं के आधार पर संभव है की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है. MIRNA-107 और miRNA-301 के स्तर जांच आधारित मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग कर तीन अग्न्याशय सेल लाइनों में मापा गया. एक ही प्रतिक्रिया में एक विशिष्ट miRNA और एक संदर्भ जीन दोनों के CDNAs के संश्लेषण डेटा की पुन: उत्पादन क्षमता में वृद्धि कर सकते हैं. PANC-1 और CAPAN-1 मानव अग्नाशयी डक्ट एडेनोकार्सीनोमा सेल लाइनें हैं, जबकि HPNE एक अमर अग्न्याशय नलिका सेल लाइन है जो एक रेट्रोवायरल अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूसर्ड है जो मानव टेलोमेरेज रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (hTERT) जीन को आश्रय देती है। एचपीएनई कोशिकाओं की तुलना में पैन्स-1 और कैपन-1 कोशिकाओं में मिराना-107 काफी कम हो गया था (चित्र 2 सी) एचपीएनई कोशिकाओं की तुलना में एमआईआरए-301 के स्तर पैनसी-1 और कैपन-1 कोशिकाओं में काफी ऊपर-नियामक थे। ये परिणाम पिछले रिपोर्टों के अनुसार कर रहे हैं कि miRNA-107 अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं में epigeneticly निष्क्रिय है और कि miRNA-301 स्तर सामान्य अग्नाशयीय नलिका कोशिकाओं की तुलना में अग्नाशयी नलिका एंडेनोकार्सीनोमा कोशिकाओं में उच्च रहे हैं16, 17.

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (एमटीटी) परख कोशिका चयापचय गतिविधियों को दर्शाता है। इस सुविधा के लिए एमटीटी परख और कुल सेल संख्या के बीच सहसंबंध की कमी प्राप्त करने के लिए एक काफी उच्च अवसर है उपचार अभिकर्मकों का एक प्रकार सहित परख शर्तों के बाद से गंभीर रूप से tetrazolium के एंजाइमी कमी को प्रभावित कर सकते हैं 18,19. इस सीमा को दूर करने के लिए, sulforhodamine बी (SRB) परख miRNA-107 के संभावित जैविक कार्यों की पहचान करने के लिए सेल प्रसार पर miRNA-107 के प्रभाव को मापने के लिए लागू किया गया था. निश्चित कोशिकाओं में बाध्य SRB डाई की राशि कोशिकाओं की कुल संख्या में परिवर्तन के एक किराए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस अध्ययन में एसआरबी परख स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि एक miRNA-107 नकल transfection के बाद PANC-1 कोशिकाओं के प्रसार में कमी आई (चित्र 3) . miRNA-107 एकाग्रता है कि 50% सेल व्यवहार्यता के एक अवरोध का कारण बना (आईसी50) एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र की पीढ़ी द्वारा निर्धारित किया गया था. इसके अतिरिक्त, समीकरण 2 का अनुप्रयोग miRNA-107 के प्रभावों का ठीक से मूल्यांकन करने के लिए सभी संभव निरोधात्मक सांद्रताओं (आईसीएक्स) की गणना करना लाभदायक है (चित्र 4)।

मिर्ना और एमआरनए स्तरों के बीच सहसंबंध की जांच मिर्ना लक्ष्य पहचान के लिए एक प्रभावी तरीका है क्योंकि मिर्ना एमआरनए2,20के अवक्रमण के माध्यम से लक्ष्य जीन स्तरों को विनियमित कर सकता है . हालांकि, के बाद से miRNAs भी MRNA गिरावट की प्रक्रियाओं को प्रभावित किए बिना अनुवाद स्तर पर कार्य, miRNA-लक्ष्य जीन बातचीत के प्रयोगात्मक सत्यापन luciferase परख का उपयोग कर एक आवश्यक कदम है. ल्यूसिफेरेस परख का मुख्य लाभ यह है कि यह परख एम आर एन ए21के अवक्रमण द्वारा विनियमित एमआरएनए स्तरों के परिवर्तनों को खारिज कर सकती है . इसलिए, अनुमानित लक्ष्य जीनों के 3 ' यूटीआर की क्लोनिंग वास्तविक समय पीसीआर और पश्चिमी दाग प्रयोगों के साथ संयोजन के रूप में ब्याज की एक miRNA के वास्तविक लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। दोहरी रिपोर्टर वैक्टर के एक कुशल उपयोग के लिए स्पष्ट प्रयोगात्मक डेटा प्राप्त करने के बाद से नियंत्रण रिपोर्टर के स्तर की माप इस तरह के कोशिकाओं की संख्या के रूप में प्रयोगात्मक विविधताओं को कम कर सकते हैं अनुमति देता है. ल्यूसिफेरेज परख डेटा की सामान्य प्रक्रिया जो एक सिन्युक्लिइन गामा (एसएनसीजी) जीन के 3 ' यूटीआर युक्त वैक्टरों से प्राप्त की जाती है, चित्र 5Eमें दर्शाया गया है। इसके अतिरिक्त, मिरना-107 के 11 संभावित पूर्वानुमानित लक्ष्यों की जांच से स्पष्ट रूप से पता चलता है कि केवल एसएनसीजी, ट्यूमर सेल विकास का एक सकारात्मक नियामक22,23, सीधे पैनक-1 कोशिकाओं में miRNA-107 के साथ सूचना का आदान-निर्देश (चित्र 6)। यह निष्कर्ष इंगित करता है कि miRNA-107 नकारात्मक SNCG अभिव्यक्ति नियमन द्वारा PANC-1 कोशिकाओं के प्रसार को विनियमित कर सकते हैं.

Figure 1
चित्र 1: miRNA लक्ष्य पहचान के लिए प्रायोगिक डिजाइन. यह आरेख एक प्रायोगिक अभिकल्पकेत के प्रवाह को दर्शाता है जो मिर्ना के लक्ष्य की पहचान करने में मदद करता है। (ए) परिपक्व miRNA अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण और ब्याज की एक miRNA के चयन. (ख) तीन प्रयोग, जैसे मिर्ना नकल ट्रांसफेक्शन, एसआरबी परख, और एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र का उत्पादन चयनित मिएनआरएनए के कार्यात्मक अध्ययन के लिए किया जा सकता है। (ग) उम्मीदवार को ब्याज की एक miRNA लक्ष्य जीन को कम करने के लिए, यह सूचना और लक्ष्य भविष्यवाणी कार्यक्रमों में अनुमानित लक्ष्य जीन के कार्य की जांच करने के लिए फायदेमंद है, Pubmed, और GeneCard. (D) ब्याज की एक miRNA के कुछ संभावित उम्मीदवार लक्ष्य जीन का पता लगाने के बाद, यह इस तरह के 3 ' MRNAs के UTR, luciferase परख, वास्तविक समय पीसीआर, और पश्चिमी धब्बा की क्लोनिंग के रूप में व्यावहारिक प्रयोगों का संचालन करने के लिए संभव है अंत में प्रत्यक्ष लक्ष्य साबित करने के लिए ब्याज की एक miRNA के जीन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: परिपक्व miRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण. (ए) प्रत्येक सेल लाइन (पैन-1, कैपन-1, और एचपीएनई) से कुल आरएनए जोड़ें, DNase I मिश्रण, और अल्ट्राप्यूरे पानी लेबल पट्टी-ट्यूब में। प्रत्येक ट्यूब में कुल मात्रा है 18 डिग्री एल (PANC-1 और कैपन-1 अग्नाशय के कैंसर सेल लाइनों रहे हैं, जबकि HPNE एक सामान्य अग्नाशय वाहिनी सेल लाइन है). (ख) स्थानांतरण 7.1 DNase के एल मैं नई पट्टी ट्यूब के 2 सेट में मिश्रण का इलाज किया, और एक GAPDH जीन के लिए antisense प्राइमर के 1.5 डिग्री एल भी प्रत्येक ट्यूब में जोड़ा जाता है. संकेत प्रतिक्रिया शर्तों पर पीसीआर पट्टी-ट्यूब इनक्यूबेट करें। इसके बाद, अपने नामित ट्यूबों में एक विशिष्ट miRNA (miRNA-107 या miRNA-301) के लिए आरटी एंजाइम मिश्रण और 5x आरटी प्राइमर जोड़ें, और फिर संकेत शर्तों पर ट्यूबों को फिर से इनक्यूबेट करें। एक विशिष्ट miRNA और GAPDH के लिए एकल-संक्षिप्त CDNAs उत्पन्न कर रहे हैं. (ग) परिपक्व मिरना-107 और मिर्ना-301 स्तरों का निर्धारण जांच-आधारित वास्तविक समय पीसीआर द्वारा पैनसी-1, कैपन-1 और एचपीएनई कोशिकाओं से अलग कुल आरएनए का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: Mimic transfection और SRB परख. (ए) शीर्ष पैनल मिरना नियंत्रण नकल और miRNA-107 नकल के कमजोर पड़ने से पता चलता है transfection मिश्रण तैयार करने के लिए. MIRNA-107 नकल के अंतिम सांद्रता की सीमा 0 एन एम, 1 एन एम, 5 एनएम, 10 एनएम, 25 एनएम, 50 एनएम, और 100 एनएम हैं। प्रत्येक कॉलम में कुल मात्रा एक 96 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से कोशिकाओं के transfection के लिए है. नीचे पैनल एक संकेत एकाग्रता पर 4 कुओं में कोशिकाओं के transfection के लिए मिश्रण की पर्याप्त मात्रा तैयार करने के लिए transfection मिश्रण स्केलिंग का एक उदाहरण से पता चलता है. इसके बाद, miRNA नियंत्रण miRNA-107 नकल के साथ नकल transfecting के लिए सुझाए गए प्रारूप का पालन करके प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रण के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. इस प्लेट SRB परख, जो सेल निर्धारण, सेल धुंधला, और अवशोषण माप भी शामिल है के लिए इस्तेमाल किया गया था. (बी) एसआरबी दाग कोशिकाओं को दिखाने वाली 96-वेल प्लेट की वास्तविक छवि। इस छवि से स्पष्ट रूप से पता चलता है कि PANC-1 कोशिकाओं की संख्या कम हो जाती है के रूप में miRNA-107 नकल की एकाग्रता बढ़ जाती है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र का उत्पादन. (क) मिरना-107 की प्रतिनिधि खुराक-प्रतिक्रिया वक्र ट्रांसफेक्टेड पैन्स-1 सेल की नकल करती है। ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को लगातार 96 ज के लिए इनक्यूबेट किया गया था। खुराक-प्रतिक्रिया वक्र से खरीदे गए पैरामीटर भी दिखाए जाते हैं। (बी) परिभाषाओं और मूल्यों के विवरण के साथ समीकरण, चर, प्रारंभिक पैरामीटर, और बाधाओं। (ग) सॉफ्टवेयर में संबंधित पैनलों में परिभाषाओं और मूल्यों को सम्मिलित करें। "f" % सेल व्यवहार्यता इंगित करता है (उदाहरण के लिए, "f" का मान है "90" और "10" IC10 और IC90पर क्रमशः). y0 मान 100 है और miRNA नियंत्रण की 100% सेल व्यवहार्यता इंगित करता है transfected कोशिकाओं की नकल. "n" हिल-प्रकार गुणांक (एक साजिश की ढलान) इंगित करता है। "k" miRNA-107 नकल की एकाग्रता इंगित करता है कि miRNA-107 नकल की एक 50% का उत्पादन अधिकतम प्रभाव (आईसी50). "R" अवशिष्ट अप्रभावित अंश (प्रतिरोध अंश) इंगित करता है। (घ) यह फलक समीकरण 1 से प्राप्त पैरामीटर (n, k, और R) के आधार पर समायोजित ICx मानों की गणना करने का तरीका दिखाता है. प्रतिशत (%) पैनल में सेल व्यवहार्यता समीकरण 1 में "f" का प्रतिनिधित्व करता है और y0 (100) से प्रत्येक ICx के x मान घटाकर परिकलित किया जाता है। समीकरण 2 स्प्रेडशीट के सूत्र पट्टी में "के रूप में इंगित किया गया है(((100-D3)/(D3-$B$5))](1/$B$3)*$B$4)" समायोजित IC10 मान की गणना के लिए। चयनित कक्ष (लाल रंग) पर बाएँ माउस बटन दबाकर और IC90 मान के कक्ष तक नीचे खींच कर अन्य ICx मानों की गणना करने के लिए समीकरण 2 को अन्य कक्षों में लागू करें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: ब्याज की एक miRNA के प्रत्यक्ष लक्ष्य जीन का सत्यापन. प्रयोग 3 ' UTR की क्लोनिंग के लिए प्राइमर डिजाइन करने के साथ शुरू करते हैं। प्राइमर का उपयोग ग्रेडिएंट पीसीआर के लिए किया जाता है। (ए) सबसे अच्छा अनीलन तापमान का चयन छह संकेतित अनीलन तापमानों में किया जा सकता है ताकि जीन के 3 ' UTR को बढ़ाया जा सके। अगले, डबल पाचन प्रतिबंध एंजाइमों के साथ किया जाता है और पीसीआर उत्पादों luciferase वेक्टर में ligated रहे हैं. (बी)लूसीफेरे वेक्टर्स जिनमें 2 रिपोर्टर जीन, जुगनू और रेनिला लूसीफेरे होते हैं, का उपयोग एमआरनए के 3 'यूटीआर के साथ एमआरनए की बातचीत को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। पीसीआर आवेषण एक क्षेत्र renilla रिपोर्टर जीन के बहाव में क्लोन कर रहे हैं. Ligated उत्पादों सक्षम कोशिकाओं में तब्दील हो गए थे और LB agar प्लेट पर कोशिकाओं में वृद्धि हुई. (ग) अलग-अलग कालोनियों (#6 के लिए #1) को उठाया गया और अल्ट्राप्यूरेट पानी के 50 डिग्री एल में फिर से निलंबित कर दिया गया। ई. कोलाई निलंबन कॉलोनी पीसीआर और टीका के लिए इस्तेमाल किया गया था. कालोनी पीसीआर एक जीन के 3 'UTR शरण luciferase वैक्टर के टीका और अलगाव के लिए सबसे अच्छा कालोनियों का चयन करने के लिए एक सुविधाजनक उपकरण है। (डी) ल्यूसिफेरेस परख के लिए, मिर्ना नियंत्रण नकल या miRNA-107 नकल एक 24 अच्छी प्लेट का उपयोग कर luciferase निर्माण के साथ PANC-1 कोशिकाओं में transfected किया गया था। (ई) यह पैनल एक miRNA-107 लक्ष्य के रूप में एक SNCG जीन के सत्यापन के लिए luciferase परख को क्रियान्वित करने के बाद प्रतिनिधि कच्चे डेटा और जुगनू के लिए रेनिला के अनुपात की गणना को दर्शाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: मिर्ना-107 के अनुमानित लक्ष्य जीनों की जांच। मिर्ना-107 और 3' अनुमानित लक्ष्यों के यूटीआर के बीच बातचीत की जांच पैनसी-1 कोशिकाओं में ल्यूसिफरेज निर्माणों का उपयोग करके की गई थी। सेल प्रसार पर miRNA-107 के नकारात्मक प्रभाव के आधार पर, संभावित उम्मीदवार जीन क्लोनिंग और स्क्रीनिंग परख के लिए निर्धारित किया गया. miRNA नियंत्रण नकल या miRNA-107 नकल PANC-1 कोशिकाओं में transfected था luciferase निर्माण के साथ 3 ' 24 एच के लिए प्रत्येक चयनित जीन के UTR युक्त. पुनिला से जुगनू के अनुपात की गणना की गई थी और पैनसी-1 कोशिकाओं में दोनों ल्यूसिफरेस के मापित स्तरों के आधार पर सामान्यीकृत किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

डिटेक्शन मिराना जीएपीडीएच
घटक
जांच आधारित वास्तविक समय पीसीआर (2x) के लिए मास्टर मिश्रण 10 जेडएल –
डाई आधारित वास्तविक समय पीसीआर (2x) के लिए मास्टर मिश्रण – 10 जेडएल
जांच मिश्रण (5x) 4 $L –
GAPDH प्राइमर्स (1 $M प्रत्येक) – 4 $L
कम cDNA (1:49) 6 $L 6 $L
कुल मात्रा 20 जेडएल 20 जेडएल

तालिका 1: इस अध्ययन में वास्तविक समय पीसीआर द्वारा एक विशिष्ट miRNA और GAPDH का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया शर्तों.

घटक 1x अभिक्रिया 7x प्रतिक्रिया
5x बफर 5 $L 35 डिग्री सेल्सियस
डीएनटीपी मिश्रण (2.5 एमएम प्रत्येक) 2 $L 14 जेडएल
प्राइमर्स (10 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक) 1 $L 7 $L
जीनोमिक डीएनए (2 एनजी/ 16.5 जेडएल 115.5 $L
पॉलिमरेज 0.5 $एल 3.5 $एल
कुल मात्रा 25 जेडएल 175 जेडएल

तालिका 2: इस अध्ययन में 3 ' UTR के प्रवर्धन के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण की संरचना.

घटक 1x अभिक्रिया
10x बफर 5 $L
पीसीआर उत्पाद या सदिश पीसीआर उत्पादों: 25 $L वेक्टर्स: 1-2 डिग्री
XhoI (या AsiSI) प्रतिबंध एंजाइम 2 $L
NotI प्रतिबंध एंजाइम 2 $L
अल्ट्राप्यूर पानी एक्स जेडएल
कुल मात्रा 50 डिग्री सेल्सियस

तालिका 3: पीसीआर उत्पादों और luciferase वैक्टर XhoI (या AsiSI) और NotI एंजाइमों का उपयोग कर इस अध्ययन में डबल पाचन के लिए शर्तें.

घटक 1x अभिक्रिया
10x बफर 2 $L
वेक्टर्स (डबल डाइजेस्ट) 50 एनजी
पीसीआर उत्पादों (सम्मिलित) एक्स जेडएल
लिगेस 200 यू
अल्ट्राप्यूर पानी वाई जेडएल
कुल मात्रा 20 जेडएल

तालिका 4: डबल पचापीसी उत्पादों के लिगेशन प्रतिक्रियाओं और ल्यूसिफेरेस सदिश इस अध्ययन में डीएनए लिगेज़ के साथ.

अनुपूरक चित्र 1: समीकरण 1 से समीकरण 2 का व्युत्पत्ति। समीकरण 2 समीकरण 1 से समायोजित ICx मानों की गणना के लिए व्युत्पन्न है। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 2: प्राइमर जानकारी. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ब्याज की एक miRNA के कार्यों के साथ सदाशयी miRNA लक्ष्यों के निर्धारण के लिए रणनीतियाँ miRNAs की कई भूमिकाओं की समझ के लिए अपरिहार्य हैं. miRNA लक्ष्य जीन की पहचान एक सेल में miRNAs द्वारा संग्राहक सेल संकेतन घटनाओं की व्याख्या के लिए एक दिशानिर्देश हो सकता है. MIRNAs के कार्यात्मक महत्वपूर्ण लक्ष्य जीन का अनावरण बुनियादी ज्ञान प्रदान करने के लिए कैंसर में एक miRNA आधारित चिकित्सा विकसित कर सकते हैं.

इस तरह के microarrays के रूप में कई तरीकों, छोटे आरएनए पुस्तकालय अनुक्रमण, गहरी अनुक्रमण, situ पीसीआर में रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस, और उत्तरी blotting सेल लाइनों और ऊतकों से अलग कुल आरएनए का उपयोग कर miRNA अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है24, 25,26. miRNAs के उच्च थ्रूपुट रूपरेखा कैंसर के विकास के आनुवंशिक underpinnings में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. जांच आधारित miRNA परख अक्सर रूपरेखा डेटा को मान्य करने के लिए प्रयोग किया जाता है और भी ब्याज की कुछ miRNAs स्क्रीन करने के लिए उपयुक्त है. हालांकि, जांच आधारित वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग कर परिपक्व miRNA स्तर की माप परिपक्व miRNAs प्रतिलेखन कदम पर या परिपक्वता के विनियमन के माध्यम से विनियमित कर रहे हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए सीमित है. डाई आधारित वास्तविक समय पीसीआर और उत्तरी blotting miRNA अग्रदूत स्तर को मापने के लिए शुरू किया गया है27,28. परिपक्व miRNA स्तर के साथ मिलकर miRNA अग्रदूतों के मापन आगे कैसे परिपक्व miRNA स्तर विनियमित कर रहे हैं पर जानकारी प्रदान कर सकते हैं. इसके अलावा, miRNA स्तर के विनियमन की एक व्यापक समझ miRNA आधारित चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास के लिए अपरिहार्य है.

सेल प्रसार इस तरह के टेट्राज़ोलियम आधारित एमटीटी परख के रूप में परख मिर्ना नकल के रूप में उपचार अभिकर्मकों के प्रभाव स्क्रीन करने के लिए लागू होते हैं। चूँकि एमटीटी परख कोशिकीय ऑक्सीडोरक्टोसेस द्वारा टेट्राज़ोलियम में कमी के आधार पर सेल उपापचयी गतिविधियों को दर्शाता है, इसलिए एमटीटी परख और कुल कोशिका संख्या19के बीच सहसंबंध की कमी का प्रेक्षण करना संभव है। वैकल्पिक रूप से, SRB परख सबसे reproduible सेल गणना परख18,19के रूप में उपलब्ध है. ट्राइक्लोरोऐसीटिक अम्ल स्थिर प्रोटीनों के लिए बाध्य एसआरबी डाई की मात्रा का मापन कुल कोशिका संख्या29का प्रतिनिधित्व कर सकता है . इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में SRB परख स्क्रीन करने के लिए लागू किया जा सकता है कई miRNA mimics के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विरोधी कैंसर दवाओं 384 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग कर. हालांकि, एसआरबी परख मैनुअल स्क्रीनिंग के रूप में ऐसी सीमाएं हैं. इसके अलावा, यह परख गैर-अनुकूल कोशिकाओं के लिए उपलब्ध नहीं है। चूंकि miRNAs भी इस तरह के लिंफोमा और myeloma30के रूप में hematologic द्रोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, सेल प्रसार के कुशल निगरानी miRNAs के कार्यों को जानने के लिए आवश्यक है. कार्बोक्सीफ्लूओरेसिन सक्सिनिमिडिल एस्टर (सीएफएसई) गैर-अनुकूल कोशिकाओं को इंट्रासेल्यूलर लेबल कर सकता है। सीएफएसई का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री31द्वारा प्रसारित कोशिकाओं के उत्पादन की निगरानी करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, miRNAs आक्रमण को प्रभावित कर सकते हैं, मेटास्टेसिस, और क्रमादेशित सेल मौत. इसलिए, अन्य प्रयोगात्मक तकनीक इस प्रोटोकॉल के साथ संयोजन miRNA कार्यों की उचित समझ के लिए और अधिक व्यावहारिक हो जाएगा, जो अंततः miRNAs के multitudinous जैविक रूप से प्रासंगिक लक्ष्यों की पहचान करने में योगदान.

अर्ध अधिक निरोधात्मक संकेंद्रण की गणना (आईसी50) न केवल मिर्ना अध्ययन के लिए बल्कि अन्य कैंसर रोधी दवाओं के प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए भी एक महत्वपूर्ण विधि है। आईसी50 मूल्यों सेल प्रसार पर कई miRNAs या विरोधी कैंसर दवाओं के संभावित प्रभाव की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह प्रदर्शन किया गया है कि विरोधी कैंसर दवाओं के साथ एक miRNA आधारित चिकित्सा के संयोजन विरोधी कैंसर दवा की प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए एक असाधारण अवसर प्रदान कर सकते हैं. इसके अलावा, कैंसर विरोधी दवाओं के साथ miRNAs के संयोजन chemoresistance32,33पर काबू पाने के लिए एक नया दृष्टिकोण हो सकता है. संयोजन दक्षता के मूल्यांकन के लिए, यह संयोजन सूचकांक (सीआई) जो synergism या विरोध33की मात्रात्मक अनुमान की अनुमति देता है के आकलन के लिए हमारे प्रोटोकॉल के आधार पर समायोजित ICx मूल्यों की गणना करने के लिए फायदेमंदहै, 34.

अंत:कोशिकीय संकेतन नेटवर्क कैंसर सहित कई रोगों में असंगत रूप से व्यक्त miRNAs द्वारा व्यापक रूप से अव्यवस्थित किया जा सकता है। हालांकि, miRNAs द्वारा जटिल रूप से प्रभावित सिग्नलिंग नेटवर्क अभी भी ज्यादातर अज्ञात हैं क्योंकि लक्ष्य जीनों के छोटे अनुपात को प्रयोगात्मक रूप से मान्य किया गया है, और लक्ष्य जीनों को भी मिर्ना35के साथ गैर-कैनोनिक प्रतिक्रिया के माध्यम से विनियमित किया जाता है। फिर भी, हमारी रणनीति और प्रोटोकॉल miRNAs के सेलुलर तंत्र को समझने के लिए विश्वसनीय तरीके हैं. इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल को लागू करने और miRNAs और अन्य विरोधी कैंसर दवाओं के संयोजन का मूल्यांकन करने के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस अध्ययन कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) शिक्षा मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित के माध्यम से बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (2017R1D1A3B03035662); और हालिम विश्वविद्यालय अनुसंधान कोष, 2017 (एचआरएफ-201703-003)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tube SPL Life Sciences 50015
24-well plate Thermo Scientific 142475
50 mL conical tube SPL Life Sciences 50050
6-well plate Falcon 353046
6x DNA loading dye Real Biotech Corporation RD006 1 mL
8-cap strip Applied Biosystems N8010535 For cDNA synthesis
8-tube strip Applied Biosystems N8010580 For cDNA synthesis
96-well plate Falcon 353072
Acetic acid Sigma A6283-1L 1 L
Agarose A Bio Basic D0012 500 g
Alkaline phosphatase New England Biolabs M0290S 10,000 U/mL
Ampicillin Bio basic Canada Inc AB0028 25 g
AriaMx 96 tube strips Agilent Technologies 401493 For real time PCR
AriaMx real-time PCR system Agilent Technologies G8830A qPCR amplification, detection, and data analysis
AsiSI New England Biolabs R0630 10,000 units/mL
CAPAN-1 cells ATCC HTB-79
Cell culture hood Labtech Model: LCB-1203B-A2
Counting chambers with V-slash Paul Marienfeld 650010 Cells counter
CutSmart buffer New England Biolabs B7204S 10X concentration
DMEM Gibco 11965-092 500 mL
DNA gel extraction kit Bionics DN30200 200 prep
DNA ladder NIPPON Genetics EUROPE MWD1 1 Kb ladder
DNase I Invitrogen 18068015 100 units
Dual-luciferase reporter assay system Promega E1910 100 assays
Fetal bovine serum Gibco 26140-079 500 mL
HIT competent cells Real Biotech Corporation(RBC) RH617 Competent cells
HPNE cells ATCC CRL-4023
LB agar broth Bio Basic SD7003 250 g
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 0.75 mL
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-075 0.75 mL
Luminometer Promega Model: E5311
Microcentrifuge tube Eppendorf 22431021
Microplate reader TECAN Infinite F50
miRNA control mimic Ambion 4464058 5 nmole
miRNA-107 mimic Ambion 4464066 5 nmole
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 50 prep
Mupid-2plus (electrophoresis system) TaKaRa Model: AD110
NotI New England Biolabs R3189 20,000 units/mL
Oligo explorer program GeneLink For primer design
Optical tube strip caps (8x Strip) Agilent Technologies 401425 For real time PCR
Opti-MEM Gibco 31985-070 500 Ml
PANC-1 cells ATCC CRL-1469
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122 100 mL
Phosphate buffer saline Gibco 14040117 1000 mL
Plasmid DNA miniprep S& V kit Bionics DN10200 200 prep
PrimeSTAR GXL DNA polymerase TaKaRa R050A 250 units
Shaker TECAN Shaking platform
Shaking incubator Labtech Model: LSI-3016A
Sigmaplot 14 software Systat Software Inc For dose-response curve generation
Sulforhodamine B powder Sigma S1402-5G 5 g
SYBR green master mix Smobio TQ12001805401-3 Binding fluorescent dye for dsDNA
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A 25,000 U
TaqMan master mix Applied Biosystems 4324018 200 reactions, no AmpErase UNG
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan miR RT kit Applied Biosystems 4366597 1,000 reactions
Thermo CO2 incubator (BB15) ThermoFisher Scientific 37 °C and 5% CO2 incubation
Trichloroacetic acid Sigma 91228-100G 100 g
Trizma base Sigma T4661-100G 100 g
Ultrapure water Invitrogen 10977-015 500 mL
Veriti 96 well thermal cycler Applied Biosystems For amplification of DNA (or cDNA)
XhoI New England Biolabs R0146 20,000 units/mL

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ट्यूमर कोशिकाओं में MicroRNA स्तर, कार्यों, और एसोसिएटेड लक्ष्य जीन का मूल्यांकन करने के लिए एक इन विट्रो प्रोटोकॉल
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Seo, H. A., Hwang, C. Y., Moeng, S., Park, J. K. An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells. J. Vis. Exp. (147), e59628, doi:10.3791/59628 (2019).

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