Summary
Denne protokol bruger en Probe-baseret real-time polymerase kædereaktion (PCR), en sulforhodamin B (SRB) assay, 3 ' ikke oversat regioner (3 ' UTR) kloning, og en der analyse for at verificere målgener af en Mirna af interesse og til at forstå funktionerne i Mirnas.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er små regulerende RNAs, som er anerkendt for at modulere talrige intracellulære signalering veje i flere sygdomme, herunder kræft. Disse små regulerende RNAs interagerer primært med de 3 ' ikke-oversatte regioner (3 ' UTR) af deres Target Messenger RNAs (mRNAs) i sidste ende resulterer i hæmning af dekodning processer af mRNAs og augmentation af Target mRNA nedbrydelser. Baseret på udtryks niveauer og intracellulære funktioner, miRNAs er i stand til at fungere som regulerende faktorer af onkogen og tumor-suppressiv mRNAs. Identifikation af bona fide Target gener af en miRNA blandt hundredvis eller endda tusinder af beregningsmæssigt forudsagte mål er et afgørende skridt til at skelne mellem roller og grundlæggende molekylære mekanismer af en miRNA af interesse. Forskellige miRNA Target forudsigelse programmer er tilgængelige for at søge mulige miRNA-mRNA interaktioner. Men det mest udfordrende spørgsmål er, hvordan man validerer direkte Target gener af en miRNA af interesse. Denne protokol beskriver en reproducerbar strategi med nøgle metoder til, hvordan man identificerer miRNA-mål i forbindelse med en miRNA-funktion. Denne protokol indeholder en praktisk vejledning om trinvise procedurer til at afdække Mirna-niveauer, funktioner og relaterede mRNAs-mål ved hjælp af den Probe baserede realtids polymerasekædereaktion (PCR), sulforhodamin B (SRB) assay efter en Mirna efterligne transfektering , dosis-respons kurve generation, og der assay sammen med kloning af 3 ' UTR af et gen, som er nødvendig for korrekt forståelse af de enkelte Mirnas roller.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) er de små regulerende RNAs, der primært moduter processen med oversættelse og nedbrydning af Messenger RNAs (mRNAs) ved at reagere på de 3 ' ikke-oversatte regioner (3 ' UTR) i bona fide Target gener1. Udtryk for miRNAs kan reguleres af transkriptionelle og post-transkriptionelle mekanismer. Ubalance i sådanne reguleringsmekanismer medfører ukontrollerede og karakteristiske miRNAs-udtryks niveauer i talrige sygdomme, herunder kræft2. En enkelt miRNA kan have flere interaktioner med forskellige mRNAs. Tilsvarende kan en individuel mRNA styres af forskellige miRNAs. Derfor er intracellulære signalerings netværk indviklet påvirket af karakteristisk udtrykte Mirnas, hvormed fysiologiske lidelser og sygdomme kan initieres og forværres2,3,4, 5 , 6. selv om det ændrede udtryk for Mirnas er blevet observeret i forskellige typer af kræft, de molekylære mekanismer, der modunere manerer af kræftceller i forbindelse med Mirnas er stadig stort set ukendte.
Akkumulerende beviser har vist, at de onkogene eller tumor-suppressiv roller miRNAs afhænger af de typer af kræft. For eksempel, ved at målrette forkhead box O3 (FOXO3), miR-155 fremmer celle proliferation, metastase, og chemoresistance af kolorektal cancer7,8. I modsætning hertil er begrænsningen af gliom celle invasion induceret af miR-107 via reguleringen af neurogen locus notch ligner protein 2 (NOTCH2) udtryk9. Vurderingen af miRNA-Target-interaktioner i forbindelse med miRNA-funktioner er en uundværlig del for bedre at forstå, hvordan miRNAs regulerer forskellige biologiske processer i både raske og syge stater10. Desuden kan opdagelsen af bona fide mål (r) af miRNAs yderligere give en finjusteret strategi for en miRNA-baseret terapi med forskellige anti-cancer narkotika. Den største udfordring i miRNAs-området er imidlertid at identificere de direkte mål for miRNAs. Her præsenteres detaljerede metoder som reproducerbare eksperimentelle tilgange til miRNA Target gen bestemmelse. Vellykket eksperimentel design for miRNA Target identifikation involverer forskellige trin og overvejelser (figur 1). Sammenligning af modne miRNA niveauer i tumorceller og normale celler kan være en af de fælles procedurer for at vælge en miRNA af interesse (figur 1a). Den funktionelle undersøgelse af en udvalgt miRNA til at påvise virkningerne af en miRNA på celle spredning er vigtigt at indsnævre listen over de bedste potentielle kandidat mål for en miRNA af interesse (figur 1b). Baseret på miRNAs eksperimentelt validerede funktioner kræves der en systematisk gennemgang af litteratur og database i selskab med et miRNA Target-forudsigelses program for at søge de mest relevante oplysninger om genfunktioner (figur 1c). Identifikationen af reelle mål gener af en Mirna af interesse kan opnås ved at gennemføre eksperimenter såsom der assay sammen med kloning af 3 ' UTR af et gen, real-time PCR, og Western blotting (figur 1d). Formålet med den nuværende protokol er at tilvejebringe omfattende metoder til nøgle eksperimenter, den sonde baserede realtids polymerasekæde reaktion (PCR), sulforhodamin B (SRB) assay efter en Mirna efterligne transfection, dosis-respons kurve generering og der assay sammen med kloning af 3 ' UTR af et gen. Den nuværende protokol kan være nyttig for en bedre forståelse af de enkelte miRNAs funktioner og konsekvenserne af en miRNA i kræftbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. moden MicroRNA (miRNA) ekspressions analyse
-
Ældre miRNA komplementær DNA (cDNA) syntese
- Tilsæt 254 ng af total RNA og 4,5 μl deoxyribonuclease i (DNase i) blandinger, og tilsæt derefter ultrarent vand til PCR Strip-rør for at gøre op til 18 μl (figur 2a). Forbered reaktionen for hver total RNA prøve renset fra flere cellelinjer ved hjælp af nok mængde DNase I blandinger baseret på det samlede antal reaktioner.
Bemærk: DNase I-blandinger består af DNase I (1,8 μL), ribonucleasehæmmer (0,3 μL) og 25 mM MgCl2 (2,4 μl). Til reproducerbart at skaffe total RNA, en kolonne-baseret ekstraktionsmetode blev appliceret i stedet for at bruge en phenol-chloroform baseret udvinding metode. Det blev rapporteret, at ekstraktions udbyttet for nogle Mirnas kan varieres afhængigt af antallet af celler ved brug af en phenol-chloroform baseret ekstraktionsmetode11,12. - Inkubér rørene i en termisk cycler. Kør rørene i 10 min ved 37 °C, og Opvarm DNase I med 5 min inkubation ved 90 °C. Anbring straks rørene på isen efter inkubationen.
- Overfør 7,1 μL DNase I-behandlet total-RNA til 2 sæt nye rør, og tilsæt derefter 1,5 μL antisense-primere til glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase-genet (GAPDH) (figur 2b).
Bemærk: Mængden af total RNA for cDNA syntese bliver 100 ng på dette trin. Lager koncentrationen af gapdh antisense primere er 10 μM. tilføjelse af gapdh antisense primere er til generering af gapdh cdnas ved hjælp af en gen-specifik primer-metode. - Inkubér rørene ved hjælp af en termisk cycler. Start ved 80 °C i 5 min efterfulgt af reaktionen ved 60 °C i 5 min. Anbring straks rørene på isen efter inkubationen.
- Tilsæt 3,4 μL reverse transkription (RT) enzym blandinger i hver reaktion (figur 2b). RT-enzym blandinger består af 100 mM deoxyribonucleotidtriphosphater (0,15 μL), 10x RT-buffer (1,5 μL), ribonucleasehæmmer (0,75 μL) og omvendt transkriptionsenzym (1 μL). Forbered tilstrækkelig mængde af blandinger baseret på det samlede antal reaktioner.
- Der tilsættes 3 μL 5x RT primere til en specifik miRNA i hver reaktion (figur 2b).
Bemærk: Total volumen er 15 μL for hver reaktion. - Kør rørene ved hjælp af en termisk cycler. Start ved 16 °C i 30 min efterfulgt af reaktionen ved 42 °C i 30 min, og endelig ved 85 °C i 5 min. hold ved 4 °C i resterende tid (figur 2b). Enkeltstrenget cDNAs genereres i dette trin for både et specifikt miRNA-og GAPDH-gen i samme rør.
- Tilsæt 254 ng af total RNA og 4,5 μl deoxyribonuclease i (DNase i) blandinger, og tilsæt derefter ultrarent vand til PCR Strip-rør for at gøre op til 18 μl (figur 2a). Forbered reaktionen for hver total RNA prøve renset fra flere cellelinjer ved hjælp af nok mængde DNase I blandinger baseret på det samlede antal reaktioner.
-
Real-time polymerase kædereaktion (PCR) og dataanalyse
- Fortyndet hver cDNA med ultrarent vand ved 1:49 ratio.
- Reaktions blandingerne forberedes til en specifik miRNA og GAPDH (tabel 1). Til påvisning af en specifik Mirna og gapdh, oprette tre eksemplarer reaktioner for hver cDNA-prøve.
- Udfør realtids-PCR og dataanalyse (figur 2c). Analysér data ved hjælp af den komparative CT -metode13,14.
2. MicroRNA (miRNA) MimicTransfection
Bemærk: miRNA-107 vælges fra trin 1. Da miRNA-107 er nedreguleret i tumorceller sammenlignet med normale celler, kan det være spekuleret, at miRNA-107 er en tumor suppressiv miRNA. I tilfælde af en Mirna, der er op-reguleret i tumorceller sammenlignet med normale celler (f.eks, Mirna-301), antisense oligonukleotider mod Mirna-301 kan anvendes til trin 2, 3 og 4.
- Tæl cellerne med en tælle kammer enhed og plade cellerne i en 96-brønd plade. Celletæthed er 2 x 103 celler/100 μl for hver brønd. Brug ikke cellekultur medier, der indeholder penicillin-streptomycin (p/s), da p/s kan reducere transfektering effektivitet.
-
Forbered et sæt transfektering blandinger til transficere cellerne ved flere endelige koncentrationer af Mirna Control efterligne og Mirna-107 efterligne den næste dag (figur 3).
- Fra bestanden (25 μM koncentration) af Mirna Control efterligne eller Mirna-107 efterligne, fortynde og tilsæt tilsvarende mængdekontrol efterligne eller Mirna-107 efterligner i de reducerede serum medier sammen med et transfektering reagens ved hjælp af mikrocentrifuge glas (figur 3a). Bland forsigtigt oligo indeholdende blandinger ved hjælp af en mikropipette. Den totale mængde oligonukleotider (Mirna efterligne Control + Mirna-107 efterligne) bør være den samme i hver brønd. Blanke brønde omfatter 100 μl cellekultur medier og reducerede serum medier, der indeholder et transfektering reagens uden celler.
- Efter en 10 min inkubation i en cellekultur hætte, bland forsigtigt oligo indeholdende blandinger igen og tilsæt derefter 50 μL af blandingerne i hver brønd. Opbevar de transficeret celler i en cellekultur inkubator. Udskift det transfektering-reagens, der indeholder mediet, med det friske cellekultur medie, der indeholder både føtal bovint serum (FBS) og P/S efter 6-12 h inkubation. Yderligere inkubere cellerne for 72 h. Den totale behandlingsvarighed af Mirna efterligne er 96 h.
3. sulforhodamin B (SRB)-analyse
-
Celle fiksering
- Fjern cellekultur mediet i hver brønd af pladen og fyld straks 100 μL af 10% trichloreddikesyre (TCA) i hver brønd. Aspirer forsigtigt cellekultur mediet fra hver brønd for at undgå celleskader og løsrivelse fra bunden.
Bemærk: Forbered 40% TCA ved at tilsætte 20 g TCA-pulver til 50 mL destilleret vand. Fra 40% TCA, lav 10% TCA ved fortynding 40% TCA med destilleret vand i et 1:3 fortyndingsforhold. - Opbevar pladen med 10% TCA i køleskab (4 °C) i 1 time.
- Pladen vaskes flere gange ved nedsænkning i vand karret og tørres. Fjern overskydende vand fra indersiden af brønde ved at tappe pladen, indtil der ikke er vand tilbage i brønde. Lad pladen stå på en laboratorie bænk for at tørre den, før du går videre til næste trin.
- Fjern cellekultur mediet i hver brønd af pladen og fyld straks 100 μL af 10% trichloreddikesyre (TCA) i hver brønd. Aspirer forsigtigt cellekultur mediet fra hver brønd for at undgå celleskader og løsrivelse fra bunden.
-
Celle farvning
- Pipette 50 μL 0,4% SRB-opløsning til hver brønd, herunder blanke brønde. Ryst forsigtigt pladen, indtil 0,4% SRB opløsning konsekvent dækker bunden af brønde.
Bemærk: Forbered og brug 0,4% SRB-opløsning ved at tilsætte 0,4 g SRB-pulver i 100 mL 1% eddikesyre. Ryst opløsningen forsigtigt for at blande den. Pak flasken med 0,4% SRB opløsning i et let beskyttende materiale såsom aluminiumsfolie. Opbevar 0,4% SRB-opløsning i køleskab. - Efter inkubation i 40 min til 60 min, vaskes pladen ved at skylle den med 1% eddikesyre. Pladen vaskes, indtil det ubundne farvestof er helt vasket væk (figur 3b).
- Lad pladen stå på en laboratorie bænk for at tørre den, før du går videre til næste trin.
Bemærk: Pladen skal tørres helt, inden du går til trin 3,3.
- Pipette 50 μL 0,4% SRB-opløsning til hver brønd, herunder blanke brønde. Ryst forsigtigt pladen, indtil 0,4% SRB opløsning konsekvent dækker bunden af brønde.
-
Absorbans måling
- Afpipettér 100 μL Tris-basis opløsning (10 mM) i de tilsvarende brønde, herunder blanke brønde. Hold pladen på en shaker i 10 min. mål absorbansen ved 492 nm.
4. generering af en dosis-respons kurve
- Analysér SRB-analysedata i et regneark. Træk den blanke absorbans fra hver gruppes absorbansværdier, og Beregn den gennemsnitlige (AVE) og standardafvigelsen (STD) af absorbansværdierne for hver gruppe.
- Beregn procentdelen af den gennemsnitlige absorbans (AVE%) og standardafvigelsen (STD%) af hver gruppe ved hjælp af absorbans-værdierne i SRB-analysen.
Bemærk: Ave% af Mirna Control efterligne behandlede gruppe er 100%. Beregn STD% ved hjælp af følgende formel: STD% = (Std for hver gruppe/Ave-absorbans af kontrol efterligne-behandlet gruppe) x 100. - Importer de rå data, herunder behandlings koncentrationer, AVE% og STD% i softwaren ved at justere disse data lodret. Da log 0 ikke er defineret, skal du indstille den første koncentration af X-aksen til en værdi, der er tæt på 0 (f. eks.0,01).
- Klik på Opret graf fane og vælg simple scatter-fejl søjler. Vælg regnearks kolonner som symbol værdier, og klik på næste. Vælg XY-par i panelet data format, og klik på næste. Vælg tilsvarende datakolonner i panelet Vælg data. Klik på finish knappen for at oprette plottet.
Bemærk: X-aksen repræsenterer koncentrationerne, Y-aksen Angiver procentdelen af den gennemsnitlige absorbans for hver koncentration (AVE%), og fejl søjlerne påpeger procentdelen af standardafvigelsen for hver koncentration (STD%). - Dobbeltklik på X-aksen for at ændre skala typen og skaleringen af aksen. Skift skala typen fra lineær til logfil. Rediger henholdsvis start-og områdenummer til 0,01 og 200.
-
Højreklik på et scatter plot, Vælg kurve pasform, og gå til under kategorien brugerdefineret. Vælg dosis-respons kurve, klik på næste knapper, og klik derefter på finish knappen. Dosis-respons kurven genereres nu sammen med en rapport fane (figur 4a).
- Hvis du vil indtaste ligning 1 i softwaren til generering af en dosis-respons kurve, skal du klikke på fanen analyse og vælge regressions guide. Gå til Brugerdefineret i Lignings kategorien, og klik derefter på knappen ny . Indsæt ligning 1, variabler, Initial parametre og begrænsninger i de tilsvarende tomme felter (figur 4b, C). Klik på knappen Tilføj som , og Angiv navnet på ligningen som dosis-respons kurve. Lignings navnet genereres nu i den under kategori brugerdefinerede i Lignings kategorien. f Angiver procentdelen af cellernes levedygtighed (% cellelevedygtighed) i ligning 1.
Ligning 1
- Gå til fanen rapport, og kontroller derefter værdierne n, k og R.
Bemærk: y0 indikerer 100% cellelevedygtighed for Mirna Control efterligne-behandlet gruppe, n indikerer bakke type koefficienten (hældningen af et plot), k angiver koncentrationen af Mirna-107 efterligne, der producerer en 50% af Mirna-107 efterligne maksimale effekt (den halve maksimal hæmmende koncentration, IC50), og R indikerer den resterende upåvirkede fraktion (modstands fraktionen)15. Ligningen, der bruges til at generere en dosis-respons kurve, genkender intervallet fra y0 til R-værdi (hvis nogen) som 100% (figur 4a). Derfor er det nødvendigt at erhverve den justerede k (IC50) værdi, der beregnes baseret på intervallet fra y0 til en værdi på nul (figur 4a). Justeret k (IC50) sammen med andre icx-værdier (f.eks ic10 gennem IC90) kan opnås ved hjælp af ligning 2, som er afledt af ligning 1. Beregning af ligning 2 fra ligning 1 er angivet i supplerende figur 1.
Ligning 2
- Dobbeltklik på den venstre museknap på den celle, hvor ligning 2 anvendes. Ved hjælp af ligning 2 og parametre fra den genererede dosis-respons kurve er den tilgængelig til beregning af de justerede værdier for ICx, der spænder fra IC10 til IC90 (figur 4d).
- Indtast lighedstegnet efterfulgt af formlen, der begynder med en parentes i cellen. Når du indtaster formlen, skal du rette værdien af n, k og R som de absolutte cellereferencer ved at tilføje dollartegnet til den tilsvarende kolonne og række, så disse faste værdier ikke ændres, når du automatisk fylder formlen ned til rækkerne (figur 4d). Alternativt kan justerede værdier beregnes manuelt ved hjælp af ligning 2.
Bemærk: IC90 -værdien bestemmes ikke, fordi R-værdien er større end 10. Hvis R-værdien er over 20, bestemmes værdien af IC80 desuden ikke (figur 4d).
5. verifikation af det direkte Målgen for en MicroRNA af interesse
Bemærk: Efter at have udført det funktionelle eksperiment som SRB-analysen, er miRNA-107 bekræftet som en tumor suppressiv miRNA, og det er meget muligt, at miRNA-107 direkte er rettet mod oncogenes. Tjek listen over alle forventede målgener ved hjælp af et miRNA Target forudsigelse program såsom Target Scan (http://www.targetscan.org/vert_71/), og derefter indsnævre til potentielle kandidat mål baseret på funktionen af et gen i databaser, herunder PubMed og GeneCards.
- Primer design til kloning af 3 ' ikke oversat region (UTR)
- Sæt navnet på et gen i GeneCards (https://www.genecards.org/) og klik på symbolet for et gen. Vurder til ensembl genom browser ved at klikke på ensembl id for et gen, og klik derefter på transkriptioner id i transkriptionen tabel. Derefter Klik på exons eksisterede på den transskriptions baserede displays liste til venstre.
- Kopier nucleotidsekvenserne af 3 ' UTR og Indsæt den i primer designprogrammet. Kopier sekvenserne igen fra dette program, og Indsæt dem i et tekstbehandler. Kontroller tilstedeværelsen af miRNA bindende sekvenser samt tilstedeværelsen af restriktionsenzymer steder, der anvendes til kloning.
Bemærk: Hvis der ikke er nogen begrænsninger enzym anerkendelse sites inden for 3 ' UTR, de restriktionsenzymer udvalgt til kloning kan bruges til næste trin. - I primer-designprogrammet skal du acceptere de 3 ' UTR-sekvenser og begynde at designe de fremadgående og omvendte primere med følgende betingelse. Længde: 20-30 nukleotider, TM: 45-58 °C, GC%: 40-60%. Forskellen mellem de to priers TM-værdier skal være mindre end 5 °C. De primer-sekvenser, der anvendes i dette studie, findes i supplerende figur 2. Tilføj begrænsnings enzym genkendelses sekvenser samt 4 tilfældige nukleotider til de designede primere.
- Gradient PCR
- Der forberedes 25 μL PCR-reaktionsblandinger, herunder konstruerede primere pr. udglødnings temperatur (tabel 2). Forbered tilstrækkelig mængde af blandinger baseret på det samlede antal reaktioner. Opløsningen blandes ved pipettering og tilsættes 25 μL reaktionsblandinger i hvert rør. Centrifuger rørene i nogle få sekunder.
- Udfør 35-40 PCR cyklusser fra denaturering trin til udvidelse trin. Konfigurer PCR-cyklussen som følgende trin: 98 °C i 1 min (1 cyklus, aktiverings trin for polymerase), 95 °C for 10 s (Denaturerings trin), 45 °C-68 °C for 30 s (annealing Step), 68 °C (forlængelses trin, 10 s-1 min pr. 1000 bp), 68 °C i 3 min (termineringstid) , og afkøles til sidst til 4 °C.
- Kør PCR-produkterne, og kontroller båndene på en 1% agopstået gel med DNA-stiger. Find den bedste udglødnings temperatur (figur 5a). Amplify 3 ' UTR af et gen igen ved hjælp af den bedste udglødning temperatur for det næste trin.
- Dobbelt fordøjelse
- Reaktions blandingerne, herunder to restriktionsenzymer, XhoI (eller AsiSI) og NotI, i et rør (tabel 3). Blandingerne til 3-4 h inkubates ved hjælp af et vandbad (37 °C).
- Kør de dobbelte Ford øjede produkter på en 1% agopstået gel og skær derefter båndene under UV-lys. I tilfælde af der vektorer, før du kører på en gel, reagerer dobbelt fordøjet vektorer med 10 U alkalisk fosfataser for en anden 1 h at forhindre en recirkularisering under ligations trinnet.
- Rensning af de dobbelte Ford øjede PCR-produkter og luciferasevektorer fra de fjernede bands.
- Ligation af PCR-produkter ind i der vektorer
- Fremstille 20 μL ligationreaktions blandinger, herunder DNA-ligasen (tabel 4).
Bemærk: Den molære ratio af PCR produkt (INSERT) til der Vector kan være 3:1. 1:1 eller 2:1. - Centrifugér kortvarigt røret til 10-15 s og Inkuber ved 16 °C natten over ved hjælp af en termisk cycler.
Bemærk: Alternativt kan røret inkuberes ved 4 °C i 2-3 dage for ligationen. I dette trin vil PCR-indsatsen blive klonet ind i den region, der er placeret neden for et renilla reporter-gen (figur 5b). Binding af miRNAs i det klonede 3 ' UTR af et gen kan falde i renilla-aktiviteten. Firefly der er til normalisering af renilla ekspression niveauer.
- Fremstille 20 μL ligationreaktions blandinger, herunder DNA-ligasen (tabel 4).
- Transformation og koloni PCR
- Tilsæt ligations blandingerne (3-5 μL) ind i røret, der indeholder de kompetente celler. Tap forsigtigt røret og holde det på is (20 min).
Bemærk: frigør kompetente celler på is, før du tilføjer ligations blandingerne. - Hurtigt og forsigtigt overføre røret til en varmeblok. Efter et varmechok (42 °C i 30 s-1 min), Placer røret på is i 20 min.
- Spred de kompetente celler på Luria-Bertani (LB) agar pladen. Vokse kompetente celler i en inkubator (37 °C) natten over.
Bemærk: Ampicillin (50-100 μg/mL) er indeholdt i agarpladen. - Vælg en individuel koloni og resuspender E. coli i et af de 8-strimrør, der indeholder ultrarent vand. Gentag dette trin for at resuspendere E. coli fra tilfældigt udvalgte 4-8 kolonier (figur 5c).
- 25 μL E. coli -suspension overføres til et andet sæt 8-Strip-rør. Nu er der 2 sæt rør af E. coli suspension.
Bemærk: En tube er for koloni PCR og en anden er for inokulation. E. coli -suspension til inokulation kan opbevares midlertidigt ved 4 °C (figur 5c). - Udføre koloni PCR ved hjælp af E. coli suspension. Dette trin er at afgøre, om kolonierne indeholder en indsats. Vælg de bedste kolonier til at inokulere og isolere der vektorer husly 3 ' UTR af et gen (figur 5c).
Bemærk: Gentag trin 5.1-5.5 for hver 3 ' UTR af udvalgte gener. Følg betingelsen for PCR-reaktion vist i tabel 2 ved at erstatte GENOMISK DNA med E. coli suspension.
- Tilsæt ligations blandingerne (3-5 μL) ind i røret, der indeholder de kompetente celler. Tap forsigtigt røret og holde det på is (20 min).
- Luciferase-analyse
- Forbered en 24-brønd plade. Brug 1-2 x 104 celler i 500 μl cellekultur medier for hver brønd. Brug ikke cellekultur medier, der indeholder p/s til transfektering, fordi brug af p/s kan reducere transfektering effektivitet.
- Transfect 50 ng af luciferasevektorer i cellerne med kontrol-efterligne eller en specifik Mirna-efterligne ved hjælp af et transfektering-reagens (figur 5D). Hvis screeningen af virkningerne af en specifik Mirna efterligner ved mere end én koncentration, skal du beholde den totale mængde oligonukleotider ens i hver brønd (Se trin 2).
- Vask indersiden af brønde to gange ved hjælp af fosfat bufferet saltvand (PBS) den næste dag.
- Påfør 200 μL lysis-reagens i brøndene, og foretag en tilstrækkelig cellelyse, inden du måler luciferaseaktiviteten.
Bemærk: Opbevar pladen på en ryste plade mindst 15 min. - Overfør 5-10 μL celle lysat til det nye rør, og tilsæt 100 μL reagens I. Bland straks opløsningen ved pipettering og Læs Firefly luciferaseaktiviteten ved hjælp af et luminometer.
Bemærk: Læs Firefly der aktivitet for 10-15 s. - Tilsæt 100 μL reagens II i samme slange, og bland derefter ved pipettering to gange. Læs renilla luciferaseaktiviteten for 10-15 s ved hjælp af et luminometer. Gentag trin 5.6.5 og 5.6.6 for hver prøve.
- Beregn forholdet mellem renilla og Firefly (figur 5e).
Bemærk: Aktiviteten af Firefly repræsenterer transfektering effektivitet af der konstruktioner i cellerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket og præcis bekræftelse af miRNA niveauer er vigtigt for fortolkningen af data, som klassificeringen af miRNAs er muligt baseret på de forventede roller miRNAs i udviklingen og progression af en sygdom. Niveauerne af miRNA-107 og miRNA-301 blev målt i tre bugspytkirtel cellelinjer ved hjælp af Probe-baserede kvantitative PCR. Syntesen af cDNAs af både en specifik miRNA og et reference gen i samme reaktion kan øge reproducerbarhed af data. Panc-1 og capan-1 er humane pancreas duktalt adenokarcinom cellelinjer, mens hpne er en udødeliggjort bugspytkirtel kanal cellelinje transduceret med en antiretroviral Expression vektor husly den menneskelige telomerase reverse transkriptase (hTERT) gen. miRNA-107 blev signifikant reduceret i PANC-1-og CAPAN-1-celler sammenlignet med HPNE-celler (figur 2c). Niveauerne af miRNA-301 blev væsentligt reguleret i PANC-1-og CAPAN-1-celler sammenlignet med HPNE-celler. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at Mirna-107 er epigenetisk inaktiveret i kræftceller i bugspytkirtlen, og at Mirna-301 niveauer er højere i pancreas duktalt adenokarcinom celler end normale bugspytkirtel duktalt celler16, 17.
Den 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) assay afspejler celle metaboliske aktiviteter. Denne funktion har en betydeligt højere mulighed for at erhverve den manglende korrelation mellem MTT-analysen og det samlede celleantal, da Analysebetingelserne, herunder en slags behandlings reagenser, kan alvorligt påvirke den enzymatiske reduktion af tetrazolium 18,19. For at overvinde denne begrænsning blev sulforhodamin B (SRB) assay anvendt til at måle virkningerne af miRNA-107 på celle spredning for at identificere de potentielle biologiske funktioner i miRNA-107. Mængden af bundet SRB farvestof i de faste celler kan bruges som en surrogat af ændringen i det samlede antal celler. SRB-analysen i denne undersøgelse viser tydeligt, at spredningen af Panc-1-celler faldt efter en Mirna-107-efterligne-Trans fection (figur 3). Den koncentration af miRNA-107, der forårsagede en hæmning af 50% cellelevedygtighed (IC50), blev bestemt ved generering af en dosis-respons kurve. Desuden er anvendelse af ligning 2 gavnlig til at beregne alle mulige hæmmende koncentrationer (ICx) til præcist at evaluere virkningerne af miRNA-107 (figur 4).
Undersøgelse af sammenhængen mellem Mirnas-og mRNAs-niveauerne er en effektiv metode til at identificere Mirna-målet, da Mirnas kan regulere målniveauerne for genet via nedbrydningen af mRNAs2,20. Men da miRNAs også handler på translationelt niveau uden at påvirke processerne med mRNA-nedbrydning, er den eksperimentelle validering af miRNA-Target-geninteraktioner ved hjælp af luciferaseanalysen et vigtigt skridt. Den største fordel ved en der analyse er, at denne analyse kan udelukke ændringer af mRNA niveauer reguleret af nedbrydningen af mRNAs21. Derfor er kloning af 3 ' UTR af forudsagte målgener et vigtigt skridt til at identificere reelle mål gener af en miRNA af interesse i forbindelse med real-time PCR og Western blot eksperimenter. En effektiv udnyttelse af Dual reporter vektorer gør det muligt at erhverve entydige eksperimentelle data, da målingen af kontrol reporter niveauer kan reducere de eksperimentelle variationer såsom antallet af celler. Normaliserings processer af luciferaseanalysen data erhvervet fra vektorer, der indeholder 3 ' UTR af et synuclein gamma (SNCG)-gen, er vist i figur 5E. Desuden viser screeningen af 11 potentielle forudsete mål for Mirna-107 klart, at kun sncg, en positiv regulator af tumorcellevækst22,23, interagerer direkte med Mirna-107 i Panc-1-celler (figur 6). Dette fund indikerer, at miRNA-107 kan regulere spredningen af PANC-1-celler negativt ved at moduere SNCG-ekspressionen.
Figur 1: eksperimentel design for Mirna Target identifikation. Dette diagram viser strømmen af et eksperimentelt design, som hjælper med at identificere målet for en miRNA. (A) analysen af modne Mirna udtryk niveauer og udvælgelsen af en Mirna af interesse. B) der kan udføres tre eksperimenter, såsom Mirna efterligne transfection, SRB assay, og generering af en dosis-respons kurve for den funktionelle undersøgelse af udvalgte Mirnas. (C) at indsnævre kandidat målgener af en Mirna af interesse, er det gavnligt at kontrollere oplysninger og funktion af forventede målgener i Target forudsigelse programmer, PubMed, og genecard. (D) efter at have detekteret nogle potentielle kandidat målgener af en Mirna af interesse, er det muligt at gennemføre praktiske eksperimenter såsom kloning af 3 ' UTR af mRNAs, der assay, real-time PCR, og Western blot til endelig at bevise det direkte mål gener af en miRNA af interesse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: moden Mirna udtryk analyse. A) Tilsæt total RNA fra hver cellelinje (Panc-1, capan-1 og HPNE), DNase i-blandinger og ultrarent vand til mærkede Strip-rør. Samlet volumen i hvert rør er 18 μL (PANC-1 og CAPAN-1 er kræft i bugspytkirtlen cellelinjer, mens HPNE er en normal bugspytkirtel kanal cellelinje). B) overfører 7,1 μl DNase i-behandlede blandinger til 2 sæt nye Strip Tubes, og 1,5 μl antisense-primere til et gapdh-gen tilsættes også i hvert rør. Incubate PCR Strip-rør ved indikerede reaktionsbetingelser. Dernæst tilsættes RT enzym blandinger og 5x RT primere for en bestemt miRNA (miRNA-107 eller miRNA-301) i sine udpegede rør, og derefter re-inkuberes rørene ved de angivne betingelser. Enkeltstrenget cDNAs til en specifik miRNA og GAPDH genereres. (C) modne miRNA-107 og mirna-301 niveauer blev bestemt af Probe-baseret real-time PCR ved hjælp af total RNA isoleret fra Panc-1, capan-1, og HPNE celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mimic transfektering og SRB-analysen. (A) toppanelet viser fortyndingen af Mirna Control efterligne og Mirna-107 efterligne for at tilberede transfektering blandinger. Rækken af endelige koncentrationer af Mirna-107 efterligne er 0 nm, 1 nm, 5 nm, 10 nm, 25 Nm, 50 nm og 100 nm. Samlet volumen i hver kolonne er for transfektering af celler i en brønd af en 96-brønd plade. Nederste panel viser et eksempel på opskalering af transfektering blandinger til at forberede nok mængde af blandinger til transfektering af cellerne i 4 brønde ved en angivet koncentration. Derefter tilsættes 50 μl af blandinger i hver brønd ved at følge det foreslåede format for transfficerende Mirna Control efterligne med Mirna-107 efterligne. Denne plade blev anvendt til SRB-analysen, som omfatter celle fiksering, celle farvning og absorbans måling. (B) faktisk billede af 96-brønd pladen, der viser SRB farvede celler. Dette billede viser tydeligt, at antallet af PANC-1 celler falder som koncentrationen af miRNA-107 efterligner stigninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: generering af en dosis-respons kurve. (A) repræsentativ dosis-respons kurve for Mirna-107 efterligne transficeret Panc-1-celler. Transfected celler blev inkuberet kontinuerligt i 96 h. parametre udtaget fra dosis-respons kurven vises også. B) ligningen, variablerne, de oprindelige parametre og begrænsningerne samt beskrivelserne af definitioner og værdier. (C) indsætte definitionerne og værdierne i de tilsvarende paneler i softwaren. "F" angiver% cellens levedygtighed (f. eks. er værdien af henholdsvis "fx" 90 "og" 10 "i IC10 og IC90). Værdien y0 er 100 og indikerer, at den 100% cellelevedygtighed for Mirna Control efterligner de transficeret celler. "N" angiver den bakke type koefficient (hældningen af et plot). "K" angiver koncentrationen af Mirna-107 efterligne, der producerer en 50% af Mirna-107 efterligne maksimale effekt (IC50). "R" indikerer den resterende upåvirkede fraktion (modstands fraktionen). (D) dette panel viser, hvordan justerede icx-værdier beregnes ud fra de parametre (n, k og R), som er erhvervet fra ligning 1. Procentdelen (%) cellens levedygtighed i panelet repræsenterer "f" i ligning 1 og beregnes ved at fratrække x-værdien for hvert ICx fra y0 (100). Ligning 2 på formellinjen i regnearket er angivet som "= ((100-D3)/(D3-$B $5)) ^ (1/$B $3) * $B $4)" til beregning af justeret IC10 -værdi. Anvend ligning 2 på andre celler til beregning af andre ICx-værdier ved at trykke på venstre museknap på den valgte celle (rød farve) og trække ned til cellen for IC90 -værdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: verifikation af det direkte målgen for en Mirna af interesse. Eksperimenter begynder med at designe primere til kloning af 3 ' UTR. Primere anvendes til gradient PCR. (A) den bedste udglødnings temperatur kan vælges blandt de seks angivne udglødnings temperaturer for at forstærke 3 ' UTR af et gen. Dernæst udføres dobbelt fordøjelse med restriktionsenzymer, og PCR-produkter er ligeret i luciferasevektorer. (B) luciferase vektorer, der indeholder 2 reporter gener, Firefly og renilla luciferase, kan bruges til at screene interaktioner af Mirnas med 3 ' UTR af mRNAs. PCR-skær er klonet ind i et område, der er placeret neden for renilla reporter-genet. Ligerede produkter blev omdannet til kompetente celler og voksede celler på LB-agar pladen. C) individuelle kolonier (#1 til #6) blev afhentet og ophængt i 50 μl ultrarent vand. E. coli -suspensionen blev anvendt til koloni PCR og inokulering. Colony PCR er et bekvemt værktøj til at vælge de bedste kolonier for inokulering og isolering af der vektorer husly 3 ' UTR af et gen. (D) for luciferaseanalysen blev Mirna Control efterligne eller Mirna-107 efterligne transficeret i Panc-1-celler med der-konstruktioner ved hjælp af en 24-brønd plade. E) dette panel viser de repræsentative rådata og beregningen af forholdet mellem renilla og Firefly efter udførelse af der-analysen til validering af et sncg-gen som et Mirna-107-mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Screening af estimerede målgener for Mirna-107. Screening af interaktioner mellem Mirna-107 og 3 ' UTR af forudsete mål blev udført i Panc-1-celler ved hjælp af der-konstrukterne. På baggrund af de negative virkninger af miRNA-107 på celle spredning blev potentielle kandidat gener bestemt for kloning og screening assays. Mirna Control efterligne eller Mirna-107 efterligne blev overføres til Panc-1-celler med der-konstruktioner indeholdende 3 ' UTR af hvert udvalgt gen i 24 timer. Forholdet mellem renilla og Firefly blev beregnet og normaliseret baseret på de målte niveauer af begge luciferaser i PANC-1-celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Påvisning | Mirna | GAPDH |
| Komponenter | ||
| Master Mix til Probe baseret real-time PCR (2x) | 10 μL | – |
| Master Mix til farve baseret real-time PCR (2x) | – | 10 μL |
| Sonde blanding (5x) | 4 μL | – |
| Gapdh primere (1 μM hver) | – | 4 μL |
| Fortyndet cDNA (1:49) | 6 μL | 6 μL |
| Samlet mængde | 20 μL | 20 μL |
Tabel 1: betingelser, der anvendes til en specifik registrering af miRNA og GAPDH ved real-time PCR i dette studie.
| Komponenter | 1x reaktion | 7x reaktion |
| 5x buffer | 5 μL | 35 μL |
| dNTP-blanding (2,5 mM hver) | 2 μL | 14 μL |
| Primere (10 μM hver) | 1 μL | 7 μL |
| Genomisk DNA (2 ng/μL) | 16,5 μL | 115,5 μL |
| Polymerase | 0,5 μL | 3,5 μL |
| Samlet mængde | 25 μL | 175 μL |
Tabel 2: sammensætning af PCR-reaktionsblandinger til forstærkning af 3 ' UTR i dette studie.
| Komponenter | 1x reaktion |
| 10x buffer | 5 μL |
| PCR-produkter eller-vektorer | PCR-produkter: 25 μL vektorer: 1-2 μg |
| XhoI (eller AsiSI) restriktionsenzym | 2 μL |
| NotI restriktionsenzym | 2 μL |
| Ultrapure vand | x μL |
| Samlet mængde | 50 μL |
Tabel 3: betingelser for dobbelt fordøjelse af PCR-produkter og luciferasevektorer ved brug af XhoI (eller AsiSI) og NotI-enzymer i dette studie.
| Komponenter | 1x reaktion |
| 10x buffer | 2 μL |
| Vektorer (dobbelt fordøjet) | 50 ng |
| PCR-produkter (Indsæt) | x μL |
| Ubiquitinligase | 200 U |
| Ultrapure vand | y μL |
| Samlet mængde | 20 μL |
Tabel 4: Ligations reaktioner af dobbelt Ford ØJEDE PCR-produkter og der vektorer med DNA-ligasen i dette studie.
Supplerende figur 1: afledningen af ligning 2 fra ligning 1. Ligning 2 er afledt af ligning 1 for beregningen af justerede ICx-værdier. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: primer information. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strategier til bestemmelse af bona fide miRNA mål med funktionerne i en miRNA af interesse er uundværlige for forståelsen af flere roller miRNAs. Identifikation af miRNA Target gener kan være en retningslinje for fortolkning af celle signalering hændelser moduleret af miRNAs i en celle. En afsløring af funktionelt vigtige mål gener af miRNAs kan give den grundlæggende viden til at udvikle en miRNA-baseret terapi i kræft.
Flere metoder såsom mikroarrays, lille RNA-Biblioteks sekvensering, dyb sekvensering, reverse transkriptase in situ-PCR og Northern-blotting kan anvendes til at udforske miRNA-udtryks niveauer ved hjælp af total RNA isoleret fra cellelinjer og væv24, 25,26. Højkapacitets profilering af miRNAs kan give værdifuld indsigt i det genetiske funda-up for kræft udvikling. Den sonde baserede miRNA-analyse bruges ofte til at validere profileringsdata og er også egnet til at screene nogle få miRNAs af interesse. Men målingen af modne miRNA niveauer ved hjælp af Probe-baseret real-time PCR er begrænset til at afgøre, om modne miRNAs er reguleret på transkriptionstrin eller gennem regulering af modning. Dye-baseret real-time PCR og Northern blotting er blevet introduceret til at måle Mirna forløber niveauer27,28. Måling af miRNA-prækursorer sammen med modne miRNA niveauer kan yderligere give oplysninger om, hvordan modne miRNA niveauer er reguleret. Desuden er en omfattende forståelse af reguleringen af miRNA-niveauerne uundværlig for udviklingen af miRNA-baserede terapeutiske tilgange.
Celle sprednings analyser såsom tetrazolium-baseret MTT-analyse anvendes til at screene virkningen af behandlings reagenser såsom miRNA efterligner. Da MTT-analysen afspejler cellernes metaboliske aktiviteter baseret på tetrazolium-reduktionen af cellulære oxidoreductases, er det muligt at observere den manglende korrelation mellem MTT-analysen og det samlede celle nummer19. Alternativt er SRB-analysen tilgængelig som den mest reproducerbare celle optællings analyse18,19. Måling af mængden af SRB farvestof bundet til trichloreddikesyre faste proteiner kan repræsentere det samlede celle nummer29. Desuden, SRB assay i denne protokol kan anvendes til at screene flere miRNA efterligner samt anti-cancer medicin ved hjælp af 384-brønd plader. Imidlertid har SRB-analysen begrænsninger såsom manuel screening. Desuden er denne analyse ikke tilgængelig for ikke-veddige celler. Da miRNAs også spiller en afgørende rolle i hæmatologiske maligniteter såsom lymfom og myelomatose30, er effektiv overvågning af celle spredning nødvendig for at afdække Mirnas funktioner. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) kan intracellulært mærke de ikke-vedlige celler. CFSE bruges til at overvåge generering af prolifererende celler ved flow cytometri31. Desuden kan miRNAs påvirke invasion, metastase, og programmeret celledød. Derfor vil andre eksperimentelle teknikker, der kombinerer med denne protokol være mere praktisk for den korrekte forståelse af miRNA funktioner, som i sidste ende bidrager til at identificere multitudinerende biologisk relevante mål for miRNAs.
Beregning af den halve maksimale hæmmende koncentration (IC50) er en vigtig metode ikke kun for Mirna-studierne, men også for effektivitetsvurderingen af andre anti-cancer-lægemidler. IC50 værdier kan bruges til at sammenligne de potentielle virkninger af flere Mirnas eller anti-cancer medicin på celle spredning. Det er blevet påvist, at kombinationen af en miRNA-baseret behandling med anti-cancer medicin kan give en enestående mulighed for at forbedre anti-cancer-lægemidlets effektivitet. Desuden, kombinationen af Mirnas med anti-cancer medicin kan være en ny tilgang til at overvinde chemoresistance32,33. Til evaluering af kombinations effektivitet er det fordelagtigt at beregne justerede ICx-værdier baseret på vores protokol til vurdering af kombinations indeks (CI), som muliggør det kvantitative skøn over synergisme eller antagonisme33 34.
Intracellulære signalering netværk kan være meget uorganiseret af anomalt udtrykte Mirnas i talrige sygdomme, herunder kræft. Signalerings netværk, der er påvirket af miRNAs, er dog stadig for det meste ukendte, da den lille andel af målgener er blevet eksperimentelt valideret, og målgener reguleres også via ikke-canonisk reaktion med miRNAs35. Ikke desto mindre, vores strategi og protokol er pålidelige metoder til at dechifrere de cellulære mekanismer miRNAs. Desuden kan vores protokol udvides yderligere til at gennemføre og evaluere kombinationen af miRNAs og andre anti-cancer-lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af grundlæggende videnskabelige forsknings program gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (2017R1D1A3B03035662); og Hallym Universitets forskningsfond, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6x DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8x Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1,000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
