Summary
Dieses Protokoll verwendet eine sondenbasierte Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einen Sulforhodamin-B-Assay (SRB), 3' unübersetztes Klonen (3' UTR) und einen Luziferase-Assay, um die Zielgene einer miRNA von Interesse zu verifizieren und die Funktionen von miRNAs zu verstehen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind kleine regulatorische RNAs, die anerkannt sind, um zahlreiche intrazelluläre Signalwege bei mehreren Krankheiten, einschließlich Krebserkrankungen, zu modulieren. Diese kleinen regulatorischen RNAs interagieren hauptsächlich mit den 3' unübersetzten Regionen (3' UTR) ihrer Zielboten-RNAs (mRNAs), was letztlich zur Hemmung von Dekodierungsprozessen von mRNAs und zur Erweiterung von Ziel-mRNA-Abbauarten führt. Basierend auf den Expressionsniveaus und intrazellulären Funktionen sind miRNAs in der Lage, als regulatorische Faktoren für onkogene und tumorsuppressive mRNAs zu dienen. Die Identifizierung von gutgläubigen Zielgenen einer miRNA unter Hunderten oder sogar Tausenden von rechnerisch vorhergesagten Zielen ist ein entscheidender Schritt, um die Rollen und grundlegenden molekularen Mechanismen einer miRNA von Interesse zu erkennen. Verschiedene miRNA-Zielvorhersageprogramme stehen zur Verfügung, um mögliche miRNA-mRNA-Interaktionen zu suchen. Die schwierigste Frage ist jedoch, wie direkte Zielgene einer miRNA von Interesse validiert werden können. Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Strategie von Schlüsselmethoden zur Identifizierung von miRNA-Zielen im Zusammenhang mit der Funktion einer miRNA. Dieses Protokoll enthält eine praktische Anleitung zu Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Aufdeckung von miRNA-Spiegeln, -Funktionen und zugehörigen Ziel-mRNAs unter Verwendung der sondenbasierten Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Sulforhodamin B (SRB)-Assay nach einer miRNA-Mimiktransfektion , Dosis-Wirkungs-Kurvengenerierung und Luziferase-Assay zusammen mit dem Klonen von 3' UTR eines Gens, das für ein richtiges Verständnis der Rollen einzelner miRNAs notwendig ist.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) sind die kleinen regulatorischen RNAs, die hauptsächlich den Prozess der Übersetzung und des Abbaus von Messenger RNAs (mRNAs) modulieren, indem sie auf die 3' unübersetzten Regionen (3' UTR) in gutgläubigen Zielgenen1reagieren. Die Expression von miRNAs kann durch transkriptionelle und posttranskriptionelle Mechanismen reguliert werden. Das Ungleichgewicht solcher Regulierungsmechanismen führt zu unkontrollierten und ausgeprägten miRNAs Expressionsniveaus bei zahlreichen Krankheiten, einschließlich Krebsarten2. Eine einzelne miRNA kann mehrere Wechselwirkungen mit verschiedenen mRNAs haben. Entsprechend kann eine einzelne mRNA durch verschiedene miRNAs gesteuert werden. Daher werden intrazelluläre Signalnetze aufwendig durch markant exprimierte miRNAs beeinflusst, durch die physiologische Störungen und Krankheiten initiiert und verschlechtert werden können2,3,4, 5 , 6. Obwohl die veränderte Expression von miRNAs bei verschiedenen Krebsarten beobachtet wurde, sind die molekularen Mechanismen, die die Manieren von Krebszellen in Verbindung mit miRNAs modulieren, noch weitgehend unbekannt.
Die Akkumulierenden Beweise zeigen, dass die onkogenen oder tumorsuppressiven Rollen von miRNAs von den Krebsarten abhängen. Zum Beispiel, indem for targeting Gabelkopf-Box o3 (FOXO3), miR-155 fördert die Zellproliferation, Metastasierung, und Chemoresistenz von Dickdarmkrebs7,8. Im Gegensatz dazu wird die Restriktion der Gliomzellinvasion durch miR-107 durch die Regulation der neurogenen Locus Kerch Homolog Protein 2 (NOTCH2) Expression9induziert. Die Bewertung von miRNA-Ziel-Wechselwirkungen im Zusammenhang mit miRNA-Funktionen ist ein unverzichtbarer Bestandteil, um besser zu verstehen, wie miRNAs verschiedene biologische Prozesse sowohl in gesunden als auch in kranken Zuständen regulieren10. Darüber hinaus kann die Entdeckung von gutgläubigen Zielen von miRNAs eine fein abgestimmte Strategie für eine miRNA-basierte Therapie mit verschiedenen Krebsmedikamenten bieten. Die größte Herausforderung im Bereich der miRNAs ist jedoch die Identifizierung direkter Ziele von miRNAs. Hier werden detaillierte Methoden als reproduzierbare experimentelle Ansätze für die miRNA-Zielgenbestimmung präsentiert. Erfolgreiches experimentelles Design für die miRNA-Zielidentifikation umfasst verschiedene Schritte und Überlegungen (Abbildung 1). Der Vergleich der reifen miRNA-Spiegel in Tumorzellen und normalen Zellen kann eine der üblichen Verfahren zur Auswahl einer miRNA von Interesse sein (Abbildung 1A). Die funktionelle Studie einer ausgewählten miRNA zum Nachweis der Auswirkungen einer miRNA auf die Zellproliferation ist wichtig, um die Liste der besten potenziellen Kandidatenziele einer miRNA von Interesse einzugrenzen (Abbildung 1B). Basierend auf den experimentell validierten Funktionen von miRNAs ist eine systematische Überprüfung von Literatur und Datenbank in Unternehmen mit einem miRNA-Zielvorhersageprogramm erforderlich, um die relevantesten Informationen über Genfunktionen zu durchsuchen (Abbildung 1C). Die Identifizierung von realen Zielgenen einer miRNA von Interesse kann durch die Durchführung von Experimenten wie dem Luziferase-Assay zusammen mit dem Klonen von 3' UTR eines Gens, Echtzeit-PCR und Western Blotting (Abbildung 1D) erreicht werden. Ziel des aktuellen Protokolls ist es, umfassende Methoden für Schlüsselexperimente, die sonsonbasierte Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Sulforhodamin B (SRB) nach einer miRNA-Mimiktransfektion, Dosis-Wirkungs-Kurvengenerierung und luziferase-Assay zusammen mit dem Klonen von 3' UTR eines Gens. Das aktuelle Protokoll kann für ein besseres Verständnis der Funktionen einzelner miRNAs und die Implikation einer miRNA in der Krebstherapie nützlich sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reife MicroRNA (miRNA) Expressionsanalyse
-
Reife miRNA-Komplementär-DNA-Synthese (cDNA)
- Fügen Sie 254 ng der gesamten RNA und 4,5 l Desoxyribonuklease I (DNase I) Gemische hinzu, und fügen Sie dann Reinstwasser in PCR-Streifenröhren ein, um bis zu 18 l zu bilden (Abbildung 2A). Bereiten Sie die Reaktion für jede gesamte RNA-Probe vor, die aus mehreren Zelllinien mit genügend DNase-I-Mischungen gereinigt wird, basierend auf der Gesamtzahl der Reaktionen.
HINWEIS: DNase-I-Mischungen bestehen aus DNase I (1,8 l), Ribonuklease-Inhibitor (0,3 l) und 25 mM MgCl2 (2,4 l). Um die gesamte RNA reproduzierbar zu beschaffen, wurde eine säulenbasierte Extraktionsmethode anstelle einer phenol-chlorformbasierten Extraktionsmethode angewandt. Es wurde berichtet, dass die Extraktionsausbeute einiger miRNAs je nach Anzahl der Zellen variiert werden kann, wenn eine Phenol-Chlorform-basierte Extraktionsmethode11,12verwendet wird. - Inkubieren Sie die Rohre in einem thermischen Cycler. Führen Sie die Rohre 10 min bei 37 °C und wärmeinaktivierend DNase I durch 5 min Inkubation bei 90 °C. Legen Sie die Rohre nach der Inkubation sofort auf Eis.
- Übertragen Sie die gesamte RNA in 2 Sätze neuer Röhrchen und fügen Sie dann 1,5 l Antisense-Primer für das Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-Gen (GAPDH) hinzu (Abbildung 2B).
HINWEIS: Die Gesamt-RNA-Menge für die cDNA-Synthese wird in diesem Schritt zu 100 ng. Die Lagerkonzentration von GAPDH Antisense Primern beträgt 10 M. Das Hinzufügen von GAPDH Antisense Primern ist für die Erzeugung von GAPDH-CDNAs mit einer genspezifischen Primermethode. - Inkubieren Sie die Rohre mit einem thermischen Cycler. Beginnen Sie bei 80 °C für 5 min, gefolgt von der Reaktion bei 60 °C für 5 min. Legen Sie die Rohre nach der Inkubation sofort auf Eis.
- Fügen Sie in jeder Reaktion 3,4 l Reverse-Transkriptions-Enzymgemische (RT) hinzu (Abbildung 2B). RT-Enzymgemische bestehen aus 100 mM Desoxyribonukleotidtriphosphaten (0,15 l), 10x RT-Puffer (1,5 l), Ribonuklease-Inhibitor (0,75 l) und Reverse-Transkriptionsenzym (1 l). Bereiten Sie genügend Mischungen basierend auf der Gesamtzahl der Reaktionen vor.
- Fügen Sie in jeder Reaktion 3 l 5x RT-Primer für eine bestimmte miRNA hinzu (Abbildung 2B).
HINWEIS: Das Gesamtvolumen beträgt 15 L pro Reaktion. - Führen Sie die Rohre mit einem thermischen Cycler. Beginnen Sie bei 16 °C für 30 min, gefolgt von der Reaktion bei 42 °C für 30 min, und schließlich bei 85 °C für 5 min. Halten Sie bei 4 °C für die verbleibende Zeit (Abbildung2B). In diesem Schritt werden sowohl für ein spezifisches miRNA- als auch für ein GAPDH-Gen in derselben Röhre einsträngige cDNAs erzeugt.
- Fügen Sie 254 ng der gesamten RNA und 4,5 l Desoxyribonuklease I (DNase I) Gemische hinzu, und fügen Sie dann Reinstwasser in PCR-Streifenröhren ein, um bis zu 18 l zu bilden (Abbildung 2A). Bereiten Sie die Reaktion für jede gesamte RNA-Probe vor, die aus mehreren Zelllinien mit genügend DNase-I-Mischungen gereinigt wird, basierend auf der Gesamtzahl der Reaktionen.
-
Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Datenanalyse
- Verdünnen Sie jede cDNA mit Reinstwasser im Verhältnis 1:49.
- Bereiten Sie die Reaktionsgemische für eine bestimmte miRNA und GAPDH vor (Tabelle 1). Für den Nachweis einer spezifischen miRNA und GAPDH, stellen Sie dreifache Reaktionen für jede cDNA-Probe ein.
- Führen Sie die Echtzeit-PCR- und Datenanalyse durch (Abbildung 2C). Analysieren von Daten mit der vergleichenden C T-Methode13,14.
2. MicroRNA (miRNA) MimicTransfektion
HINWEIS: miRNA-107 wird aus Schritt 1 ausgewählt. Da miRNA-107 in Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen down-reguliert ist, kann spekuliert werden, dass miRNA-107 eine tumorsuppressive miRNA ist. Bei einer miRNA, die in Tumorzellen im Vergleich zu normalenZellen (z.B. , miRNA-301) hochreguliert ist, können Antisense-Oligonukleotide gegen miRNA-301 für die Schritte 2, 3 und 4 angewendet werden.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Zählkammergerät und verkleben Sie die Zellen in einer 96-Well-Platte. Die Zelldichte beträgt 2 x 103 Zellen/100 l für jeden Brunnen. Verwenden Sie keine Zellkulturmedien, die Penicillin-Streptomycin (P/S) enthalten, da P/S die Transfektionseffizienz reduzieren kann.
-
Bereiten Sie eine Reihe von Transfektionsmischungen vor, um die Zellen in mehreren endlichen Konzentrationen von miRNA-Kontrollmimik und miRNA-107 Mimik am nächsten Tag zu transfekieren (Abbildung 3).
- Aus dem Bestand (25 M-Konzentration) der miRNA-Steuerung imitieren oder miRNA-107 imitieren, verdünnen und fügen Sie entsprechende Menge an Kontrollmimik oder miRNA-107 Mimik in den reduzierten Serummedien zusammen mit einem Transfektionsreagenz mit Mikrozentrifugenröhren hinzu (Abbildung 3A). Mischen Sie die Oligo enthaltenden Mischungen vorsichtig mit einer Mikropipette. Die Gesamtmenge der Oligos (miRNA mimisch control + miRNA-107 mimic) sollte in jedem Brunnen gleich sein. Leere Brunnen umfassen 100 L Zellkulturmedien und reduzierte Serummedien, die ein Transfektionsreagenz ohne Zellen enthalten.
- Nach einer 10 min Inkubation in einer Zellkulturhaube die Oligo-haltigen Mischungen vorsichtig wieder mischen und dann 50 l der Mischungen in jeden Brunnen geben. Bewahren Sie die transfizierten Zellen in einem Zellkultur-Inkubator auf. Ersetzen Sie das medienhaltige Transfektionsreagenz durch die Frischzellkulturmedien, die sowohl fetales Rinderserum (FBS) als auch P/S nach 6-12 h Inkubation enthalten. Weitere inkubieren die Zellen für 72 h. Die Gesamtbehandlungsdauer von miRNA mimimimiiert beträgt 96 h.
3. Sulforhodamin B (SRB) Assay
-
Zellfixierung
- Entfernen Sie die Zellkulturmedien in jedem Brunnen der Platte und füllen Sie sofort 100 l 10% Trichloressigsäure (TCA) in jeden Brunnen. Saugen Sie vorsichtig die Zellkulturmedien von jedem Brunnen, um Zellschäden und Ablösung von unten zu vermeiden.
HINWEIS: Bereiten Sie 40% TCA vor, indem Sie 20 g TCA-Pulver in 50 ml destilliertes Wasser geben. Von 40% TCA, machen 10% TCA durch Verdünnung 40% TCA mit destilliertem Wasser bei einem Verdünnungsverhältnis von 1:3. - Bewahren Sie die Platte mit 10% TCA im Kühlschrank (4 °C) für 1 h auf.
- Waschen Sie die Platte mehrmals, indem Sie in die Wasserwanne eintauchen und trocknen. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Inneren der Brunnen, indem Sie die Platte anzapfen, bis kein Wasser mehr in den Brunnen vorhanden ist. Lassen Sie die Platte auf einer Laborbank, um sie zu trocknen, bevor Sie zum nächsten Schritt gehen.
- Entfernen Sie die Zellkulturmedien in jedem Brunnen der Platte und füllen Sie sofort 100 l 10% Trichloressigsäure (TCA) in jeden Brunnen. Saugen Sie vorsichtig die Zellkulturmedien von jedem Brunnen, um Zellschäden und Ablösung von unten zu vermeiden.
-
Zellfärbung
- Pipette 50 l 0,4% SRB-Lösung in jeden Brunnen einschließlich Leerbohrungen. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, bis 0,4% SRB-Lösung konsequent den Boden der Brunnen bedeckt.
HINWEIS: Bereiten Sie 0,4% SRB-Lösung vor und verwenden Sie 0,4 g SRB-Pulver in 100 ml 1% Essigsäure. Schütteln Sie die Lösung sorgfältig, um sie zu mischen. Wickeln Sie die Flasche mit 0,4% SRB-Lösung in ein leichtes Schutzmaterial wie Aluminiumfolie. 0,4% SRB-Lösung im Kühlschrank aufbewahren. - Nach der Inkubation für 40 min bis 60 min die Platte waschen, indem Sie sie mit 1% Essigsäure abspülen. Waschen Sie die Platte, bis der ungebundene Farbstoff vollständig weggespült wird (Abbildung 3B).
- Lassen Sie die Platte auf einer Laborbank, um sie zu trocknen, bevor Sie zum nächsten Schritt gehen.
HINWEIS: Die Platte sollte vollständig getrocknet werden, bevor Sie zu Schritt 3.3 gehen.
- Pipette 50 l 0,4% SRB-Lösung in jeden Brunnen einschließlich Leerbohrungen. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, bis 0,4% SRB-Lösung konsequent den Boden der Brunnen bedeckt.
-
Absorptionsmessung
- Pipette 100 l Tris Basislösung (10 mM) in die entsprechenden Brunnen einschließlich Leerbrunnen. Halten Sie die Platte 10 min auf einem Shaker. Messen Sie die Absorption bei 492 nm.
4. Erzeugung einer Dosis-Wirkungs-Kurve
- Analysieren Sie die SRB-Assay-Daten in einer Kalkulationstabelle. Subtrahieren Sie die Leerabsorption von den Absorptionswerten jeder Gruppe und berechnen Sie den Durchschnitt (AVE) und die Standardabweichung (STD) der Absorptionswerte jeder Gruppe.
- Berechnen des Prozentsatzes der durchschnittlichen Absorption (AVE%) und die der Standardabweichung (STD%) jeder Gruppe unter Verwendung von Absorptionswerten des SRB-Assays.
HINWEIS: Die AVE% der miRNA-Kontroll-Mimik-behandelten Gruppe beträgt 100%. Berechnen Sie die STD% mit der folgenden Formel: STD% = (STD jeder Gruppe / AVE-Absorption der Kontrollmimik behandelt enikuliert) x 100. - Importieren Sie die Rohdaten einschließlich Behandlungskonzentrationen, AVE% und STD% in die Software, indem Sie diese Daten vertikal ausrichten. Da Log 0 nicht definiert ist, legen Sie die erste Konzentration der X-Achse auf einen Wert nahe 0 fest (z. B.., 0,01).
- Klicken Sie auf Die Registerkarte Diagramm erstellen, und wählen Sie Einfache Streufehlerbalkenaus. Wählen Sie Arbeitsblattspalten als Symbolwerte aus, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie im Datenformatbedienfeld XY-Paare aus, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie die entsprechenden Datenspalten im Auswahldatenbedienfeld aus. Klicken Sie auf Fertig stellen, um das Diagramm zu erstellen.
HINWEIS: Die X-Achse stellt die Konzentrationen dar, die Y-Achse gibt den Prozentsatz der durchschnittlichen Absorption jeder Konzentration (AVE) an, und die Fehlerbalken weisen auf den Prozentsatz der Standardabweichung jeder Konzentration (STD) hin. - Doppelklicken Sie auf die X-Achse, um den Maßstabstyp und die Skalierung der Achse zu ändern. Ändern Sie den Maßstabstyp von linear in protokollieren. Ändern Sie die Start- und Endbereichsnummer auf 0,01 bzw. 200.
-
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein beliebiges Streudiagramm, wählen Sie Kurve passen, und gehen Sie zur Unterkategorie Benutzerdefiniert. Wählen Sie Dosis-Antwort-Kurve, klicken Sie auf Weiter und dann auf Fertig stellen. Die Dosis-Wirkungs-Kurve wird nun zusammen mit einer Berichtsregisterkarte generiert (Abbildung 4A).
- Um Gleichung 1 in die Software für die Generierung einer Dosis-Wirkungs-Kurve einzugeben, klicken Sie auf die Registerkarte Analyse, und wählen Sie Regressions-Assistentaus. Wechseln Sie zu Benutzerdefiniert in der Gleichungskategorie, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Neu. Fügen Sie Gleichung 1, Variablen, Anfangsparameter und Abhängigkeiten in die entsprechenden leeren Felder ein (Abbildung 4B, C). Klicken Sie auf Als hinzufügen, und legen Sie den Namen der Gleichung als Dosis-Antwort-Kurvefest. Der Gleichungsname wird nun in der Unterkategorie Benutzerdefiniert in der Gleichungskategorie generiert. f gibt den Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit (% Zelllebensfähigkeit) in Gleichung 1 an.
Gleichung 1
- Wechseln Sie zur Registerkarte Bericht, und überprüfen Sie dann die N-, K- und R-Werte.
ANMERKUNG: y0 zeigt 100% Zelllebensfähigkeit der miRNA-Kontroll-Mimik-behandelten Gruppe an, n zeigt den Hill-Typ-Koeffizienten (die Steigung eines Diagramms), k zeigt die Konzentration von miRNA-107 Mimik an, die eine 50% der maximalen Wirkung der miRNA-107 Mimik erzeugt (die Hälfte maximale hemmende Konzentration, IC50), und R zeigt die verbleibende nicht betroffene Fraktion (die Widerstandsfraktion)15an. Die Gleichung, die zum Generieren einer Dosis-Wirkungs-Kurve verwendet wird, erkennt den Bereich von y0 bis R-Wert (falls vorhanden) als 100 % (Abbildung 4A). Daher ist es notwendig, den angepassten k (IC50) Wert zu erfassen, der auf der Grundlage des Bereichs von y0 bis zu einem Wert von Null berechnet wird (Abbildung 4A). Angepasst k (IC50) zusammen mit anderenICx-Werten (z.B. , IC10 bis IC90) kann mit Gleichung 2 ermittelt werden, die aus Gleichung 1 abgeleitet ist. Die Ableitung von Gleichung 2 aus Gleichung 1 ist in der Ergänzenden Abbildung 1angegeben.
Gleichung 2
- Doppelklicken Sie auf die linke Maustaste auf die Zelle, in der Gleichung 2 angewendet wird. Unter Verwendung von Gleichung 2 und Parametern aus der generierten Dosis-Wirkungs-Kurve steht es zur Verfügung, um die angepassten Werte von ICx von IC10 bis IC90 zu berechnen (Abbildung 4D).
- Geben Sie das Gleichheitszeichen gefolgt von der Formel ein, die mit einer Klammer in der Zelle beginnt. Legen Sie bei der Eingabe der Formel den Wert von n, k und R als absolute Zellbezüge fest, indem Sie das Dollarzeichen zur entsprechenden Spalte und Zeile hinzufügen, damit diese festen Werte nicht beim automatischen Ausfüllen der Formel bis zu den Zeilen geändert werden (Abbildung 4D). Alternativ können angepasste Werte manuell mit Gleichung 2 berechnet werden.
HINWEIS: Der IC 90-Wert wird nicht ermittelt, da der R-Wert größer als 10 ist. Wenn der R-Wert über 20 liegt, wird auch der Wert von IC80 nicht ermittelt (Abbildung 4D).
5. Überprüfung des direkten Zielgens einer MicroRNA von Interesse
HINWEIS: Nach der Durchführung des funktionellen Experiments wie dem SRB-Assay wird miRNA-107 als tumorsuppressive miRNA bestätigt und es ist durchaus möglich, dass miRNA-107 direkt auf Onkogene abzielt. Überprüfen Sie die Liste aller vorhergesagten Zielgene mit einem miRNA-Zielvorhersageprogramm wie TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/), und schränken Sie sie dann auf potenzielle Kandidatenziele ein, basierend auf der Funktion eines Gens in Datenbanken wie PubMed und GeneCards.
- Primer-Design zum Klonen von 3' unübersetzten Regionen (UTR)
- Setzen Sie den Namen eines Gens in GeneCards (https://www.genecards.org/) ein, und klicken Sie auf Symbol eines Gens. Bewerten Sie den Ensembl-Genombrowser, indem Sie auf Ensembl ID eines Gens klicken und dann in der Transkriptiontabelle auf Transkripts-ID klicken. Danach wurde in der Liste Transkript-basierte Anzeigen auf der linken Seite auf Exons geklickt.
- Kopieren Sie die Nukleotidsequenzen des 3' UTR und fügen Sie es in das Primer-Design-Programm ein. Kopieren Sie die Sequenzen aus diesem Programm erneut, und fügen Sie sie in eine Textverarbeitung ein. Überprüfen Sie das Vorhandensein von miRNA-Bindungssequenzen sowie das Vorhandensein von Restriktionsenzymen, die für das Klonen verwendet werden.
HINWEIS: Wenn es innerhalb der 3' UTR keine Beschränkungs-Enzymerkennungsstellen gibt, können die für das Klonen ausgewählten Restriktionsenzyme für den nächsten Schritt verwendet werden. - Akzeptieren Sie im Primer-Design-Programm die 3' UTR-Sequenzen und beginnen Sie, die Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung mit der folgenden Bedingung zu entwerfen. Länge: 20-30 Nukleotide, Tm: 45-58 °C, GC%: 40-60%. Die Differenz zwischen den Tm-Werten der beiden Primer sollte weniger als 5 °C betragen. Die in dieser Studie verwendeten Primersequenzen sind in der ergänzenden Abbildung 2dargestellt. Fügen Sie den entworfenen Primern Restriktionsenzymerkennungssequenzen sowie 4 zufällige Nukleotide hinzu.
- GradientPCR
- Bereiten Sie 25 L PCR-Reaktionsgemische vor, einschließlich entworfener Primer pro Glühtemperatur (Tabelle 2). Bereiten Sie genügend Mischungen basierend auf der Gesamtzahl der Reaktionen vor. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren und fügen Sie 25 L Reaktionsgemische in jedes Rohr. Zentrifugieren Sie die Rohre für einige Sekunden.
- Führen Sie 35-40 PCR-Zyklen von Denaturierungsschritt zu Erweiterungsschritt durch. Einrichten des PCR-Zyklus in folgenden Schritten: 98 °C für 1 min (1 Zyklus, Polymerase-Aktivierungsschritt), 95 °C für 10 s (Denaturierungsschritt), 45 °C-68 °C für 30 s (Glühschritt), 68 °C (Verlängerungsschritt, 10 s-1 min pro 1000 bp), 68 °C für 3 min (Beendigungsschritt) und abkühlen auf 4 °C.
- Führen Sie die PCR-Produkte und überprüfen Sie Bänder auf einem 1% Agarose-Gel mit DNA-Leitern. Finden Sie die beste Glühtemperatur (Abbildung 5A). Verstärken Sie 3' UTR eines Gens wieder mit der besten Glühtemperatur für den nächsten Schritt.
- Doppelte Verdauung
- Machen Sie die Reaktionsgemische einschließlich zweier Restriktionsenzyme, XhoI (oder AsiSI) und NotI, in einer Röhre (Tabelle 3). Inkubieren Sie die Mischungen für 3-4 h mit einem Wasserbad (37 °C).
- Führen Sie die doppelt verdauten Produkte auf einem 1% Agarose-Gel und schneiden Sie dann die Bänder unter UV-Licht. Im Falle von Luziferase-Vektoren, vor dem Laufen auf einem Gel, reagieren doppelverdaute Vektoren mit 10 U alkalische Phosphatasen für weitere 1 h, um eine Rezirkulierung während des Ligationsschritts zu verhindern.
- Reinigen Sie die doppelt verdauten PCR-Produkte und Luziferase-Vektoren aus den ausgeschnittenen Bändern.
- Ligation von PCR-Produkten in die Luziferase-Vektoren
- Machen Sie 20 l Ligationsreaktionsgemische einschließlich der DNA-Ligase (Tabelle 4).
HINWEIS: Das Molverhältnis von PCR-Produkt (Insert) zu Luziferase-Vektor kann 3:1 sein. 1:1 oder 2:1. - Kurz zentrifugieren Sie das Rohr für 10-15 s und inkubieren Sie bei 16 °C über Nacht mit einem thermischen Cycler.
HINWEIS: Alternativ kann das Rohr bei 4 °C für 2-3 Tage für die Ligation inkubiert werden. In diesem Schritt wird der PCR-Einsatz in den Bereich geklont, der nach einem Renilla-Reporter-Gen positioniert ist (Abbildung 5B). Die Bindung von miRNAs in die geklonte 3' UTR eines Gens kann die Renilla-Aktivität verringern. Firefly luziferase ist für die Normalisierung der Renilla Ausdruck Ebenen.
- Machen Sie 20 l Ligationsreaktionsgemische einschließlich der DNA-Ligase (Tabelle 4).
- Transformation und Kolonie PCR
- Fügen Sie die Ligationsgemische (3-5 l) in das Rohr mit kompetenten Zellen. Tippen Sie vorsichtig auf die Röhre und halten Sie sie auf Eis (20 min).
HINWEIS: Entfrieren Sie kompetente Zellen auf Eis, bevor Sie die Ligationsmischungen hinzufügen. - Übertragen Sie das Rohr schnell und vorsichtig auf einen Wärmeblock. Nach einem Hitzeschock (42 °C für 30 s-1 min) die Röhre 20 min auf Eis legen.
- Verteilen Sie kompetente Zellen auf der Luria-Bertani (LB) Agarplatte. Wachsen Sie kompetente Zellen in einem Inkubator (37 °C) über Nacht.
HINWEIS: Ampicillin (50-100 g/ml) ist in der Agarplatte enthalten. - Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und setzen Sie E. coli in einem der 8-Streifen-Rohre, die Reinstwasser enthalten, wieder aus. Wiederholen Sie diesen Schritt, um E. coli aus zufällig ausgewählten 4-8 Kolonien wieder auszusetzen (Abbildung 5C).
- Übertragen Sie 25 l E. coli Suspension in einen anderen Satz von 8-Streifen-Röhren. Jetzt gibt es 2 Sätze von Röhren von E. coli Suspension.
HINWEIS: Ein Rohr ist für Kolonie PCR und eine andere ist für die Impfung. E. coli Suspension zur Impfung kann vorübergehend bei 4 °C gelagert werden (Abbildung 5C). - Führen Sie die Kolonie PCR mit E. coli Suspension. In diesem Schritt soll festgestellt werden, ob die Kolonien einen Einsatz enthalten. Wählen Sie die besten Kolonien aus, um Luziferasevektoren zu impfen und zu isolieren, die 3' UTR eines Gens beherbergen (Abbildung 5C).
HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 5.1-5.5 für jede 3' UTR ausgewählter Gene. Folgen Sie dem Zustand der PCR-Reaktion in Tabelle 2, indem Sie die genomische DNA durch E. coli Suspension ersetzen.
- Fügen Sie die Ligationsgemische (3-5 l) in das Rohr mit kompetenten Zellen. Tippen Sie vorsichtig auf die Röhre und halten Sie sie auf Eis (20 min).
- Luziferase-Assay
- Bereiten Sie eine 24-Well-Platte vor. Verwenden Sie 1-2 x 104 Zellen in 500 L Zellkulturmedien für jeden Brunnen. Verwenden Sie für die Transfektion keine Zellkulturmedien, die P/S enthalten, da die Verwendung von P/S die Transfektionseffizienz reduzieren kann.
- Transfekte 50 ng Luziferase-Vektoren in die Zellen mit Kontrollmimik oder einer spezifischen miRNA-Mimik mit einem Transfektionsreagenz (Abbildung 5D). Wenn das Screening der Wirkungen einer bestimmten miRNA in mehr als einer Konzentration imitiert, halten Sie die Gesamtmenge der Oligos in jedem Brunnen gleich (siehe Schritt 2).
- Waschen Sie das Innere der Brunnen zweimal mit Phosphat gepufferter Saline (PBS) am nächsten Tag.
- Tragen Sie 200 l Lysereagenz in die Brunnen auf und führen Sie eine Zelllyse ausreichend durch, bevor Sie die Luziferaseaktivität messen.
HINWEIS: Halten Sie die Platte mindestens 15 min auf einer Schüttelplatte. - Übertragen Sie 5-10 l Zelllysat in das neue Rohr und fügen Sie 100 l Reagenz I hinzu. Mischen Sie die Lösung sofort durch Pipettieren und lesen Sie die Galleifegauchaktivität mit einem Luminometer.
HINWEIS: Lesen Sie die Galleife-Aktivität für 10-15 s. - Fügen Sie 100 l Reagenz II in das gleiche Rohr, und dann mischen, indem Sie zweimal pipetieren. Lesen Sie die Renilla-Luziferase-Aktivität für 10-15 s mit einem Luminometer. Wiederholen Sie Schritt 5.6.5 und 5.6.6 für jede Probe.
- Berechnen Sie das Verhältnis von Renilla zu Gunen (Abbildung 5E).
HINWEIS: Die Aktivität von Firefly stellt die Transfektionseffizienz von Luziferasekonstrukten in die Zellen dar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eine erfolgreiche und genaue Bestätigung des miRNA-Spiegels ist wichtig für die Interpretation von Daten, durch die die Klassifizierung von miRNAs auf der Grundlage der erwarteten Rolle von miRNAs bei der Entwicklung und dem Fortschreiten einer Krankheit möglich ist. Die Konzentrationen von miRNA-107 und miRNA-301 wurden in drei Pankreaszelllinien mit der sondenbasierten quantitativen PCR gemessen. Die Synthese von cDNAs sowohl einer spezifischen miRNA als auch eines Referenzgens in derselben Reaktion kann die Reproduzierbarkeit von Daten erhöhen. PANC-1 und CAPAN-1 sind menschliche duktale Adenokarzinom-Zelllinien der Bauchspeicheldrüse, während HPNE eine verewigte Pankreas-Kanalzelllinie ist, die mit einem retroviralen Expressionsvektor transduziert wird, der das menschliche Telomerase-Reverse-Transkriptase-Gen (hTERT) beherbergt. miRNA-107 wurde in PANC-1- und CAPAN-1-Zellen im Vergleich zu HPNE-Zellen signifikant reduziert (Abbildung 2C). Die MiRNA-301-Spiegel waren in PANC-1- und CAPAN-1-Zellen im Vergleich zu HPNE-Zellen signifikant hochreguliert. Diese Ergebnisse entsprechen früheren Berichten, dass miRNA-107 in Pankreaskarzinomzellen epigenetisch inaktiviert ist und dass miRNA-301-Spiegel in pankreatischen duktodatodischen Adenokarzinomzellen höher sind als normale Pankreas-Duktalzellen16, 17.
Der 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay spiegelt die metabolische Aktivität der Zelle wider. Diese Funktion hat eine signifikant höhere Chance, die fehlende Korrelation zwischen dem MTT-Assay und der Gesamtzellzahl zu erwerben, da die Assay-Bedingungen einschließlich einer Art von Behandlungsreagenzien die enzymatische Reduktion von Tetrazolium stark beeinträchtigen können. 18,19. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde der Sulforhodamin B (SRB) Assay angewendet, um die Auswirkungen von miRNA-107 auf die Zellproliferation zu messen, um die potenziellen biologischen Funktionen von miRNA-107 zu identifizieren. Die Menge des gebundenen SRB-Farbstoffs in den festen Zellen kann als Ersatz für die Änderung der Gesamtzahl der Zellen verwendet werden. Der SRB-Assay in dieser Studie zeigt deutlich, dass die Proliferation von PANC-1-Zellen nach einer miRNA-107-Mimiktransfektion abnahm (Abbildung 3). Die miRNA-107-Konzentration, die eine Hemmung der 50%igen Zelllebensfähigkeit (IC50) verursachte, wurde durch die Erzeugung einer Dosis-Wirkungs-Kurve bestimmt. Darüber hinaus ist die Anwendung von Gleichung 2 vorteilhaft, um alle möglichen hemmenden Konzentrationen (ICx) für die genaue Bewertung der Wirkungen von miRNA-107 (Abbildung 4) zu berechnen.
Die Untersuchung der Korrelation zwischen miRNAs und mRNAs-Spiegeln ist ein effektiver Weg für die miRNA-Zielidentifikation, da miRNAs die Zielgenspiegel durch den Abbau von mRNAs2,20regulieren können. Da miRNAs jedoch auch auf translationaler Ebene wirken, ohne die Prozesse des mRNA-Abbaus zu beeinflussen, ist die experimentelle Validierung von miRNA-Target-Gen-Wechselwirkungen mit dem Luziferase-Assay ein wesentlicher Schritt. Der Hauptvorteil eines Luziferase-Tests ist, dass dieser Test die Veränderungen der mRNA-Spiegel ausschließen kann, die durch den Abbau von mRNAs reguliert werden21. Daher ist das Klonen von 3' UTR von vorhergesagten Zielgenen ein wichtiger Schritt, um reale Zielgene einer miRNA von Interesse in Verbindung mit Echtzeit-PCR- und Western-Blot-Experimenten zu identifizieren. Eine effiziente Nutzung der Dual-Reporter-Vektoren ermöglicht die Erfassung eindeutiger experimenteller Daten, da die Messung von Kontrollreporter-Spiegeln die experimentellen Variationen wie die Anzahl der Zellen reduzieren kann. Die Normalisierungsprozesse der Luziferase-Assay-Daten, die von Vektoren mit 3' UTR eines Synuclein-Gamma-Gens (SNCG) erfasst wurden, sind in Abbildung 5Edargestellt. Darüber hinaus zeigt das Screening von 11 potentiellen vorhersagezielen von miRNA-107 deutlich, dass nur SNCG, ein positiver Regulator des Tumorzellwachstums22,23, direkt mit miRNA-107 in PANC-1-Zellen interagiert (Abbildung 6). Dieser Befund deutet darauf hin, dass miRNA-107 die Proliferation von PANC-1-Zellen durch Modulation der SNCG-Expression negativ regulieren kann.
Abbildung 1: Experimentelles Design für die miRNA-Zielidentifikation. Dieses Diagramm zeigt den Fluss eines experimentellen Designs, das hilft, das Ziel einer miRNA zu identifizieren. (A) Die Analyse der reifen miRNA-Expressionsniveaus und die Auswahl einer miRNA von Interesse. (B) Drei Experimente, wie die miRNA-Mimiktransfektion, SRB-Assay und die Generierung einer Dosis-Wirkungs-Kurve können für die funktionelle Studie ausgewählter miRNAs durchgeführt werden. (C) Um Kandidatenzielgene einer miRNA von Interesse einzugrenzen, ist es von Vorteil, die Informationen und die Funktion der vorhergesagten Zielgene in Zielvorhersageprogrammen, Pubmed und GeneCard zu überprüfen. (D) Nach dem Nachweis einiger potenzieller Kandidatenzielgene einer miRNA von Interesse ist es möglich, praktische Experimente wie das Klonen von 3' UTR von mRNAs, Luziferase-Assay, Echtzeit-PCR und Western Blot durchzuführen, um endlich das direkte Ziel zu beweisen Gene einer miRNA von Interesse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Reife miRNA-Expressionsanalyse. (A) Fügen Sie die gesamte RNA aus jeder Zelllinie (PANC-1, CAPAN-1 und HPNE), DNase I-Mischungen und Reinstwasser in beschriftete Streifenröhren ein. Das Gesamtvolumen in jedem Rohr beträgt 18 l (PANC-1 und CAPAN-1 sind Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien, während HPNE eine normale Bauchspeicheldrüsenkanal-Zelllinie ist). (B) Transfer 7,1 l DNase I behandelte Mischungen in 2 Sätze neuer Streifenröhren, und 1,5 l Antisense-Primer für ein GAPDH-Gen werden ebenfalls in jedem Rohr zugesetzt. INkubieren Sie PCR-Streifenröhren unter indizierte Reaktionsbedingungen. Als nächstes fügen Sie RT-Enzymmischungen und 5x RT-Primer für eine spezifische miRNA (miRNA-107 oder miRNA-301) in die vorgesehenen Röhrchen ein, und inkubieren Sie die Röhrchen dann unter den angegebenen Bedingungen erneut. Einsträngige cDNAs für eine bestimmte miRNA und GAPDH werden erzeugt. (C) Die Reifen miRNA-107- und miRNA-301-Spiegel wurden durch die sonsonbasierte Echtzeit-PCR mit der gesamten RNA ermittelt, die aus PANC-1-, CAPAN-1- und HPNE-Zellen isoliert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Mimik-Transfektion und der SRB-Assay. (A) Das obere Panel zeigt die Verdünnung von miRNA-Kontrollmimik und miRNA-107-Mimik zur Herstellung von Transfektionsmischungen. Der Bereich der Endkonzentrationen von miRNA-107 mimimik beträgt 0 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM und 100 nM. Das Gesamtvolumen in jeder Säule ist für die Transfektion von Zellen in einem Brunnen einer 96-Well-Platte. Das untere Panel zeigt ein Beispiel für die Skalierung der Transfektionsgemische, um genügend Mischungen für die Transfektion der Zellen in 4 Brunnen in einer angegebenen Konzentration vorzubereiten. Als nächstes fügen Sie 50 l Mischungen in jeden Brunnen, indem Sie das vorgeschlagene Format für die Transfizierung miRNA Steuerung mimimik mit miRNA-107 mimimik. Diese Platte wurde für den SRB-Assay verwendet, der Zellfixierung, Zellfärbung und Absorptionsmessung umfasst. (B) Tatsächliches Bild der 96-Well-Platte, die die SRB-gefärbten Zellen zeigt. Dieses Bild zeigt deutlich, dass die Anzahl der PANC-1-Zellen mit zunehmender Mimikkonzentration von miRNA-107 abnimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Generierung einer Dosis-Wirkungs-Kurve. (A) Repräsentative Dosis-Wirkungs-Kurve von miRNA-107 imitiert transfizierte PANC-1-Zellen. Transfizierte Zellen wurden kontinuierlich für 96 h inkubiert. Parameter, die aus der Dosis-Wirkungs-Kurve beschafft wurden, werden ebenfalls angezeigt. (B) Die Gleichung, Variablen, Anfangsparameter und Abhängigkeiten, zusammen mit den Beschreibungen von Definitionen und Werten. (C) Fügen Sie die Definitionen und Werte in die entsprechenden Panels in der Software ein. Das "f" gibt die % Zelllebensfähigkeit an (z. B. ist der Wert von "f" "90" bzw. "10" bei IC10 bzw. IC90). Der y0-Wert ist 100 und gibt die 100% Zelllebensfähigkeit der miRNA-Steuerung an, die transfizierte Zellen imitiert. Das "n" gibt den Hill-Typ-Koeffizienten (die Neigung eines Diagramms) an. Das "k" gibt die Konzentration von miRNA-107 Mimik an, die 50% des maximalen Effekts der miRNA-107-Mimik erzeugt (IC50). Das "R" gibt den verbleibenden nicht betroffenen Bruch (den Widerstandsanteil) an. (D) In diesem Bereich wird gezeigt, wie angepasste ICx-Werte basierend auf den Parametern (n, k und R) berechnet werden, die aus Gleichung 1 erfasst wurden. Der Prozentsatz (%) Die Zelllebensfähigkeit im Bedienfeld stellt "f" in Gleichung 1 dar und wird berechnet, indem der x-Wert jedes ICx von y0 (100) subtrahiert wird. Gleichung 2 in der Formelleiste der Kalkulationstabelle wird für die Berechnung des angepassten IC 10-Wertes als "=(((100-D3)/(D3-$B-5)))"(1/$B-3)*$B-4)" angegeben. Wenden Sie Gleichung 2 auf andere Zellen an, um andere ICx-Werte zu berechnen, indem Sie die linke Maustaste auf der ausgewählten Zelle (rote Farbe) drücken und auf die Zelle des IC 90-Werts nach unten ziehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Verifikation des direkten Zielgens einer miRNA von Interesse. Experimente beginnen mit der Entwicklung von Primern für das Klonen von 3' UTR. Primer werden für die Gradienten-PCR verwendet. (A) Die beste Glühtemperatur kann unter den sechs angegebenen Glühtemperaturen ausgewählt werden, um 3' UTR eines Gens zu verstärken. Als nächstes wird die Doppelverdauung mit Restriktionsenzymen durchgeführt und PCR-Produkte werden in Luziferase-Vektoren ligiert. (B) Luciferase-Vektoren, die 2 Reportergene, Grüfly und Renilla-Luziferase enthalten, können verwendet werden, um die Wechselwirkungen von miRNAs mit 3' UTR von mRNAs zu untersuchen. PCR-Einsätze werden in eine Region geklont, die dem Renilla-Reportergen flussabwärts liegt. Ligated Produkte wurden in kompetente Zellen umgewandelt und wuchs Zellen auf der LB Agarplatte. (C) Einzelne Kolonien (#1 bis #6) wurden in 50 l Reinstwasser aufgenommen und resuspendiert. Die E. coli Suspension wurde für die Kolonie PCR und Impfung verwendet. Colony PCR ist ein praktisches Werkzeug, um die besten Kolonien für die Impfung und Isolierung von Luziferase-Vektoren auszuwählen, die 3' UTR eines Gens beherbergen. (D) Für den Luziferase-Assay wurde miRNA-Kontrollmimik oder miRNA-107-Mimik mit einer 24-Well-Platte in PANC-1-Zellen mit Luziferase-Konstrukten transfiziert. (E) Dieses Panel zeigt die repräsentativen Rohdaten und die Berechnung des Verhältnisses von Renilla zu Galle nach Derdurchexegung des Luziferase-Assays zur Validierung eines SNCG-Gens als miRNA-107-Ziel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Screening der vorhergesagten Zielgene von miRNA-107. Das Screening von Wechselwirkungen zwischen miRNA-107 und 3' UTR der vorhergesagten Targets wurde in PANC-1-Zellen mit den Luziferase-Konstrukten durchgeführt. Basierend auf den negativen Auswirkungen von miRNA-107 auf die Zellproliferation wurden potenzielle Kandidatengene für die Klon- und Screening-Assays bestimmt. miRNA control mimimioder miRNA-107 mimic wurde in PANC-1-Zellen transfiziert, wobei Luziferasekonstrukte 3' UTR jedes ausgewählten Gens für 24 h enthalten. Das Verhältnis von Renilla zu Gune wurde berechnet und normalisiert auf der Grundlage der gemessenen Werte beider Luziferasen in PANC-1-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| entdeckung | Mirna | GAPDH |
| Komponenten | ||
| Master-Mix für sondenbasierte Echtzeit-PCR (2x) | 10 l | – |
| Master-Mix für farbstoffbasierte Echtzeit-PCR (2x) | – | 10 l |
| Sondenmischung (5x) | 4 l | – |
| GAPDH-Primer (je 1 M) | – | 4 l |
| Verdünnte cDNA (1:49) | 6 l | 6 l |
| Gesamtvolumen | 20 l | 20 l |
Tabelle 1: Bedingungen für eine spezifische miRNA- und GAPDH-Detektion durch die Echtzeit-PCR in dieser Studie.
| Komponenten | 1x Reaktion | 7x Reaktion |
| 5x Puffer | 5 l | 35 l |
| dNTP-Mischung (je 2,5 mM) | 2 l | 14 l |
| Primer (je 10 m) | 1 L | 7 l |
| Genomische DNA (2 ng/l) | 16,5 l | 115,5 l |
| Polymerase | 0,5 l | 3,5 l |
| Gesamtvolumen | 25 l | 175 l |
Tabelle 2: Zusammensetzung von PCR-Reaktionsgemmischen zur Amplifikation von 3' UTR in dieser Studie.
| Komponenten | 1x Reaktion |
| 10x Puffer | 5 l |
| PCR-Produkte oder Vektoren | PCR-Produkte: 25 L-Vektoren: 1-2 g |
| XhoI (oder AsiSI) Restriktionsenzym | 2 l |
| NotI-Restriktionsenzym | 2 l |
| Reinstwasser | x L |
| Gesamtvolumen | 50 l |
Tabelle 3: Bedingungen für die doppelte Verdauung von PCR-Produkten und Luziferase-Vektoren mit XhoI (oder AsiSI) und NotI-Enzymen in dieser Studie.
| Komponenten | 1x Reaktion |
| 10x Puffer | 2 l |
| Vektoren (doppelt verdaut) | 50 ng |
| PCR-Produkte (Einfügen) | x L |
| Ligase | 200 U |
| Reinstwasser | y -L |
| Gesamtvolumen | 20 l |
Tabelle 4: Ligationsreaktionen von doppelt verdauten PCR-Produkten und luziferase Vektoren mit der DNA-Ligase in dieser Studie.
Ergänzende Abbildung 1: Ableitung von Gleichung 2 aus Gleichung 1. Gleichung 2 wird aus Gleichung 1 für die Berechnung der angepassten ICx-Werte abgeleitet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Primerinformationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strategien zur Bestimmung von gutgläubigen miRNA-Zielen mit den Funktionen einer miRNA von Interesse sind für das Verständnis mehrerer Rollen von miRNAs unverzichtbar. Die Identifizierung von miRNA-Zielgenen kann eine Richtschnur für die Interpretation der von miRNAs in einer Zelle modulierten Zellsignalereignisse sein. Eine Enthüllung funktionell wichtiger Zielgene von miRNAs kann das grundlegende Wissen zur Entwicklung einer miRNA-basierten Therapie bei Krebs liefern.
Mehrere Methoden wie Mikroarrays, kleine RNA-Bibliothekssequenzierung, tiefe Sequenzierung, Reverse-Transkriptase in situ PCR und Nördliches Blotting können angewendet werden, um miRNA-Expressionsniveaus mit gesamter RNA-isoliert aus Zelllinien und Geweben zu untersuchen24, 25,26. Die Hochdurchsatzprofilierung von miRNAs kann wertvolle Einblicke in die genetischen Grundlagen der Krebsentwicklung liefern. Der sondenbasierte miRNA-Assay wird häufig zur Validierung von Profiling-Daten verwendet und eignet sich auch für die Überprüfung einiger miRNAs von Interesse. Die Messung der reifen miRNA-Werte mit der sondenbasierten Echtzeit-PCR ist jedoch begrenzt, um festzustellen, ob reife miRNAs bei den Transkriptionsschritten oder durch die Regulierung der Reifung reguliert werden. Dye-based Real-Time PCR und Northern Blotting wurden eingeführt, um miRNA-Vorläufer-Spiegel27,28zu messen. Die Messung von miRNA-Vorstufen zusammen mit reifen miRNA-Spiegeln kann darüber hinaus die Information darüber liefern, wie reife miRNA-Spiegel reguliert werden. Darüber hinaus ist ein umfassendes Verständnis der Regulation von miRNA-Spiegeln für die Entwicklung von miRNA-basierten therapeutischen Ansätzen unerlässlich.
Zellproliferations-Assays wie der Tetrazolium-basierte MTT-Assay sind anwendbar, um die Wirkung von Behandlungsreagenzien wie miRNA-Mimik zu untersuchen. Da der MTT-Assay die zellmetabolischen Aktivitäten auf der Grundlage der Tetrazoliumreduktion durch zelluläre Oxidoreduktasen widerspiegelt, ist es möglich, das Fehlen einer Korrelation zwischen dem MTT-Assay und der Gesamtzellzahl19zu beobachten. Alternativ ist der SRB-Assay als reproduzierbarer Zellenumerationstest18,19verfügbar. Die Messung der Menge an SRB-Farbstoff, die an trichloresessigsäurefeste Proteine gebunden ist, kann die Gesamtzellzahl29darstellen. Darüber hinaus kann der SRB-Assay in diesem Protokoll angewendet werden, um mehrere miRNA-Mimiks sowie Anti-Krebs-Medikamente mit 384-Well-Platten zu untersuchen. Der SRB-Test weist jedoch Einschränkungen wie das manuelle Screening auf. Darüber hinaus ist dieser Test für nicht anhaftende Zellen nicht verfügbar. Da miRNAs auch eine entscheidende Rolle bei hämatologischen Malignitäten wie Lymphom und Myelom30spielen, ist eine effiziente Überwachung der Zellproliferation erforderlich, um die Funktionen von miRNAs zu entwirren. Carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) kann die nicht anhaftenden Zellen intrazellulär kennzeichnen. CFSE wird verwendet, um die Erzeugung von vermehrenden Zellen durch Durchflusszytometrie31zu überwachen. Darüber hinaus können miRNAs Invasion, Metastasierung und programmierten Zelltod beeinflussen. Daher werden andere experimentelle Techniken, die mit diesem Protokoll kombiniert werden, praktischer für das richtige Verständnis der miRNA-Funktionen sein, die letztlich dazu beitragen, multitudinous biologisch relevante Ziele von miRNAs zu identifizieren.
Die Berechnung der halbmaximalen hemmenden Konzentration (IC50) ist eine wichtige Methode nicht nur für die miRNA-Studien, sondern auch für die Wirksamkeitsbewertung anderer Krebsmedikamente. IC 50-Werte können verwendet werden, um die möglichen Auswirkungen mehrerer miRNAs oder Anti-Krebs-Medikamente auf die Zellproliferation zu vergleichen. Es wurde gezeigt, dass die Kombination einer miRNA-basierten Therapie mit Anti-Krebs-Medikamenten eine außergewöhnliche Gelegenheit bieten kann, die Wirksamkeit des Krebsmedikaments zu verbessern. Darüber hinaus kann die Kombination von miRNAs mit Anti-Krebs-Medikamenten ein neuartiger Ansatz sein, um Chemoresistenz zu überwinden32,33. Für die Bewertung der Kombinationseffizienz ist es vorteilhaft, angepasste ICx-Werte auf Basis unseres Protokolls zur Bewertung des Kombinationsindex (CI) zu berechnen, der die quantitative Abschätzung von Synergismus oder Antagonismus 33 ermöglicht33, 34.
Intrazelluläre Signalnetze können durch anomal ausgedrückte miRNAs bei zahlreichen Krankheiten, einschließlich Krebserkrankungen, weitgehend desorganisiert werden. Signalnetze, die von miRNAs faltig beeinflusst werden, sind jedoch noch weitgehend unbekannt, da der geringe Anteil der Zielgene experimentell validiert wurde und Zielgene auch durch nicht-kanonisch reagierende miRNAsreguliertwerden 35 . Nichtsdestotrotz sind unsere Strategie und unser Protokoll zuverlässige Methoden zur Entschlüsselung der zellulären Mechanismen von miRNAs. Darüber hinaus kann unser Protokoll weiter erweitert werden, um die Kombination von miRNAs und anderen Krebsmedikamenten umzusetzen und zu bewerten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom Basic Science Research Program von der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, die vom Bildungsministerium (2017R1D1A3B03035662) gefördert wurde. und Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6x DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8x Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1,000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
