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Genetics

Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais

doi: 10.3791/59628 Published: May 21, 2019

Summary

Este protocolo utiliza uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR), um ensaio de sulforhodamina B (SRB), 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) clonagem e um ensaio de luciferase para verificar os genes alvo de um miRNA de interesse e para compreender as funções de miRNAs.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) são pequenas RNAs regulatórias que são reconhecidas para modular inúmeras vias de sinalização intracelular em várias doenças, incluindo cânceres. Esses pequenos RNAs regulatórios interagem principalmente com as 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) de seus RNAs de mensageiro alvo (mRNAs), resultando na inibição dos processos de decodificação de mRNAs e no aumento das degradações de mRNA alvo. Com base nos níveis de expressão e nas funções intracelulares, os miRNAs são capazes de servir como fatores regulatórios de mRNAs oncogênicas e supressoras de tumores. A identificação de genes-alvo de boa-fé de um miRNA entre centenas ou mesmo milhares de alvos computacionalmente previstos é um passo crucial para discernir os papéis e os mecanismos moleculares básicos de um miRNA de interesse. Vários programas de predição de alvo de miRNA estão disponíveis para pesquisar possíveis interações de miRNA-mRNA. No entanto, a questão mais desafiadora é como validar genes alvo diretos de um miRNA de interesse. Este protocolo descreve uma estratégia reprodutível de métodos chaves em como identificar alvos de miRNA relativos à função de um miRNA. Este protocolo apresenta um guia prático em procedimentos passo a passo para descobrir níveis de miRNA, funções e mRNAs alvo relacionados usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real baseada em sonda (PCR), o ensaio de sulforhodamina B (SRB) após uma transfecção mímica de miRNA , geração da curva da dose-resposta, e ensaio do luciferase junto com a clonagem de 3 ' UTR de um gene, que seja necessário para a compreensão apropriada dos papéis de miRNAs individuais.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) são os pequenos RNAs regulatórios que modulam principalmente o processo de tradução e degradação de RNAs mensageiro (mRNAs), reagindo às 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) em genes alvo de boa-fé1. A expressão de miRNAs pode ser regulada por mecanismos transcricional e pós-transcricional. O desequilíbrio desses mecanismos reguladores traz níveis de expressão miRNAs descontrolados e distintos em inúmeras doenças, incluindo os cânceres2. Um único miRNA pode ter interações múltiplas com mRNAs diversos. Correspondentemente, um mRNA individual pode ser controlado por vários miRNAs. Portanto, as redes de sinalização intracelular são intrinsecamente influenciadas por miRNAs distintivamente expressas pelas quais distúrbios fisiológicos e doenças podem ser iniciados e deteriorados2,3,4 , 5. º , 6. embora a expressão alterada de miRNAs tenha sido observada em vários tipos de cânceres, os mecanismos moleculares que modulam os modos de células cancerosas em conjunto com miRNAs ainda são largamente desconhecidos.

A acumulação de evidências tem sido evidenciando que os papéis oncogênicos ou supressores de tumores de miRNAs dependem dos tipos de cânceres. Por exemplo, ao segmentar a caixa de os O3 (FOXO3), o miR-155 promove a proliferação celular, metástase e quimiorresistência do câncer colorretal7,8. Ao contrário, a limitação da invasão da pilha do glioma é induzida por miR-107 através da regulação da expressão9da proteína 2 do homólogo do entalhe do locus neurogênica (NOTCH2). A avaliação das interações de miRNA-Target em conexão com as funções de miRNA é uma parte indispensável para entender melhor como os miRNAs regulam vários processos biológicos em Estados saudáveis e doentes10. Além disso, a descoberta de alvo (s) de bona fide de miRNAs pode ainda fornecer uma estratégia aperfeiçoada para uma terapia baseada em miRNA com vários medicamentos anticancerígenos. No entanto, o principal desafio no campo dos miRNAs é a identificação de alvos diretos de miRNAs. Aqui, métodos detalhados são apresentados como abordagens experimentais reprodutíveis para a determinação do gene alvo de miRNA. O projeto experimental bem-sucedido para a identificação do alvo de miRNA envolve várias etapas e considerações (Figura 1). A comparação dos níveis de miRNA maduros nas células tumorais e nas células normais pode ser um dos procedimentos comuns para selecionar um miRNA de interesse (Figura 1a). O estudo funcional de um miRNA selecionado para detectar os efeitos de um miRNA na proliferação celular é importante para estreitar a lista dos melhores alvos potenciais candidatos de um miRNA de interesse (Figura 1b). Com base nas funções experimentalmente validadas de miRNAs, é necessária uma revisão sistemática da literatura e da base de dados em empresa com um programa de predição de alvo de miRNA para pesquisar as informações mais relevantes sobre as funções genéticas (Figura 1C). A identificação de genes alvo reais de um miRNA do interesse pode ser conseguida implementando experiências tais como o ensaio do luciferase junto com a clonagem de 3 ' UTR de um gene, PCR do tempo real, e mancha ocidental (Figura 1D). O objetivo do protocolo atual é fornecer métodos abrangentes de experimentos principais, a reação em cadeia da polimerase em tempo real baseada em sonda (PCR), o ensaio de sulforhodamina B (SRB) após uma transfecção mímica de miRNA, geração de curva de dose-resposta e o ensaio de luciferase juntamente com a clonagem de 3 ' UTR de um gene. O protocolo atual pode ser útil para uma compreensão melhor das funções de miRNAs individuais e da implicação de um miRNA na terapia de cancro.

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Protocol

1. maduro MicroRNA (miRNA) análise de expressão

  1. Síntese de DNA complementar maduro de miRNA (cDNA)
    1. Adicionar 254 ng de RNA total e 4,5 μL de misturas de desoxirribonuclease I (DNase I) e, em seguida, adicionar água ultrapura em tubos de tiras de PCR para fazer até 18 μL (Figura 2a). Prepare a reação para cada amostra de RNA total purificada de várias linhas celulares usando quantidade suficiente de misturas de DNase I com base no número total de reações.
      Nota: As misturas de DNase I são compostas por DNase I (1,8 μL), inibidor da ribonuclease (0,3 μL) e 25 mM MgCl2 (2,4 μL). Para obter o RNA total de forma revisível, um método de extração baseado em coluna foi aplicado em vez de usar um método de extração com base em fenol-clorofórmio. Foi relatado que o rendimento de extração de alguns miRNAs pode ser variado dependendo do número de células ao usar um método de extração baseado em fenol-clorofórmio11,12.
    2. Incubar os tubos em um ciclador térmico. Executar os tubos por 10 min a 37 ° c, e calor-inactivate DNase I por 5 min incubação em 90 ° c. Coloque imediatamente os tubos no gelo após a incubação.
    3. Transferência 7,1 μL de DNase eu tratei o RNA total em 2 jogos de tubos novos e adiciono então 1,5 μL de primers antisense para o gene do desidrogenase do glyceraldehyde-3-fosfato (GAPDH) (Figura 2b).
      Nota: A quantidade de RNA total para a síntese do cDNA transforma-se 100 ng nesta etapa. A concentração de estoque de primers antisense GAPDH é de 10 μM. a adição de primers antisense GAPDH é para a geração de cDNAs GAPDH usando um método de primer específico para genes.
    4. Incubar os tubos usando um termociclador. Começar a 80 ° c durante 5 min seguido da reacção a 60 ° c durante 5 min. Coloque imediatamente os tubos no gelo após a incubação.
    5. Adicionar 3,4 μL de misturas de enzimas de transcrição reversa (RT) em cada reação (Figura 2b). As misturas enzimáticas RT são compostas por 100 mM de desoxirribonucleotídeo trifosfatos (0,15 μL), tampão 10x RT (1,5 μL), inibidor de ribonuclease (0,75 μL) e enzima de transcrição reversa (1 μL). Prepare quantidade suficiente de misturas com base no número total de reações.
    6. Adicionar 3 μL de primers de 5x RT para um miRNA específico em cada reação (Figura 2b).
      Nota: O volume total é de 15 μL para cada reação.
    7. Executar os tubos usando um termociclador. Começar a 16 ° c durante 30 min seguido da reacção a 42 ° c durante 30 min e, finalmente, a 85 ° c durante 5 min. Segure a 4 ° c para qualquer tempo restante (Figura 2b). Os cDNAs único-encalhado são gerados nesta etapa para um miRNA específico e um gene de GAPDH no mesmo tubo.
  2. Reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) e análise de dados
    1. Diluir cada cDNA com água ultrapura na relação 1:49.
    2. Prepare as misturas de reacção para um miRNA específico e GAPDH (tabela 1). Para a detecção de um determinado miRNA e GAPDH, configurar reações triplicado para cada amostra de cDNA.
    3. Realize a PCR em tempo real e a análise de dados (Figura 2C). Analise os dados utilizando o método comparativo CT 13,14.

2. MicroRNA (miRNA) MimicTransfection

Nota: o miRNA-107 é seleccionado a partir do passo 1. Desde que miRNA-107 é para baixo-regulado em pilhas do tumor comparado com as pilhas normais, pode-se especficar que miRNA-107 é um miRNA supressor do tumor. No caso de um Mirna que seja regulado em pilhas do tumor comparado com as pilhas normais (por exemplo, Mirna-301), os oligonucleotídeos antisense de encontro a Mirna-301 podem ser aplicados para as etapas 2, 3, e 4.

  1. Conte as células com um dispositivo de câmara de contagem e placa as células em uma placa de 96 bem. A densidade celular é de 2 x 103 células/100 μl para cada poço. Não use meios de cultura celular contendo penicilina-estreptomicina (P/S) porque P/S pode reduzir a eficiência do transfection.
  2. Prepare um conjunto de misturas de transfecção para transfecção as células em várias concentrações finais de mímica de controle de Mirna e mímica de Mirna-107 no dia seguinte (Figura 3).
    1. Do estoque (concentração de 25 μM) do mímico do controle de miRNA ou do mímico de miRNA-107, diluir e adicionar a quantidade correspondente de imitações do controle ou de miRNA-107 imitam nos meios de soro reduzidos junto com um reagente do transfection usando os tubos do microcentrifugador (Figura 3a). Misture suavemente o oligo contendo misturas usando uma micropipeta. A quantidade total de oligos (controle mímico de miRNA + mímica de miRNA-107) deve ser mesma em cada poço. Os poços em branco incluem 100 μL de meios de cultura celular e meios séricos reduzidos contendo um reagente de transfecção sem células.
  3. Depois de uma incubação de 10 min em uma capa de cultura celular, misture suavemente o oligo contendo misturas novamente e, em seguida, adicione 50 μL das misturas em cada poço. Mantenha as células transfectadas em uma incubadora de cultura celular. Substitua o reagente do transfection que contem meios com os meios de cultura frescos da pilha que contêm o soro fetal bovino (FBS) e o P/S após a incubação de 6-12 h. Incubar ainda mais as células para 72 h. A duração total do tratamento do mímico de miRNA é 96 h.

3. ensaio de sulforhodamina B (SRB)

  1. Fixação celular
    1. Retire o meio de cultura celular em cada poço da placa e preencha prontamente 100 μL de ácido tricloroacético a 10% (TCA) em cada poço. Aspirar cuidadosamente os meios de cultura celular de cada poço para evitar qualquer dano celular e descolamento do fundo.
      Nota: Prepare 40% TCA adicionando 20 g de pó de TCA em 50 mL de água destilada. De 40% de TCA, faça 10% TCA diluindo 40% TCA com água destilada em uma relação da diluição 1:3.
    2. Mantenha a placa contendo 10% de TCA num frigorífico (4 ° c) durante 1 h.
    3. Lave a placa várias vezes submergindo na cuba de água e seque-a. Retire o excesso de água do interior dos poços tocando na placa até que não haja água deixada em poços. Deixe a placa em um banco do laboratório para secá-la antes de ir à etapa seguinte.
  2. Coloração celular
    1. Pipeta 50 μL de 0,4% de solução de SRB em cada poço, incluindo poços em branco. Agitar suavemente a placa até 0,4% SRB solução consistentemente cobre a parte inferior dos poços.
      Nota: Prepare e use 0,4% de solução de SRB adicionando 0,4 g de pó de SRB em 100 mL de ácido acético a 1%. Agitar a solução cuidadosamente para misturá-lo. Enrole o frasco de 0,4% de solução de SRB em um material protetor claro tal como a folha de alumínio. Armazene 0,4% de solução de SRB em um refrigerador.
    2. Após a incubação para 40 min a 60 min, lave a placa enxaguando-a com 1% de ácido acético. Lave a placa até que o corante não acoplado seja totalmente lavado (Figura 3B).
    3. Deixe a placa em um banco do laboratório para secá-la antes de ir à etapa seguinte.
      Nota: A placa deve ser completamente seca antes de ir para o passo 3,3.
  3. Medição de absorvância
    1. Pipete 100 μL de solução base tris (10 mM) para os poços correspondentes, incluindo poços em branco. Mantenha a placa em uma coqueteleira por 10 min. Meça a absorvância em 492 nm.

4. geração de uma curva dose-resposta

  1. Analise os dados do ensaio SRB em uma planilha. Subtrair a absorvência em branco dos valores de absorvância de cada grupo e calcular a média (AVE) e o desvio padrão (STD) dos valores de absorvência de cada grupo.
  2. Calcular a percentagem de absorvância média (AVE%) e a do desvio padrão (STD%) de cada grupo utilizando valores de absorvância do ensaio SRB.
    Nota: O grupo tratado mímico de controle AVE% de miRNA é de 100%. Calcule o STD% usando a seguinte fórmula: STD% = (STD de cada grupo/AVE absorbância de controle imitado grupo tratado) x 100.
  3. Importe os dados brutos, incluindo as concentrações de tratamento, AVE% e STD% para o software, alinhando verticalmente esses dados. Como o log 0 não está definido, defina a primeira concentração do eixo X para um valor que está próximo de 0 (por exemplo, 0, 1).
  4. Clique em criar guia de gráfico e escolha barras de erro de dispersão simples. Selecione colunas de planilha como valores de símbolo e clique em Avançar. No painel de formato de dados, selecione pares XY e clique em Avançar. Selecione as colunas de dados correspondentes no painel de dados selecionado. Clique no botão concluir para criar o gráfico.
    Nota: O eixo X representa as concentrações, o eixo Y indica o percentual de absorbância média de cada concentração (AVE%), e as barras de erro apontam a porcentagem de desvio padrão de cada concentração (STD%).
  5. Clique duas vezes no eixo X para modificar o tipo de escala e o dimensionamento do eixo. Altere o tipo de escala de linear para log. Modifique o número do intervalo de início e término para 0, 1 e 200, respectivamente.
  6. Clique com o botão direito do mouse em qualquer gráfico de dispersão, escolha ajuste de curva e vá para a subcategoria definida pelo usuário. Selecione curva dose-resposta, clique em Avançar botões e, em seguida, clique em Concluir botão. A curva dose-resposta é gerada agora junto com uma aba do relatório (figura 4a).
    1. Para inserir a equação 1 no software para a geração de uma curva de dose-resposta, clique na guia análise e selecione Assistente de regressão. Vá para definido pelo usuário na categoria de equação e, em seguida, clique no botão novo . Insira a equação 1, variáveis, parâmetros iniciais e restrições nas caixas em branco correspondentes (Figura 4B, C). Clique em Adicionar como botão e defina o nome da equação como curva dose-resposta. O nome da equação agora é gerado na subcategoria usuário-definido na categoria de equação. f indica a porcentagem de viabilidade celular (% de viabilidade celular) na equação 1.

Equação 1
Equation 1

  1. Vá para a guia relatório e, em seguida, verifique os valores n, k e R.
    Nota: y0 indica 100% de viabilidade celular do grupo tratado mímico de controle de Mirna, n indica o coeficiente do tipo colina (a inclinação de um gráfico), k indica a concentração de mímica de mirna-107 que produz um 50% do efeito máximo do mímico de mirna-107 (a metade concentração inibitória máxima, IC50), e R indica a fração residual não afetada (a fração de resistência)15. A equação utilizada para gerar uma curva dose-resposta reconhece o intervalo de y0 a R (se houver) como 100% (figura 4a). Portanto, é necessário adquirir o valor k (IC50) ajustado que é calculado com base no intervalo de y0 para um valor de zero (figura 4a). K ajustado (IC50) juntamente com outros valores de icx (por exemplo, IC10 através de IC90) pode ser obtido usando a equação 2, que é derivada da equação 1. A derivação da equação 2 da equação 1 é indicada na Figura 1 suplementar.

Equação 2
Equation 2

  1. Clique duas vezes no botão esquerdo do mouse na célula na qual a equação 2 é aplicada. Usando a equação 2 e os parâmetros da curva dose-resposta gerada, está disponível para calcular os valores ajustados de ICx, variando de IC10 a IC90 (Figura 4D).
  2. Insira o sinal de igual seguido pela fórmula começando com um colchete na célula. Ao inserir a fórmula, corrija o valor de n, k e R como as referências de célula absoluta adicionando o sinal de cifrão à coluna e linha correspondentes, para que esses valores fixos não sejam alterados ao preencher automaticamente a fórmula até as linhas (Figura 4D). Alternativamente, os valores ajustados podem ser calculados manualmente usando a equação 2.
    Nota: IC90 valor não é determinado porque o valor de R é maior que 10. Além disso, se o valor R for superior a 20, o valor de IC80 também não é determinado (Figura 4D).

5. verificação do gene alvo direto de um MicroRNA de interesse

Nota: Após a realização do experimento funcional, como o ensaio SRB, o miRNA-107 é confirmado como um tumor supressor de miRNA e é altamente viável que o miRNA-107 atinge diretamente os oncogenes. Verifique a lista de todos os genes-alvo previstos usando um programa de previsão de destino miRNA, como o TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/), e, em seguida, restrinja-se a potenciais alvos candidatos com base na função de um gene em bancos de dados, incluindo PubMed e Para.

  1. Primer design para a clonagem de 3 ' região não traduzida (UTR)
    1. Coloque o nome de um gene em GeneCards (https://www.genecards.org/) e clique no símbolo de um gene. Avalie o navegador do genoma do Ensemble, clicando em Ensemble ID de um gene e, em seguida, clique em transcripts ID na tabela de transcrição. Depois disso, clique em exons existia na lista de exibições baseadas em transcrição à esquerda.
    2. Copie as sequências de nucleotídeo do 3 ' UTR e cole-o no programa de design da cartilha. Copie as sequências novamente deste programa e cole-a em um processador de texto. Verificar a presença de seqüências de ligação de miRNA, bem como a presença de enzimas de restrição locais utilizados para a clonagem.
      Nota: Se não existirem sítios de reconhecimento enzimático de restrição dentro do 3 ' UTR, as enzimas de restrição seleccionadas para a clonagem podem ser utilizadas para a próxima etapa.
    3. No programa do projeto da primeira demão, aceite as 3 ' seqüências de UTR e comece projetar os primers para diante e reverso com a seguinte circunstância. Comprimento: 20-30 nucleotides, TM: 45-58 ° c, GC%: 40-60%. A diferença entre os valores de TM dos dois primers deve ser inferior a 5 ° c. As sequências de primer utilizadas neste estudo são fornecidas na Figura 2 suplementar. Adicionar seqüências de reconhecimento de enzima de restrição, bem como 4 nucleotídeos aleatórios para os primers projetados.
  2. PCR do inclinação
    1. Prepare 25 μL de misturas de reação de PCR, incluindo primers projetados por uma temperatura de recozimento (tabela 2). Prepare quantidade suficiente de misturas com base no número total de reações. Misture a solução introduzindo pipetagem e adicione 25 μL de misturas de reacção em cada tubo. Centrifugue os tubos por alguns segundos.
    2. Execute 35-40 ciclos do PCR da etapa da desnaturação à etapa da extensão. Configurar o ciclo de PCR como as seguintes etapas: 98 ° c para 1 minuto (1 ciclo, etapa da ativação do polymerase), 95 ° c para 10 s (etapa da desnaturação), 45 ° c-68 ° c para 30 s (etapa do recozimento), 68 ° c (etapa da extensão, 10 s-1 minuto por 1000 BP), 68 e, finalmente, arrefecer até 4 ° c.
    3. Execute os produtos do PCR e verifique as faixas em um gel do agarose de 1% com escadas do ADN. Encontre a melhor temperatura de recozimento (Figura 5a). Amplificar 3 ' UTR de um gene novamente usando a melhor temperatura de recozimento para a próxima etapa.
  3. Digestão dobro
    1. Faça as misturas de reação, incluindo duas enzimas de restrição, XhoI (ou AsiSI) e NotI, em um tubo (tabela 3). Incubar as misturas para 3-4 h usando um banho de água (37 ° c).
    2. Execute os produtos digeridos duplos em um gel de agarose de 1% e, em seguida, corte as bandas luz UV. No caso de vectores de luciferase, antes de funcionar em gel, reaja vetores digeridos duplos com 10 U de fosfatases alcalinas por mais 1 h para evitar a reconstituição durante a etapa de ligadura.
    3. Purify os produtos digeridos dobro do PCR e os vetores do luciferase das bandas extirpada.
  4. Ligadura de produtos do PCR nos vetores do luciferase
    1. Fazer 20 μL de misturas de reacção de ligadura, incluindo a ligase de ADN (tabela 4).
      Nota: A relação molar do produto do PCR (inserção) ao vetor do luciferase pode ser 3:1. 1:1 ou 2:1.
    2. Centrifugue momentaneamente o tubo para 10-15 s e incubar em 16 ° c durante a noite usando um Thermal cycler.
      Nota: Alternativamente, o tubo pode ser incubado a 4 ° c por 2-3 dias para a ligadura. Nesta etapa, o inserto de PCR será clonado na região posicionada a jusante de um gene repórter de renilla (Figura 5b). A ligação de miRNAs para o clonado 3 ' UTR de um gene pode diminuir na atividade de renilla. Firefly luciferase é para a normalização dos níveis de expressão de renilla.
  5. Transformação e PCR da colônia
    1. Adicione as misturas de ligadura (3-5 μL) no tubo que contém as células competentes. Bata suavemente no tubo e mantenha-o no gelo (20 min).
      Nota: descongelar as células competentes no gelo antes de adicionar as misturas de ligadura.
    2. Transfira rápida e suavemente o tubo para um bloco de calor. Após um choque térmico (42 ° c por 30 s-1 min), coloque o tubo no gelo por 20 min.
    3. Espalhe as células competentes na placa de agar Luria-Bertani (LB). Cresça pilhas competentes em uma incubadora (° c 37) durante a noite.
      Nota: A ampicilina (50-100 μg/mL) está contida na placa de agar.
    4. Escolha uma colônia individual e ressuscitem e . coli em um dos tubos de 8 tiras contendo água ultrapura. Repita este passo para ressuscidar E. coli de 4-8 colônias selecionadas aleatoriamente (Figura 5C).
    5. Transfira 25 μL de suspensão de E. coli para outro conjunto de tubos de 8 tiras. Agora, existem 2 conjuntos de tubos de E. coli suspensão.
      Nota: Um tubo é para a colônia PCR e outro é para inoculação. A suspensão de E. coli para inoculação pode ser temporariamente armazenada a 4 ° c (Figura 5C).
    6. Realize o PCR da colônia usando a suspensão de E. coli . Esta etapa é determinar se as colônias contêm uma inserção. Selecione as melhores colônias para inocular e isolar vetores de luciferase abrigando 3 ' UTR de um gene (Figura 5C).
      Nota: Repita o passo 5.1-5.5 para cada 3 ' UTR de genes seleccionados. Siga a condição da reação do PCR mostrada na tabela 2 substituindo o ADN genomic com suspensão de E. coli .
  6. Ensaio de luciferase
    1. Prepare uma placa de 24 poços. Use 1-2 x 104 células em 500 μL de mídia de cultura de células para cada poço. Não use meios de cultura da pilha que contêm P/S para o transfection porque usar P/S pode reduzir a eficiência do transfection.
    2. Transfect 50 ng de vetores de luciferase nas células com mímica de controle ou um mímico específico de miRNA usando um reagente de transfecção (Figura 5D). Se a triagem dos efeitos de uma mímica específica de miRNA em mais de uma concentração, manter a quantidade total de oligos mesmo em cada poço (ver passo 2).
    3. Lave o interior de poços duas vezes usando fosfato tampão salina (PBS) no dia seguinte.
    4. Aplique 200 μL de reagente de Lise nos poços e realize suficientemente a lise celular antes de medir a atividade da luciferase.
      Nota: Mantenha a placa em uma placa de agitação pelo menos 15 min.
    5. Transferir 5-10 μL de lisado de células para o novo tubo e adicionar 100 μL de reagente I. misture imediatamente a solução introduzindo pipetagem e leia a atividade da luciferase do vagalume utilizando um luminômetro.
      Nota: Leia a atividade luciferase Firefly para 10-15 s.
    6. Adicionar 100 μL de reagente II no mesmo tubo e, em seguida, misturar por pipetagem duas vezes. Leia a atividade de renilla luciferase para 10-15 s usando um luminômetro. Repita a etapa 5.6.5 e 5.6.6 para cada amostra.
    7. Calcule a proporção de renilla para vaga-lume (Figura 5E).
      Nota: A atividade do Firefly representa a eficiência do transfection de construções do luciferase nas pilhas.

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Representative Results

A confirmação bem-sucedida e precisa dos níveis de miRNA é importante para a interpretação dos dados pelos quais a classificação de miRNAs é possível com base nos papéis esperados de miRNAs no desenvolvimento e progressão de uma doença. Os níveis de miRNA-107 e miRNA-301 foram medidos em três linhagens de células pancreáticas utilizando a PCR quantitativa baseada em sonda. A síntese de cDNAs de ambos um miRNA específico e um gene de referência na mesma reação pode aumentar a reprodutibilidade dos dados. Panc-1 e capan-1 são linhas celulares do adenocarcinoma ductal pancreatic humano, quando hpne for uma linha de pilha do duto do pâncreas imortalizado transdued com um vetor da expressão retroviral que abrigando o gene da transcriptase reversa do telomerase humano (htert). o miRNA-107 foi significativamente reduzido nas células PANC-1 e CAPAN-1 em comparação com as células HPNE (Figura 2C). Os níveis de miRNA-301 foram significativamente regulados em células PANC-1 e CAPAN-1 em comparação com células HPNE. Estes resultados são de acordo com relatórios precedentes que Mirna-107 é inativado epigeneticamente em pilhas de cancro pancreatic e que os níveis de Mirna-301 são mais elevados em pilhas ductal pancreáticas do adenocarcinoma do que pilhas ductal pancreatic normais16, a 17.

O ensaio 3-(4, 5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) reflete as atividades metabólicas celulares. Esta característica tem uma oportunidade significativamente mais elevada de adquirir a falta da correlação entre o ensaio de MTT e o número de pilha total desde que as condições do ensaio que incluem um tipo de reagentes do tratamento podem severamente afetar a redução enzimática do tetrazólio 18,19. Para superar essa limitação, aplicou-se o ensaio de sulforhodamina B (SRB) para medir os efeitos do miRNA-107 na proliferação celular para identificar as potenciais funções biológicas de miRNA-107. A quantidade de corante dependente de SRB nas células fixas pode ser usada como um substituto da alteração no número total de células. O ensaio do SRB neste estudo demonstra claramente que a proliferação de células PANC-1 diminuiu após uma transfecção mímica de miRNA-107 (Figura 3). A concentração de miRNA-107 que causou uma inibição de 50% de viabilidade celular (IC50) foi determinada pela geração de uma curva dose-resposta. Além disso, a aplicação da equação 2 é benéfica para o cálculo de todas as possíveis concentrações inibitórias (ICx) para avaliar precisamente os efeitos do miRNA-107 (Figura 4).

O exame da correlação entre os níveis de miRNAs e mRNAs é uma forma efetiva para a identificação do alvo de Mirna, pois miRNAs pode regular os níveis de gene alvo por meio da degradação de mRNAs2,20. No entanto, como o miRNAs também atua no nível translacional sem afetar os processos de degradação do mRNA, a validação experimental das interações do gene miRNA-alvo utilizando o ensaio luciferase é um passo essencial. A principal vantagem de um ensaio de luciferase é que este ensaio pode descartar as alterações dos níveis de mRNA regulados pela degradação de mRNAs21. Conseqüentemente, a clonagem de 3 ' UTR de genes previstos do alvo é uma etapa importante para identificar genes reais do alvo de um miRNA do interesse conjuntamente com o PCR em tempo real e os experimentos ocidentais do borrão. Uma utilização eficiente dos vetores de repórter duplo permite adquirir dados experimentais inequívocos, uma vez que a mensuração dos níveis de repórter de controle pode reduzir as variações experimentais, como o número de células. Os processos de normalização dos dados do ensaio de luciferase adquiridos a partir de vetores contendo 3 ' UTR de um gene de sinucleína Gamma (sncg) são mostrados na Figura 5E. Além disso, a triagem de 11 potenciais alvos previstos do Mirna-107 mostra claramente que apenas o sncg, um regulador positivo do crescimento da célula tumoral22,23, interage diretamente com o Mirna-107 em células Panc-1 (Figura 6). Este achado indica que o miRNA-107 pode regular negativamente a proliferação de células PANC-1 modulando a expressão SNCG.

Figure 1
Figura 1: delineamento experimental para identificação do alvo de Mirna. Este diagrama mostra o fluxo de um experimento experimental que ajuda a identificar o alvo de um miRNA. (A) a análise dos níveis de expressão de Mirna maduros e a seleção de um Mirna de interesse. (B) três experimentos, como o transfection mímico de Mirna, o ensaio SRB e a geração de uma curva dose-resposta podem ser conduzidos para o estudo funcional de miRNAs selecionados. (C) para restringir os genes alvo de um Mirna de interesse, é benéfico verificar a informação e a função dos genes-alvo previstos em programas de predição de alvos, PubMed e genecard. (D) depois de detectar alguns potenciais candidatos a genes alvo de um Mirna de interesse, é viável realizar experimentos práticos, como a clonagem de 3 ' UTR de mRNAs, ensaio luciferase, PCR em tempo real, e Western blot para finalmente provar o alvo direto genes de um miRNA de interesse. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: análise da expressão de Mirna madura. (A) Adicionar o RNA total de cada linha celular (Panc-1, capan-1 e hpne), misturas de DNase I e água ultrapura em tubos de strip rotulados. O volume total em cada tubo é de 18 μL (PANC-1 e CAPAN-1 são linhagens de células cancerosas pancreáticas, enquanto HPNE é uma linha celular normal do duto pancreático). (B) transferir 7,1 μL de DNase eu tratei misturas em 2 conjuntos de novos tubos de strip, e 1,5 μL de primers antisense para um gene GAPDH também é adicionado em cada tubo. Incubar as tiras-tubos do PCR em condições indicadas da reação. Em seguida, adicione misturas de enzimas RT e primers 5x RT para um miRNA específico (miRNA-107 ou miRNA-301) em seus tubos designados e, em seguida, reincubar os tubos nas condições indicadas. Os cDNAs de uma única fita para um miRNA e um GAPDH específicos são gerados. (C) os níveis de mirna-107 e mirna-301 maduros foram determinados pela PCR em tempo real baseada em sonda utilizando o RNA total isolado das células Panc-1, capan-1 e hpne. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: transfecção mímica e o ensaio SRB. (A) o painel superior mostra a diluição do mímico do controle de Mirna e o mímico de mirna-107 para preparar misturas do transfection. A escala de concentrações finais do mímico de miRNA-107 é 0 nanômetro, 1 nanômetro, 5 nanômetro, 10 nanômetro, 25 nanômetro, 50 nanômetro, e 100 nanômetro. O volume total em cada coluna é para o transfection das pilhas em um poço de uma placa 96-well. O painel inferior mostra um exemplo de ampliação das misturas de transfecção para preparar quantidade suficiente de misturas para a transfecção das células em 4 poços em uma concentração indicada. Em seguida, adicione 50 μL de misturas em cada poço seguindo o formato sugerido para transfecting mímica do controle de miRNA com mímica de miRNA-107. Esta placa foi usada para o ensaio de SRB, que inclui a fixação da pilha, a mancha da pilha, e a medida da absorbância. (B) imagem real da placa 96-well que mostra as pilhas manchadas SRB. Esta imagem mostra claramente que o número de células PANC-1 diminui à medida que a concentração de miRNA-107 mímica aumenta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: geração de uma curva dose-resposta. (A) curva de dose-resposta representativa de miRNA-107 mimetizam células Panc-1 transfectadas. As células transfectadas foram incubadas continuamente por 96 h. os parâmetros adquiridos da curva dose-resposta também são mostrados. (B) a equação, variáveis, parâmetros iniciais e restrições, juntamente com as descrições de definições e valores. (C) inserir as definições e valores nos painéis correspondentes no software. O "f" indica a viabilidade da célula% (por exemplo, o valor de "f" é "90" e "10" no IC10 e IC90, respectivamente). O valor y0 é 100 e indica a viabilidade da célula 100% do controle de miRNA mimetizam as células transfectadas. O "n" indica o coeficiente do tipo Hill (a inclinação de um gráfico). O "k" indica a concentração de mímica de miRNA-107 que produz um 50% do efeito máximo do mímico de miRNA-107 (CI50). O "R" indica a fração residual não afetada (a fração de resistência). (D) este painel mostra como calcular os valores de icx ajustados com base nos parâmetros (n, k e R) adquiridos a partir da equação 1. A percentagem (%) a viabilidade celular no painel representa "f" na equação 1 e calculada subtraindo o valor de x de cada ICx de y0 (100). A equação 2 na barra de fórmulas da planilha é indicada como "= ((100-D3)/(D3-$B $5)) ^ (1/$B $3) * $B $4)" para o cálculo do valor do IC10 ajustado. Aplique a equação 2 a outras células para calcular outros valores de ICx pressionando o botão esquerdo do mouse na célula selecionada (cor vermelha) e arrastando para baixo até a célula do valor IC90 . Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: verificação do gene alvo directo de um Mirna de interesse. Experimentos começam com a concepção de primers para a clonagem de 3 ' UTR. Os primers são usados para o PCR do inclinação. (A) a melhor temperatura de recozimento pode ser selecionada entre as seis temperaturas indicadas do recozimento para amplificar 3 ' UTR de um gene. Em seguida, a digestão dobro é executada com enzimas da limitação e os produtos do PCR são ligado em vetores do luciferase. (B) os vetores de luciferase contendo 2 genes de repórter, vagalume e renilla luciferase, podem ser usados para a tela das interações de miRNAs com 3 ' UTR de mRNAs. As inserções do PCR são clonadas em uma região coloc a jusante do gene do repórter do renilla. Os produtos ligados foram transformados em células competentes e cresceram células na placa de agar LB. (C) as colônias individuais (#1 a #6) foram colhidas e ressuscitou em 50 μL de água ultrapura. A suspensão de e. coli foi utilizada para a PCR e inoculação da colônia. A PCR da colônia é uma ferramenta conveniente selecionar as melhores colônias para a inoculação e a isolação de vetores do luciferase que abrigando 3 ' UTR de um gene. (D) para o ensaio de luciferase, o mímico do controle de Mirna ou o mímico de mirna-107 foram transfected em pilhas Panc-1 com os constructos do luciferase usando uma placa de 24 poços. (E) este painel demonstra os dados brutos representativos e o cálculo da proporção de renilla para vaga-lume após a execução do ensaio de luciferase para a validação de um gene sncg como alvo de miRNA-107. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Triagem de genes-alvo previstos de Mirna-107. A triagem das interações entre o miRNA-107 e o 3 ' UTR de alvos previstos foi realizada em células PANC-1, utilizando-se os constructos da luciferase. Com base nos efeitos negativos do miRNA-107 sobre a proliferação celular, os potenciais genes candidatos foram determinados para os ensaios de clonagem e triagem. mímica de controle de miRNA ou mímica de miRNA-107 foi transfected em pilhas PANC-1 com os constructos do luciferase que contêm 3 ' UTR de cada gene selecionado para 24 h. A proporção de renilla para vaga-lume foi calculada e normalizada com base nos níveis medidos de ambas as luciferases em células PANC-1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Detecção Mirna GAPDH
Componentes
Master Mix para PCR em tempo real baseado em sonda (2x) 10 μL de
Master Mix para PCR em tempo real baseado em corante (2x) 10 μL de
Mistura de sonda (5x) 4 μL de
Primers GAPDH (1 μM cada) 4 μL de
CDNA diluído (1:49) 6 μL de 6 μL de
Volume total 20 μL de 20 μL de

Tabela 1: condições utilizadas para uma detecção específica de miRNA e GAPDH pela PCR em tempo real neste estudo.

Componentes reação 1x 7x reação
5x tampão 5 μL de 35 μL
mistura dNTP (2,5 mM cada) 2 μL de 14 μL de
Primers (10 μM cada) 1 μL de 7 μL de
DNA genómico (2 ng/μL) 16,5 μL 115,5 μL
Polymerase 0,5 μL 3,5 μL
Volume total 25 μL de 175 μL

Tabela 2: composição de misturas de reação de PCR para a amplificação de 3 ' UTR neste estudo.

Componentes reação 1x
10x tampão 5 μL de
Produtos ou vetores de PCR Produtos do PCR: 25 μL vetores: 1-2 μg
Enzima de restrição XhoI (ou AsiSI) 2 μL de
Enzima de restrição NotI 2 μL de
Água ultrapura x μL
Volume total 50 μL

Tabela 3: condições para a dupla digestão de produtos de PCR e de vetores de Luciferase usando enzimas XhoI (ou AsiSI) e NotI neste estudo.

Componentes reação 1x
10x tampão 2 μL de
Vetores (duplamente digerido) 50 ng
Produtos do PCR (inserção) x μL
Ligase 200 U
Água ultrapura y μL
Volume total 20 μL de

Tabela 4: reações de ligadura de produtos de PCR digeridos duplos e vetores luciferase com a ligase do DNA neste estudo.

Complementar Figura 1: a derivação da equação 2 da equação 1. A equação 2 é derivada da equação 1 para o cálculo dos valores de ICx ajustados. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura complementar 2: informação da cartilha. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Estratégias para a determinação de alvos de miRNA de bona fide com as funções de um miRNA de interesse são indispensáveis para a compreensão de múltiplos papéis de miRNAs. A identificação de genes alvo de miRNA pode ser uma diretriz para interpretar os eventos de sinalização celular modulados por miRNAs em uma célula. Um desvelamento de genes-alvo funcionalmente importantes de miRNAs pode fornecer o conhecimento fundamental para desenvolver uma terapia baseada em miRNA no câncer.

Diversos métodos tais como Microarrays, arranjar em seqüência pequeno da biblioteca do RNA, arranjar em seqüência profundo, transcriptase reversa in situ PCR, e a mancha do Norte podem ser aplicados para explorar níveis da expressão de miRNA usando o RNA total isolado das linhas e dos tecidos de pilha24, 25,26. O perfil de alta taxa de transferência de miRNAs pode fornecer a introspecção valiosa nos fundamentos genéticos do desenvolvimento do cancro. O ensaio de miRNA baseado em sonda é freqüentemente usado para validar dados de perfil e também é adequado para a tela de alguns miRNAs de interesse. Entretanto, a medida de níveis maduros de miRNA usando a PCR em tempo real baseada em sonda é limitada para determinar se os miRNAs maduros são regulados nas etapas de transcrição ou através da regulação da maturação. A PCR em tempo real baseada em corante e a mancha do Norte foram introduzidas para medir os níveis do precursor de Mirna27,28. A medição de precursores de miRNA juntamente com níveis maduros de miRNA pode fornecer ainda mais informações sobre como os níveis de miRNA maduros são regulados. Além disso, um entendimento abrangente da regulação dos níveis de miRNA é indispensável para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas baseadas em miRNA.

Os ensaios de proliferação celular, como o ensaio MTT à base de tetrazólio, são aplicáveis para a tela dos efeitos dos reagentes de tratamento, como mímica de miRNA. Uma vez que o ensaio MTT reflete as atividades metabólicas celulares com base na redução do tetrazólio por oxidoreductases celulares, é possível observar a falta de correlação entre o ensaio MTT e o número total de células19. Alternativamente, o ensaio SRB está disponível como o ensaio de enumeração de células mais reprodutível18,19. A mensuração da quantidade de corante SRB ligada às proteínas fixas de ácido tricloroacético pode representar o número total de células29. Além disso, o ensaio SRB neste protocolo pode ser aplicado para a tela múltiplas mímica de miRNA, bem como drogas anti-câncer usando placas 384-well. No entanto, o ensaio SRB apresenta limitações como a triagem manual. Além disso, este ensaio não está disponível para células não aderentes. Desde que miRNAs igualmente joga um papel crítico na malignidade hematológicas tal como o Lymphoma e o mieloma30, a monitoração eficiente da proliferação de pilha é exigida para desvendar as funções de miRNAs. O éster do grufo do carboxyfluorescein (CFSE) pode etiquetar intracelularmente as pilhas não-aderentes. O CFSE é usado para monitorar a geração de células proliferantes por citometria de fluxo31. Além disso, miRNAs pode afetar a invasão, metástase e morte celular programada. Portanto, outras técnicas experimentais que combinam com este protocolo serão mais práticas para o entendimento adequado das funções de miRNA, que, em última análise, contribuem para a identificação de alvos multitudinosos biologicamente relevantes de miRNAs.

O cálculo da metade da concentração inibitória máxima (IC50) é um método importante não só para os estudos de Mirna, mas também para a avaliação da eficácia de outros fármacos anticancerígenos. IC50 valores podem ser usados para comparar os efeitos potenciais de vários miRNAs ou drogas anticancerígenas na proliferação celular. Demonstrou-se que a combinação de uma terapia baseada em miRNA com drogas anticancerígenas pode proporcionar uma oportunidade excepcional para melhorar a eficácia do medicamento anticancerígeno. Além disso, a combinação de miRNAs com drogas anticancerígenas pode ser uma nova abordagem para superar a quimiorresistência32,33. Para a avaliação da eficiência da combinação, é vantajoso calcular os valores ajustados de icx baseados em nosso protocolo para a avaliação do índice da combinação (CI) que permite a estimativa quantitativa do sinergismo ou do antagonismo33, 34.

As redes de sinalização intracellular podem extensamente ser desorganizadas por miRNAs anomalamente expressadas em doenças numerosas que incluem cancros. No entanto, as redes de sinalização convolutamente afetadas pelos miRNAs ainda são praticamente desconhecidas, já que a pequena proporção de genes alvo foi validada experimentalmente, e os genes alvo também são regulados via não-canonicamente reagindo com miRNAs35. No entanto, nossa estratégia e protocolo são métodos confiáveis para decifrar os mecanismos celulares de miRNAs. Além disso, nosso protocolo pode ser ampliado para implementar e avaliar a combinação de miRNAs e outros medicamentos anticancerígenos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) financiado pelo Ministério da educação (2017R1D1A3B03035662); e fundo de pesquisa da Universidade Hallym, 2017 (HRF-201703-003).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tube SPL Life Sciences 50015
24-well plate Thermo Scientific 142475
50 mL conical tube SPL Life Sciences 50050
6-well plate Falcon 353046
6x DNA loading dye Real Biotech Corporation RD006 1 mL
8-cap strip Applied Biosystems N8010535 For cDNA synthesis
8-tube strip Applied Biosystems N8010580 For cDNA synthesis
96-well plate Falcon 353072
Acetic acid Sigma A6283-1L 1 L
Agarose A Bio Basic D0012 500 g
Alkaline phosphatase New England Biolabs M0290S 10,000 U/mL
Ampicillin Bio basic Canada Inc AB0028 25 g
AriaMx 96 tube strips Agilent Technologies 401493 For real time PCR
AriaMx real-time PCR system Agilent Technologies G8830A qPCR amplification, detection, and data analysis
AsiSI New England Biolabs R0630 10,000 units/mL
CAPAN-1 cells ATCC HTB-79
Cell culture hood Labtech Model: LCB-1203B-A2
Counting chambers with V-slash Paul Marienfeld 650010 Cells counter
CutSmart buffer New England Biolabs B7204S 10X concentration
DMEM Gibco 11965-092 500 mL
DNA gel extraction kit Bionics DN30200 200 prep
DNA ladder NIPPON Genetics EUROPE MWD1 1 Kb ladder
DNase I Invitrogen 18068015 100 units
Dual-luciferase reporter assay system Promega E1910 100 assays
Fetal bovine serum Gibco 26140-079 500 mL
HIT competent cells Real Biotech Corporation(RBC) RH617 Competent cells
HPNE cells ATCC CRL-4023
LB agar broth Bio Basic SD7003 250 g
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 0.75 mL
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-075 0.75 mL
Luminometer Promega Model: E5311
Microcentrifuge tube Eppendorf 22431021
Microplate reader TECAN Infinite F50
miRNA control mimic Ambion 4464058 5 nmole
miRNA-107 mimic Ambion 4464066 5 nmole
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 50 prep
Mupid-2plus (electrophoresis system) TaKaRa Model: AD110
NotI New England Biolabs R3189 20,000 units/mL
Oligo explorer program GeneLink For primer design
Optical tube strip caps (8x Strip) Agilent Technologies 401425 For real time PCR
Opti-MEM Gibco 31985-070 500 Ml
PANC-1 cells ATCC CRL-1469
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122 100 mL
Phosphate buffer saline Gibco 14040117 1000 mL
Plasmid DNA miniprep S& V kit Bionics DN10200 200 prep
PrimeSTAR GXL DNA polymerase TaKaRa R050A 250 units
Shaker TECAN Shaking platform
Shaking incubator Labtech Model: LSI-3016A
Sigmaplot 14 software Systat Software Inc For dose-response curve generation
Sulforhodamine B powder Sigma S1402-5G 5 g
SYBR green master mix Smobio TQ12001805401-3 Binding fluorescent dye for dsDNA
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A 25,000 U
TaqMan master mix Applied Biosystems 4324018 200 reactions, no AmpErase UNG
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan miR RT kit Applied Biosystems 4366597 1,000 reactions
Thermo CO2 incubator (BB15) ThermoFisher Scientific 37 °C and 5% CO2 incubation
Trichloroacetic acid Sigma 91228-100G 100 g
Trizma base Sigma T4661-100G 100 g
Ultrapure water Invitrogen 10977-015 500 mL
Veriti 96 well thermal cycler Applied Biosystems For amplification of DNA (or cDNA)
XhoI New England Biolabs R0146 20,000 units/mL

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Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais
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Seo, H. A., Hwang, C. Y., Moeng, S., Park, J. K. An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells. J. Vis. Exp. (147), e59628, doi:10.3791/59628 (2019).More

Seo, H. A., Hwang, C. Y., Moeng, S., Park, J. K. An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells. J. Vis. Exp. (147), e59628, doi:10.3791/59628 (2019).

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