Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

基于数字PCR的沙门氏菌健康高通量分析竞争指数

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59630
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

Summary

这种基于分子的确定细菌适应性的方法,使用通过数字PCR量化的独特基因组DNA条形码,有助于精确、准确地检测微生物。该协议描述了计算沙门氏菌菌株的竞争指数;然而,该技术很容易适应需要绝对定量任何基因可塑性有机体的协议。

Abstract

竞争指数是一种常用方法,用于评估细菌的适应性和/或毒性。这种方法的效用体现在其易于执行和标准化许多菌株对野生型生物体的适用性的能力。然而,该技术受限于可用的型型标记和可同时评估的菌株数量,因此需要进行大量的复制实验。在进行大量实验的同时,基于型状标记对细菌进行量化的人工和材料成本并非微不足道。为了克服这些消极方面,同时保留积极方面,我们开发了一种基于分子的方法,在将基因标记工程到细菌染色体上后,直接量化微生物。独特的是 , 25 个碱基对 DNA 条形码入在野生型和突变菌株的染色体上的无害位点。 体外竞争实验使用由池菌株组成的接种。比赛结束后,使用数字PCR量化了每个菌株的绝对数量,并计算了每种菌株的竞争指数。我们的数据表明,这种量化沙门氏菌的方法对于检测高度丰富(高适应性)和稀有(低适应性)微生物具有极其灵敏、准确和精确的检测方法。此外,这种技术很容易适应几乎任何具有染色体的有机体能够修改,以及各种需要绝对定量微生物的实验设计。

Introduction

评估致病微生物的适应性和毒性是微生物学研究的一个基本方面。它允许在菌株之间或突变的生物体之间进行比较,使研究人员能够确定特定条件下某些基因的重要性。传统上,毒性评估利用动物感染模型使用不同的细菌菌株,并观察受感染动物的结果(例如,传染性剂量50,致命剂量50,死亡时间,症状严重程度,缺乏症状等)。 这个程序提供了宝贵的毒性描述,但它需要菌株导致结果相当大的差异,以检测从野生类型的变化。此外,结果是半定量的,因为虽然疾病进展和症状严重性可以随着时间的推移主观量化,但与野生类型相比,对毒性的解释更定性(即更多、更少或同样具有毒性)。执行动物感染性测定的一种常见替代方法是生成竞争指数(CIs),该值直接将菌株的适应性或毒性与混合感染1中的野生型对应物进行比较。与传统的动物感染模式相比,该技术具有许多优点,通过标准化对野生型菌株的毒性,并确定可量化的值以反映衰减程度。这项技术还可以通过确定取消的竞争指数(COI)2来调整,以分析细菌的基因相互作用。计算一组突变生物的COI,使研究人员能够确定两个基因是否独立地导致发病机制,或者它们是否参与同一毒治途径并相互依赖。此外,计算 CI 需要对细菌进行枚举,从而对生物体的发病机制提供有价值的见解。CIs 和 COIs 还允许研究人员评估不会导致临床疾病但仍在健身方面存在差异的阿维鲁特菌株。这种技术受到使用传统抗生素耐药性标记来识别菌株的限制,从而将输入菌株的数量限制在一次只有一两个。由于这种限制,需要大量的实验组和复制,这除了增加劳动力和材料成本外,还增加了实验条件变异的机会和不准确的结果。(有关使用混合感染研究毒性、适应性和基因相互作用的好处和应用的透彻回顾,请参阅 C.R. Beuzón 和 D.W. Holden 1)

已经尝试克服这一限制,例如使用荧光标记的细胞量化通过流细胞学3,4,5。此技术使用标记的抗体对细胞进行量化,以表示型状标记或 2) 内分泌产生的荧光蛋白。使用标记抗体的检测量限制在1000个细胞/mL,因此需要大量细胞来分析3。表达荧光蛋白的细胞生理变化,易受高蛋白表达6引起的健身变化的影响。这两种方法都受使用流式细胞测定可检测的荧光标记的数量的限制。分子定量的进步是通过开发一种微阵列技术实现的,该技术在120个菌株中检测到120个菌株的衰减,最初混合感染了1000多个菌株,在鼠模型7中。该技术利用了突变菌株对RNA的微阵列分析,导致结果具有相当大的变异性。 然而,它确定,大量的混合感染池可以是一个有用的工具,并且通过利用敏感的检测技术,可以识别细菌毒性的差异。随着下一代测序的发展,Tn-seq扩展了转波龙突变的效用,为随机突变的8、9、10细菌提供了强有力的量化方法。 11.最近开发了一种替代方案,消除了转座子的需要,而是使用DNA条形码更容易地识别和跟踪基因组变化及其对适应性12的影响。这项技术是一项重大进步,但基因组条形码的插入仍是一个随机的过程。为了克服以往实验的随机性,Yoon等人开发了一种利用插入细菌13染色体精确位置的独特DNA条形码来计算沙门氏菌菌株的CIs的方法。使用基于 qPCR 的方法检测出独特的条形码菌株,该方法具有 SYBR 绿色和特定于每个唯一条形码的引油。该技术受到qPCR施加的限制,包括引漆效率和低灵敏度的差异,qPCR之前需要嵌套PCR就证明了这一点。然而,这种方法表明,靶向基因组修饰可用于检测和潜在量化多个细菌菌株池。

在下面的协议中,我们描述了一种新方法,用于使用大型混合接种池进行细菌竞争实验,然后使用高度敏感的数字PCR技术进行精确定量。该协议涉及基因标记的细菌菌株,在染色体的无害区域插入独特的DNA条形码。这种修饰允许使用现代分子技术快速准确地量化菌株,而不是传统的序列稀释、复制电镀和计数依赖表型标记的菌群形成单位(即抗生素耐药性)).这些修改允许在单个池接种中同时评估许多菌株,大大减少了实验变异的可能性,因为所有菌株都暴露在完全相同的条件下。此外,虽然这项技术是在沙门氏菌中开发的,但它对任何遗传可塑性有机体和几乎任何需要精确细菌计数的实验设计都具有很强的适应性,提供了新的工具,以提高微生物实验室的准确性和产量,不受以前方法的限制。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 将独特的DNA条形码纳入含有等位交换必要成分的质粒中

注:与现有的pKD13等位体交换质粒相比,创建了一种新的质粒,名为pSKAP,具有较高的拷贝数和更高的转换效率。这在步骤 1.1-1.12 中描述 (图 1.包含唯一DNA条形码和等位交换成分的最终质粒可通过质粒库(材料表)获得。

  1. 使用商业质粒小提具套件,纯化 pKD1314和 pPCR 脚本凸轮 SK–从在卢里亚-贝尔塔尼 (LB) 培养的隔夜细菌培养物中辅以 50 μg/mL 卡那霉素或 25 μg/mL 氯霉素 (用于 pKD13 和 pPCR 脚本凸轮)SK+,分别) (表 1.
  2. 根据制造商的规格,使用商业限制酶 HindIII 和 BamHI 对两种质粒进行限制消化。
  3. 去除限制性酶,从pPCR脚本Cam SK+反应中去除限制性酶,并根据制造商的规格,使用市售的DNA清理试剂盒,纯化3,370碱基对(bp)质粒主干。
  4. 使用电泳室将片段从pKD13限制消化分离到1%的甘蔗凝胶上。
  5. 使用蓝光透射器可视化带,并从凝胶中去除 1,333 bp 片段(图 1C)。
    注:该片段包含染色体等位基因置换所需的FRT侧皮卡那霉素抗基因。
  6. 使用商业凝胶提取试剂盒从步骤 1.5 中纯化已切除的 DNA。
  7. 要创建 pSKAP,根据制造商的规格,使用商用 T4 DNA 连带将纯化片段从 pKD13(从步骤 1.6)到 pPCR 脚本凸轮 SK+ (从步骤 1.3 起)。
  8. 按照制造商的协议,使用带质的pSKAP质粒转化具有化学能力的DH5+细胞(表1)。
  9. 将转化剂扩散到LB琼脂板上,辅以50μg/mL卡那霉素,并在37°C孵育过夜。
  10. 从板中挑选一个菌落,并将其条纹在一个新的LB琼脂板上,辅以50μg/mL卡那霉素,并在37°C孵育过夜。从这个盘子里挑选一个菌群,用50μg/mL卡那霉素补充的LB肉汤接种。在37°C下,持续搅拌,在一夜之间孵育培养。
  11. 使用商业质粒小提具套件从隔夜细菌培养中纯化pSKAP。
  12. 根据制造商的规格,使用 Hind III 和 Bam HI 从步骤 1.11 执行对质粒的诊断限制消化。如步骤 1.4-1.5 中的步骤 1.4-1.5 中那样,在 1% 的甘蔗凝胶上可视化片段。
    注:pSKAP 的总大小应为 4,703 bp. 步骤 1.12 之后的碎片应为 3,370 bp 和 1,333 bp。
  13. 设计PCR引物,用于插入位点定向诱变(SDM)(表2和S1),以便在pSKAP位置725处插入独特的25基对DNA序列(图2)。
    注:条形码 DNA 入到 FRT 侧皮卡那霉素抗基因外的质粒中 , 因此条形码在随后去除卡那霉素抗卡带时不会丢失。如果生成新的条形码序列,请使用在线工具确保荧光标记的目标特定 PCR 探头(以下简称"探针")将有效地绑定到新序列。表 2和S1提供了迄今为止设计的插入序列以及创建它们所需的引注。
  14. 使用商业高保真DNA聚合酶、所需的引物对(表2)和pSKAP模板制备SDM反应。设置热循环器以执行以下操作:1) 98 °C 表示 30 秒,2) 98 °C 表示 10 秒,56°C 为 15 秒,72°C 为 2 分钟,3) 重复步骤 2、24 次、4) 72°C 为 5 分钟,5) 在 4°C 保持。
  15. PCR 完成后,通过在反应中添加限制性酶 Dpn I 来耗尽 pSKAP 模板。在37°C孵育20分钟。
    注:PCR 的产品应在胶凝剂凝胶上可视化,以验证产品的大小和纯度。由未修改的pSKAP模板组成的对照Dpn I消化可以执行,并在后续步骤中使用,以确保模板DNA被完全消化。
  16. 使用步骤 1.15 中 5 μL 的产品,根据制造商的建议转换 100 μL 的商业化学能力 DH5+ 细胞。
  17. 将转化剂扩散到LB琼脂板上,辅以25微克/mL氯霉素,并在37°C孵育过夜。
  18. 从过夜板中选择菌落(或菌落)并条纹到单个 LB 琼脂板上,辅以 25 μg/mL 氯霉素,并在 37°C 孵育过夜。从隔夜板中选择一个菌群,使用接种5 mL的LB肉汤,辅以25微克/mL氯霉素。在37°C下孵育文化,持续搅拌。
  19. 使用商业质粒小试剂盒从过夜培养中纯化质粒。
  20. 桑格使用M13正向测序引基(表2)测序纯化质粒。将突变区域与原始质粒进行比较,并评估SDM插入精度。
  21. 确认条形码插入和准确性后,为每个条形码和质粒指定一个名称。
    注:迄今生成的条形码已分配两个字母名称:AA、AB、AC、...、BA、BB、BC 等。条形码质粒表示为 pSKAP_AA、pSKAP_AB、pSKAP_AC、...、pSKAP_BA、pSKAP_BB、pSKAP_BC 等。
  22. 重复步骤 1.14-1.21 以生成所需的 DNA 条形码数量。

2. 将DNA条形码引入S染色体。 蒂奇穆里

注:将DNA条形码插入S.Typhimurium染色体是通过使用达琴科和万纳14描述的等位交换方法实现的,该方法已被修改用于S。打字人。

  1. 确定S上的轨迹。分型基因组,在其中插入DNA条形码(图3)。
    注:选择染色体的大、基因间区域。避免产生非编码RNA的区域。本研究利用了Put P的下游位点,在残留物1,213,840和1,213,861之间(从基因组组装GCA_000022165.1)确定。该区域以前曾被基因操纵用于基因15的转补。或者,DNA条形码可以引入,同时破坏感兴趣的基因。这样做需要对该协议进行最少的修改并简化突变的创建。
  2. 设计PCR引源,以放大步骤1.21(表2)中所需的pSKAP条形码中独特的条形码和FRT侧皮卡那霉素抗素基因。将40个核苷酸延伸添加到步骤2.1中选定的区域,到每个引源的5'端(表2)。
  3. 使用商业高保真聚合酶、步骤 2.2 中的引物以及所需的包含质粒的 pSKAP 条形码作为模板执行扩增。设置热循环器以执行以下操作:1) 98 °C 表示 30 秒,2) 98 °C 表示 10 秒,3) 56 °C 为 15 秒,4) 72°C 为 60 秒,重复步骤 2-4 29 次,5) 72 °C 为 5 分钟,6) 在 4°C 保持。
  4. PCR 完成后,使用 DpnI 耗尽模板 DNA,如步骤 1.15 所述。根据制造商的规格,使用商业DNA清理试剂盒净化和浓缩DNA。
  5. 请参阅前面发布的在S中生成突变体的协议。来自PCR产品14、16、17、18的Typhimurium菌株14028s。
    注:从染色体中去除卡那霉素抗性基因并非必要。然而,切除该基因对细菌染色体的破坏性最小,因为它会导致129 bp的疤痕,从而将潜在的下游基因留在框架中。建议保留含有卡那霉素抗基因的菌株,因为它可用于通过P22介导转导在菌株之间移动条形码。
  6. 重复步骤 2.3 = 2.5,使用适当的条形码创建所需的应变。
    注:条形码可以引入到野生型 S中。然后可以进行进一步基因操作的Typhimurium,或者条形码可以引入到以前基因改变的菌株中。

3. 细菌生长条件和体外竞争测定

  1. 从细菌库存,条纹所需的S。 Typhimurium 菌株,每个含有一个独特的DNA条形码到LB琼脂板。在37°C下孵育板过夜。
  2. 从每个菌株中选择一个菌落,接种 5 mL 的 LB 肉汤。在37°C下孵育20小时,持续搅拌。
    注:使用隔夜培养,继续步骤3.5从每个条形码菌株收集纯基因组DNA(gDNA)。对于第 6 节中的后续验证和控制实验,这是必要的。
  3. 对于每个竞争测定,将每个隔夜培养的等量转移到适当大小的无菌管中。通过大力涡旋至少5s将菌株彻底混合在一起。
    注:每个隔夜培养的传输量应足以满足每种条件和复制,以及隔离 gDNA 以量化输入。虽然并非完全有必要测量培养物的光学密度,因为输入微生物的绝对数量将使用数字 PCR 进行量化,但每种菌株的输入细菌数量应大致相等,以避免瓶颈或在实验的早期,不平等的竞争。该协议中的代表性竞争测定同时比较了8个菌株的增长率。对于单个实验设计,可能需要增加或更少的菌株。
  4. 将混合接种的100 μL转移到4.9 mL无菌LB肉汤中。在37°C下孵育所需时间或达到所需光学密度。
  5. 通过在 >12,000 x g处离心,将 500 μL 的接种量收获 1 分钟。取出并丢弃上清液。立即使用单元格转到第 4 节。
  6. 在所需时间点,通过+gt;12,000 x g的离心,去除500 μL等分培养和收获细胞,1分钟。去除并丢弃上清液。
    注:如果在多个时间点收集等分,在 -20°C 冷冻颗粒,或在每个收集后立即执行步骤 4.1。

4. 从S收集和量化 gDNA 。Typhimurium(来自步骤3.5和3.6)

  1. 使用商业gDNA纯化试剂盒从细胞中收获gDNA。如果可用,执行可选的 RNA 耗尽步骤。
    注:RNA耗尽是不必要的;然而,RNA的存在将人为地增加DNA浓度,导致后续步骤中的异常计算。如果使用商业 gDNA 纯化试剂盒,请遵循制造商的建议,以确保该柱不会超载 DNA。如果样本在后续步骤中可量化,则不需要最低DNA浓度。
  2. 使用分光光度计对每个样品中的DNA进行量化。
    注:DNA可以用任何可靠的方法进行量化。
  3. 使用以下公式基于细菌基因组大小计算 gDNA 拷贝数:X 是 ng 中的 DNA 量,N 是双链 DNA 分子的长度(基因组大小)。
    Equation 1
    注:660克/摩尔用作1个DNAbp的平均质量。根据生物体的核苷酸组成,可能存在小的变化。有许多计算器可以在线执行计算。

5. 设计引子和探针,用于通过dDigital PCR定量检测DNA条形码

  1. 设计引体以放大S的条形码区域。putP下游的 Typhimurium 染色体 (图 3C和表 2)。
    注:引物和探头设计可以通过许多在线程序(材料表)促进。如果条形码都插入在同一位点,则所有条形码都通用一组放大底漆。
  2. 设计基于 6 卡博氟辛 (FAM) 和/或六氯氟素 (HEX) 的探头,特定于每个条形码(表 2和S1)。
    注:本实验中使用的滴读器能够在多路反应中同时检测基于FAM和HEX的探头。设计 1/2 的探头,以利用 FAM 和 1/2 利用 HEX。这不是一个必要的步骤,但将减少试剂的使用和实验成本,如果实施。
  3. 制作 20x 底漆探针主混合物,每个正向和反向放大底漆包含 1) 20 mM,单个 FAM 探头 2) 10 mM,单个 HEX 探头 3) 10 mM(如果多路复用)。

6. 使用数字PCR验证每个基因组条码的每个Pprimer探针集的灵敏度和特异性

注:此协议使用验证八个唯一条形码和八个唯一的探测器作为示例。使用的条形码数量可以增加或减少,以适应各种实验设计。

  1. 创建包含除条形码以外的每个条形码的 gDNA 池。使用此池作为稀释剂,使用包含单个剩余条形码的 gDNA 执行稀释系列(如图4所示, 样本稀释方案)。
    注:使用池化gDNA作为稀释剂可确保在确定灵敏度时保持一致的背景。使用步骤 4.3 中确定的拷贝编号,将 gDNA 稀释到推荐的数字 PCR 范围内的副本数(每 20 μL 反应 1-100,000 份)。请记住,范围是为每个唯一目标(条形码)设置的,而不是总 gDNA。
  2. 根据制造商关于使用数字 PCR 超混合设计用于基于探头的化学的建议,为数字 PCR 制备重复的反应。使用步骤 6.1 中的混合物作为模板 DNA。使用步骤 5.3 中的 20x 底漆探针主混合物,其中包含步骤 6.1 中稀释条形码的探针。
  3. 根据制造商关于使用数字 PCR 超混合用于基于探头的化学的建议,为数字 PCR 准备复制控制反应。每个探针组合的控制反应必须包括 1) 无模板控件 (NTC)、2) 负控件和 3) 正控制。
    注:复制控制反应的最小数量为两个。此示例协议为每个条形码使用四个 NTC、六个负控件和六个正控制。负控制应包含带有每个条形码的 gDNA,但与所测试的探测器对应的条形码除外。这将验证每个探测器的特异性。
  4. 重复步骤 6.1-6.3 为每个条形码 gDNA 样品创建数字 PCR 反应。图5给出了样品板布置。
    注:此步骤和后续步骤基于利用液滴和基于流的技术的特定数字 PCR 平台进行描述。使用基于芯片技术的替代数字 PCR 平台可以很容易地通过对该协议稍作修改来替代。步骤 6.4 可能需要多个 96 孔板来验证所有引漆集。与 qPCR 相比,通过数字 PCR 分析的单独板可以轻松比较,而无需在板之间使用标准化参考孔。
  5. 根据制造商的说明,使用液滴发生器为每个反应条件生成液滴。
  6. 将新创建的液滴转移到适当的 96 孔板中。在 5-50 μL 多通道移液器上使用 200 μL 移液器。
    注:移液液滴时,移液器缓慢而平稳!数字 PCR 设备制造商建议仅使用特定制造商(例如 Ranin)的移液器和移液器提示。这些移液器吸头具有平滑的开口,没有微小的塑料碎片,可以破坏液滴或损坏液滴读取器的微流体。许多品牌的提示被检查和观察,有一系列的制造质量。使用移液器尖端替代品取得了同等的结果;但是,在偏离制造商的建议时,应小心谨慎。
  7. 生成并转移所有液滴后,用箔板密封器密封板。
  8. 使用制造商推荐的热循环器执行以下循环条件:1) 94 °C 10 分钟;2) 94°C 1分钟,斜坡速率设定为1°C/s;3) 55°C 2分钟,斜坡速率设定为1°C/s;4) 重复步骤 2 和 3 49 次;5) 98 °C 10 分钟;6) 保持在 4 °C 至 24 小时。
    注:液滴反应中的热传递与标准 PCR 不同。反应条件可能需要修改。
  9. 执行热循环时,使用板设置信息(如样品名称、实验类型(绝对定量)、使用的超级混合、目标 1 名称(FAM 条形码名称)、目标 1 类型(NTC、正控制、负控制,或未知),目标2名称(HEX条形码名称),目标2类型(空白、正控制、负控制或未知)。最终板设置信息如图5所示。
  10. 热循环完成后,将已完成的反应转移到滴片读取器,然后根据制造商的说明开始读取过程。

7. 在竞争指数实验中量化细菌数量

  1. 稀释gDNA从第4节分离和量化到上述适当的浓度。
  2. 根据制造商关于使用适当超级混合的建议,准备数字 PCR 的反应。使用步骤 7.1 中的 DNA 作为模板。使用一个包含探头的 20x 底漆-探针主混合物(如果同时检测 FAM 和 HEX,则使用探头)来检测实验中可能存在的条形码。
  3. 准备额外的数字PCR反应,如步骤7.2使用不同的20x底漆探针主混合物,直到可以检测到实验设计中使用的所有条形码。
  4. 包括 6.3 中所述的每个条件的控件。这包括 1) 没有模板控件 (NTC),2) 负控件,3) 正控件。
  5. 继续执行步骤 6.5-6.10 中描述的协议。

8. 分析数字 PCR 数据并计算绝对拷贝数

  1. 读取所有井并完成运行后,使用数据分析软件打开 .qlp 数据文件。
    注:此处描述的文件类型和数据分析过程特定于一个数字 PCR 制造商。如果使用替代数字 PCR 平台,文件类型和数据分析过程将特定于所使用的平台,并且应根据制造商的建议规范执行。
  2. 选择使用同一引体-探针主混合物的所有井。
  3. 在"液滴"选项卡上,检查每个孔中分析的液滴数(正液滴和负液滴)。从分析中排除总液滴少于 10,000 口的任何井。
  4. 移动到1D 振幅选项卡并检查正液滴和负液滴的振幅。确保它们由两个不同的种群组成。
  5. 在软件中,使用阈值功能对所使用的每个探头的正液滴和负液滴进行截止(图6)。
    注:步骤 5.3 中使用相同底漆-探针主混合物的所有井应具有相同的阈值。
  6. 一旦对所有油井应用了适当的阈值,软件将计算每个反应中的DNA拷贝数。将数据导出到电子表格,以便进一步分析。
    注:数据分析软件使用适合泊森分布的正负液滴数来确定拷贝数。
  7. 使用步骤 8.6 中的值,计算样本中每个唯一基因组条形码的初始拷贝数。确定负对照反应中的平均假阳性率,并从实验反应中获得的值中减去此值。根据需要根据设置每个实验时执行的稀释法将值相乘(表 3)。

9. 通过计算基于数字 PCR 的条形码菌株的 CI 或 COI,确定生物体的相对适应性

  1. 使用以下公式计算条码菌株的 CI:输出是给定时间点条码菌株的绝对量化,WT输出是条形码野生型细菌的绝对量化时点,A输入是条码菌株输入接种的绝对定量,WT输入是条形码野生型细菌输入接种的绝对定量,X输出是所有菌株的总和。同一时间点,X输入是所有条形码菌株的总输入接种的总和。

Equation 2
Equation 3
注:有关每个公式的优点、缺点和最适当的用处,请参阅讨论。

  1. 在所有时间点对每个条形码应变重复步骤 9.1。
  2. 如果适用,使用以下公式计算 COI:输出是给定时间点具有突变基因A的条码菌株的绝对量化,AB输出是条形码应变的绝对量化与突变基因A和B在同一时间点,A输入是具有突变基因A的条形码菌株输入接种的绝对定量,AB输入是输入接种的绝对定量突变基因A和B的条码应变,B输出是在给定时间点与突变基因B的条码应变的绝对定量,B输入是输入的绝对量化带有突变基因B的条形码菌株的接种。

Equation 4
和/或
Equation 5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

使用这种方法需要执行适当的控制反应,以验证用于识别目标DNA的每个探针的敏感性和特异性。在这个具有代表性的实验中,我们验证了8个独特的DNA条形码与8个相应的探针进行鉴定。所有八个探针在NTC和阴性对照反应中的假阳性率都很低(表3),即使在高度相似的DNA序列中,也突出了它们的特异性。为了评估每种情况的敏感性,包含唯一条形码的 gDNA 在包含其余七个条形码序列的 gDNA 的恒定背景中被序列稀释。通过上述方法,数字PCR在近2,000,000个类似DNA序列的背景中可以分辨到多达2个gDNA拷贝(表3)。

除了确定每个探针和DNA条形码序列的灵敏度和特异性外,验证研究中执行的稀释功能还使我们能够从结果数据中计算模拟的竞争指数。虽然此实验没有真正的输入或输出,但可以像执行竞争实验一样对数据进行分析。为此,我们将序列稀释中的每个混合物视为稀释条形码的输出(A 输出),而每个应变的总输出(X输出)、输入(A输入)和总输入(X输入)均根据在包含所有条形码的正控制中量化。使用每种混合物的稀释系数,确定理论CI,并在表3中报告。在为每个条形码执行的每个稀释系列中,将报告平均模拟 CI 以及每个重复稀释系列的标准偏差。在所有情况下,计算的模拟 CI 与理论 CI 类似。大多数计算的 CI 偏离理论 C 值的偏差小于 25%。在理论 C 值较低的情况下,计算值的偏差为 2 倍以上。例如,这表示从理论 CI 0.000625 到计算 CI 0.001220 的变化。这些数据突出表明,所述方法既高精度又高度精确。高灵敏度、特异性、精度和精度相结合,使该系统能够可靠地检测可能被忽视的适应性差异。

在验证基因组条形码能否准确检测和量化后,我们进行了体外竞争实验(表4)。第一次竞赛实验利用了8个野生S型。 Typhimurium 菌株,每个都包含一个独特的DNA条形码。每种菌株在一夜之间生长,八种文化以相同数量混合在一起。这种混合接种的100 μL用于接种4.9 mL的无菌LB肉汤,所得培养在37°C下孵育,持续搅拌。gDNA是从接种中采集的,以计算每个菌株的精确输入。通过测量 600 nm (OD600) 的吸收度来监测培养基的生长。在OD600 = 0.5(对数相)时,从每种培养中采集样本,并采集gDNA。剩余的培养物返回37°C,持续搅拌,直到接种后8小时,当最终样本被收集并采集gDNA(静止)。结果使用为池感染修改的 CI 公式计算。正如预期的那样,所有野生型菌株的 CI 值几乎等于 1 (表 4)。使用八种突变S进行了类似的竞赛实验。 除了单、双、三转基酶缺乏18外,每个类型菌株都有独特的条形码。如前所述,在LB肉汤中,菌株都生长相似,在三重转基酶缺乏菌株中仅观察到轻微滞后。然而,当通过分析CI来评估每个菌株的生长情况时,观察到了反酮酶缺乏菌株的一个更为深刻的缺陷(在Shaw等人18年将CI与生长曲线进行比较)。此外,这个实验使我们能够为每个菌株的生长特性分配一个可量化的值,而不是仅仅从定性上描述生长模式。每个菌株的 CIs 都使用传统公式计算,其中每个应变仅与野生型进行比较,而修改公式则考虑所有输入应变。虽然变化很小,但三重转基酶缺乏菌株的CI在传统配方中被人为地降低,因为它没有考虑到其他六种竞争菌株,这些菌株都表现出近乎野生型的适应性。

株 基因 来源或引用
S. Typhimurium ATCC 14028s 野生型 ATCC
TT22236 LT2沙门氏菌携带 pTP2223 (27)
DH5* F= +80lacZ_M15 = (lac ZYA-argF)U169 recA1端A1 hsdR17 (rK+, mK=)磷A supE44= =thi -1 陀螺仪A96 relA1  (28)
JAS18077 普普::AA:: FRT 本研究
JAS18080 普P::AD:::FRT 本研究
JAS18083 普普::AG:: FRT 本研究
JAS18088 普普::AL:: FRT 本研究
JAS18091 普普::AO:: FRT 本研究
JAS18096 普普::AT:: FRT 本研究
JAS18099 普普::AW:: FRT 本研究
JAS18100 普普::AX:: FRT 本研究
JAS18122 •tktA::FRT putP::AD:: FRT 本研究
JAS18130 •tktB::FRT putP::AL:: FRT 本研究
JAS18138 •tktC::FRT putP::AT:: FRT 本研究
JAS18125 •tktA::FRT =tktB::FRT putP::AG::FRT 本研究
JAS18133 \tktA::FRT =tktC::FRT putP::AO::FRT 本研究
JAS18141 •tktB::FRT =tktC::FRT putP::AW::FRT 本研究
JAS18142 •tktA::FRT =tktB::FRT =tktC::FRT putP::AX::FRT 本研究
质 粒
pKD13 布拉FRT ahp FRT PS1 PS4 oriR6K (14)
pPCR 脚本凸轮 SK* 科雷1奥里;厘米R 斯特拉塔根/阿利金特
pTP2223 普拉克拉姆赌注 exo ttR (16)
pCP20 bla cat cI857 PRflp pSC101 oriTS (29)
pSKAP 科雷1奥里;厘米R;布拉FRT ahp FRT 本研究
pSKAP_AA 科雷1奥里;厘米R;布拉FRT ahp FRT;AA 本研究
pSKAP_AD 科雷1奥里;厘米R;布拉FRT ahp FRT;广告 本研究
pSKAP_AG 科雷1奥里;厘米R;布拉FRT ahp FRT;阿格 本研究
pSKAP_AL 科雷1奥里;厘米R;布拉FRT ahp FRT;阿尔 本研究
pSKAP_AO 科雷1奥里;厘米R;布拉FRT ahp FRT;AO 本研究
pSKAP_AT 科雷1奥里;厘米R;布拉FRT ahp FRT;在 本研究
pSKAP_AW 科雷1奥里;厘米R;布拉FRT ahp FRT;AW 本研究
pSKAP_AX 科雷1奥里;厘米R;布拉FRT ahp FRT;AX 本研究

表1:本研究中使用的菌株和质粒。

名字 序列 (5' - 3')1,2,3
pSKAP SDM AA - F AGAAGTCTCTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGC加特格格格格格格格格格格GC
pSKAP SDM AA - R ACTCAACACAGAGAGAGACTCTCTCAAGACGTATGCG
pSKAP SDM AD - F 阿加格加格格格格格格塔格C加特格格格格格格格格格格GC
pSKAP SDM AD - R 中联社CTCAAGACGTATGCG
pSKAP SDM AG - F AGTAGTGGGAGGGGGGGGGGGGAC加特格格格格格格格格格格GC
pSKAP SDM AG - R CTCCTCACACACACTACTACTACTACTCTCAAGACGTATGCG
pSKAP SDM AL - F ACCCACATAGCACCACATCTCTCTCAAGACGTATGCG
pSKAP SDM AL - R 阿加格塔格特格特格特格特格格特格格特格格特格格特格格特格格C加特格格格格格格格格格格GC
pSKAP SDM AO - F 格卡卡卡卡加特加特CTCAAGACGTATGCG
pSKAP SDM AO - R AGTATACATATGGTGGGGACC加特格格格格格格格格格格GC
pSKAP SDM AT - F ACCAGTGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGC加特格格格格格格格格格格GC
pSKAP SDM AT - R GTCTAGCCATCTCACGGATATTCTCAAGACGTATGCG
pSKAP SDM AW - F ACGACTATATATGGGGGCGC加特格格格格格格格格格格GC
pSKAP SDM AW - R 中联社CTCAAGACGTATGCG
pSKAP SDM AX - F ACTATCGTGGACGGGGGGGGGC加特格格格格格格格格格格GC
pSKAP SDM AX - R 卡塔格特格塔卡加塔格塔特CTCAAGACGTATGCG
M13 - F 格格亚阿加格格格集团
putP重组 - F 塔格加特加加加加加塔塔塔塔塔塔
TGCAGCATTACACGTC
putP重组 - R 塔塔格格塔塔加特加亚卡塔卡塔卡塔加特格
CCTGCTTCAGAGTCC
qPCR 条形码区域放大 - F1 TGCAGCATACCTTG
qPCR 条形码区域放大 - R2 塔加特加加格加格格GC
条形码 AA 探头 - FAM 6-FAM/AGAAGTCTC/ZEN/CTGCGGGGGGGGGGGGTC/IBFQ
条形码 AD 探头 - FAM 6-FAM/AAGAGCACG/ZEN/GTGAGGTGATAGGC/IBFQ
条形码 AG 探头 - FAM 6-FAM/AGTAGTGTC/ZEN/CTGGAGGGGTGGAC/IBFQ
条形码 AL 探头 - FAM 6-FAM/阿加格茨塔格特/ZEN/GCCTATGTGTGGTC/IBFQ
条形码 AO 探头 - HEX HEX/AGTATCACT/ZEN/GAGTGTGGGGACC/IBFQ
条形码 AT 探头 - HEX HEX/ACCAGTGTC/ZEN/CGTGAGGGGTTAGACC/IBFQ
条形码 AW 探头 - HEX HEX/ACGACTGAG/ZEN/TATGTGGGGACGC/IBFQ
条形码 AX 探头 - HEX HEX/ACTATCGTG/ZEN/GTGTAACGAGGCTGC/IBFQ
1下划线核苷酸表示 SDM 后插入 pSKAP 的每个 DNA 条形码的互补序列。
2双下划线核苷酸表示S上的一个互补区域。用于等位基因置换的Typhimurium染色体。
3PrimeTime qPCR 探针是标有 5' 荧光染料的杂交寡聚物,包括 6-卡博氟辛 (6-FAM) 或六氯氟辛 (HEX)、内部淬火器 (ZEN) 和 3' 淬火爱荷华黑® FQ (IBFQ)。

表2:本研究中使用的引性剂和探针。

定量(拷贝/20μL反应)
描述 机 管 局 广告 银 铝 坳 在 AW 斧头
Ntc 不适用 0.000 0.000 3.510 不适用 0.000 0.000 0.000
Ntc 3.600 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Ntc 3.510 0.000 1.280 1.180 2.340 0.000 0.000 0.000
Ntc 2.290 0.000 0.000 1.200 1.150 1.160 0.000 0.000
意味 着 3.133 0.000 0.320 1.473 1.163 0.290 0.000 0.000
负 5.130 1.156 0.000 1.124 3.745 1.281 7.354 7.142
负 5.270 0.000 0.000 1.087 1.666 1.643 7.746 2.269
负 2.660 0.000 1.361 1.451 8.974 0.000 不适用 0.000
负 6.090 0.000 0.000 2.251 0.000 2.531 8.700 3.495
负 1.740 0.000 1.086 2.130 4.171 0.000 7.113 5.522
负 6.220 3.581 0.000 4.022 1.175 1.341 不适用 5.950
意味 着 4.518 0.789 0.408 2.011 3.288 1.133 7.728 4.063
积极 22281.540 42673.039 46442.242 45359.180 47885.625 15708.027 45325.906 20810.559
积极 23989.676 44625.523 47356.438 45790.660 47456.973 15096.601 47929.840 22455.234
积极 17846.824 38980.133 45633.809 44174.820 33875.039 15156.063 42536.270 21467.840
积极 21047.588 40140.848 41672.648 46028.496 47426.527 16718.000 46978.664 19876.473
积极 20218.238 44660.602 41718.707 45799.375 46495.602 14590.264 54741.023 22011.938
积极 18531.740 41620.801 不适用 48082.313 35645.199 15341.382 48950.992 2117.559
意味 着 20652.601 42116.824 44564.769 45872.474 43130.827 15435.056 47743.783 21289.934
空白减法 20648.083 42116.035 44564.361 45870.463 43127.539 15433.923 47736.054 21285.871
未稀释 A 23024.961 44448.875 58897.510 51120.948 55450.191 18155.305 62844.068 27567.828
未稀释 B 18278.174 35252.586 54409.510 66022.396 43101.148 15732.609 60761.328 26581.979
1/50 A 521.670 755.035 1066.898 1287.187 1053.339 181.324 1278.336 580.961
1/50 B 435.326 634.215 1168.087 1383.537 991.040 165.443 1180.445 596.461
1/100 A 228.028 598.848 603.911 631.116 507.956 258.405 665.647 331.590
1/100 B 256.330 585.834 583.325 670.875 459.325 289.207 638.916 307.948
1/200 A 121.283 305.293 258.247 346.965 234.774 114.163 169.055 172.553
1/200 B 114.638 313.040 253.685 297.216 191.637 179.895 280.989 147.297
1/400 A 42.829 141.343 127.337 163.605 不适用 71.241 157.697 85.976
1/400 B 59.544 180.543 162.080 162.108 115.508 104.682 151.141 87.804
1/800 A 34.304 67.934 65.939 83.857 66.134 31.784 82.722 45.616
1/800 B 20.390 80.222 81.453 85.325 53.102 38.034 55.460 29.660
1/1600 A 15.405 44.505 47.672 39.613 33.027 18.006 37.655 20.988
1/1600 B 22.091 48.828 46.781 37.388 30.245 30.138 34.553 19.795
1/3200 A 12.333 22.104 16.850 18.403 11.460 10.535 21.245 9.218
1/3200 B 6.796 32.555 15.742 26.249 15.111 9.908 23.393 10.175
空白减法
未稀释 A 23020.443 44448.086 58897.103 51118.937 55446.903 18154.172 62836.339 27563.765
未稀释 B 18273.655 35251.797 54409.103 66020.385 43097.860 15731.477 60753.600 26577.916
1/50 A 517.152 754.246 1066.490 1285.176 1050.051 180.192 1270.607 576.898
1/50 B 430.808 633.426 1167.679 1381.526 987.751 164.311 1172.717 592.398
1/100 A 223.509 598.059 603.503 629.105 504.668 257.272 657.918 327.527
1/100 B 251.812 585.044 582.918 668.864 456.036 288.074 631.187 303.885
1/200 A 116.765 304.503 257.840 344.954 231.486 113.030 161.327 168.490
1/200 B 110.120 312.251 253.277 295.205 188.348 178.762 273.261 143.234
1/400 A 38.310 140.554 126.929 161.594 不适用 70.108 149.968 81.913
1/400 B 55.026 179.753 161.672 160.097 112.219 103.549 143.413 83.741
1/800 A 29.786 67.145 65.531 81.847 62.846 30.651 74.994 41.553
1/800 B 15.872 79.433 81.045 83.314 49.813 36.901 47.732 25.596
1/1600 A 10.886 43.716 47.264 37.602 29.739 16.874 29.927 16.925
1/1600 B 17.573 48.039 46.373 35.377 26.957 29.005 26.825 15.732
1/3200 A 7.815 21.314 16.442 16.392 8.172 9.402 13.517 5.155
1/3200 B 2.278 31.765 15.334 24.238 11.822 8.776 15.664 6.112
模拟 CI
未稀释 A 1.114895 1.055372 1.321619 1.114419 1.285650 1.176251 1.316329 1.294932
未稀释 B 0.885005 0.837016 1.220911 1.439279 0.999312 1.019279 1.272698 1.248618
1/50 A 0.025046 0.017909 0.023931 0.028018 0.024348 0.011675 0.026617 0.027102
1/50 B 0.020864 0.015040 0.026202 0.030118 0.022903 0.010646 0.024567 0.027831
1/100 A 0.010825 0.014200 0.013542 0.013715 0.011702 0.016669 0.013782 0.015387
1/100 B 0.012195 0.013891 0.013080 0.014582 0.010574 0.018665 0.013222 0.014276
1/200 A 0.005655 0.007230 0.005786 0.007520 0.005367 0.007323 0.003380 0.007916
1/200 B 0.005333 0.007414 0.005683 0.006436 0.004367 0.011582 0.005724 0.006729
1/400 A 0.001855 0.003337 0.002848 0.003523 不适用 0.004542 0.003142 0.003848
1/400 B 0.002665 0.004268 0.003628 0.003490 0.002602 0.006709 0.003004 0.003934
1/800 A 0.001443 0.001594 0.001470 0.001784 0.001457 0.001986 0.001571 0.001952
1/800 B 0.000769 0.001886 0.001819 0.001816 0.001155 0.002391 0.001000 0.001203
1/1,600 A 0.000527 0.001038 0.001061 0.000820 0.000690 0.001093 0.000627 0.000795
1/1,600 B 0.000851 0.001141 0.001041 0.000771 0.000625 0.001879 0.000562 0.000739
1/3,200 A 0.000378 0.000506 0.000369 0.000357 0.000189 0.000609 0.000283 0.000242
1/3,200 B 0.000110 0.000754 0.000344 0.000528 0.000274 0.000569 0.000328 0.000287
平均 CI(理论)
未稀释 (1) 0.999950 0.946194 1.271265 1.276849 1.142481 1.097765 1.294514 1.271775
1/50 (0.02) 0.022955 0.016474 0.025067 0.029068 0.023625 0.011161 0.025592 0.027466
1/100 (0.01) 0.011510 0.014046 0.013311 0.014148 0.011138 0.017667 0.013502 0.014832
1/200 (0.005) 0.005494 0.007322 0.005735 0.006978 0.004867 0.009453 0.004552 0.007322
1/400 (0.0025) 0.002260 0.003803 0.003238 0.003507 0.00260* 0.005626 0.003073 0.003891
1/800 (0.00125) 0.001106 0.001740 0.001645 0.001800 0.001306 0.002188 0.001285 0.001577
1/1,600 (0.000625) 0.000689 0.001089 0.001051 0.000795 0.000657 0.001486 0.000594 0.000767
1/3,200 (0.000313) 0.000244 0.000630 0.000357 0.000443 0.000232 0.000589 0.000306 0.000265
标准偏差
未稀释 0.11494 0.10918 0.05035 0.16243 0.14317 0.07849 0.02182 0.02316
1/50 0.00209 0.00143 0.00114 0.00105 0.00072 0.00051 0.00103 0.00036
1/100 0.00069 0.00015 0.00023 0.00043 0.00056 0.00100 0.00028 0.00056
1/200 0.00016 0.00009 0.00005 0.00054 0.00050 0.00213 0.00117 0.00059
1/400 0.00040 0.00047 0.00039 0.00002 0€ 0.00108 0.00007 0.00004
1/800 0.00034 0.00015 0.00017 0.00002 0.00015 0.00020 0.00029 0.00037
1/1,600 0.00016 0.00005 0.00001 0.00002 0.00003 0.00039 0.00003 0.00003
1/3,200 0.00013 0.00012 0.00001 0.00009 0.00004 0.00002 0.00002 0.00002
*表示单个实验的结果。

表3:绝对量化和模拟CI计算。

条件 竞争指数1
实验1
WTAA WT广告 WTAG WTAL WTAO WTAT WTAW WTAX
对数 0.927 × 0.033 0.992 × 0.031 1.068 × 0.025 0.921 × 0.02 1.044 × 0.03 1.051 × 0.057 1.094 × 0.027 0.929 × 0.005
固定 1.1 × 0.021 1.071 × 0.053 1.079 × 0.065 0.948 × 0.02 0.98 × 0.02 0.873 × 0.044 0.97 × 0.056 1.021 × 0.007
实验2
CI(传统) WTAA *A广告 *BAL *CAT _ABAG *ACAO *BCAW _ABCAX
对数 1 × 0 0.802 × 0.084 0.957 × 0.02 0.989 × 0.073 0.581 × 0.153 0.86 × 0.053 0.995 × 0.011 0.695 × 0.061
固定 1 × 0 0.97 × 0.063 1.043 × 0.058 0.99 × 0.036 1.625 × 0.589 0.835 × 0.051 0.912 × 0.047 0.477 × 0.049
CI(池化的接种)
对数 1.114 × 0.039 0.864 × 0.074 1.073 × 0.032 1.1 × 0.068 0.633 × 0.152 0.938 × 0.056 1.111 × 0.043 0.746 × 0.06
固定 1.078 × 0.039 1.039 × 0.049 1.166 × 0.093 1.066 ± 0.01 1.735 × 0.613 0.876 × 0.035 0.97 × 0.045 0.49 × 0.047
1值表示三个或四个复制实验的平均 CI = 标准偏差。

表4:S . Typhimurium菌株。

表 S1.可选引引,用于创建用于检测的其他条形码序列和相应的荧光探针。请点击此处下载此文件。

Figure 1
图 1.生成 pSKAP。(A) 纯化的pKD13受到欣德III和BamHI的限制消化。(B, C)含有FRT侧边卡那霉素抗性基因的1,333bp片段被纯化。(D) pPCR 脚本凸轮 SK+ 也与 HindIII 和 BamHI 一起消化,pKD13 (B) 的片段被连在一起以生成 (E) pSKAP.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:插入位点定向诱变到pSKAP。(A) 在位置725处插入25 bp DNA条形码是使用PCR进行的。特定于该位置的正向和反向引基设计为辅以 25 核苷酸 5' 扩展(在引注中表示为小写"a")。(B) 显示由 SDM 产生的通用 pSKAP_条形码质粒,插入的 DNA 条形码的位置突出显示橙色。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:色谱重放p下游。 (A) β - 红色介导重组后 , FRT 位点 ( 灰色 ) 的可选卡那霉素抗基因 ( 深紫色 ) 入指示的位点 ( 染色体重组位点 , 红色 ) 之间的染色体上。唯一的 DNA 条形码(橙色)插入到 FRT 站点的正下方。(B) Kanamycin抗性基因通过FRT介导的切除去除,在染色体上留下由DNA条形码和FRT疤痕组成的插入DNA的残余物(总插入DNA,蓝色)。(C) 显示插入DNA周围的修饰染色体DNA序列,以及用于数字PCR的扩增充注位(浅紫色)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:用于验证荧光探针灵敏度和特异性的稀释方案。(A) 从七个条形码菌株中纯化的 gDNA 以等量混合在一起,以创建稀释省略的条形码 gDNA 的稀释剂(上例中所示的 AX)。(B) 使用前面所述的制备稀释剂对省略的条形码 gDNA(上例中的 AX)进行串行稀释。在转移到下一个管子之前,彻底混合每个管子的内容物。图 4 是使用 BioRender 创建的。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:用于分析引探器集1和2的灵敏度和特异性的板布局。数字 PCR 实验包括 NTC、正控制、负控制以及每个测试条形码的稀释方案。用于验证底漆探针集 3 和 4 的板使用适当的条形码 gDNA 以相同的模式布局。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:稀释AA条形码DNA的代表性数字PCR结果。包含AA条形码的gDNA在所有其他条形码gDNA的背景中被稀释,如图4所述。通道 1 表示 AA 条形码(顶部面板)的 FAM 探头,通道 2 表示 AO 条形码的 HEX 探头(底部面板)。每个探针的结果既以单个液滴荧光振幅(左面板)一样显示,也以直方图形式显示,该直方图表示所选孔(右面板)中所有液滴的荧光强度频率。对于每种情况,正(高荧光)和负(低荧光)液滴应形成两个不同的群体。在被稀释的 AA 的情况下,并且大多数液滴为负值,直方图(右上面板)似乎只描绘了单个总体。这是因为正液滴的数量大大超过负液滴;然而,通过检查左面板中的滴荧光振幅,仍然可以看到两个不同的群体。 应使用阈值功能分隔种群以定义正液滴和负液滴(由粉红色线可视化)。阈值因所使用的探头而异,但使用相同探头组合的所有井都应具有相同的阈值。由于 AA 条形码 dna 被稀释,正(高荧光)液滴减少,而正 AO 液滴的数量在后台保持不变。请点击此处查看此图的较大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

准确量化微生物的能力对微生物研究至关重要,从最初的混合种群中列举独特菌株的能力已被证明是评估微生物的适应性和毒性特征的宝贵工具。细菌。然而,实现这一目的的技术并没有随着分子生物学的现代发展而进步。该技术可轻松修改许多细菌的染色体,包括S.Typhimurium,已经可用了近20年14,然而这种能力很少用于分子标记菌株与独特的DNA序列。通过利用基于插入细菌染色体的独特、破坏性最小的DNA条形码,以及最先进的技术来检测和量化这些分子标识符的能力,创建易于识别的菌株(即数字PCR),我们创建了一个系统,提供精细的灵敏度,特异性,准确性和精度,以轻松量化不同细菌种群中的单个菌株。

如上所述,计算 C 和 COIs 取决于对细菌染色体进行适当修改的能力。所有修改都应通过 Sanger 测序进行验证,以确保不会发生随机突变。使用高保真聚合酶将最大限度地减少这些错误,但任何此类突变都会损害检测菌株的能力,这是该协议的另一个关键方面。尽管我们已经证明,数字 PCR 在近 200 万个背景中可以检测到多达两个 gDNA 拷贝,但超出此范围的菌株可能需要额外的稀释才能准确定量。此外,DNA条形码序列的设计必须便于使用高质量的探针序列。应分析探针序列,以分析其自粘、形成发夹或无效绑定目标的倾向。使用质量序列和探测器的重要性不能最小化,每个探测器都必须执行仔细的验证实验就证明了这一点。努力创建最佳的DNA条形码将创造最佳的数字PCR定量结果。

虽然精心设计的分子标记对于获得高质量的结果很重要,但解释结果是该协议的另一个关键方面。CI被定义为突变菌株和野生型菌株在输出中除以输入1、19、20中两个菌株的比率。当混合感染只由一种菌株与野生型组成时,第 9 节中介绍的传统 CI 非常有用。然而,当使用大池菌株接种介质或动物时,菌株不仅与野生型竞争,而且与接种中存在的其他所有菌株竞争。以前使用多种感染菌株进行竞争实验的研究,在计算7、13时没有考虑到这一点。为了考虑混合感染的这一特性,我们引入了一个公式来计算已针对集合感染修改的 C。不可能所有菌株都提供同样水平的竞争,野生型菌株会。然而,由于大多数细菌基因对毒性影响很小,随着竞争指数实验中使用的菌株数量增加,整体毒性趋向野生型菌株的可能性增加。对于某些使用许多菌株池的实验设计,可能不一定如此,所有菌株都有已知的毒性缺陷。然而,这在修改后的方程中被解释,因为结果中不太丰富的菌株(拟合性)对X输出的影响较小。根据特定的实验设计,在某些情况下,可能首选一个或另一个公式。然而,在大多数涉及合并感染的病例中,必须考虑混合感染中,所有菌株相互竞争,而不仅仅是与野生型竞争。在分析结果时,必须充分理解每个公式背后的原理,以便对应变适应性做出最准确的解释。报告结果时,准确披露数据分析方式同样重要。

该协议的第9节还包括帮助确定使用COI的基因相互作用的公式。通过这种分析,可以预测以确定两个毒力基因是独立工作还是一起工作。COI定义为输出中双突变菌株与单突变菌株之比除以输入1中两个菌株的比率。该公式旨在检测基因中断的型状添加性。如果基因独立地作用,以提高毒性,两个基因的中断应该导致更大的健康下降相比,单一破坏任一基因。如果基因共同作用,以提高毒性(如基因编码两个酶在通路),任何一个基因的中断应该有相同的效果,破坏两个基因的毒性。当单个基因引起的衰减水平非常高或非常低的情况下,检测型型添加性可能很困难。然而,对同一动物体内菌株的直接比较提供了较少的变异性,并更可靠地说明基因之间的功能关系,这种计算可以从较大的混合种群中的两个菌株中进行。

解释结果的最后一个关键方面是考虑人口动态的影响。在一些具有多重菌株的混合感染中,由于随机种群漂移,单个菌株可能显得更占优势或更不适合。当发生瓶颈事件时,这种现象可能会放大。这可能是由于使用非常大量的输入菌株,在接种中非常少量的总细菌,或两者的组合造成的。混合感染产生的另一个干扰方面是跨补体的可能性。当拟合应变(如野生型)人为地增强拟合应变的毒性时,就会发生这种情况。一个假设的例子就是比较S的适应性。Typhimurium致病性岛2(SPI2)-敲除菌株与野生型菌株共同感染。SPI2 启用S。通过分泌效应器进入宿主细胞溶素,在巨噬细胞内改变噬菌体中的噬菌体,在细胞内存活。此系统的中断使S.易发生细胞内杀伤的Typhimurium。然而,由于巨噬细胞能够同时吞噬两个或两种以上的细菌,SPI2-敲除如果与野生类S一样生活在相同的巨噬细胞中,那么其体能就会大大增加。 将效应器分泌到宿主细胞醇中的Typhimurium。随机种群动力学和跨互补的可能性是任何竞争实验的一个限制。如果怀疑在转补,表型应确认使用其他补充方法评估健康。为了克服随机总体动力学,增加复制实验的数量会增加识别结果中异常值的可能性。幸运的是,上述协议使得进行更多相同的复制实验变得更加容易,因为实验条件的数量大大减少。

上述 CI 技术的一个关键要素是能够适应几乎任何有机体和需要准确定量微生物的任何实验设计。然而,它确实需要生物体的遗传操作,以纳入染色体上独特的DNA序列。该技术的适应性要求物种具有遗传可塑性,并将依靠替代协议的生成来修改基因组(步骤1和2)。表2和S1中列出的DNA条形码应该足以满足大多数细菌;然而,与所有定量PCR实验一样,通过简单的BLAST分析,分析细菌基因组以确保引物和探针脱靶束的最小潜力。在这项研究中使用的DNA条形码序列在某些情况下仅相差3-4个碱基,突出了探针的精细特异性,从而将非特定结合的可能性降至最低。无论荧光探针的特异性如何,所有新的条形码序列都必须经过适当的验证,以便获得步骤 6 中描述的灵敏度和特异性。在创建条形码菌株后,除了上述体外竞争检测外,还可以将该协议适应多种实验类型。该菌株适用于小鼠或其他动物模型系统中的体内竞争检测。从动物器官和组织中提取gDNA只需要极少的修改,这些修饰被用于此类目的的试剂盒制造商很好地描述。此外,在体内竞争的大型混合感染池已经成功地利用了7,提供了减少单个实验所需的动物数量的潜力,这不仅降低了这些实验的成本也降低了动物对动物变异的可能性。同样,条形码菌株可用于其他体外检测,以检查菌株对各种治疗条件的易感性(例如抗生素、酸易感性、活性氧或氮种杀伤等)。对于这些实验,通过在步骤3.4中向生长介质中加入所需的化学物质并按照所述继续进行,可以评估生长抑制。为了评估细菌死亡,可以混合大量菌株,并量化输入如上所述。接触所需治疗后,活细胞可以通过将数字PCR定量程序与可活PCR耦合,以区分活细胞和死细胞21、22、23进行选择性定量,24,25,26.这种实验的吞吐量将大大增加,因为每个菌株的稀释和复制板被更流线型的分子技术所取代。最后,虽然分析进化生物学和种群遗传学超出了本文的范围,但条形码生物体对此类研究具有很强的适应性。 最终,该协议的目的是开发一种强大的技术,用于量化细菌,这种技术具有很强的适应性,适用于多种物种和许多类型的实验。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

本出版物中报告的研究得到了乔治·哈迪克斯总统学院研究基金和国家卫生研究院国家普通医学研究所的支持,奖励编号为GM103427。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 22600028 Procure from any manufacturer
16 mL culture tubes MidSci 8599 Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tips RAININ 30389241 Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipette RAININ 17013804 Use alternative multichannel pipettes with caution
Agarose ThermoFisher Scientific BP160-500 Procure from any manufacturer
BLAST Analysis NCBI N/A https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module Bio Rad 1851197 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5α Invitrogen 18258012 Procure from any manufacturer or prepare yourself
Chloramphenicol ThermoFisher Scientific BP904-100 Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate reader BioTek CYT5MF Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) Bio Rad N/A Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well Plates Bio Rad 12001925 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader Oil Bio Rad 1863004 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Bio Rad 1863024 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1864008 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1863009 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for Probes Bio Rad 1863005 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Kanamycin ThermoFisher Scientific BP906-5 Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agar ThermoFisher Scientific BP1425-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani broth ThermoFisher Scientific BP1426-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio Rad 1814040 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR Tubes Eppendorf 951010022 Procure from any manufacturer
Petri dishes ThermoFisher Scientific FB0875712 Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+ Stratagene/Agilent 211192 No longer available commercially
Primer/Probe Design IDT N/A https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_Barcodes Addgene Plasmid numbers 122702-122726 www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer Bio Rad 1814000 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Generator Bio Rad 1864002 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Reader Bio Rad 1864003 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s ATCC ATCC 14028s www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate BioTek TAKE3 Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHI ThermoFisher Scientific FERFD0054 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnI ThermoFisher Scientific FERFD1704 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIII ThermoFisher Scientific FERFD0504 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit ThermoFisher Scientific FERK0832 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit ThermoFisher Scientific FERK0503 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F534L Procure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific FEREL0011 Procure from any manufacturer
Thermocycler Bio Rad 1861096 Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue Transilluminator ThermoFisher Scientific UV95043301 Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology Grade ThermoFisher Scientific BP28191 Procure from any manufacturer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
  2. Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
  3. Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
  4. Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
  5. Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
  6. Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
  7. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
  8. Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
  9. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  10. Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
  11. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
  12. Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
  13. Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
  16. Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
  17. McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
  18. Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
  19. Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
  20. Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
  21. Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
  22. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
  23. Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
  24. Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
  25. Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
  26. Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
  27. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
  28. Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
  29. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).

Tags

遗传学 问题 147 竞争指数 毒力因子 健身 细菌定量 ddPCR 数字 PCR,取消竞争指数 沙门氏菌 DNA条形码 分子定量 基因相互作用
基于数字PCR的<em>沙门氏菌</em>健康高通量分析竞争指数
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital… More

Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella. J. Vis. Exp. (147), e59630, doi:10.3791/59630 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter