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Genetics

Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59630
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

Summary

Cette approche moléculaire pour déterminer la forme physique bactérienne facilite la détection précise et précise des micro-organismes à l'aide de codes-barres d'ADN génomique uniques qui sont quantifiés par l'intermédiaire du PCR numérique. Le protocole décrit le calcul de l'indice concurrentiel des souches de Salmonella; cependant, la technologie est facilement adaptable aux protocoles exigeant la quantification absolue de n'importe quel organisme génétiquement malléable.

Abstract

Un indice concurrentiel est une méthode courante utilisée pour évaluer la condition physique bactérienne et/ou la virulence. L'utilité de cette approche est illustrée par sa facilité à effectuer et sa capacité à normaliser la condition physique de nombreuses souches à un organisme de type sauvage. La technique est toutefois limitée par les marqueurs phénotypiques disponibles et le nombre de souches qui peuvent être évaluées simultanément, ce qui crée la nécessité d'un grand nombre d'expériences de repli. Parallèlement à un grand nombre d'expériences, les coûts de main-d'œuvre et de matériaux pour quantifier les bactéries à partir de marqueurs phénotypiques ne sont pas négligeables. Pour surmonter ces aspects négatifs tout en conservant les aspects positifs, nous avons développé une approche moléculaire pour quantifier directement les micro-organismes après l'ingénierie des marqueurs génétiques sur les chromosomes bactériens. Unique, 25 paires de base codes-barres d'ADN ont été insérés à un locus inoffensif sur le chromosome des souches sauvages de type et mutant de Salmonella. Des expériences de compétition in vitro ont été réalisées à l'aide d'inocula composées de souches mises en commun. Après la compétition, les nombres absolus de chaque souche ont été quantifiés à l'aide de PCR numérique et les indices concurrentiels pour chaque souche ont été calculés à partir de ces valeurs. Nos données indiquent que cette approche pour quantifier Salmonella est extrêmement sensible, précise et précise pour détecter à la fois des micro-organismes très abondants (haute condition physique) et rares (faible condition physique). En outre, cette technique est facilement adaptable à presque n'importe quel organisme avec des chromosomes capables de modification, ainsi qu'à diverses conceptions expérimentales qui nécessitent une quantification absolue des micro-organismes.

Introduction

L'évaluation de la condition physique et de la virulence des organismes pathogènes est un aspect fondamental de la recherche en microbiologie. Il permet de faire des comparaisons entre les souches ou entre les organismes mutés, ce qui permet aux chercheurs de déterminer l'importance de certains gènes dans des conditions spécifiques. Traditionnellement, l'évaluation de la virulence utilise un modèle animal d'infection à l'aide de différentes souches bactériennes et en observant les résultats de l'animal infecté (p. ex. Dose infectieuse50, Dose létale50, temps de mort, sévérité des symptômes, absence de symptômes, etc.). Cette procédure fournit des descriptions précieuses de la virulence, mais elle exige des souches de causer des différences considérables dans les résultats afin de détecter les variations de type sauvage. En outre, les résultats sont semi-quantitatifs parce que si la progression de la maladie et la gravité des symptômes peuvent être subjectivement quantifiées au fil du temps, l'interprétation de la virulence par rapport au type sauvage est plus qualitative (c.-à-d. plus, moins, ou tout aussi virulente). Une alternative commune aux essais d'infectiosité animale est de générer des indices concurrentiels (CI), des valeurs qui comparent directement la forme physique ou la virulence d'une souche à une contrepartie de type sauvage dans une infection mixte1. Cette technique présente de nombreux avantages par rapport à un modèle animal traditionnel d'infection en standardisant la virulence d'une souche de type sauvage et en déterminant une valeur quantifiable pour refléter le degré d'atténuation. Cette technique peut également être adaptée pour analyser les interactions génétiques chez les bactéries en déterminant un indice concurrentiel annulé (COI)2. Le calcul d'un ICO pour un groupe d'organismes mutés permet aux chercheurs de déterminer si deux gènes contribuent indépendamment à la pathogénie ou s'ils sont impliqués dans la même voie de virulence et dépendent les uns des autres. En outre, le calcul d'un CI nécessite l'énumération des bactéries qui peuvent fournir des informations précieuses sur la pathogénie des organismes. Les IC et les IC permettent également aux chercheurs d'asses souches avirulentes qui ne causent pas de maladie clinique, mais qui ont encore des différences de condition physique. Cette technique est limitée par l'utilisation de marqueurs traditionnels de résistance aux antibiotiques pour identifier les souches, limitant ainsi le nombre de souches d'entrée à seulement une ou deux à la fois. En raison de cette limitation, un grand nombre de groupes expérimentaux et de répliques sont nécessaires, ce qui, en plus d'augmenter les coûts de main-d'œuvre et de matériaux, augmente également les possibilités de variabilité dans les conditions expérimentales et les résultats inexacts. (Pour un examen approfondi des avantages et des applications de l'utilisation d'infections mixtes pour étudier la virulence, la condition physique et les interactions génétiques, voir C.R. Beuzon et D.W. Holden 1)

Des tentatives ont été faites pour surmonter cette limitation, comme l'utilisation de cellules fluorescentes quantifiées par cytométrie de flux3,4,5. Cette technique quantifie les cellules à l'aide d'anticorps étiquetés 1) à des marqueurs phénotypiques ou 2) de protéines fluorescentes produites endogènement. L'utilisation d'anticorps étiquetés a une limite de détection de 1000 cellules/mL, et nécessite donc un grand nombre de cellules pour analyser3. Les cellules exprimant des protéines fluorescentes ont une physiologie altérée et sont sensibles aux changements de forme physique résultant de l'expression riche en protéines6. Les deux méthodes sont limitées par le nombre de marqueurs fluorescents détectables à l'aide de la cytométrie du débit. Un progrès dans la quantification moléculaire a été réalisé par le développement d'une technique de microarray qui a détecté l'atténuation dans 120 souches d'une infection mélangée initiale de plus de 1.000 souches dans un modèle de murine7. Cette technique a utilisé une analyse de microarray de l'ARN des souches mutées, qui mènent à la variabilité considérable dans le résultat.  Néanmoins, il a établi que de grands bassins d'infections mixtes peuvent être un outil utile et qu'en utilisant des techniques de détection sensibles, des différences dans la virulence bactérienne peuvent être identifiées. Avec le développement du séquençage de la prochaine génération, Tn-seq a élargi l'utilité des mutations transposon, permettant une méthode puissante pour quantifier les bactéries qui ont été mutées au hasard8,9,10, 11. Un protocole alternatif a été récemment développé qui élimine le besoin de transposons et utilise plutôt des codes-barres d'ADN pour identifier et suivre plus facilement les changements génomiques et leur impact sur la condition physique12. Cette technologie est un progrès majeur, mais l'insertion des codes à barres génomiques est encore un processus aléatoire. Pour surmonter le caractère aléatoire des expériences précédentes, Yoon et coll. ont mis au point une méthode pour calculer les IC des souches de Salmonella à l'aide de codes-barres d'ADN uniques insérés à des endroits précis sur les chromosomes des bactéries13. Des souches à code à barres uniques ont été détectées à l'aide d'une méthode qPCR avec sYBR vert et amorces spécifiques à chaque code-barres unique. La technique a été limitée par des contraintes imposées par qPCR, y compris des différences dans l'efficacité des amorces et une faible sensibilité, comme en témoigne la nécessité de l'imminance-PCR avant qPCR. Néanmoins, cette approche a démontré que des modifications génomiques ciblées pouvaient être exploitées pour détecter et quantifier potentiellement des bassins de souches bactériennes multiples.

Dans le protocole suivant, nous décrivons une nouvelle méthodologie pour effectuer des expériences de compétition bactérienne avec de grands pools d'inocula mélangés suivis d'une quantification précise à l'aide d'une technique de PCR numérique très sensible. Le protocole consiste à étiqueter génétiquement les souches bactériennes avec un code-barres unique d'ADN inséré sur une région inoffensive du chromosome. Cette modification permet aux souches d'être rapidement et avec précision quantifiées à l'aide de la technologie moléculaire moderne au lieu des dilutions en série traditionnelles, du placage de réplique et du comptage des unités de formation de colonies qui reposent sur des marqueurs phénotypiques (c.-à-d. résistance aux antibiotiques ). Les modifications permettent d'évaluer simultanément de nombreuses souches dans un seul inoculum mis en commun, réduisant considérablement la possibilité de variabilité expérimentale parce que toutes les souches sont exposées aux mêmes conditions exactes. En outre, bien que cette technique ait été développée dans Salmonella enterica serovar Typhimurium, elle est très adaptable à tout organisme génétiquement malléable et presque à toute conception expérimentale où des numérations bactériennes précises sont nécessaires, fournissant une nouvelle d'augmenter la précision et le débit dans les laboratoires de microbiologie sans les contraintes imposées par les méthodes précédentes.

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Protocol

1. Incorporez des codes-barres d'ADN uniques sur un Plasmide contenant les composants nécessaires à l'échange allélique

REMARQUE: Un nouveau plasmide, nommé pSKAP, avec un nombre de copies élevés et une efficacité de transformation accrue par rapport au plasmide d'échange allélique pKD13 existant a été créé. Cela est décrit dans les étapes 1.1-1.12 (figure 1). Les plasmides finalisés contenant des codes-barres et des composants uniques d'ADN pour l'échange allélique sont disponibles par l'intermédiaire d'un dépôt de plasmide (tableau des matériaux).

  1. À l'aide d'un kit de miniprep plasmique commercial, purifie pKD1314 et pPCR Script Cam SK- à partir de cultures bactériennes de nuit cultivées dans le bouillon Luria-Bertani (LB) complété par 50 g/mL de kanamycine ou 25 g/mL de chloramphenicol (pour pKD13 et pPCR Script Cam respectivement) ( Tableau1).
  2. Effectuer des digestions de restriction sur les deux plasmides en utilisant des enzymes de restriction commerciale HindIII et BamHI selon les spécifications du fabricant.
  3. Enlevez les enzymes de restriction et l'ADN excisé de la réaction de pPCR Script Cam SK et purifiez la paire de 3 370 bases (bp) épine dorsale plasmide à l'aide d'un kit de nettoyage de l'ADN disponible dans le commerce selon les spécifications du fabricant.
  4. Séparez les fragments de la digestion de restriction de pKD13 sur un gel d'agarose de 1% utilisant une chambre d'électrophoresis.
  5. Visualisez les bandes à l'aide d'un transilluminateur de lumière bleue et excisez le fragment de 1 333 pb du gel (Figure 1C).
    REMARQUE: Ce fragment contient le gène de résistance à la kanamycine frT-flanked requis pour le remplacement allélique chromosomique.
  6. Purifier l'ADN excisé de l'étape 1.5 à l'aide d'un kit commercial d'extraction de gel.
  7. Pour créer pSKAP, ligate le fragment purifié de pKD13 (à partir de l'étape 1.6) en pPCR Script Cam SK (à partir de l'étape 1.3) en utilisant une ligase commerciale d'ADN T4 selon les spécifications du fabricant.
  8. Transformez les cellules DH5mD chimiquement compétentes avec le plasmide pSKAP ligated suivant le protocole du fabricant (tableau 1).
  9. Étendre les transformants sur les plaques d'agar LB complétées par une kanamycine de 50 g/mL et incuber à 37 oC pendant la nuit.
  10. Choisissez une colonie dans la plaque et étirez-la sur une nouvelle plaque d'agar LB complétée par une kanamycine de 50 g/mL et incubez-la à 37 oC pendant la nuit. Choisissez une colonie dans cette assiette et utilisez-la pour inoculer le bouillon LB complété par une kanamycine de 50 g/mL. Incuber la culture toute la nuit à 37 oC avec une agitation constante.
  11. Utilisez un kit de miniprep plasmide commercial pour purifier le pSKAP de la culture bactérienne du jour au lendemain.
  12. Effectuer une digestion de restriction diagnostique du plasmide à partir de l'étape 1.11 en utilisant Hind III et Bam HI selon les spécifications du fabricant. Visualisez des fragments sur un gel agarose de 1 % comme dans les étapes 1.4-1.5.
    REMARQUE: La taille totale de pSKAP devrait être de 4 703 pb. Les fragments après l'étape 1,12 devraient être de 3 370 et 1 333 pb.
  13. Concevoir des amorces PCR pour la mutagénèse dirigée par site insertionnel (SDM) (tableau2 et S1) de manière à insérer une séquence unique d'ADN de 25 paires à la position 725 de pSKAP (figure 2).
    REMARQUE: L'ADN de code-barres est inséré dans le plasmide juste à l'extérieur du gène de résistance à la kanamycine flanqué de FRT, de sorte que le code-barres n'est pas perdu lors de l'enlèvement ultérieur de la cassette de résistance à la kanamycine. Si vous génèrez de nouvelles séquences de codes à barres, utilisez des outils en ligne pour vous assurer que les sondes PCR fluorescentes (ci-après appelées simplement « sondes ») se lient efficacement à la nouvelle séquence. Les séquences d'insertion conçues à ce jour, ainsi que les amorces nécessaires pour les créer, sont fournies dans les tableaux 2 et S1.
  14. Préparer les réactions SDM à l'aide d'une polymérase commerciale à haute fidélité, des paires d'amorces souhaitées (tableau 2) et d'un modèle pSKAP. Définir le thermocycleur pour effectuer les étapes suivantes : 1) 98 oC pour 30 s, 2) 98 oC pour 10 s, 56 oC pour 15 s, 72 oC pour 2 min, 3) répéter les étapes 2, 24 fois, 4) 72 oC pour 5 min, 5) tenir à 4 oC.
  15. Après l'achèvement de PCR, épuisez le modèle de pSKAP en ajoutant l'enzyme de restriction Dpn I à la réaction. Incuber à 37 oC pendant 20 min.
    REMARQUE: Les produits de PCR doivent être visualisés sur un gel d'agarose pour vérifier la taille et la pureté du produit. Une digestion d'I de contrôle composée du modèle non modifié de pSKAP peut être exécutée et employée dans les étapes suivantes pour s'assurer que l'ADN de modèle est complètement digéré.
  16. Utilisez 5 L du produit à partir de l'étape 1,15 pour transformer 100 l de cellules DH5 commerciales chimiquement compétentes selon les recommandations du fabricant.
  17. Étendre les transformants sur les plaques d'agar LB complétées par du chloramphenicol de 25 g/mL et incuber à 37 oC pendant la nuit.
  18. Sélectionnez une colonie (ou colonies) à partir de plaques de nuit et stries sur des plaques d'agar LB individuelles complétées par du chloramphenicol de 25 g/mL et incubez à 37 oC pendant la nuit. Sélectionnez une colonie dans des assiettes de nuit et utilisez-la pour inoculer 5 ml de bouillon LB complété par du chloramphenicol de 25 g/mL. Incuber la culture (s) pendant la nuit à 37 oC avec une agitation constante.
  19. Utilisez un kit de miniprep plasmide commercial pour purifier les plasmides de la culture de nuit.
  20. Séquence de sanger plasmides purifiés à l'aide de l'amorce de séquençage vers l'avant M13 (tableau 2). Comparez la région mutée au plasmide d'origine et évaluez la précision de l'insertion SDM.
  21. Après avoir confirmé l'insertion et la précision du code-barres, assignez chaque code-barres et plasmide zunauun un nom.
    REMARQUE: Les codes-barres générés à ce jour ont reçu une désignation de deux lettres : AA, AB, AC, ..., BA, BB, BC, etc. Les plasmides à code à barres sont désignés comme pSKAP-AA, pSKAP-AB, pSKAP-AC, ..., pSKAP-BA, pSKAP-BB, pSKAP-BC, etc.
  22. Répétez les étapes 1.14-1.21 pour générer le nombre désiré de codes à barres d'ADN.

2. Introduire le code-barres d'ADN sur le chromosome de S. Typhimurium

REMARQUE: Insertion de codes-barres d'ADN sur le S. Typhimurium chromosome est atteint en utilisant une méthode d'échange allélique décrit par Datsenko et Wanner14 qui a été modifié pour une utilisation en S. Typhimurium.

  1. Déterminer le locus sur le S. Génome du typhimurium pour insérer le code-barres de l'ADN (Figure 3).
    REMARQUE: Sélectionnez une grande région intergénique du chromosome. Évitez les régions qui produisent de l'ARN non codant. Cette étude a utilisé un locus en aval du put P entre les résidus 1 213 840 et 1 213 861 (déterminé à partir de l'assemblage du génome GCA-000022165.1). Cette région a déjà été génétiquement manipulée pour dans la complémentaration trans des gènes15. Alternativement, un code-barres d'ADN pourrait être introduit tout en perturbant simultanément un gène d'intérêt. Cela nécessiterait des modifications minimes à ce protocole et rationaliserait la création mutante.
  2. Concevoir des amorces PCR pour amplifier le code-barres unique et le gène de résistance à la kanamycine à flanc de FRT du plasmide pSKAP désiré contenant du code-barres à partir de l'étape 1.21 (tableau 2). Ajouter des extensions de 40 nucléotides qui sont homologues à la région sélectionnée à l'étape 2.1 à la fin de 5' de chaque amorce (tableau 2).
  3. Effectuez l'amplification à l'aide d'une polymérase commerciale haute fidélité, des amorces de l'étape 2.2 et du plasmide plasmide contenant le code-barres pSKAP souhaité comme modèle. Définir le thermocycleur pour effectuer les éléments suivants : 1) 98 oC pour 30 s, 2) 98 oC pour 10 s, 3) 56 oC pour 15 s, 4) 72 oC pour 60 s, répéter les étapes 2-4 29 fois, 5) 72 oC pour 5 min, 6) tenir à 4 oC.
  4. Après l'achèvement de PCR, épuisez l'ADN de modèle utilisant DpnI comme décrit dans l'étape 1.15. Purifiez et concentrez l'ADN à l'aide d'un kit commercial de nettoyage de l'ADN selon les spécifications du fabricant.
  5. Se référer au protocole précédemment publié pour générer des mutants en S. Typhimurium souche 14028s de produits PCR14,16,17,18.
    REMARQUE: Il n'est pas essentiel que le gène de résistance à la kanamycine soit excisé du chromosome. Cependant, l'excision du gène est peu perturbatrice pour le chromosome bactérien car elle a comme conséquence une cicatrice de 129 bp qui laisserait les gènes en aval potentiels dans le cadre. Il est recommandé que la souche contenant le gène de résistance à la kanamycine soit conservée car elle peut être utilisée pour déplacer les codes-barres entre les souches par transduction à médiation P22.
  6. Répétez les étapes 2.3 à 2.5 pour créer les souches désirées avec les codes à barres appropriés.
    REMARQUE: Les codes-barres peuvent être introduits dans le type sauvage S. Typhimurium qui peut ensuite être soumis à d'autres manipulations génétiques, ou codes à barres peuvent être introduits dans des souches qui ont déjà été génétiquement modifiés.

3. Conditions de croissance bactérienne et essais de concurrence in vitro

  1. Du stock de bactéries, strie désirée S. Typhimurium souches qui abritent chacun un code-barres d'ADN unique sur les plaques d'agar LB. Incuber les assiettes pendant la nuit à 37 oC.
  2. Sélectionnez une seule colonie de chaque souche et inoculer 5 ml de bouillon LB. Incuber pendant 20 h à 37 oC avec une agitation constante.
    REMARQUE: En utilisant la culture du jour au lendemain, passez à l'étape 3.5 pour recueillir l'ADN génomique pur (GDNA) de chaque souche codée à barres. Ceci est nécessaire pour les expériences ultérieures de validation et de contrôle de la section 6.
  3. Pour chaque essai de compétition, transférez un volume égal de chaque culture de nuit dans un tube stérile de taille appropriée. Mélanger soigneusement les souches ensemble en vortexant vigoureusement pendant au moins 5 s.
    REMARQUE: Le volume de chaque culture de nuit à transférer devrait être suffisant pour chaque condition et de reproduire, ainsi que pour isoler l'ADN gpour quantifier l'entrée. Bien qu'il ne soit pas tout à fait nécessaire de mesurer les densités optiques des cultures parce que le nombre absolu de micro-organismes d'entrée sera quantifié à l'aide de PCR numérique, le nombre de bactéries d'entrée pour chaque souche devrait être à peu près égal pour éviter les goulots d'étranglement ou concurrence inégale au début de l'expérience. Les tests de concurrence représentatifs dans ce protocole ont comparé simultanément les taux de croissance de 8 souches. Des souches supplémentaires ou moins nombreuses peuvent être nécessaires pour des conceptions expérimentales individuelles.
  4. Transférer 100 l de l'inoculum mélangé dans un bouillon LB stérile de 4,9 ml. Incuber à 37 oC pour le temps désiré ou à une densité optique désirée.
  5. Récolte de 500 l'inoculum par centrifugation à 12 000 x g pendant 1 min. Retirez et jetez le supernatant. Passez immédiatement à la section 4 avec les cellules.
  6. Aux moments désirés, retirez 500 aliquots de culture et récoltez les cellules par centrifugation à 12 000 x g pendant 1 min. Retirez et jetez le supernatant.
    REMARQUE: Si vous collectez des aliquots à plusieurs points de temps, congelez les granulés à -20 oC ou passez immédiatement à l'étape 4.1 après chaque collecte.

4. Collecte et quantification de l'ADN g de S. Typhimurium (à partir des étapes 3.5 et 3.6)

  1. Récoltez l'ADNc à partir de cellules à l'aide d'un kit commercial de purification de l'ADNc. Si disponible, effectuez l'étape facultative d'épuisement d'ARN.
    REMARQUE: L'épuisement de l'ARN n'est pas nécessaire; cependant, la présence d'ARN augmentera artificiellement la concentration d'ADN, menant aux calculs aberrants dans les étapes suivantes. Si vous utilisez un kit commercial de purification de l'ADNc, suivez les recommandations du fabricant pour vous assurer que la colonne n'est pas surchargée d'ADN. Il n'y a pas de concentration minimale d'ADN requise si l'échantillon est quantifiable dans les étapes suivantes.
  2. Utilisez un spectrophotomètre pour quantifier l'ADN dans chaque échantillon.
    REMARQUE: L'ADN peut être quantifié à l'aide de n'importe quelle méthode fiable.
  3. Calculer le nombre de copies d'ADNc en fonction de la taille du génome bactérien en utilisant l'équation suivante où: X est la quantité d'ADN en ng et N est la longueur d'une molécule d'ADN à double brin (la taille du génome).
    Equation 1
    REMARQUE : 660 g/taupe est utilisée comme masse moyenne de 1 ADN bp. De petites variations peuvent exister selon la composition du nucléotide de l'organisme. De nombreuses calculatrices sont disponibles en ligne pour effectuer le calcul.

5. Concevoir des amorces et des sondes pour la détection quantitative des codes à barres d'ADN par l'intermédiaire de PCR dDigital

  1. Concevoir des amorces pour amplifier la région codée à barres du S. Chromosome typhimurium en aval du putP (Figure 3C et tableau 2).
    REMARQUE: Les conceptions d'apprêt et de sonde peuvent être facilitées par de nombreux programmes en ligne (tableaudes matériaux). Si les codes-barres sont tous insérés au même loci, un seul ensemble d'amorces d'amplification est universel pour tous les codes à barres.
  2. Concevoir des sondes à base de 6 carboxyfluorescein (FAM) et/ou hexachlorofluorescein (HEX) spécifiques à chaque code-barres (tableau2 et S1).
    REMARQUE: Le lecteur de gouttelettes utilisé dans cette expérience est capable de détecter simultanément les sondes BASÉES sur FAM et HEX dans une réaction multiplexe. Concevoir la demi-partie des sondes pour utiliser FAM et 1/2 pour utiliser HEX. Il ne s'agit pas d'une étape nécessaire, mais elle réduira l'utilisation du réactif et les coûts expérimentaux s'ils sont mis en œuvre.
  3. Faire 20x mélanges maître d'amorce-probe contenant 1) 20 mm de chaque amorce d'amplification vers l'avant et inverse, 2) 10 mm d'une seule sonde FAM, et 3) 10 mM d'une seule sonde HEX (si multiplexage).

6. Valider la sensibilité et la spécificité de chaque ensemble de sondes Pprimer pour chaque code à barres génomique à l'aide de PCR numérique

REMARQUE: Ce protocole utilise la validation de huit codes à barres uniques avec huit sondes uniques à titre d'exemple. Le nombre de codes-barres utilisés peut être augmenté ou diminué pour accueillir diverses conceptions expérimentales.

  1. Créez un pool de gDNA qui contient tous les codes à barres sauf un. Utilisez ce pool comme diluant pour effectuer une série de dilution avec de l'ADN g contenant le seul code à barres restant (le schéma de dilution de l'échantillon est fourni à la figure 4).
    REMARQUE: L'utilisation de l'ADG mise en commun comme diluant assure un arrière-plan cohérent tout en vérifiant la sensibilité. À l'aide des numéros de copie déterminés à l'étape 4.3, diluer l'ADGn à un numéro de copie dans la plage pcR numérique recommandée (1 à 100 000 exemplaires par réaction de 20 L). Gardez à l'esprit que la plage est fixée pour chaque cible unique (code à barres), pas l'ADN total.
  2. Préparer les réactions pour PCR numérique en double selon les recommandations du fabricant pour l'utilisation d'un supermix PCR numérique conçu pour la chimie basée sur la sonde. Utilisez les mélanges de l'étape 6.1 comme modèle d'ADN. Utilisez le mix maître 20x primer-probe de l'étape 5.3 qui contient la sonde pour le code à barres dilué dans l'étape 6.1.
  3. Préparer les réactions de contrôle de répétition pour PCR numérique selon les recommandations du fabricant pour l'utilisation d'un supermix PCR numérique conçu pour la chimie basée sur la sonde. Les réactions de contrôle pour chaque mélange de sonde doivent consister en 1) aucun modèle de contrôle (CNT), 2) de contrôles négatifs et 3) de contrôles positifs.
    REMARQUE: Le nombre minimum de réactions de contrôle de repli est de deux. Cet exemple de protocole utilise quatre CNT, six contrôles négatifs et six contrôles positifs pour chaque code à barres. Les contrôles négatifs doivent contenir de l'ADN g avec chaque code à barres, à l'exception du code-barres correspondant à la sonde testée. Cela permettra de valider la spécificité de chaque sonde.
  4. Répétez les étapes 6.1-6.3 pour créer des réactions PCR numériques pour chaque échantillon de gDNA codé à barres. Un arrangement de plaque d'échantillon est présenté à la figure 5.
    REMARQUE: Cette étape et les étapes suivantes sont décrites sur la base d'une plate-forme PCR numérique spécifique qui utilise des gouttelettes et une technologie basée sur le flux. D'autres plates-formes PCR numériques qui utilisent la technologie à puce peuvent facilement être remplacées par de légères modifications à ce protocole. L'étape 6.4 peut nécessiter plus d'une plaque de 96 puits pour valider tous les ensembles d'amorces. Contrairement au qPCR, les plaques séparées analysées par PCR numérique peuvent être facilement comparées sans avoir besoin de puits de référence normalisés entre les plaques.
  5. Générer des gouttelettes pour chaque condition de réaction à l'aide d'un générateur de gouttelettes selon les instructions du fabricant.
  6. Transférer les gouttelettes nouvellement créées dans la plaque appropriée de 96 puits. Utilisez des pointes de pipette de 200 l sur une pipette multicanal de 5 à 50 l.
    REMARQUE: Lorsque pipetting gouttelettes, pipette lentement et en douceur! Le fabricant d'équipement sp. numérique recommande d'utiliser uniquement des pipettes et des conseils de pipette s'il n'y a pas de fabricants particuliers (p. ex. Ranin). Ces pointes de pipette ont une ouverture lisse sans fragments de plastique microscopiques qui peuvent détruire des gouttelettes ou endommager les microfluidiques du lecteur de gouttelettes. De nombreuses marques de conseils ont été examinées et observées pour avoir un spectre de qualité de fabrication. Des résultats équivalents ont été obtenus à l'aide d'alternatives à la pointe de pipette; toutefois, il faut faire preuve de prudence lorsqu'il s'écarte des recommandations du fabricant.
  7. Une fois que toutes les gouttelettes ont été générées et transférées, scellez la plaque à l'arme à l'eau.
  8. Utiliser le thermocycleur recommandé par le fabricant pour effectuer les conditions de cycle suivantes : 1) 94 oC pendant 10 min; 2) 94 oC pour 1 min, taux de rampe fixé à 1 oC/s; 3) 55 oC pendant 2 min, taux de rampe fixé à 1 oC/s; 4) répéter les étapes 2 et 3 49 fois; 5) 98 oC pendant 10 min; 6) tenir à 4 oC jusqu'à 24 h.
    REMARQUE: Le transfert thermique dans une réaction de gouttelette n'est pas le même que PCR standard. Les conditions de réaction peuvent nécessiter des modifications.
  9. Pendant que le thermocyclisme est effectué, programmez le logiciel d'analyse de données avec les informations de configuration de plaque telles que le nom de l'échantillon, le type d'expérience (quantification absolue), le supermix utilisé, le nom cible 1 (nom de code-barres FAM), le type de cible 1 (NTC, contrôle positif, contrôle négatif, ou inconnu), nom cible 2 (nom de code à barres HEX), type cible 2 (blanc, contrôle positif, contrôle négatif ou inconnu). Les informations de configuration de la plaque finale sont affichées à la figure 5.
  10. Une fois le thermocycle terminé, transférez les réactions terminées au lecteur de gouttelettes et commencez le processus de lecture selon les instructions du fabricant.

7. Quantifier le nombre de bactéries dans une expérience d'indice concurrentiel

  1. Diluer l'ADN g isolé et quantifié de la section 4 à une concentration appropriée comme décrit ci-dessus.
  2. Préparer les réactions pour PCR numérique selon les recommandations du fabricant pour l'utilisation du supermix approprié. Utilisez l'ADN de l'étape 7.1 comme modèle. Utilisez un mélange maître 20x primer-probe qui contient la sonde (ou les sondes si la détection à la fois FAM et HEX) pour les codes à barres possibles présents dans l'expérience.
  3. Préparer des réactions PCR numériques supplémentaires comme à l'étape 7.2 en utilisant différents mélanges 20x primer-probe maître jusqu'à ce que tous les codes-barres utilisés dans la conception expérimentale peut être détecté.
  4. Inclure des contrôles pour chaque condition décrite dans 6.3. Cela comprend 1) aucun modèle de contrôle (CNT), 2) les contrôles négatifs et 3) les contrôles positifs.
  5. Continuer avec le protocole tel que décrit dans les étapes 6.5-6.10.

8. Analyser les données PCR numériques et calculer les numéros de copie absolue

  1. Lorsque tous les puits ont été lus et que l'exécution est terminée, ouvrez le fichier de données .qlp à l'aide du logiciel d'analyse de données.
    REMARQUE: Les types de fichiers et les procédures d'analyse de données décrites ici sont spécifiques à un fabricant de PCR numérique. Si l'utilisation d'autres plates-formes PCR numériques, les types de fichiers et les procédures d'analyse de données seront spécifiques à la plate-forme utilisée et doivent être effectuées selon les spécifications recommandées par le fabricant.
  2. Sélectionnez tous les puits qui utilisent le même mélange maître amorce-probe.
  3. Sur l'onglet Droplets, examinez le nombre de gouttelettes analysées dans chaque puits (gouttelettes positives et négatives). Exclure de l'analyse tout puits qui a moins de 10.000 gouttelettes totales.
  4. Déplacez-vous vers l'onglet Amplitude 1D et examinez les amplitudes des gouttelettes positives et négatives. Assurez-vous qu'ils comprennent deux populations distinctes.
  5. Dans le logiciel, utilisez la fonction de seuil pour faire une coupure entre les gouttelettes positives et négatives pour chaque sonde qui a été utilisée (Figure 6).
    REMARQUE: Tous les puits qui utilisent le même mélange maître amorce-probe de l'étape 5.3 devraient avoir les mêmes seuils.
  6. Une fois que des seuils appropriés ont été appliqués à tous les puits, le logiciel calculera le nombre de copies d'ADN dans chaque réaction. Exporter des données vers une feuille de calcul pour faciliter une analyse plus approfondie.
    REMARQUE: Le logiciel d'analyse de données utilise le nombre de gouttelettes positives et négatives qui sont adaptées à une distribution Poisson pour déterminer le numéro de copie.
  7. À l'aide des valeurs de l'étape 8.6, calculez le numéro de copie initial de chaque code à barres génomique unique de l'échantillon. Déterminez le taux moyen de faux positifs à partir des réactions de contrôle négatives et soustrayez cette valeur des valeurs obtenues dans les réactions expérimentales. Multipliez les valeurs au besoin en fonction des dilutions qui ont été effectuées lors de la mise en place de chaque expérience (tableau 3).

9. Déterminer l'aptitude relative d'un organisme en calculant l'IC ou l'ICO à partir de quantification numérique à base de PCR des souches à codes à barres

  1. Calculer l'IC d'une souche codée à barres en utilisant les formules suivantes où: AOutput est la quantification absolue de la souche codée à barres à un point de temps donné, WTOutput est la quantification absolue des bactéries de type sauvage codées à barres en même temps timepoint, AInput est la quantification absolue de l'inoculum d'entrée de la souche codée à barres, WTInput est la quantification absolue de l'inoculum d'entrée des bactéries de type sauvage codées à barres, XOutput est la synthèse de toutes les souches à le même point de temps, XInput est la somme de l'inoculum d'entrée totale de toutes les souches codées à barres.

Equation 2
Equation 3
REMARQUE: Voir la discussion pour les avantages, les inconvénients, et l'utilisation la plus appropriée de chaque formule.

  1. Répétez l'étape 9.1 pour chaque souche codée à barres à tous les moments.
  2. Le cas échéant, calculer l'ICO à l'aide des formules suivantes où : Unesortie est la quantification absolue d'une souche codée à barres avec le gène Muté A à un point de temps donné, ABOutput est la quantification absolue d'une souche codée à barres avec les gènes mutés A et B en même temps, AInput est la quantification absolue de l'inoculum d'entrée de la souche à code à barres avec le gène muté A, ABInput est la quantification absolue de l'inoculum d'entrée de la souche codée à barres avec les gènes mutés A et B, BLa production est la quantification absolue d'une souche codée à barres avec le gène B muté à un point de temps donné, et BInput est la quantification absolue de l'entrée inoculum de la souche à code à barres avec le gène muté B.

Equation 4
ET/OU
Equation 5

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Representative Results

L'utilisation de cette méthodologie exige que des réactions de contrôle appropriées soient effectuées pour valider la sensibilité et la spécificité de chaque sonde utilisée pour identifier l'ADN cible. Dans cette expérience représentative, nous avons validé huit codes-barres d'ADN uniques avec les huit sondes correspondantes pour identification. Les huit sondes avaient un faible taux de faux positifs dans les réactions de contrôle du CNT et négatives (tableau 3), soulignant leur spécificité même parmi les séquences d'ADN très similaires. Pour évaluer la sensibilité de chaque condition, l'ADNc contenant un code-barres unique a été dilué en série dans un fond constant de gDNA contenant chacune des sept séquences restantes de code à barres. Avec l'approche décrite ci-dessus, PCR numérique pourrait distinguer aussi peu que 2 copies de gDNA dans un fond de près de 2.000.000 séquences d'ADN similaires (tableau 3).

En plus de déterminer la sensibilité et la spécificité de chaque séquence de code-barres de sonde et d'ADN, les dilutions effectuées dans l'étude de validation nous ont permis de calculer un indice concurrentiel simulé à partir des données résultantes. Bien qu'il n'y ait pas eu d'entrée ou de sortie réelle pour cette expérience, les données peuvent être analysées comme si une expérience de compétition avait été effectuée. Pour ce faire, nous considérons chaque mélange dans la dilution en série comme une sortie (AOutput) pour le code à barres dilué, tandis que la sortie totale (XOutput), entrée (AInput), et l'entrée totale (XInput) de chaque souche est calculée à partir de la quantification dans les contrôles positifs où tous les codes-barres sont inclus. En utilisant le facteur de dilution pour chaque mélange, l'IC théorique a été déterminé et est rapporté dans le tableau 3. Dans chacune des séries de dilution exécutées pour chaque code à barres, l'IC simulé moyen est signalé avec les écarts types pour chaque série de dilution en double. Dans tous les cas, l'IC simulé qui a été calculé est similaire à l'IC théorique. La majorité des CI calculées s'écartent des CI théoriques de moins de 25 %. Dans les cas de CI théoriques inférieurs, l'écart de la valeur calculée était multiplié par plus de 2. Par exemple, il s'agissait d'un changement d'UN IC théorique de 0,000625 à un IC calculé de 0,001220. Ces données soulignent que la méthode décrite est à la fois très précise et très précise. La combinaison d'une sensibilité élevée, de la spécificité, de la précision et de la précision permet à ce système de détecter de façon fiable les différences de condition physique qui pourraient autrement passer inaperçues.

Après avoir validé que les codes à barres génomiques pouvaient être détectés et quantifiés avec précision, nous avons effectué des expériences de compétition in vitro (tableau4). La première expérience de compétition a utilisé huit sauvages de type S. Des souches de typhimurium qui contenaient chacune un code-barres d'ADN unique. Chaque souche a été cultivée du jour au lendemain, et les huit cultures ont été mélangées en quantités égales. 100 L de cet inoculum mélangé ont été utilisés pour inoculer 4,9 ml de bouillon de LB stérile et la culture qui en a résulté a été incubée à 37 oC avec une agitation constante. gDNA a été récolté à partir de l'inoculum pour calculer l'entrée exacte de chaque souche. La croissance de la culture a été surveillée en mesurant l'absorption à 600 nm (OD600). À l'OD600 et 0,5 (phase logarithmique), un échantillon a été prélevé dans chaque culture et l'ADNc g a été prélevé. La culture restante a été retournée à 37 oC avec une agitation constante jusqu'à 8 heures après l'inoculation lorsqu'un échantillon final a été prélevé et que l'ADN g a été prélevé (stationnaire). Les résultats ont été calculés à l'aide de la formule CI modifiée pour les infections mises en commun. Comme prévu, toutes les souches de type sauvage avaient des valeurs CI presque égales à 1 (tableau 4). Une expérience de compétition similaire a été réalisée à l'aide de huit mutants S. Les souches de Typhimurium qui avaient chacune des codes-barres uniques en plus d'une carence en une seule, double ou triple transketolase18. Comme indiqué précédemment, les souches ont toutes augmenté de la même façon dans le bouillon LB, avec seulement un léger décalage observé dans la souche triple-transketolase-déficiente. Cependant, lorsque la croissance de chaque souche a été évaluée en analysant l'IC, un défaut beaucoup plus profond a été observé pour la souche transketolase-déficiente (CI a été comparé aux courbes de croissance dans Shaw et al.18). En outre, cette expérience nous a permis d'attribuer une valeur quantifiable aux caractéristiques de croissance de chaque souche au lieu de simplement décrire qualitativement les modèles de croissance. Les CI pour chaque souche ont été calculées à l'aide de la formule traditionnelle où chaque souche n'était comparée qu'à la formule sauvage et de la formule modifiée où toutes les souches d'entrée étaient prises en considération. Bien que les changements aient été faibles, l'IC de la souche triple-transketolase-déficiente était artificiellement faible dans la formule traditionnelle parce qu'elle ne tient pas compte des six autres souches concurrentes qui présentaient toutes une forme physique de type quasi sauvage.

Souches Génotype Source ou référence
S. Typhimurium ATCC 14028s sauvage-type Atcc
TT22236 (en) LT2 Salmonella porte-t-il pTP2223 (27)
DH5 F- 80lacZM15 (lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK-, mK) phoA supE44- thi-1 gyrA96 relA1 (28)
JAS18077 (en) putP::AA::FRT Cette étude
JAS18080 (en) putP::AD::FRT Cette étude
JAS18083 putP::AG::FRT Cette étude
JAS18088 (en) putP::AL::FRT Cette étude
JAS18091 (en) putP::AO::FRT Cette étude
JAS18096 (en) putP::AT::FRT Cette étude
JAS18099 (en) putP::AW::FRT Cette étude
JAS18100 (en) putP::AX::FRT Cette étude
JAS18122 (en) TktA::FRT putP::AD::FRT Cette étude
JAS18130 (en) TktB::FRT putP::AL::FRT Cette étude
JAS18138 (en) TktC::FRT putP::AT::FRT Cette étude
JAS18125 (en) TktA::FRT'tktB::FRT putP::AG::FRT Cette étude
JAS18133 (en) TktA::FRT'tktC::FRT putP::AO::FRT Cette étude
JAS18141 (en) TktB::FRT'tktC::FRT putP::AW::FRT Cette étude
JAS18142 TktA::FRT'tktB::FRT'tktC::FRT putP::AX::FRT Cette étude
Plasmides
pKD13 (en) bla bla FRT ahp FRT PS1 PS4 oriR6K (14)
script pPCR Cam SK ColE1 ori; CmR Stratagene/Aligent
pTP2223 Plac lam bet exo tetR (16)
pCP20 (en) bla cat cI857 PRflp pSC101 oriTS (29)
pSKAP (en anglais) ColE1 ori; CmR; bla bla FRT ahp FRT Cette étude
pSKAP-AA ColE1 ori; CmR; bla bla FRT ahp FRT; AA (AA) Cette étude
pSKAP-AD ColE1 ori; CmR; bla bla FRT ahp FRT; AD (en) Cette étude
pSKAP-AG ColE1 ori; CmR; bla bla FRT ahp FRT; AG (EN) Cette étude
pSKAP-AL ColE1 ori; CmR; bla bla FRT ahp FRT; AL (AL) Cette étude
pSKAP-AO ColE1 ori; CmR; bla bla FRT ahp FRT; AO (En) Cette étude
pSKAP-AT ColE1 ori; CmR; bla bla FRT ahp FRT; À Cette étude
pSKAP-AW ColE1 ori; CmR; bla bla FRT ahp FRT; AW (en) Cette étude
pSKAP-AX ColE1 ori; CmR; bla bla FRT ahp FRT; AX (AX) Cette étude

Tableau 1 : Souches et plasmides utilisés dans cette étude.

nom Séquence (5' - 3')1,2,3
pSKAP SDM AA - F AGAAGTCTCCTGCTGGTGCTTGAGT CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AA - R ACTCAAGCACCAGCAGGAGACTTTT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AD - F AAGAGCACGGTGAGGTGATAGTAGG CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AD - R CCTACTATCACCTCACCGTGCTCTTTT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AG - F AGTAGTGTCCTGGAGGAGCATGTGA CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AG - R TCACATGCTCCTCCAGGACACT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AL - F ACCACACATCGAAGGCACCTCTT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AL - R AGAGCTAGTGCCTCGATGTGTGTTT CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AO - F GTCCACAACCACACTCAGTGATACTACT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AO - R AGTATCACTGAGTGTGGTTTGTGGAC CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AT - F ACCAGTGTCCGTGACATGGCTAGAC CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AT - R GTCTAGCCATGTCACGGACACTGGT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AW - F ACGACTGAGTGATGTGGATGTGACG CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AW - R CGTCACATCCACATCACTCAGTCGT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AX - F ACTATCGTGGTGTAACGACAGGCTG CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AX - R CAGCCTGTCGTTACCACCGATAGT CTCAAGACGTGTAATGCTG
M13 - F GTAAACGACGGCCAG
putP Recombinaison - F TAGCGATGGGAGAGAGGACACGTTAATTATTCCATTTTAA
TGCAGCATTACACGTC
putP Recombinaison - R TACTGCGGGTATTAATGCTGAAACATCCATAACCCATTG TACTGCGCGGGTATTAATGCTGAAACATCCATAACCCATTG
CCTGCAGTTCGAAGTTCC
qPCR Barcode Region Amplify - F1 TGCAGCATTACACGTCTTG
qPCR Barcode Region Amplify - R2 TAGGAACTTCGAAGCAGC
Sonde Barcode AA - FAM 6-FAM/AGAAGTCTC/ZEN/CTGCTGGTGCTTGAGTC/IBFQ
Sonde AD De code à barres - FAM 6-FAM/AAGAGCACG/ZEN/GTGAGGTGATAGTAGGC/IBFQ
Sonde AG de code à barres - FAM 6-FAM/AGTAGTGTC/ZEN/CTGGagGAGCATGTGAC/IBFQ
Sonde Barcode AL - FAM 6-FAM/AGAGCTAGT/ZEN/GCCTTCGATGTGTGGTC/IBFQ
Sonde Barcode AO - HEX HEX/AGTATCACT/ZEN/GAGTGTGGTTGTGGACC/IBFQ
Code-barres AT Probe - HEX HEX/ACCAGTGTC/ZEN/CGTGACATGGCTAGACC/IBFQ
Sonde Barcode AW - HEX HEX/ACGACTGAG/ZEN/TGATGTGGGTATGTGACGC/IBFQ
Sonde AX Decode - HEX HEX/ACTATCGTG/ZEN/GTGTAACGACAGGCTGC/IBFQ
1 Fois Les nucléotides soulignés indiquent des séquences complémentaires pour chaque code-barres d'ADN qui est inséré sur pSKAP après SDM.
2 (en) Les nucléotides doublement soulignés indiquent une région complémentaire sur le S. Chromosome de Typhimurium employé pour le remplacement allélique.
3 (en) PrimeTime qPCR Probes sont des oligos d'hybridation étiquetés avec un colorant fluorescent de 5' soit 6 carboxyfluorescein (6-FAM) ou hexachlorofluorescein (HEX), un quencher interne (ZEN), et le 3' quencer Iowa Black® FQ (IBFQ).

Tableau 2 : Amorces et sondes utilisées dans cette étude.

Quantification (copies/20 l réaction)
description Aa annonce Ag Al Ao à AW (en) Ax
Ntc ne s'applique pas 0,000 0,000 3.510 Annonces ne s'applique pas 0,000 0,000 0,000
Ntc 3 600 Annonces 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
Ntc 3.510 Annonces 0,000 1.280 Annonces 1,180 2,340 0,000 0,000 0,000
Ntc 2,290 0,000 0,000 1.200 1,150 1,160 0,000 0,000
signifier 3.133 0,000 0,320 1,473 1.163 Annonces 0,290 0,000 0,000
négative 5.130 Annonces 1.156 Annonces 0,000 1.124 3.745 Annonces 1.281 Annonces 7,354 7.142 Annonces
négative 5.270 Annonces 0,000 0,000 1,087 1,666 1.643 Annonces 7,746 2,269
négative 2,660 0,000 1.361 Annonces 1.451 Annonces 8.974 Annonces 0,000 ne s'applique pas 0,000
négative 6,090 0,000 0,000 2.251 Annonces 0,000 2,531 8.700 Annonces 3,495
négative 1.740 Annonces 0,000 1,086 2,130 4.171 Annonces 0,000 7.113 Annonces 5.522 Annonces
négative 6,220 3.581 Annonces 0,000 4,022 1,175 1.341 ne s'applique pas 5.950 Annonces
signifier 4.518 Annonces 0,789 0,408 2,011 3.288 Annonces 1.133 7,728 4,063
positif 22281.540 Annonces 42673.039 Annonces 46442,242 45359.180 Annonces 47885.625 Annonces 15708.027 Annonces 45325.906 45325.906 en 20810.559
positif 23989.676 Annonces 44625.523 47356.438 Annonces 45790.660 45790.660 47456.973 Annonces 15096.601 Annonces 47929.840 47929.840 22455.234 Annonces
positif en 17846.824 38980.133 Annonces 45633.809 45633.809 44174.820 Annonces 33875.039 Annonces 15156.063 42536.270 Annonces 21467.840 Annonces
positif 21047.588 40140.848 41672.648 Annonces 46028,496 47426.527 Annonces en 16718.000 46978.664 Annonces en 19876.473
positif 20218.238 44660.602 Annonces 41718,707 45799.375 Annonces 46495.602 Annonces 14590.264 Annonces 54741.023 Annonces 22011.938 Annonces
positif en 18531.740 41620.801 41620.801 ne s'applique pas 48082.313 Annonces 35645.199 15341.382 Annonces 48950.992 48950.992 21117.559
signifier 20652.601 42116.824 42116.824 44564,769 45872.474 Annonces 43130.827 43130.827 15435.056 Annonces 47743.783 4743.783 21289.934 Annonces
Soustraction blanche 20648.083 42116.035 Annonces 44564.361 Annonces 45870.463 45870.463 43127.539 Annonces 15433.923 47736.054 Annonces 21285.871 Annonces
A non dilué 23024.961 Annonces 44448.875 58897.510 Annonces 51120.948 Annonces 55450.191 Annonces en 18155.305 62844.068 Annonces 27567.828 Annonces
B non dilué en 18278.174 35252.586 Annonces 54409.510 Annonces 66022.396 Annonces 43101.148 43101.148 15732.609 60761.328 Annonces 26581.979 Annonces
1/50 A 521.670 Annonces 755.035 Annonces 1066.898 Annonces 1287.187 Annonces 1053.339 Annonces 181.324 Annonces 1278.336 Annonces 580.961 Annonces
1/50 B 435.326 Annonces 634.215 Annonces 1168.087 Annonces 1383.537 Annonces 991.040 165.443 Annonces 1180.445 Annonces 596.461 Annonces
1/100 A 228.028 Annonces 598 848 Annonces 603.911 Annonces 631.116 Annonces 507.956 Annonces 258.405 Annonces 665.647 Annonces 331.590 Annonces
1/100 B 256.330 Annonces 585.834 Annonces 583.325 Annonces 670.875 Annonces 459.325 Annonces 289.207 Annonces 638,916 307.948 Annonces
1/200 A 121.283 Annonces 305.293 Annonces 258.247 Annonces 346.965 Annonces 234.774 Annonces 114.163 Annonces 169.055 Annonces 172.553 Annonces
1/200 B 114.638 Annonces 313.040 253.685 Annonces 297.216 Annonces 191.637 Annonces 179.895 Annonces 280,989 147.297 Annonces
1/400 A 42.829 Annonces 141.343 127.337 Annonces 163.605 Annonces ne s'applique pas 71.241 Annonces 157.697 Annonces 85.976 Annonces
1/400 B 59,544 180.543 Annonces 162.080 Annonces 162.108 Annonces 115.508 Annonces 104.682 Annonces 151.141 Annonces 87,804
1/800 A 34.304 67,934 65.939 Annonces 83.857 Annonces 66.134 Annonces 31.784 Annonces 82,722 45.616 Annonces
1/800 B 20.390 80.222 Annonces 81,453 85.325 Annonces 53.102 Annonces 38.034 Annonces 55.460 Annonces 29.660 Annonces
1/1600 A 15.405 Annonces 44.505 Annonces 47.672 Annonces 39.613 Annonces 33.027 Annonces 18.006 Annonces 37,655 20,988
1/1600 B 22.091 48.828 Annonces 46.781 Annonces 37.388 Annonces 30.245 Annonces 30.138 Annonces 34.553 Annonces 19.795 Annonces
1/3200 A 12.333 22.104 16.850 Annonces 18.403 Annonces 11.460 Annonces 10.535 Annonces 21.245 Annonces 9,218
1/3200 B 6,796 32,555 15.742 Annonces 26.249 Annonces 15.111 Annonces 9,908 23.393 10.175 Annonces
Soustraction blanche
A non dilué 23020.443 44448.086 4444.086 58897.103 Annonces 51118.937 Annonces 55446.903 en 18154,172 62836.339 Annonces 27563.765 Annonces
B non dilué en 18273.655 35251.797 Annonces 54409.103 Annonces 66020.385 Annonces 43097.860 43097.860 15731.477 60753.600 Annonces 26577.916 Annonces
1/50 A 517.152 Annonces 754.246 Annonces 1066.490 Annonces 1285.176 Annonces 1050.051 Annonces 180.192 Annonces 1270.607 Annonces 576.898 Annonces
1/50 B 430.808 Annonces 633.426 Annonces 1167.679 Annonces 1381.526 Annonces 987,751 164.311 Annonces 1172.717 Annonces 592.398 Annonces
1/100 A 223.509 Annonces 598,059 Annonces 603.503 Annonces 629.105 Annonces 504.668 Annonces 257.272 Annonces 657.918 Annonces 327.527 Annonces
1/100 B 251.812 Annonces 585.044 Annonces 582,918 668 864 Annonces 456.036 Annonces 288.074 Annonces 631.187 Annonces 303.885 Annonces
1/200 A 116,765 304.503 Annonces 257.840 Annonces 344.954 Annonces 231.486 Annonces 113.030 161.327 Annonces 168.490 Annonces
1/200 B 110.120 312.251 Annonces 253.277 Annonces 295.205 Annonces 188.348 Annonces 178,762 273.261 Annonces 143.234
1/400 A 38.310 Annonces 140.554 Annonces 126,929 161.594 Annonces ne s'applique pas 70.108 Annonces 149.968 Annonces 81,913
1/400 B 55.026 Annonces 179,753 161.672 Annonces 160.097 Annonces 112,219 103.549 Annonces 143.413 83,741
1/800 A 29.786 Annonces 67,145 65.531 Annonces 81.847 Annonces 62,846 30.651 Annonces 74,994 41.553 Annonces
1/800 B 15.872 Annonces 79,433 81.045 Annonces 83.314 Annonces 49.813 Annonces 36.901 Annonces 47.732 Annonces 25.596 Annonces
1/1600 A 10.886 Annonces 43.716 Annonces 47.264 Annonces 37.602 Annonces 29.739 Annonces 16.874 Annonces 29.927 Annonces 16.925 Annonces
1/1600 B à 17.573 48.039 Annonces 46.373 Annonces 35.377 Annonces 26.957 Annonces 29.005 Annonces 26.825 Annonces 15.732 Annonces
1/3200 A 7.815 Annonces 21.314 16.442 Annonces 16.392 Annonces 8.172 Annonces 9,402 13.517 Annonces 5.155 Annonces
1/3200 B 2.278 Annonces 31.765 Annonces 15.334 Annonces 24.238 Annonces 11.822 Annonces 8,776 15.664 Annonces 6.112 Annonces
CI simulé
A non dilué 1.114895 1.055372 Annonces 1.321619 Annonces 1.114419 1.285650 Annonces 1.176251 Annonces 1.316329 Annonces 1.294932
B non dilué 0.885005 Annonces 0,837016 1.220911 1.439279 Annonces 0.999312 1.019279 Annonces 1.272698 Annonces 1.248618 Annonces
1/50 A 0,025046 Annonces 0,017909 0,023931 0,028018 0,024348 0,011675 0,026617 Annonces 0.027102 Annonces
1/50 B 0,020864 0,015040 0,026202 0.030118 0,030118 0,022903 0,010646 0,024567 Annonces 0,027831 Annonces
1/100 A 0.010825 0,014200 0,013542 0,013715 0,011702 0.016669 0,06669 0,013782 Annonces 0,015387 Annonces
1/100 B 0,012195 0,013891 0,013080 0.014582 Annonces 0.010574 Annonces 0,018665 0,013222 0,014276
1/200 A 0,005655 0,007230 0,005786 0,007520 0,005367 Annonces 0,007323 0,003380 0.007916 Annonces
1/200 B 0,005333 0,007414 Annonces 0,005683 0,005683 0,006436 Annonces 0,004367 Annonces 0.011582 Annonces 0,005724 Annonces 0,006729 Annonces
1/400 A 0,001855 0,003337 0,02848 0,003523 Annonces ne s'applique pas 0,004542 Annonces 0,003142 0,003848
1/400 B 0,02665 0,004268 0,003628 Annonces 0,003490 0,02602 0,006709 0,003004 0,003934
1/800 A 0,001443 0,001594 Annonces 0,001470 0,001784 Annonces 0,001457 Annonces 0,001986 0,001571 Annonces 0.001952 Annonces
1/800 B 0,000769 0,000769 0,001886 0,001819 0,001816 0,001155 0,02391 0,001000 0.001203
1/1 600 A 0,000527 0,00527 0,001038 0.001061 Annonces 0,000820 0,000690 0,001093 0,000627 Annonces 0,000795
1/1 600 B 0,000851 0,000851 0,001141 0.001041 0,001041 0,000771 Annonces 0,000625 0,001879 0,000562 Annonces 0,000739 0,000739
1/3 200 A 0,000378 Annonces 0,000506 0,000369 0,00369 0,000357 Annonces 0,000189 0,00189 0,000609 0,000283 0,000242
1/3 200 B 0,000110 0,00110 0,000754 Annonces 0,000344 0,000528 0,000528 0,000274 Annonces 0,000569 0,000569 0,000328 Annonces 0,000287 Annonces
MOYENNE CI (théorique)
Non dilué (1) 0.999950 0.946194 Annonces 1.271265 1.276849 1.142481 Annonces 1.097765 1.294514 Annonces 1.271775 Annonces
1/50 (0,02) 0,022955 0,016474 Annonces 0,025067 Annonces 0,029068 0,023625 0.011161 Annonces 0,025592 Annonces 0,027466
1/100 (0,01) 0.011510 0,011510 0,014046 0,013311 0.014148 Annonces 0.011138 Annonces 0,017667 0,013502 0,014832
1/200 (0,005) 0,005494 Annonces 0.007322 0,005735 0,006978 0,004867 Annonces 0,009453 0,009453 0,004552 Annonces 0.007322
1/400 (0,0025) 0,02260 0,003803 Annonces 0,003238 0,003507 0,00260 0,005626 0,003073 Annonces 0,003891 Annonces
1/800 (0,00125) 0,001106 0,001740 0,001645 Annonces 0,001800 0,001306 0,02188 0,001285 0,001577
1/1 600 (0,000625) 0,000689 0,001089 0,001051 Annonces 0,000795 0,000657 Annonces 0,001486 0,000594 Annonces 0,000767
1/3 200 (0,000313) 0,000244 0,000630 Annonces 0,000357 Annonces 0,000443 0,00443 0,000232 0,000589 0,000589 0,000306 0,000265
Écart
non dilué 0,11494 0.10918 Annonces 0,05035 Annonces 0,16243 0,14317 0,07849 0,02182 Annonces 0,02316
1/50 0,0209 0,00143 0,00114 0,00105 0,00072 Annonces 0,00051 Annonces 0,00103 0,00036 Annonces
1/100 0,00069 0,00015 0,00023 0,00043 0,00056 Annonces 0,00100 0,00028 Annonces 0,00056 Annonces
1/200 0,00016 Annonces 0,00009 0,00009 0,00005 0,00005 0,00054 Annonces 0,00050 0,0213 0,00117 Annonces 0,00059 0,0005
1/400 0,00040 0,00047 Annonces 0,00039 0,00002 0 et 0 0,00108 0,00007 0,00007 0,00004 0,00004
1 800 0,00034 0,00015 0,00017 0,00017 0,00002 0,00015 0,00020 0,00029 0,00029 0,00037 Annonces
1/1 600 0,00016 Annonces 0,00005 0,00005 0,00001 0,00001 0,00002 0,00003 0,00039 0,00003 0,00003
1/3 200 0,00013 0,00012 0,00001 0,00001 0,00009 0,00009 0,00004 0,00004 0,00002 0,00002 0,00002
Représente les résultats d'une seule expérience.

Tableau 3 : Quantification absolue et calcul simulé de l'IC.

condition Indice concurrentiel1
Expérience 1
WTAA WTAD (en) AG WT WTAL (en) WTAO (en) WTAT WTAW (en) WTAX (en)
Logarithmique 0,927 à 0,033 0,992 à 0,031 1,068 à 0,025 0,921 à 0,02 1,044 à 0,03 1,051 à 0,057 1,094 à 0,027 0,929 à 0,005
stationnaire 1,1 à 0,021 1,071 à 0,053 1,079 à 0,065 0,948 à 0,02 0,98 à 0,02 0,873 à 0,044 0,97 à 0,056 1,021 à 0,007
Expérience 2
CI (traditionnel) WTAA AAD AL CAT AGABAB AOac AWde la Colombie-Britannique AX ABC
Logarithmique 1 à 0 0,802 à 0,084 0,957 à 0,02 0,989 à 0,073 0,581 à 0,153 0,86 à 0,053 0,995 à 0,011 0,695 à 0,061
stationnaire 1 à 0 0,97 à 0,063 1,043 à 0,058 0,99 à 0,036 1,625 à 0,589 0,835 à 0,051 0,912 à 0,047 0,477 à 0,049
CI (Inoculum pooled)
Logarithmique 1,114 à 0,039 0,864 à 0,074 1,073 à 0,032 1,1 à 0,068 0,633 à 0,152 0,938 à 0,056 1,111 à 0,043 0,746 à 0,06
stationnaire 1,078 à 0,039 1,039 à 0,049 1,166 à 0,093 1,066 à 0,01 1,735 à 0,613 0,876 à 0,035 0,97 à 0,045 0,49 à 0,047
1 Fois Les valeurs représentent l'écart standard ci-moyen pour trois ou quatre expériences de repli.

Tableau 4 : Résultats représentatifs de la compétition in vitro entre S. Typhimurium souches.

Tableau S1. Amorces facultatives pour créer des séquences de codes à barres supplémentaires et des sondes fluorescentes correspondantes pour leur détection. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 1
Figure 1. Génération de pSKAP. (A) Purified pKD13 a été soumis à la digestion de restriction avec HindIII et BamHI. (B, C) Le fragment d'intérêt de 1 333 pb contenant un gène de résistance à la kanamycine à flanc de FRT a été purifié. (D) pPCR Script Cam SKA a également été digéré avec HindIII et BamHI et le fragment de pKD13 (B) a été ligated dedans pour générer (E) pSKAP. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Mutagénèse dirigée par site insertionnel à pSKAP. (A) L'insertion de codes-barres d'ADN de 25 pb à la position 725 a été effectuée à l'aide de PCR. Les amorces avant et inversées spécifiques à cet emplacement ont été conçues avec des extensions complémentaires de 25 nucléotides 5' (indiquées dans l'amorce comme minuscules "a"). (B) Un plasmide générique pSKAP-Barcode résultant de SDM est montré avec l'emplacement du code à barres d'ADN inséré mis en évidence orange. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Réarrangement chromosomique en aval du putP. (A) Après une recombinaison médiée par le rouge, le gène de résistance à la kanamycine sélectionnable (violet foncé) flanqué de sites FRT (gris) est inséré sur le chromosome entre les loci indiqués (Site de recombinaison chromosomique, rouge). Le code-barres ADN unique (orange) est inséré juste à l'extérieur du site FRT. (B) Le gène de résistance à la kanamycine est enlevé par excision médiée par frEt, laissant un reste d'ADN inséré sur le chromosome (ADN inséré total, bleu) composé du code-barres d'ADN et d'une cicatrice FRT. (C) La séquence d'ADN chromosomique modifiée entourant l'ADN inséré est montrée, ainsi que les sites d'amorçage d'amplification (violet clair) utilisés pour le PCR numérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Système de dilution pour valider la sensibilité et la spécificité de la sonde fluorescente. (A) L'ADNc purifié de sept souches codées à barres est mélangée en quantités égales pour créer le diluant pour diluer l'ADG codé à barres omis (AX dans l'exemple ci-dessus). (B) Effectuer une dilution en série de l'ADNc à code à barres omis (AX dans l'exemple ci-dessus) à l'aide du diluant préparé décrit précédemment. Mélanger soigneusement le contenu de chaque tube avant de le transférer au tube suivant. Figure 4 a été créé avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Disposition des plaques pour l'analyse de la sensibilité et de la spécificité des ensembles 1 et 2 de la sonde d'amorce. L'expérience PCR numérique comprend des CNT, des contrôles positifs, des contrôles négatifs et les systèmes de dilution pour chacun des codes à barres testés. La plaque pour valider les ensembles de sonde d'apprêt 3 et 4 est disposée dans le même modèle en utilisant l'ADNc à code à barres approprié. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Résultats PCR numériques représentatifs de l'AA-coded gDNA dilué AA. gDNA contenant le code-barres AA a été dilué dans un arrière-plan de tous les autres aDNc à code à barres tels que décrits dans la figure 4. Le canal 1 représente la sonde FAM pour le code à barres AA (panneaux supérieurs) tandis que le canal 2 représente la sonde HEX pour le code à barres AO (panneaux inférieurs). Les résultats de chaque sonde sont présentés à la fois sous forme d'amplitude fluorescente individuelle (panneaux gauches) et d'un histogramme représentant la fréquence de l'intensité fluorescente de toutes les gouttelettes dans les puits sélectionnés (panneaux droits). Pour chaque condition, les gouttelettes positives (fluorescence élevée) et négatives (faible fluorescence) devraient former deux populations distinctes. Dans le cas des AA qui ont été dilués, et la plupart des gouttelettes étaient négatives, l'histogramme (panneau supérieur droit) semble représenter seulement une seule population. C'est parce que les gouttelettes positives sont largement plus nombreuses que les gouttelettes négatives; cependant, deux populations distinctes sont encore visibles en examinant l'amplitude fluorescente des gouttelettes dans les panneaux gauches.  Les populations doivent être séparées en utilisant la fonction de seuil pour définir les gouttelettes positives et négatives (visualisées par la ligne rose). Les valeurs de seuil varient en fonction des sondes qui ont été utilisées, mais tous les puits qui utilisent le même mélange de sondes devraient avoir des seuils identiques. Comme l'AA-barcoded gDNA a été dilué, il ya une diminution des gouttelettes positives (haute fluorescente) tandis que le nombre de gouttelettes AO positives reste constante en arrière-plan. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La capacité de quantifier avec précision les microorganismes est d'une importance primordiale pour la recherche en microbiologie, et la capacité d'énumérer des souches uniques d'une population mixte initiale s'est avérée être un outil inestimable pour évaluer les traits de forme physique et de virulence dans bactérie. Cependant, les techniques pour y parvenir n'ont pas progressé dans le rythme des développements modernes en biologie moléculaire. La technologie pour modifier facilement les chromosomes de nombreuses bactéries, y compris S. Typhimurium, a été disponible pendant près de deux décennies14, mais cette capacité a été rarement utilisée pour le marquage moléculaire des souches avec des séquences d'ADN uniques. En exploitant la capacité de créer des souches facilement identifiables basées sur des codes-barres d'ADN uniques et peu perturbateurs insérés sur le chromosome bactérien, couplés à la technologie la plus à la fine pointe de la technologie pour détecter et quantifier ces identificateurs moléculaires ( c'est-à-dire PCR numérique), nous avons créé un système qui fournit la sensibilité exquise, la spécificité, la précision, et la précision pour quantifier facilement des souches individuelles au sein d'une population diverse de bactéries.

Le calcul des IC et des IC décrits ci-dessus repose sur la capacité d'apporter avec précision les modifications appropriées aux chromosomes bactériens. Toutes les modifications doivent être vérifiées par séquençage Sanger pour s'assurer qu'aucune mutation aléatoire ne s'est produite. L'utilisation d'une polymérase haute fidélité minimisera ces erreurs, mais toute mutation de ce genre qui se produit nuira à la capacité de détecter la souche, qui est un autre aspect critique de ce protocole. Bien que nous ayons démontré que le PCR numérique peut détecter aussi peu que deux copies d'ADNc dans un arrière-plan de près de 2 millions, les souches en dehors de cette gamme peuvent nécessiter des dilutions supplémentaires pour leur quantification précise. De plus, les séquences de codes à barres d'ADN doivent être conçues pour faciliter l'utilisation de séquences de sondes de haute qualité. Les séquences de sonde doivent être analysées pour déterminer les tendances à l'auto-dimériser, former des épingles à cheveux ou lient inefficacement leurs cibles. L'importance d'utiliser des séquences et des sondes de qualité ne peut pas être minimale, un fait qui est démontré par les expériences de validation minutieuses qui doivent être effectuées avec chaque sonde. Les efforts visant à créer des codes-barres d'ADN optimaux créeront des résultats optimaux de quantification numérique de PCR.

Bien que les étiquettes moléculaires soigneusement conçues soient importantes pour obtenir des résultats de qualité, l'interprétation des résultats est un autre aspect critique de ce protocole. L'IC est défini comme le rapport entre la souche mutante et la souche de type sauvage dans la production divisée par le rapport des deux souches dans l'entrée1,19,20. Cette CI traditionnelle présentée à la section 9 est utile lorsque l'infection mixte se compose d'une seule souche par rapport à un type sauvage. Cependant, lorsqu'on utilise de grands bassins de souches pour inoculer des médias ou des animaux, les souches sont non seulement en concurrence avec les animaux sauvages, mais aussi contre toutes les autres souches présentes dans l'inoculum. Les études précédentes qui ont effectué des expériences de compétition à l'aide de souches infectieuses multiples n'ont pas tenu compte de cela dans leurs calculs7,13. Pour tenir compte de cette caractéristique des infections mixtes, nous avons introduit une formule pour calculer les CI qui a été modifiée pour les infections mises en commun. Il est peu probable que toutes les souches offrent le même niveau de concurrence qu'une souche de type sauvage. Cependant, comme la plupart des gènes bactériens ont peu d'impact sur la virulence, à mesure que le nombre de souches utilisées dans les expériences d'indices concurrentiels augmente, la probabilité que la virulence globale tend vers la souche de type sauvage augmente. Cela n'est pas nécessairement le cas pour certaines conceptions expérimentales utilisant des bassins de nombreuses souches tous avec des défauts de virulence connus. Cependant, cela est pris en compte dans l'équation modifiée parce que les souches moins abondantes (moins d'ajustement) dans le résultat aura un effet plus faible sur lasortieX . Selon la conception expérimentale spécifique, il peut y avoir des cas dans lesquels l'une ou l'autre formule est préférée. Dans la plupart des cas impliquant des infections mises en commun, cependant, il est important de considérer que dans une infection mixte, toutes les souches se font concurrence, et pas seulement contre les animaux sauvages. Lors de l'analyse des résultats, il est essentiel que la raison d'être de chaque formule soit bien comprise pour faire les interprétations les plus précises de la condition physique des souches. Lors de la communication des résultats, il est tout aussi important de divulguer avec précision la façon dont les données ont été analysées.

La section 9 du protocole comprend également des formules pour aider à déterminer les interactions génétiques à l'aide d'une ICO. Avec cette analyse, des prédictions peuvent être faites pour déterminer si deux gènes de virulence fonctionnent indépendamment ou ensemble. CoI est défini comme le rapport de la double souche mutante à une souche mutante unique dans la production divisée par le rapport des deux souches dans l'entrée1. La formule est conçue pour détecter l'additivité phénotypique des perturbations génétiques. Si les gènes fonctionnent indépendamment pour améliorer la virulence, une perturbation des deux gènes devrait causer une plus grande diminution de la forme physique par rapport à une seule perturbation de l'un ou l'autre gène seul. Si les gènes fonctionnent ensemble pour améliorer la virulence (comme les gènes codant deux enzymes dans une voie), une perturbation de l'un ou l'autre gène devrait avoir le même effet sur la virulence que perturber les deux gènes. La détection de l'additivité phénotypique peut être difficile dans les cas où le niveau d'atténuation causé par un seul gène est soit très élevé, soit très faible. Néanmoins, la comparaison directe des souches dans le même système animal fournit moins de variabilité et un compte rendu plus fiable de la relation fonctionnelle entre les gènes, et ce calcul peut être effectué à partir de deux souches au sein d'une population mixte plus importante.

Un dernier aspect essentiel de l'interprétation des résultats est d'examiner les effets de la dynamique des populations. Dans certaines infections mixtes qui ont plusieurs souches, une seule souche peut émerger comme plus dominante ou moins apte en raison de la dérive aléatoire de la population. Ce phénomène peut être amplifié lorsque des événements de goulot d'étranglement se produisent. Cela peut être causé par l'utilisation d'un très grand nombre de souches d'entrée, un très petit nombre de bactéries totales dans l'inoculum, ou une combinaison des deux. Un autre aspect interférant qui découle des infections mixtes est la possibilité de la complémentarité trans. Cela se produit lorsqu'une souche d'ajustement, comme le type sauvage, améliore artificiellement la virulence d'une souche moins en forme. Un exemple hypothétique de cela serait de comparer l'aptitude d'un S. Typhimurium Pathogenicity Island 2 (SPI2)-knockout strain co-infected with a wild-type strain. SPI2 active S. Typhimurium pour survivre intracellulairement en sécrétant des effecteurs dans le cytosol hôte qui modifient le phagosome dans un macrophage. Perturbation de ce système fait S. Typhimurium sensible à la mise à mort intracellulaire. Cependant, parce que les macrophages sont capables d'engloutir deux bactéries ou plus à la fois, le SPI2-knockout pourrait recevoir une augmentation considérable de la condition physique si elle réside dans le même macrophage comme un type sauvage S.  Typhimurium qui sécrète des effecteurs dans le cytosol hôte. La dynamique aléatoire des populations et la possibilité d'une complémentarité trans sont une limitation de toute expérience de compétition. Si dans la complémentarité trans est suspectée, les phénotypes devraient être confirmés utilisant d'autres méthodes complémentaires pour évaluer l'aptitude. Pour surmonter la dynamique aléatoire des populations, l'augmentation du nombre d'expériences de reproduisent augmente la probabilité d'identifier les valeurs aberrantes dans les résultats. Heureusement, le protocole décrit ci-dessus facilite la mise sur un plus grand nombre d'expériences de repli identiques, car le nombre de conditions expérimentales est considérablement réduit.

Un élément clé de la technique CI décrite ci-dessus est sa capacité à être adapté à presque n'importe quel organisme et toute conception expérimentale qui nécessite une quantification précise des micro-organismes. Il exige cependant la manipulation génétique d'un organisme pour incorporer une séquence d'ADN unique sur le chromosome. L'adaptabilité de la technique exige que l'espèce soit génétiquement malléable et s'appuiera sur la génération de protocoles alternatifs pour modifier le génome (étapes 1 et 2). Les codes-barres d'ADN énumérés dans les tableaux 2 et S1 devraient être suffisants pour la plupart des bactéries; cependant, comme dans toutes les expériences quantitatives de PCR, il est pertinent d'analyser le génome bactérien pour assurer un potentiel minimal pour la liaison hors cible des amorces et des sondes par une analyse simple de BLAST. Les séquences de codes à barres d'ADN utilisées dans cette étude diffèrent par seulement 3-4 bases dans certains cas, soulignant la spécificité exquise des sondes qui minimise le potentiel de liaison non spécifique. Indépendamment de la spécificité des sondes fluorescentes, toutes les nouvelles séquences de codes à barres doivent être correctement validées pour la sensibilité et la spécificité décrites à l'étape 6. Après avoir créé des souches à codes à barres, il est possible d'adapter ce protocole à de nombreux types d'expériences en plus des essais de compétition in vitro comme décrit ci-dessus. Les souches conviennent aux essais de compétition in vivo chez la souris ou d'autres systèmes de modèles animaux. Seules des modifications minimales sont nécessaires pour extraire l'ADNc des organes et tissus animaux, et ces modifications sont bien décrites par les fabricants de kits à de telles fins. En outre, de grands bassins d'infections mixtes pour la concurrence in vivo ont été utilisés avec succès précédemment7, offrant le potentiel de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour une seule expérience, ce qui non seulement diminue les coûts de ces expériences mais diminue également le potentiel de variabilité d'un animal à l'autre. De même, des souches codées à barres pourraient être utilisées dans d'autres essais in vitro qui examinent la susceptibilité des souches à diverses conditions de traitement (p. ex. antibiotiques, susceptibilité à l'acide, mise à mort par des espèces réactives d'oxygène ou d'azote, etc.). Pour ces expériences, l'évaluation de l'inhibition de la croissance pourrait être réalisée en ajoutant le produit chimique désiré au milieu de croissance à l'étape 3.4 et en procédant comme décrit. Pour évaluer la mort bactérienne, un grand bassin de souches pourrait être mélangé, et l'entrée quantifiée comme décrit ci-dessus. Après l'exposition au traitement désiré, les cellules vivantes pourraient être sélectivement quantifiées en couplant la procédure numérique de quantification de PCR avec pcR de viabilité pour différencier entre les cellules vivantes et mortes21,22,23 , 24 Ans, états-unis , 25 Annonces , 26. Le débit de ces expériences serait considérablement augmenté parce que les dilutions et les plaques répliques pour chaque souche sont remplacées par des techniques moléculaires plus rationalisées. Enfin, bien que l'analyse de la biologie évolutive et de la génétique des populations dépasse le cadre du présent document, les organismes codés à barres sont très adaptables à de telles études.  En fin de compte, le but de ce protocole était de développer une technique puissante pour quantifier les bactéries qui est très adaptable pour son utilisation dans de nombreuses espèces diverses et dans de nombreux types d'expériences.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les recherches rapportées dans cette publication ont été appuyées par le Fonds de recherche du président george F. Haddix et le National Institute of General Medical Science des National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de prix GM103427. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 22600028 Procure from any manufacturer
16 mL culture tubes MidSci 8599 Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tips RAININ 30389241 Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipette RAININ 17013804 Use alternative multichannel pipettes with caution
Agarose ThermoFisher Scientific BP160-500 Procure from any manufacturer
BLAST Analysis NCBI N/A https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module Bio Rad 1851197 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5α Invitrogen 18258012 Procure from any manufacturer or prepare yourself
Chloramphenicol ThermoFisher Scientific BP904-100 Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate reader BioTek CYT5MF Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) Bio Rad N/A Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well Plates Bio Rad 12001925 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader Oil Bio Rad 1863004 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Bio Rad 1863024 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1864008 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1863009 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for Probes Bio Rad 1863005 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Kanamycin ThermoFisher Scientific BP906-5 Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agar ThermoFisher Scientific BP1425-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani broth ThermoFisher Scientific BP1426-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio Rad 1814040 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR Tubes Eppendorf 951010022 Procure from any manufacturer
Petri dishes ThermoFisher Scientific FB0875712 Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+ Stratagene/Agilent 211192 No longer available commercially
Primer/Probe Design IDT N/A https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_Barcodes Addgene Plasmid numbers 122702-122726 www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer Bio Rad 1814000 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Generator Bio Rad 1864002 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Reader Bio Rad 1864003 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s ATCC ATCC 14028s www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate BioTek TAKE3 Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHI ThermoFisher Scientific FERFD0054 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnI ThermoFisher Scientific FERFD1704 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIII ThermoFisher Scientific FERFD0504 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit ThermoFisher Scientific FERK0832 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit ThermoFisher Scientific FERK0503 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F534L Procure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific FEREL0011 Procure from any manufacturer
Thermocycler Bio Rad 1861096 Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue Transilluminator ThermoFisher Scientific UV95043301 Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology Grade ThermoFisher Scientific BP28191 Procure from any manufacturer

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References

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