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Genetics

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59630
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

Summary

Dieser molekulare Ansatz zur Bestimmung der bakteriellen Fitness ermöglicht die präzise und genaue Detektion von Mikroorganismen mithilfe einzigartiger genomischer DNA-Barcodes, die über digitale PCR quantifiziert werden. Das Protokoll beschreibt die Berechnung des Wettbewerbsindex für Salmonellenstämme; Die Technologie ist jedoch leicht an Protokolle anpassbar, die eine absolute Quantifizierung jedes genetisch verformbaren Organismus erfordern.

Abstract

Ein Wettbewerbsindex ist eine gängige Methode zur Beurteilung der bakteriellen Fitness und/oder Virulenz. Der Nutzen dieses Ansatzes wird durch seine Leichtigkeit zu erfüllen und seine Fähigkeit, die Fitness vieler Stämme auf einen wilden Organismus zu standardisieren veranschaulicht. Die Technik wird jedoch durch verfügbare phänotypische Marker und die Anzahl der Stämme begrenzt, die gleichzeitig bewertet werden können, was die Notwendigkeit für eine große Anzahl von Replikationsexperimenten erzeugt. Gleichzeitig mit einer großen Anzahl von Experimenten sind die Arbeits- und Materialkosten für die Quantifizierung von Bakterien auf der Grundlage von phänotypischen Markern nicht unerheblich. Um diese negativen Aspekte zu überwinden und gleichzeitig die positiven Aspekte beizubehalten, haben wir einen molekularbasierten Ansatz entwickelt, um Mikroorganismen direkt nach technischen genetischen Markern auf bakterielle Chromosomen zu quantifizieren. Einzigartige, 25 Basispaar-DNA-Barcodes wurden an einem harmlosen Ort auf dem Chromosom von Wildtyp- und mutierten Salmonellenstämmen eingefügt. In-vitro-Wettbewerbsexperimente wurden mit Inocula durchgeführt, die aus gepoolten Stämmen bestehen. Im Anschluss an den Wettbewerb wurden die absoluten Zahlen der einzelnen Stämme anhand der digitalen PCR quantifiziert, und die Wettbewerbsindizes für jede Sorte wurden aus diesen Werten berechnet. Unsere Daten deuten darauf hin, dass dieser Ansatz zur Quantifizierung von Salmonellen äußerst empfindlich, genau und präzise ist, um sowohl sehr reichlich (hohe Fitness) als auch seltene (niedrige Fitness) Mikroorganismen zu erkennen. Darüber hinaus ist diese Technik leicht an nahezu jeden Organismus mit modifizierenden Chromosomen sowie an verschiedene experimentelle Konstruktionen anpassbar, die eine absolute Quantifizierung von Mikroorganismen erfordern.

Introduction

Die Beurteilung von Fitness und Virulenz pathogener Organismen ist ein grundlegender Aspekt der mikrobiologischen Forschung. Es ermöglicht Vergleiche zwischen Stämmen oder zwischen mutierten Organismen, was es Forschern ermöglicht, die Bedeutung bestimmter Gene unter bestimmten Bedingungen zu bestimmen. Traditionell nutzt die Virulenzbewertung ein tierisches Infektionsmodell mit verschiedenen Bakterienstämmen und beobachtet das Ergebnis des infizierten Tieres (z. B. Infektiöse Dosis50, Tödliche Dosis50, Zeit bis zum Tod, Symptomschwere, Symptome usw.). Dieses Verfahren liefert wertvolle Beschreibungen der Virulenz, erfordert jedoch, dass Stämme erhebliche Unterschiede in den Ergebnissen verursachen, um Variationen vom Wildtyp zu erkennen. Darüber hinaus sind die Ergebnisse semiquantitativ, da die Krankheitsprogression und die Symptomschwere im Laufe der Zeit subjektiv quantifiziert werden können, die Interpretation der Virulenz im Vergleich zum Wildtyp qualitativer ist (d. h. mehr, weniger oder gleich virulent). Eine häufige Alternative zur Durchführung von Tierinfektivitätstests besteht darin, wettbewerbsfähige Indizes (CIs) zu generieren, Werte, die Die Fitness oder Virulenz eines Stammes direkt mit einem Wildtyp-Gegenstück in einer gemischten Infektion vergleichen1. Diese Technik hat zahlreiche Vorteile gegenüber einem traditionellen Tiermodell der Infektion, indem sie Virulenz auf einen Wildstamm standardisiert und einen quantifizierbaren Wert bestimmt, der den Grad der Dämpfung widerspiegelt. Diese Technik kann auch angepasst werden, um Genwechselwirkungen in Bakterien zu analysieren, indem ein aufgehobener Wettbewerbsindex (COI)2ermittelt wird. Die Berechnung eines COI für eine Gruppe mutierter Organismen ermöglicht es den Forschern zu bestimmen, ob zwei Gene unabhängig voneinander zur Pathogenese beitragen oder ob sie an demselben Virulenzweg beteiligt und voneinander abhängig sind. Darüber hinaus erfordert die Berechnung eines CI die Aufzählung von Bakterien, die wertvolle Einblicke in die Pathogenese von Organismen liefern können. CIs und COIs ermöglichen es Forschern auch, avirulente Stämme zu asses, die keine klinischen Krankheiten verursachen, aber immer noch Unterschiede in der Fitness haben. Diese Technik wird durch die Verwendung von traditionellen Antibiotikaresistenzmarkern zur Identifizierung von Stämmen eingeschränkt, wodurch die Anzahl der Eingangsstämme auf jeweils nur ein oder zwei begrenzt wird. Aufgrund dieser Einschränkung sind eine große Anzahl von experimentellen Gruppen und Replikationen erforderlich, was neben der Erhöhung der Arbeits- und Materialkosten auch die Chancen für Variabilität unter experimentellen Bedingungen und ungenaue Ergebnisse erhöht. (Für eine gründliche Überprüfung der Vorteile und Anwendungen der Verwendung von gemischten Infektionen zur Untersuchung von Virulenz, Fitness, und Gen-Wechselwirkungen, siehe C.R. Beuzén und D.W. Holden 1)

Es wurde versucht, diese Einschränkung zu überwinden, wie z. B. die Verwendung fluoreszierend markierter Zellen, die über die Durchflusszytometrie3,4,5quantifiziert werden. Diese Technik quantifiziert Zellen mit entweder 1) markierten Antikörpern gegen phänotypische Marker oder 2) endogen produzierten fluoreszierenden Proteinen. Die Verwendung von markierten Antikörpern hat eine Nachweisgrenze von 1.000 Zellen/ml und erfordert daher eine hohe Anzahl von Zellen, um3zu analysieren. Zellen, die fluoreszierende Proteine exezieren, haben eine veränderte Physiologie und sind anfällig für Fitnessveränderungen infolge einer hohen Proteinexpression6. Beide Methoden sind durch die Anzahl der fluoreszierenden Marker begrenzt, die mit Derdurchflusszytometrie nachweisbar sind. Ein Fortschritt in der molekularen Quantifizierung wurde durch die Entwicklung einer Mikroarray-Technik erreicht, die Dämpfung in 120 Stämmen aus einer anfänglichen gemischten Infektion von über 1.000 Stämmen in einem murinen Modell7erkannte. Diese Technik nutzte eine Mikroarray-Analyse von RNA aus mutierten Stämmen, die zu einer erheblichen Variabilität des Ergebnisses führten.  Dennoch stellte sie fest, dass große Pools gemischter Infektionen ein nützliches Werkzeug sein können und dass durch den Einsatz empfindlicher Nachweistechniken Unterschiede in der bakteriellen Virulenz identifiziert werden können. Mit der Entwicklung der Sequenzierung der nächsten Generation erweiterte Tn-seq den Nutzen von Transposonmutationen und ermöglichte eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Bakterien, die nach dem Zufallsprinzip mutiert waren8,9,10, 11. Kürzlich wurde ein alternatives Protokoll entwickelt, das Transposons überflüssig macht und stattdessen DNA-Barcodes verwendet, um genomische Veränderungen und ihre Auswirkungen auf die Fitness leichter zu identifizieren und zu verfolgen12. Diese Technologie ist ein großer Fortschritt, aber das Einfügen der genomischen Barcodes ist immer noch ein zufälliger Prozess. Um die Zufälligkeit früherer Experimente zu überwinden, entwickelten Yoon et al. eine Methode zur Berechnung der CIs von Salmonellenstämmen mithilfe einzigartiger DNA-Barcodes, die an präzisen Stellen auf den Chromosomen von Bakterien eingefügt wurden13. Einzigartige Barcode-Stämme wurden mit einer qPCR-basierten Methode mit SYBR-Grün und Primern, die für jeden eindeutigen Barcode spezifisch sind, erkannt. Die Technik wurde durch die von qPCR auferlegten Einschränkungen eingeschränkt, einschließlich Unterschieden in der Primer-Effizienz und der geringen Empfindlichkeit, was durch die Notwendigkeit von geschachtelter PCR vor qPCR belegt wird. Dennoch zeigte dieser Ansatz, dass gezielte genomische Modifikationen für den Nachweis und die potentielle Quantifizierung von Pools mehrerer Bakterienstämme genutzt werden könnten.

Im folgenden Protokoll beschreiben wir eine neuartige Methodik zur Durchführung bakterieller Wettbewerbsexperimente mit großen Pools gemischter Inocula, gefolgt von einer genauen Quantifizierung mit einer hochsensiblen digitalen PCR-Technik. Das Protokoll beinhaltet die genetische Kennzeichnung von Bakterienstämmen mit einem einzigartigen DNA-Barcode, der auf eine harmlose Region des Chromosoms eingefügt wird. Diese Modifikation ermöglicht eine schnelle und genaue Quantifizierung von Stämmen mithilfe moderner molekularer Technologie anstelle herkömmlicher serieller Verdünnungen, Nachahmung und Zählen von Koloniebildenden Einheiten, die auf phänotypischen Markern basieren (d. h. Antibiotikaresistenz ). Die Modifikationen ermöglichen die gleichzeitige Bewertung vieler Stämme in einem einzigen gepoolten Inokulum, wodurch die Möglichkeit einer experimentellen Variabilität erheblich reduziert wird, da alle Stämme genau den gleichen Bedingungen ausgesetzt sind. Während diese Technik in Salmonella enterica serovar Typhimurium entwickelt wurde, ist sie hochgradig anpassungsfähig an jeden genetisch verformbaren Organismus und nahezu jedes experimentelle Design, bei dem genaue Bakterienzahlen erforderlich sind, was eine neue Werkzeug zur Erhöhung der Genauigkeit und des Durchsatzes in mikrobiologischen Laboratorien ohne die Einschränkungen, die durch frühere Methoden auferlegt wurden.

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Protocol

1. Integrieren Sie einzigartige DNA-Barcodes auf ein Plasmid, das die notwendigen Komponenten für den Allelic-Austausch enthält

HINWEIS: Ein neues Plasmid namens pSKAP mit einer hohen Kopierzahl und erhöhter Transformationseffizienz im Vergleich zum bestehenden pKD13 Allelic Exchange Plasmid wurde erstellt. Dies wird in den Schritten 1.1-1.12 (Abbildung 1) beschrieben. Die fertigen Plasmide, die eindeutige DNA-Barcodes und Komponenten für den Allelaustausch enthalten, sind über ein Plasmid-Repository (Materialtabelle )verfügbar.

  1. Reinigen Sie pKD1314 und pPCR Script Cam SK+ aus über Nacht angebauten Bakterienkulturen aus Luria-Bertani (LB) Brühe, ergänzt mit 50 g/mL Kanamycin oder 25 g/ml Chloramphenicol (für pKD13 und pPCR Script Cam SK+) (Tabelle 1).
  2. Führen Sie Restriktionsverdauungen auf beiden Plasmiden mit kommerziellen Restriktionsenzymen HindIII und BamHI gemäß den Spezifikationen des Herstellers durch.
  3. Entfernen Sie Restriktionsenzyme und ausgeschnittene DNA aus der pPCR Script Cam SK+ Reaktion und reinigen Sie das 3.370-Basis-Paar (bp) Plasmid-Rückgrat mit einem handelsüblichen DNA-Reinigungskit gemäß den Spezifikationen des Herstellers.
  4. Trennen Sie die Fragmente von der pKD13-Einschränkungsverdauung auf einem 1% Agarose-Gel mit einer Elektrophoresekammer.
  5. Visualisieren Sie Bänder mit einem Blaulichttransilluminator und verbrauchen Sie das 1.333 bp Fragment aus dem Gel (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Dieses Fragment enthält das FRT-flankierte Kanamycin-Resistenzgen, das für den chromosomalen Allelersatz erforderlich ist.
  6. Reinigen Sie die ausgeschnittene DNA aus Schritt 1.5 mit einem kommerziellen Gel-Extraktionskit.
  7. Um pSKAP zu erstellen, ligate das gereinigte Fragment von pKD13 (ab Schritt 1.6) in pPCR Script Cam SK+ (ab Schritt 1.3) mit einer kommerziellen T4-DNA-Ligase nach den Spezifikationen des Herstellers.
  8. Transformieren Sie chemisch kompetente DH5-Zellen mit dem ligattierten pSKAP-Plasmid nach dem Herstellerprotokoll (Tabelle 1).
  9. Transformanten auf LB-Agarplatten verteilen, die mit 50 g/ml Kanamycin ergänzt werden, und bei 37 °C über Nacht inkubieren.
  10. Wählen Sie eine Kolonie von der Platte und streifen Sie sie auf einer neuen LB-Agarplatte, ergänzt mit 50 g/ml Kanamycin, und bebrüten Sie sie bei 37 °C über Nacht. Wählen Sie eine Kolonie aus dieser Platte und verwenden Sie, um LB-Brühe mit 50 g/ml Kanamycin ergänzt zu impfen. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 °C mit ständiger Erregung.
  11. Verwenden Sie ein kommerzielles Plasmid-Miniprep-Kit, um pSKAP von der über Nacht bakteriellen Kultur zu reinigen.
  12. Führen Sie eine diagnostische Restriktionsverdauung des Plasmids ab Schritt 1.11 mit Hind III und Bam HI gemäß herstellerspezifischen Spezifikationen durch. Visualisieren Sie Fragmente auf einem 1% Agarose-Gel wie in den Schritten 1.4-1.5.
    HINWEIS: Die pSKAP Gesamtgröße sollte 4.703 bp sein. Fragmente nach Schritt 1.12 sollten 3.370 und 1.333 bp sein.
  13. Entwerfen Sie PCR-Primer für die einfügungsweise standortgesteuerte Mutagenese (SDM) (Tabelle 2 und S1) so, dass eine eindeutige 25-Basepair-DNA-Sequenz an Position 725 von pSKAP eingefügt wird (Abbildung 2).
    HINWEIS: Die Barcode-DNA wird in das Plasmid etwas außerhalb des FRT-flankierten Kanamycin-Resistenzgens eingeführt, so dass der Barcode bei der anschließenden Entfernung der Kanamycin-Resistenzkassette nicht verloren geht. Wenn Sie neue Barcode-Sequenzen erzeugen, verwenden Sie Online-Tools, um sicherzustellen, dass die fluoreszierend markierten zielspezifischen PCR-Sonden (im Folgenden einfach als "Sonden" bezeichnet) effizient an die neue Sequenz binden. Einfügesequenzen, die bis heute entworfen wurden, sowie die erforderlichen Primer, um sie zu erstellen, sind in den Tabellen 2 und S1enthalten.
  14. Bereiten Sie SDM-Reaktionen mit einer kommerziellen High-Fidelity-DNA-Polymerase, den gewünschten Primer-Paaren (Tabelle 2) und pSKAP-Vorlage vor. Stellen Sie den Thermocycler so ein, dass er folgendes durchführt: 1) 98 °C für 30 s, 2) 98 °C für 10 s, 56 °C für 15 s, 72 °C für 2 min, 3) Wiederholungsschritte 2, 24-fach, 4) 72 °C für 5 min, 5) bei 4 °C halten.
  15. Nach Abschluss der PCR, deplete pSKAP-Vorlage durch Hinzufügen des Restriktionsenzyms Dpn I zur Reaktion. Bei 37 °C für 20 min inkubieren.
    HINWEIS: Produkte von PCR sollten auf einem Agarose-Gel visualisiert werden, um die Größe und Reinheit des Produkts zu überprüfen. Eine Kontroll-Dpn-I-Verdauung, die aus der unveränderten pSKAP-Vorlage besteht, kann in nachfolgenden Schritten durchgeführt und verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Vorlagen-DNA vollständig verdaut wird.
  16. Verwenden Sie 5 l des Produkts ab Schritt 1,15, um 100 l kommerziell chemisch kompetente DH5-Zellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers umzuwandeln.
  17. Transformanten auf LB-Agarplatten verteilen, die mit 25 g/ml Chloramphenicol ergänzt werden, und über Nacht bei 37 °C brüten.
  18. Wählen Sie eine Kolonie (oder Kolonien) aus Nachtplatten und streifen Sie auf einzelne LB-Agarplatten, die mit 25 g/ml Chloramphenicol ergänzt werden, und brüten Sie bei 37 °C über Nacht. Wählen Sie eine Kolonie aus Nachtplatten und verwenden Sie, um 5 ml LB-Brühe zu impfen, ergänzt mit 25 g/ml Chloramphenicol. Inkubieren Kultur(en) über Nacht bei 37 °C mit ständiger Agitation.
  19. Verwenden Sie ein kommerzielles Plasmid-Miniprep-Kit, um Plasmide aus der Nachtkultur zu reinigen.
  20. Sanger-Sequenz gereinigte Plasmide mit dem M13 Forward Sequenzierungsprimer (Tabelle 2). Vergleichen Sie mutierte Region mit dem ursprünglichen Plasmid und bewerten Sie die SDM-Einfügegenauigkeit.
  21. Nach bestätigung der Barcode-Einfügung und Genauigkeit, weisen Sie jedem Barcode und Plasmid einen Namen.
    HINWEIS: Barcodes, die bisher generiert wurden, haben eine zweistellige Bezeichnung zugewiesen: AA, AB, AC, ..., BA, BB, BC, etc. Barcoded-Plasmide werden als pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC, ..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC usw. bezeichnet.
  22. Wiederholen Sie die Schritte 1.14-1.21, um die gewünschte Anzahl von DNA-Barcodes zu generieren.

2. DNA Barcode auf das Chromosom von S einführen. Typhimurium

HINWEIS: Einfügen von DNA-Barcodes in das S. Typhimuriumchromosom wird durch die Verwendung einer von Datsenko und Wanner14 beschriebenen allelischen Austauschmethode erreicht, die für den Einsatz in S modifiziert wurde. Typhimurium.

  1. Bestimmen Sie den Ort auf dem S. Typhimurium-Genom, bei dem der DNA-Barcode eingefügt werden soll (Abbildung 3).
    HINWEIS: Wählen Sie einen großen, intergenen Bereich des Chromosoms aus. Vermeiden Sie Regionen, die nicht-kodierende RNA produzieren. Diese Studie nutzte einen Ort nach dem Put P zwischen den Rückständen 1.213.840 und 1.213.861 (ermittelt aus der Genombaugruppe GCA_000022165.1). Diese Region wurde zuvor genetisch manipuliert, da gene15transkomplementiert wurden. Alternativ könnte ein DNA-Barcode eingeführt werden, während gleichzeitig ein Gen von Interesse gestört wird. Dies würde minimale Änderungen an diesem Protokoll erfordern und die erstellung von Mutanten optimieren.
  2. Entwerfen Sie PCR-Primer, um den einzigartigen Barcode und das FRT-flankierte Kanamycin-Resistenzgen aus dem gewünschten pSKAP-Barcode-haltigen Plasmid aus Schritt 1.21 (Tabelle 2) zu verstärken. Fügen Sie 40-Nukleotid-Erweiterungen, die homologe sind, zu der Region hinzu, die in Schritt 2.1 ausgewählt wurde, bis zum 5' Ende jedes Primers (Tabelle 2).
  3. Führen Sie die Verstärkung mit einer kommerziellen High-Fidelity-Polymerase, den Primern ab Schritt 2.2 und dem gewünschten pSKAP-Barcode-haltigen Plasmid als Vorlage durch. Stellen Sie den Thermocycler so ein, dass er folgendes durchführt: 1) 98 °C für 30 s, 2) 98 °C für 10 s, 3) 56 °C für 15 s, 4) 72 °C für 60 s, Wiederholungsschritte 2-4 29-mal, 5) 72 °C für 5 min, 6) bei 4 °C halten.
  4. Nach Abschluss der PCR, deplete Template DNA mit DpnI, wie in Schritt 1.15 beschrieben. Reinigen und konzentrieren Sie die DNA mit einem kommerziellen DNA-Reinigungskit nach den Spezifikationen des Herstellers.
  5. Siehe das zuvor veröffentlichte Protokoll zum Generieren von Mutanten in S. Typhimuriumstamm 14028s aus PCR-Produkten14,16,17,18.
    HINWEIS: Es ist nicht unbedingt notwendig, dass das Kanamycinresistenzgen aus dem Chromosom entfernt wird. Die Exzision des Gens ist jedoch minimal störend für das bakterielle Chromosom, da es zu einer 129 bp Narbe führt, die potenzielle nachgeschaltete Gene im Rahmen belassen würde. Es wird empfohlen, dass der Stamm, der das Kanamycin-Resistenzgen enthält, beibehalten wird, da er verwendet werden kann, um Barcodes zwischen Stämmen über P22-vermittelte Transduktion zu bewegen.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 – 2.5, um die gewünschten Stämme mit den entsprechenden Barcodes zu erstellen.
    HINWEIS: Barcodes können in den Wildtyp S eingeführt werden. Typhimurium, das dann weiteren genetischen Manipulationen ausgesetzt werden kann, oder Barcodes können in Stämme eingeführt werden, die zuvor genetisch verändert wurden.

3. Bakterielle Wachstumsbedingungen und In-Vitro-Wettbewerbstests

  1. Aus Bakterienbestand, Streifen gewünscht S. Typhimurium-Stämme, die jeweils einen einzigartigen DNA-Barcode auf LB-Agarplatten beherbergen. Teller über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  2. Wählen Sie aus jedem Stamm eine einzelne Kolonie aus und impfen Sie 5 ml LB-Brühe. 20 h bei 37 °C bei konstanter Rührung inkubieren.
    HINWEIS: Fahren Sie mit der Nachtkultur schritt 3.5, um reine genomische DNA (gDNA) aus jedem Barcode-Stamm zu sammeln. Dies ist für nachfolgende Validierungs- und Kontrollexperimente in Abschnitt 6 erforderlich.
  3. Übertragen Sie für jeden Wettbewerbstest ein gleiches Volumen jeder Nachtkultur in eine entsprechend große sterile Röhre. Durch kräftiges Wirbeln für mindestens 5 s die Stämme gründlich vermischen.
    HINWEIS: Das Volumen jeder zu übertragenden Nachtkultur sollte für jede Bedingung und Replikation sowie für die Isolierung von gDNA zur Quantifizierung des Eingangs ausreichen. Obwohl es nicht unbedingt notwendig ist, die optische Dichte von Kulturen zu messen, da die absolute Anzahl der Eingangsmikroorganismen mit Hilfe der digitalen PCR quantifiziert wird, sollte die Anzahl der Eingangsbakterien für jeden Stamm ungefähr gleich sein, um Engpässe zu vermeiden oder ungleiche Konkurrenz zu Beginn des Experiments. Repräsentative Wettbewerbsassays in diesem Protokoll verglichen Wachstumsraten von 8 Stämmen gleichzeitig. Für einzelne Versuchsentwürfe können zusätzliche oder weniger Stämme erforderlich sein.
  4. 100 l des gemischten Inokulums in 4,9 ml sterile LB-Brühe übertragen. Bei 37 °C für die gewünschte Zeit oder auf eine gewünschte optische Dichte inkubieren.
  5. Ernten Sie 500 l des Inokulums durch Zentrifugation bei >12.000 x g für 1 min. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Fahren Sie sofort mit Abschnitt 4 mit den Zellen fort.
  6. Entfernen Sie zu den gewünschten Zeitpunkten 500 L-Aliquots der Kultur und ernten Sie Zellen durch Zentrifugation bei >12.000 x g für 1 min. Entfernen und entsorgen Sie überstand.
    HINWEIS: Wenn Sie Aliquots an mehreren Zeitpunkten sammeln, frieren Sie Pellets bei -20 °C ein oder fahren Sie sofort nach jeder Sammlung mit Schritt 4.1 fort.

4. Sammeln und Quantifizieren von gDNA aus S. Typhimurium (ab den Schritten 3.5 und 3.6)

  1. Ernte gDNA aus Zellen mit einem kommerziellen gDNA-Reinigungskit. Wenn verfügbar, führen Sie den optionalen RNA-Erschöpfungsschritt aus.
    HINWEIS: RNA-Erschöpfung ist nicht notwendig; Das Vorhandensein von RNA erhöht jedoch künstlich die DNA-Konzentration, was zu abnormen Berechnungen in späteren Schritten führt. Wenn Sie ein kommerzielles gDNA-Reinigungskit verwenden, befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers, um sicherzustellen, dass die Säule nicht mit DNA überlastet ist. Es ist keine minimale DNA-Konzentration erforderlich, wenn die Probe in späteren Schritten quantifizierbar ist.
  2. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die DNA in jeder Probe zu quantifizieren.
    HINWEIS: DNA kann mit jeder zuverlässigen Methode quantifiziert werden.
  3. Berechnen Sie die gDNA-Kopiernummer basierend auf der bakteriellen Genomgröße mit der folgenden Gleichung, wobei: X die Menge der DNA in ng und N die Länge eines doppelsträngigen DNA-Moleküls (die Genomgröße) ist.
    Equation 1
    HINWEIS: 660 g/Mol wird als durchschnittliche Masse von 1 DNA bp verwendet. Je nach Nukleotidzusammensetzung des Organismus können kleine Variationen vorhanden sein. Zahlreiche Rechner stehen online zur Verfügung, um die Berechnung durchzuführen.

5. Design Primer und Sonden für die quantitative Detektion von DNA-Barcodes über dDigital PCR

  1. Design-Primer, um den Barcode-Bereich des Szu verstärken. Typhimuriumchromosom nach dem PutP (Abbildung 3C und Tabelle 2).
    HINWEIS: Primer- und Sondendesigns können durch zahlreiche Online-Programme (Tabelle der Materialien) erleichtert werden. Wenn Barcodes alle an der gleichen Loci eingefügt werden, ist ein einziger Satz von Amplifikationsgrundierungen universell für alle Barcodes.
  2. Design 6-Carboxyfluorescein (FAM)-basierte und/oder Hexachlorfluorescein (HEX)-basierte Sonden spezifisch für jeden Barcode (Tabelle 2 und S1).
    HINWEIS: Der in diesem Experiment verwendete Tröpfchenleser ist in der Lage, sowohl FAM- als auch HEX-basierte Sonden gleichzeitig in einer Multiplex-Reaktion zu erkennen. Entwerfen Sie 1/2 der Sonden, um FAM und 1/2 zu verwenden, um HEX zu verwenden. Dies ist kein notwendiger Schritt, sondern reduziert den Einsatz von Reagenzien und die experimentellen Kosten, wenn sie umgesetzt werden.
  3. Erstellen Sie 20x Primer-Sonden-Master-Mischungen, die 1) 20 mM jeder Vorwärts- und Rückwärtsverstärkungsgrundierung, 2) 10 mM einer einzelnen FAM-Sonde und 3) 10 mM einer einzelnen HEX-Sonde (wenn Multiplexing) enthalten.

6. Validieren Sie die Empfindlichkeit und Spezifität jedes Pprimer-Sonden-Sets für jeden Genom-Barcode mit digitaler PCR

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die Validierung von acht eindeutigen Barcodes mit acht eindeutigen Sonden als Beispiel. Die Anzahl der verwendeten Barcodes kann erhöht oder verringert werden, um verschiedene experimentelle Designs aufzunehmen.

  1. Erstellen Sie einen Pool von gDNA, der jeden Barcode mit Ausnahme eines Barcodes enthält. Verwenden Sie diesen Pool als Verdünnungsmittel, um eine Verdünnungsserie mit gDNA durchzuführen, die den einzelnen verbleibenden Barcode enthält (Musterverdünnungsschema ist in Abbildung 4angegeben).
    HINWEIS: Die Verwendung von gepoolter gDNA als Verdünnungsmittel sorgt für einen konsistenten Hintergrund bei gleichzeitiger Ermittlung der Empfindlichkeit. Unter Verwendung der in Schritt 4.3 ermittelten Kopiernummern verdünnen Sie gDNA auf eine Kopiernummer innerhalb des empfohlenen digitalen PCR-Bereichs (1-100.000 Kopien pro 20-L-Reaktion). Beachten Sie, dass der Bereich für jedes einzelne Ziel (Barcode) festgelegt ist, nicht für die gesamte gDNA.
  2. Bereiten Sie Reaktionen für digitale PCR in doppelter Weise gemäß den Empfehlungen des Herstellers für die Verwendung eines digitalen PCR-Supermix für die sondenbasierte Chemie vor. Verwenden Sie die Mischungen aus Schritt 6.1 als Vorlagen-DNA. Verwenden Sie den 20x Primer-Sonden-Master-Mix aus Schritt 5.3, der die Sonde für den verdünnten Barcode in Schritt 6.1 enthält.
  3. Bereiten Sie Replizierbare Steuerungsreaktionen für digitale PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers für die Verwendung eines digitalen PCR-Supermixs für die sondenbasierte Chemie vor. Kontrollreaktionen für jeden Sondenmix müssen aus 1) keinen Vorlagensteuerelementen (NTCs), 2) Negativkontrollen und 3) positiven Steuerelementen bestehen.
    HINWEIS: Die minimale Anzahl von Replikationskontrollreaktionen beträgt zwei. Dieses Beispielprotokoll verwendet vier NTCs, sechs Negative-Steuerelemente und sechs positive Steuerelemente für jeden Barcode. Negativkontrollen sollten gDNA mit jedem Barcode enthalten, mit Ausnahme des Barcodes, der der zu prüfenden Sonde entspricht. Dadurch wird die Spezifität der einzelnen Tests überprüft.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 6.1-6.3, um digitale PCR-Reaktionen für jedes barcoded gDNA-Beispiel zu erstellen. Eine Probenplattenanordnung ist in Abbildung 5dargestellt.
    HINWEIS: Diese und nachfolgende Schritte werden auf der Grundlage einer spezifischen digitalen PCR-Plattform beschrieben, die Tröpfchen und strömungsbasierte Technologie nutzt. Alternative digitale PCR-Plattformen, die Chip-basierte Technologie nutzen, können leicht durch geringfügige Änderungen an diesem Protokoll ersetzt werden. Schritt 6.4 kann mehr als eine 96-Well-Platte erfordern, um alle Primer-Sets zu validieren. Im Gegensatz zu qPCR können separate Platten, die von der digitalen PCR analysiert werden, ohne standardisierte Referenzbrunnen zwischen Platten problemlos verglichen werden.
  5. Generieren Sie Tröpfchen für jede Reaktionsbedingung mit einem Tröpfchengenerator gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  6. Neu angelegte Tröpfchen in die entsprechende 96-Well-Platte geben. Verwenden Sie 200 L Pipettenspitzen auf einer Mehrkanalpipette mit 5-50 l.
    HINWEIS: Beim Pipetieren von Tröpfchen, Pipette langsam und glatt! Der Hersteller digitaler PCR-Geräte empfiehlt, nur Pipetten und Pipettenspitzen eines bestimmten Herstellers (z.B. Ranin) zu verwenden. Diese Pipettenspitzen haben eine glatte Öffnung ohne mikroskopische Kunststofffragmente, die Tröpfchen zerstören oder die Mikrofluidik des Tröpfchenlesers beschädigen können. Zahlreiche Tipps-Marken wurden untersucht und beobachtet, um ein Spektrum an Fertigungsqualität zu haben. Äquivalente Ergebnisse wurden mit Pipettenspitzenalternativen erzielt; Bei abweichender Abweichung von den Empfehlungen des Herstellers ist jedoch Vorsicht geboten.
  7. Nachdem alle Tröpfchen erzeugt und übertragen wurden, versiegeln Sie die Platte mit einem Folienplattenversiegeler.
  8. Verwenden Sie den vom Hersteller empfohlenen Thermocycler, um die folgenden Zyklusbedingungen zu erfüllen: 1) 94 °C für 10 min; 2) 94 °C für 1 min, Rampenrate auf 1 °C/s eingestellt; 3) 55 °C für 2 min, Rampenrate auf 1 °C/s eingestellt; 4) Wiederholen Sie die Schritte 2 und 3 49 Mal; 5) 98 °C für 10 min; 6) bei 4 °C bis 24 h halten.
    HINWEIS: Die Wärmeübertragung in einer Tröpfchenreaktion ist nicht identisch mit der Standard-PCR. Reaktionsbedingungen können eine Änderung erfordern.
  9. Während Thermocycling durchgeführt wird, programmieren Sie die Datenanalyse-Software mit den Platten-Setup-Informationen wie Beispielname, Experimentiertyp (absolute Quantifizierung), Supermix verwendet, Ziel 1 Name (FAM-Barcode-Name), Ziel 1-Typ (NTC, positive Kontrolle, Negativsteuerelement oder unbekannt), Ziel-2-Name (HEX-Barcodename), Ziel-2-Typ (leer, positiv, negativ gesteuert oder unbekannt). Die informationen zum Einrichten der endgültigen Platte sind in Abbildung 5dargestellt.
  10. Nachdem das Thermocycling abgeschlossen ist, übertragen Sie die abgeschlossenen Reaktionen auf den Tröpfchenleser und starten Sie den Lesevorgang gemäß den Anweisungen des Herstellers.

7. Quantifizieren Sie die Anzahl der Bakterien in einem Wettbewerbsindex-Experiment

  1. Verdünnung der gDNA isoliert und quantifiziert von Abschnitt 4 auf eine geeignete Konzentration, wie oben beschrieben.
  2. Bereiten Sie Reaktionen für digitale PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers für die Verwendung des entsprechenden Supermix. Verwenden Sie DNA aus Schritt 7.1 als Vorlage. Verwenden Sie einen 20-fachen Primer-Sonden-Master-Mix, der die Sonde (oder Sonden bei der Erkennung von FAM und HEX) für mögliche Barcodes enthält, die im Experiment vorhanden sind.
  3. Bereiten Sie zusätzliche digitale PCR-Reaktionen wie in Schritt 7.2 mit verschiedenen 20x Primer-Sonden-Master-Mixen vor, bis alle Barcodes, die im experimentellen Design verwendet werden, erkannt werden können.
  4. Fügen Sie Steuerelemente für jede Bedingung ein, wie in 6.3 beschrieben. Dazu gehören 1) keine Vorlagensteuerelemente (NTCs), 2) Negativsteuerelemente und 3) positive Steuerelemente.
  5. Fahren Sie mit dem Protokoll fort, wie in den Schritten 6.5-6.10 beschrieben.

8. Analysieren Sie digitale PCR-Daten und berechnen Sie absolute Kopiernummern

  1. Wenn alle Brunnen gelesen wurden und die Ausführung abgeschlossen ist, öffnen Sie die .qlp-Datendatei mit der Datenanalysesoftware.
    HINWEIS: Die hier beschriebenen Dateitypen und Datenanalyseverfahren sind spezifisch für einen digitalen PCR-Hersteller. Bei Verwendung alternativer digitaler PCR-Plattformen sind Dateitypen und Datenanalyseverfahren spezifisch für die verwendete Plattform und sollten gemäß den vom Hersteller empfohlenen Spezifikationen durchgeführt werden.
  2. Wählen Sie alle Brunnen aus, die den gleichen Primer-Sonden-Master-Mix verwenden.
  3. Untersuchen Sie auf der Registerkarte Tröpfchen die Anzahl der in jedem Brunnen analysierten Tröpfchen (sowohl positive als auch negative Tröpfchen). Schließen Sie alle Brunnen aus, der weniger als 10.000 Tröpfchen insgesamt enthält.
  4. Wechseln Sie zur Registerkarte 1D-Amplituden, und untersuchen Sie die Amplituden positiver und negativer Tröpfchen. Stellen Sie sicher, dass sie aus zwei unterschiedlichen Populationen bestehen.
  5. Verwenden Sie innerhalb der Software die Schwellenwertfunktion, um einen Grenzwert zwischen positiven und negativen Tröpfchen für jede verwendete Sonde vorzunehmen (Abbildung 6).
    HINWEIS: Alle Bohrungen, die den gleichen Primer-Sonden-Master-Mix aus Schritt 5.3 verwenden, sollten die gleichen Schwellenwerte haben.
  6. Sobald entsprechende Schwellenwerte auf alle Brunnen angewendet wurden, berechnet die Software die Anzahl der DNA-Kopien in jeder Reaktion. Exportieren Sie Daten in eine Kalkulationstabelle, um weitere Analysen zu erleichtern.
    HINWEIS: Die Datenanalysesoftware verwendet die Anzahl der positiven und negativen Tröpfchen, die zu einer Poisson-Verteilung passen, um die Kopiernummer zu bestimmen.
  7. Berechnen Sie anhand der Werte aus Schritt 8.6 die anfängliche Kopiernummer jedes eindeutigen genomischen Barcodes in der Probe. Bestimmen Sie die mittlere falsch-positive Rate von den negativen Kontrollreaktionen und subtrahieren Sie diesen Wert von den Werten, die in experimentellen Reaktionen erhalten wurden. Multiplizieren Sie die Werte nach Bedarf basierend auf den Verdünnungen, die beim Einrichten jedes Experiments durchgeführt wurden (Tabelle 3).

9. Bestimmen Sie die relative Fitness eines Organismus durch Berechnung des CI oder COI aus digitaler PCR-basierter Quantifizierung von Barcoded-Stämmen

  1. Berechnen Sie das CI eines Barcode-Stamms mit den folgenden Formeln, wobei: EinOutput ist die absolute Quantifizierung des Barcode-Stamms zu einem bestimmten Zeitpunkt, WTOutput ist die absolute Quantifizierung von Barcode-Wild-Typ-Bakterien an der gleichen Zeitpunkt ist AInput die absolute Quantifizierung des Eingangsinokulums des Barcode-Stamms, WTInput ist die absolute Quantifizierung des Eingangsinokulums von Barcode-Wild-Typ-Bakterien, XOutput ist die Summierung aller Stämme bei der gleiche Zeitpunkt ist XInput die Summe des gesamten Eingangsinokulums aller Barcode-Stämme.

Equation 2
Equation 3
HINWEIS: Sehen Sie sich die Diskussion für Vor- und Nachteile und die am besten geeignete Verwendung jeder Formel an.

  1. Wiederholen Sie Schritt 9.1 für jede Barcode-Dehnung zu allen Zeitpunkten.
  2. Berechnen Sie ggf. die COI anhand der folgenden Formeln: EinOutput ist die absolute Quantifizierung eines Barcode-Stamms mit mutiertem Gen A zu einem bestimmten Zeitpunkt, ABOutput ist die absolute Quantifizierung eines Barcode-Stamms. mit den mutierten Genen A und B gleichzeitig ist AInput die absolute Quantifizierung des Eingangsinokulums des Barcode-Stamms mit dem mutierten Gen A,ABInput ist die absolute Quantifizierung des Eingangsinoculums Barcode-Stamm mit mutierten Genen A und B, BOutput ist die absolute Quantifizierung eines Barcode-Stamms mit mutiertem Gen B zu einem bestimmten Zeitpunkt, undB-Eingang ist die absolute Quantifizierung des Eingangs Inokulum des Barcode-Stamms mit mutiertem Gen B.

Equation 4
UND/ODER
Equation 5

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Representative Results

Die Anwendung dieser Methode erfordert, dass geeignete Kontrollreaktionen durchgeführt werden, um die Empfindlichkeit und Spezifität jeder Sonde zu validieren, die zur Identifizierung der Ziel-DNA verwendet wird. In diesem repräsentativen Experiment haben wir acht eindeutige DNA-Barcodes mit den acht entsprechenden Sonden zur Identifizierung validiert. Alle acht Sonden wiesen sowohl bei NTC als auch bei negativen Kontrollreaktionen eine geringe Rate falscher Positivwerte auf (Tabelle3), was ihre Spezifität selbst bei sehr ähnlichen DNA-Sequenzen hervorhob. Um die Empfindlichkeit jeder Bedingung zu beurteilen, wurde gDNA, die einen eindeutigen Barcode enthält, seriell in einem konstanten Hintergrund von gDNA verdünnt, der jede der sieben verbleibenden Barcodesequenzen enthält. Mit dem oben beschriebenen Ansatz könnte die digitale PCR nur 2 Kopien von gDNA in einem Hintergrund von fast 2.000.000 ähnlichen DNA-Sequenzen unterscheiden (Tabelle 3).

Neben der Bestimmung der Empfindlichkeit und Spezifität jeder Sonde und DNA-Barcodesequenz ermöglichten uns die in der Validierungsstudie durchgeführten Verdünnungen, einen simulierten Wettbewerbsindex aus den resultierenden Daten zu berechnen. Obwohl es für dieses Experiment keine echte Eingabe oder Ausgabe gab, können die Daten so analysiert werden, als ob ein Wettbewerbsexperiment durchgeführt wurde. Dazu betrachten wir jede Mischung in der seriellen Verdünnung als Ausgang (AOutput) für den verdünnten Barcode, während die Gesamtausgabe (XOutput), Eingang (AInput) und der Gesamteingang (XEingang) jeder Dehnung aus dem Quantifizierung in den Positivkontrollen, bei denen alle Barcodes enthalten sind. Unter Verwendung des Verdünnungsfaktors für jedes Gemisch wurde das theoretische CI bestimmt und in Tabelle 3dargestellt. In jeder der Verdünnungsreihen, die für jeden Barcode durchgeführt wurden, wird der durchschnittliche simulierte CI zusammen mit den Standardabweichungen für jede doppelte Verdünnungsserie gemeldet. In allen Fällen ähnelt das berechnete simulierte CI dem theoretischen CI. Die Mehrheit der berechneten CIs weicht um weniger als 25 % von den theoretischen CIs ab. Bei niedrigeren theoretischen CIs lag die Abweichung des berechneten Wertes um das Zweifache. Dies bedeutete z. B. eine Änderung von einem theoretischen CI von 0,000625 zu einem berechneten CI von 0,001220. Diese Daten unterstreichen, dass die beschriebene Methode sowohl hochpräzise als auch hochpräzise ist. Die Kombination aus hoher Empfindlichkeit, Spezifität, Genauigkeit und Präzision ermöglicht es diesem System, Unterschiede in der Fitness zuverlässig zu erkennen, die sonst unbemerkt bleiben könnten.

Nachdem wir validiert hatten, dass genomische Barcodes genau erkannt und quantifiziert werden konnten, führten wir In-vitro-Wettbewerbsexperimente durch (Tabelle 4). Das erste Wettkampfexperiment nutzte acht Wildtyp S. Typhimurium-Stämme, die jeweils einen eindeutigen DNA-Barcode enthielten. Jede Sorte wurde über Nacht angebaut, und die acht Kulturen wurden in gleichen Mengen miteinander vermischt. 100 l dieses gemischten Inokulums wurden verwendet, um 4,9 ml sterile LB-Brühe zu impfen, und die resultierende Kultur wurde bei 37 °C mit konstanter Rührung inkubiert. gDNA wurde aus dem Inokulum geerntet, um den genauen Input jedes Stammes zu berechnen. Das Wachstum der Kultur wurde durch Messung der Absorption bei 600 nm (OD600) überwacht. Bei OD600 = 0,5 (logarithmische Phase) wurde aus jeder Kultur eine Probe entnommen und gDNA geerntet. Die verbleibende Kultur wurde auf 37 °C mit ständiger Agitation bis 8 Stunden nach der Impfung zurückgegeben, als eine letzte Probe gesammelt und gDNA geerntet (stationär) wurde. Die Ergebnisse wurden mit der CI-Formel berechnet, die für gepoolte Infektionen modifiziert wurde. Wie erwartet hatten alle Wildtyp-Stämme CI-Werte, die fast gleich 1 waren (Tabelle 4). Ein ähnliches Wettbewerbsexperiment wurde mit acht mutierten Sdurchgeführt. Typhimurium-Stämme, die jeweils einzigartige Barcodes zusätzlich zu einem Single-, Double- oder Triple-Transketolase-Mangel18hatten. Wie bereits gezeigt, wuchsen die Stämme alle in der LB-Brühe ähnlich, wobei nur ein geringer Rückstand bei der Dreifach-Transketolase-Mangel-Sorte beobachtet wurde. Als jedoch das Wachstum der einzelnen Stämme durch die Analyse des CI beurteilt wurde, wurde ein viel tieferer Defekt für die transketolase-defizientische Sorte beobachtet (CI wurde mit Wachstumskurven in Shaw et al.18verglichen). Darüber hinaus ermöglichte uns dieses Experiment, den Wachstumsmerkmalen jeder Sorte einen quantifizierbaren Wert zuzuweisen, anstatt nur die Wachstumsmuster qualitativ zu beschreiben. CIs für jeden Stamm wurden sowohl nach der traditionellen Formel berechnet, bei der jeder Stamm nur mit Wildtyp verglichen wurde, als auch mit der modifizierten Formel, bei der alle Eingangsstämme berücksichtigt wurden. Während die Veränderungen klein waren, war das CI der Triple-Transketolase-Mangel-Sorte in der traditionellen Formel künstlich niedrig, da es nicht für die anderen sechs konkurrierenden Stämme verantwortlich ist, die alle nahezu wilde Fitness aufwiesen.

Stämme Genotyp Quelle oder Referenz
S. Typhimurium ATCC 14028s Wild-Typ ATCC
TT22236 LT2 Salmonellen tragen pTP2223 (27)
DH5 F– 80lacZ-M15 (lac ZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rK–, mK+) phoA supE44 -thi-1 gyrA96 relA1  (28)
JAS18077 putP::AA::FRT Diese Studie
JAS18080 putP::AD::FRT Diese Studie
JAS18083 putP::AG::FRT Diese Studie
JAS18088 putP::AL::FRT Diese Studie
JAS18091 putP::AO::FRT Diese Studie
JAS18096 putP::AT::FRT Diese Studie
JAS18099 putP::AW::FRT Diese Studie
JAS18100 putP::AX::FRT Diese Studie
JAS18122 tktA::FRT putP::AD::FRT Diese Studie
JAS18130 tktB::FRT putP::AL::FRT Diese Studie
JAS18138 tktC::FRT putP::AT::FRT Diese Studie
JAS18125 tktA::FRT -tktB::FRT putP::AG::FRT Diese Studie
JAS18133 tktA::FRT beitktC::FRT putP::AO::FRT Diese Studie
JAS18141 tktB::FRT beitktC::FRT putP::AW::FRT Diese Studie
JAS18142 tktA::FRT -tktB::FRT -tktC::FRT putP::AX::FRT Diese Studie
Plasmide
pKD13 bla FRT ahp FRT PS1 PS4 oriR6K (14)
pPCR Script Cam SK+ ColE1 ori; CmR Stratagene/Aligent
pTP2223 Plac lam bet exo tetR (16)
pCP20 bla cat cI857 PFlp pSC101 oriTS (29)
pSKAP ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT Diese Studie
pSKAP_AA ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AA Diese Studie
pSKAP_AD ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; ad Diese Studie
pSKAP_AG ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AG Diese Studie
pSKAP_AL ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AL Diese Studie
pSKAP_AO ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AO Diese Studie
pSKAP_AT ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; BEI Diese Studie
pSKAP_AW ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AW Diese Studie
pSKAP_AX ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AX Diese Studie

Tabelle 1: Stämme und Plasmide, die in dieser Studie verwendet werden.

name Sequenz (5' - 3')1,2,3
pSKAP SDM AA - F AGAAGTCTCTTGCTGGTGCTTGAGT CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AA - R ACTCAAGCACCAGCAGGAGACTTCT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AD - F AAGAGCACGGTGAGGATAGTAGG CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AD - R CCTACTATCACCTCCGCTCTT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AG - F AGTAGTGTCCTGGAGGAGCATGTGA CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AG - R TCACATGCTCCTCCAGGACACTACT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AL - F ACCACACATCGAAGGCACTAGCTCT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AL - R AGAGCTAGTGCCTTCGATGTGGT CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AO - F GTCCACAACACACCAGTGATACT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AO - R AGTATCACTGAGTGTGGTTGGAC CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AT - F ACCAGTGTCCGTGACATGGCTAGAC CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AT - R GTCTAGCCATGTCACGGACACTGGT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AW - F ACGACTGAGTGATGTGGATGTGACG CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AW - R CGTCACATCCACATCACTCAGTCGTGT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AX - F ACTATCGTGGTGTAACGACAGGCTG CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AX - R CAGCCTGTCGTTACACACGATAGT CTCAAGACGTGTAATGCTG
M13 - F GTAAAACGACGGCCAG
putP Rekombination - F TAGCGATGGGAGAGAGGACACGTTAATTATTCCATTTTAA
TGCAGCATTACACGTC
putP Rekombination - R TACTGCGGGTATTAATGCTGAAAACATCCATAACCCATTG
CCTGCAGTTCGAAGTTCC
qPCR Barcode Region Verstärken - F1 TGCAGCATTACACCTTG
qPCR Barcode Region verstärken - R2 TAGGAACTTCGAAGCAGC
Barcode AA Probe - FAM 6-FAM/AGAAGTCTC/ZEN/CTGCTGGTGCTTGAGTC/IBFQ
Barcode AD Probe - FAM 6-FAM/AAGAGCACG/ZEN/GTGAGGTGATAGTAGGC/IBFQ
Barcode AG Sonde - FAM 6-FAM/AGTAGTGTC/ZEN/CTGGAGGAGGAGGTGAC/IBFQ
Barcode AL Probe - FAM 6-FAM/AGAGCTAGT/ZEN/GCCTTCGATGTGGTC/IBFQ
Barcode AO Sonde - HEX HEX/AGTATCACT/ZEN/GAGTGTGGTTGGACC/IBFQ
Barcode AT Probe - HEX HEX/ACCAGTGTC/ZEN/CGTGACATGGCTAGACC/IBFQ
Barcode AW Sonde - HEX HEX/ACGACTGAG/ZEN/TGATGTGGATGTGACGC/IBFQ
Barcode AX Probe - HEX HEX/ACTATCGTG/ZEN/GTGTAACGACAGGCTGC/IBFQ
1 Unterstrichene Nukleotide zeigen komplementäre Sequenzen für jeden DNA-Barcode an, der nach SDM auf pSKAP eingefügt wird.
2 Doppelt unterstrichene Nukleotide weisen auf eine sich ergänzende Region auf der Shin. Typhimuriumchromosom, das für den Allelersatz verwendet wird.
3 PrimeTime qPCR Sonden sind Hybridisierungsoligos, die mit einem 5' Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet sind, entweder 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) oder Hexachlorfluorescein (HEX), ein interner Quencher (ZEN) und der 3' Quencer Iowa Black® FQ (IBFQ).

Tabelle 2: In dieser Studie verwendete Primer und Sonden.

Quantifizierung (Kopien/20-L-Reaktion)
beschreibung Aa anzeige Ag Al Ao an Aw Ax
Ntc N/A 0.000 0.000 3.510 N/A 0.000 0.000 0.000
Ntc 3.600 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Ntc 3.510 0.000 1.280 1.180 2.340 0.000 0.000 0.000
Ntc 2.290 0.000 0.000 1.200 1.150 1.160 0.000 0.000
knauserig 3.133 0.000 0,320 1.473 1.163 0,290 0.000 0.000
ablehnend 5.130 1.156 0.000 1.124 3.745 1.281 7.354 7.142
ablehnend 5.270 0.000 0.000 1.087 1.666 1.643 7.746 2.269
ablehnend 2.660 0.000 1.361 1.451 8.974 0.000 N/A 0.000
ablehnend 6.090 0.000 0.000 2.251 0.000 2.531 8.700 3.495
ablehnend 1.740 0.000 1.086 2.130 4.171 0.000 7.113 5.522
ablehnend 6.220 3.581 0.000 4.022 1.175 1.341 N/A 5.950
knauserig 4.518 0,789 0,408 2.011 3.288 1.133 7.728 4.063
positiv 22281.540 42673.039 46442.242 45359.180 47885.625 15708.027 45325.906 20810.559
positiv 23989.676 44625.523 47356.438 45790.660 47456.973 15096.601 47929.840 22455.234
positiv 17846.824 38980.133 45633.809 44174.820 33875.039 15156.063 42536.270 21467.840
positiv 21047.588 40140.848 41672.648 46028.496 47426.527 16718.000 46978.664 19876.473
positiv 20218.238 44660.602 41718,707 45799.375 46495.602 14590.264 54741.023 22011.938
positiv 18531.740 41620,801 N/A 48082.313 35645.199 15341.382 48950,992 21117.559
knauserig 20652.601 42116.824 44564.769 45872.474 43130,827 15435.056 47743.783 21289.934
Leere Subtraktion 20648.083 42116.035 44564.361 45870.463 43127.539 15433.923 47736.054 21285.871
Unverdünnt A 23024.961 44448.875 58897.510 51120.948 55450.191 18155,305 62844.068 27567.828
Unverdünnt Esb 18278,174 35252.586 54409.510 66022.396 43101.148 15732.609 60761.328 26581.979
1/50 A 521.670 755.035 1066.898 1287.187 1053.339 181.324 1278.336 580.961
1/50 B 435.326 634.215 1168.087 1383.537 991.040 165.443 1180.445 596.461
1/100 A 228.028 598.848 603.911 631.116 507.956 258.405 665.647 331.590
1/100 B 256.330 585.834 583.325 670.875 459.325 289.207 638.916 307.948
1/200 A 121.283 305,293 258,247 346.965 234.774 114.163 169.055 172.553
1/200 B 114.638 313.040 253.685 297.216 191.637 179,895 280,989 147,297
1/400 A 42.829 141.343 127.337 163.605 N/A 71.241 157,697 85,976
1/400 B 59.544 180,543 162.080 162.108 115.508 104.682 151.141 87.804
1/800 A 34.304 67.934 65,939 83.857 66.134 31.784 82.722 45.616
1/800 B 20.390 80.222 81.453 85,325 53.102 38.034 55.460 29.660
1/1600 A 15.405 44.505 47.672 39.613 33.027 18.006 37.655 20.988
1/1600 B 22.091 48.828 46,781 37.388 30.245 30.138 34.553 19.795
1/3200 A 12.333 22.104 16.850 18.403 11.460 10.535 21.245 9.218
1/3200 B 6.796 32.555 15.742 26.249 15.111 9.908 23.393 10.175
Leere Subtraktion
Unverdünnt A 23020,443 44448.086 58897.103 51118.937 55446.903 18154.172 62836.339 27563.765
Unverdünnt Esb 18273.655 35251.797 54409.103 66020.385 43097.860 15731.477 60753.600 26577,916
1/50 A 517.152 754,246 1066.490 1285.176 1050.051 180,192 1270.607 576.898
1/50 B 430.808 633.426 1167.679 1381.526 987.751 164.311 1172.717 592.398
1/100 A 223.509 598.059 603.503 629.105 504.668 257.272 657.918 327.527
1/100 B 251.812 585.044 582.918 668.864 456.036 288.074 631.187 303.885
1/200 A 116.765 304.503 257.840 344.954 231.486 113.030 161.327 168.490
1/200 B 110.120 312.251 253,277 295.205 188.348 178.762 273.261 143.234
1/400 A 38.310 140.554 126.929 161.594 N/A 70.108 149.968 81,913
1/400 B 55.026 179.753 161.672 160.097 112.219 103.549 143.413 83,741
1/800 A 29.786 67.145 65.531 81.847 62.846 30.651 74,994 41.553
1/800 B 15.872 79,433 81.045 83.314 49,813 36.901 47.732 25.596
1/1600 A 10.886 43,716 47.264 37.602 29.739 16.874 29.927 16.925
1/1600 B 17.573 48.039 46.373 35.377 26.957 29.005 26.825 15.732
1/3200 A 7.815 21.314 16.442 16.392 8.172 9.402 13.517 5.155
1/3200 B 2.278 31.765 15.334 24.238 11.822 8.776 15.664 6.112
Simuliertes CI
Unverdünnt A 1.114895 1.055372 1.321619 1.114419 1.285650 1.176251 1.316329 1.294932
Unverdünnt Esb 0,885005 0,837016 1.220911 1.439279 0,999312 1.019279 1.272698 1.248618
1/50 A 0,025046 0,017909 0,023931 0,028018 0,024348 0,011675 0,026617 0,027102
1/50 B 0,020864 0,015040 0,026202 0,030118 0,022903 0,010646 0,024567 0,027831
1/100 A 0,010825 0,014200 0,013542 0,013715 0,011702 0,016669 0,013782 0,015387
1/100 B 0,012195 0,013891 0,013080 0,014582 0,010574 0,018665 0,013222 0,014276
1/200 A 0,005655 0,007230 0,005786 0,007520 0,005367 0,007323 0,003380 0,007916
1/200 B 0,005333 0,007414 0,005683 0,006436 0,004367 0,011582 0,005724 0,006729
1/400 A 0,001855 0,003337 0,002848 0,003523 N/A 0,004542 0,003142 0,003848
1/400 B 0,002665 0,004268 0,003628 0,003490 0,002602 0,006709 0,003004 0,003934
1/800 A 0,001443 0,001594 0,001470 0,001784 0,001457 0,001986 0,001571 0,001952
1/800 B 0,000769 0,001886 0,001819 0,001816 0,001155 0,002391 0,001000 0,001203
1/1.600 A 0,000527 0,001038 0,001061 0,000820 0.000690 0,001093 0,000627 0.000795
1/1.600 B 0,000851 0,001141 0,001041 0,000771 0,000625 0,001879 0,000562 0,000739
1/3.200 A 0,000378 0,000506 0,000369 0,000357 0,000189 0,000609 0,000283 0,000242
1/3.200 B 0,000110 0,000754 0,000344 0,000528 0,000274 0,000569 0,000328 0,000287
Durchschnittliches CI (theoretisch)
Unverdünnt (1) 0,999950 0,946194 1.271265 1.276849 1.142481 1.097765 1.294514 1.271775
1/50 (0,02) 0,022955 0,016474 0,025067 0,029068 0,023625 0,011161 0,025592 0,027466
1/100 (0,01) 0,011510 0,014046 0,013311 0,014148 0,011138 0,017667 0,013502 0,014832
1/200 (0,005) 0,005494 0,007322 0,005735 0,006978 0,004867 0,009453 0,004552 0,007322
1/400 (0,0025) 0,002260 0,003803 0,003238 0,003507 0,00260* 0,005626 0,003073 0,003891
1/800 (0,00125) 0,001106 0,001740 0,001645 0,001800 0,001306 0,002188 0,001285 0,001577
1/1.600 (0,000625) 0,000689 0,001089 0,001051 0.000795 0,000657 0,001486 0.000594 0,000767
1/3.200 (0,000313) 0,000244 0,000630 0,000357 0,000443 0,000232 0,000589 0,000306 0,000265
standardabweichung
unverdünnt 0,11494 0,10918 0,05035 0,16243 0,14317 0,07849 0,02182 0,02316
1/50 0,00209 0,00143 0,00114 0,00105 0,00072 0,00051 0,00103 0,00036
1/100 0,00069 0,00015 0,00023 0,00043 0,00056 0,00100 0,00028 0,00056
1/200 0,00016 0,00009 0.00005 0,00054 0.00050 0,00213 0,00117 0,00059
1/400 0,00040 0,00047 0,00039 0,00002 0* 0,00108 0,00007 0,00004
1/800 0,00034 0,00015 0,00017 0,00002 0,00015 0,00020 0,00029 0,00037
1/1.600 0,00016 0.00005 0,00001 0,00002 0,00003 0,00039 0,00003 0,00003
1/3.200 0,00013 0,00012 0,00001 0,00009 0,00004 0,00002 0,00002 0,00002
*Stellt Ergebnisse aus einem einzelnen Experiment dar.

Tabelle 3: Absolute Quantifizierung und simulierte CI-Berechnung.

zustand Wettbewerbsindex1
Experiment 1
WTAA WTAD WTAG WTAL WTAO WTAT WTAW WTAX
Logarithmische 0,927 € 0,033 0,992 € 0,031 1,068 € 0,025 0,921 € 0,02 1,044 € 0,03 1,051 € 0,057 1,094 € 0,027 0,929 € 0,005
Stationär 1,1 bis 0,021 1,071 € 0,053 1,079 € 0,065 0,948 € 0,02 0,98 € 0,02 0,873 € 0,044 0,97 € 0,056 1,021 € 0,007
Experiment 2
CI (Traditionell) WTAA AAD BAL CAT ABAG ACAO BCAW •ABC-AX
Logarithmische 1 x 0 0,802 bei 0,084 0,957 € 0,02 0,989 bei 0,073 0,581 bei 0,153 0,86 € 0,053 0,995 € 0,011 0,695 € 0,061
Stationär 1 x 0 0,97 € 0,063 1,043 € 0,058 0,99 € 0,036 1,625 € 0,589 0,835 € 0,051 0,912 bei 0,047 0,477 € 0,049
CI (Gepooltes Inokulum)
Logarithmische 1,114 € 0,039 0,864 € 0,074 1,073 € 0,032 1,1 bis 0,068 0,633 bei 0,152 0,938 € 0,056 1,111 x 0,043 0,746 € 0,06
Stationär 1,078 € 0,039 1,039 € 0,049 1,166 € 0,093 1,066 € 0,01 1,735 € 0,613 0,876 € 0,035 0,97 € 0,045 0,49 € 0,047
1 Die Werte stellen die mittlere CI-Standardabweichung für drei oder vier Replikationsexperimente dar.

Tabelle 4: Repräsentative Ergebnisse des In-vitro-Wettbewerbs zwischen S. Typhimurium-Stämme.

Tabelle S1. Optionale Primer zur Erstellung zusätzlicher Barcode-Sequenzen und entsprechender Fluoreszenzsonden für deren Detektion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Figure 1
Abbildung 1. Generierung von pSKAP. (A) Gereinigtes pKD13 wurde mit HindIII und BamHI einer Einschränkungsverdauung unterzogen. (B, C) Das 1.333 bp-Fragment von Interesse, das ein FRT-flankiertes Kanamycin-Resistenzgen enthält, wurde gereinigt. (D) pPCR Script Cam SK+ wurde auch mit HindIII und BamHI verdaut und das Fragment von pKD13 (B) wurde zur Erzeugung (E) pSKAP eingepfert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Einfügungsstelle gerichtete Mutagenese in pSKAP. (A) Das Einsetzen von 25 bp DNA-Barcodes an Position 725 wurde mit PCR durchgeführt. Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen, die für diesen Standort spezifisch sind, wurden mit komplementären 25-Nukleotid-5-Erweiterungen (in der Grundierung als Kleinbuchstaben "a" bezeichnet) entwickelt. (B) Ein generisches pSKAP_Barcode-Plasmid aus SDM wird mit der Position des eingefügten DNA-Barcodes orange hervorgehoben angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Chromosomale Neuanordnung nach dem PutP. (A) Nach der red vermittelten Rekombination wird das wählbare Kanamycinresistenzgen (dunkelviolett), flankiert von FRT-Stellen (grau), auf das Chromosom zwischen der angegebenen Loci (Chromosomal Recombination Site, rot) eingefügt. Der einzigartige DNA-Barcode (orange) wird direkt außerhalb der FRT-Site eingefügt. (B) Das Kanamycin-Resistenzgen wird durch FRT-vermittelte Exzision entfernt, so dass ein Überbleibsel der eingefügten DNA auf dem Chromosom (Total Inserted DNA, blau) aus dem DNA-Barcode und einer FRT-Narbe zurückbleibt. (C) Die modifizierte chromosomale DNA-Sequenz, die die eingefügte DNA umgibt, wird zusammen mit den Amplifikationsgrundierstellen (hellviolett) für die digitale PCR gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Verdünnungsschema zur Validierung der Fluoreszenzsonenempfindlichkeit und -spezifität. (A) Gereinigte gDNA aus sieben Barcode-Stämmen wird in gleichen Mengen miteinander vermischt, um das Verdünnungsmittel zur Verdünnung der ausgelassenen Barcode-gDNA zu erzeugen (AX im obigen Beispiel). (B) Führen Sie eine serielle Verdünnung der ausgelassenen Barcode-gDNA (AX im obigen Beispiel) mit dem zuvor beschriebenen vorbereiteten Verdünnungsmittel durch. Mischen Sie den Inhalt der einzelnen Rohre gründlich, bevor Sie auf die nächste Röhre übertragen. Abbildung 4 wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Plattenlayout zur Analyse der Empfindlichkeit und Spezifität der Primer-Sondensätze 1 und 2. Das digitale PCR-Experiment umfasst NTCs, Positivsteuerungen, Negativkontrollen und die Verdünnungsschemata für jeden der getesteten Barcodes. Die Platte zur Validierung der Primer-Sondensätze 3 und 4 wird im gleichen Muster mit der entsprechenden Barcode-gDNA ausgelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Repräsentative digitale PCR-Ergebnisse von verdünnter AA-Barcode-gDNA. gDNA, die den AA-Barcode enthält, wurde in einem Hintergrund aller anderen barcoded gDNA verdünnt, wie in Abbildung 4beschrieben. Kanal 1 stellt die FAM-Sonde für den AA-Barcode (obere Panels) dar, während Kanal 2 die HEX-Sonde für den AO-Barcode (untere Panels) darstellt. Die Ergebnisse jeder Sonde werden sowohl als einzelne Tröpfchenfluoreszenzamplitude (linke Panels) als auch als Histogramm dargestellt, das die Häufigkeit der fluoreszierenden Intensität aller Tröpfchen in den ausgewählten Brunnen (rechte Panels) darstellt. Für jede Bedingung sollten positive (hohe Fluoreszenz) und negative (niedrige Fluoreszenz) Tröpfchen zwei unterschiedliche Populationen bilden. Im Fall von AA, das verdünnt wurde und die meisten Tröpfchen negativ waren, scheint das Histogramm (oben rechtes Panel) nur eine einzige Population darzustellen. Dies liegt daran, dass positive Tröpfchen durch negative Tröpfchen erheblich übersteigen; Allerdings sind zwei unterschiedliche Populationen noch sichtbar, indem sie die Fluoreszenzamplitude von Tröpfchen in den linken Panels untersuchen.  Die Populationen sollten mithilfe des Schwellenwert-Features getrennt werden, um positive und negative Tröpfchen zu definieren (visualisiert durch die rosa Linie). Die Schwellenwerte variieren je nach den verwendeten Prüfpunkten, aber alle Bohrungen, die dieselbe Sondenmischung verwenden, sollten identische Schwellenwerte aufweisen. Da die AA-barcoded gDNA verdünnt wurde, gibt es eine Abnahme der positiven (hochfluoreszierenden) Tröpfchen, während die Anzahl der positiven AO-Tröpfchen im Hintergrund konstant bleibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Fähigkeit, Mikroorganismen genau zu quantifizieren, ist für die mikrobiologische Forschung von größter Bedeutung, und die Fähigkeit, einzigartige Stämme aus einer anfänglichen gemischten Population aufzuzählen, hat sich als ein unschätzbares Instrument zur Bewertung von Fitness- und Virulenzmerkmalen in bakterien. Die Techniken dazu sind jedoch nicht im Schritttempo mit den modernen Entwicklungen in der Molekularbiologie vorangekommen. Die Technologie, um die Chromosomen vieler Bakterien, einschließlich S. Typhimurium, ist seit fast zwei Jahrzehntenverfügbar 14, aber diese Fähigkeit wurde selten für molekulare Tagging Stämme mit einzigartigen DNA-Sequenzen verwendet. Durch die Nutzung der Fähigkeit, leicht identifizierbare Stämme auf der Grundlage einzigartiger, minimal-disruptiver DNA-Barcodes zu erzeugen, die auf das bakterielle Chromosom eingefügt werden, gekoppelt mit der modernsten Technologie, um diese molekularen Identifikatoren zu erkennen und zu quantifizieren ( d.h. digitale PCR) haben wir ein System entwickelt, das exquisite Empfindlichkeit, Spezifität, Genauigkeit und Präzision für die einfache Quantifizierung einzelner Stämme innerhalb einer vielfältigen Bakterienpopulation bietet.

Die Berechnung von CIs und COIs, wie oben beschrieben, beruht auf der Fähigkeit, die entsprechenden Modifikationen an bakteriellen Chromosomen genau vorzunehmen. Alle Änderungen sollten durch Sanger-Sequenzierung überprüft werden, um sicherzustellen, dass keine zufälligen Mutationen aufgetreten sind. Die Verwendung einer High-Fidelity-Polymerase minimiert diese Fehler, aber solche Mutationen, die auftreten, beeinträchtigen die Fähigkeit, den Stamm zu erkennen, was ein weiterer kritischer Aspekt dieses Protokolls ist. Obwohl wir gezeigt haben, dass digitale PCR nur zwei gDNA-Kopien in einem Hintergrund von fast 2 Millionen erkennen können, können Stämme außerhalb dieses Bereichs zusätzliche Verdünnungen für ihre genaue Quantifizierung erfordern. Darüber hinaus müssen DNA-Barcodesequenzen so konzipiert sein, dass sie die Verwendung hochwertiger Sondensequenzen erleichtern. Sondensequenzen sollten auf Tendenzen zur Selbstverdünnung, Bildung von Haarnadeln oder ineffektiv binden ihre Ziele analysiert werden. Die Bedeutung der Verwendung von Qualitätssequenzen und Sonden kann nicht minimiert werden, was durch die sorgfältigen Validierungsexperimente belegt wird, die mit jeder Sonde durchgeführt werden müssen. Die Bemühungen, optimale DNA-Barcodes zu erstellen, werden optimale digitale PCR-Quantifizierungsergebnisse erzielen.

Während sorgfältig entworfene molekulare Tags wichtig sind, um Qualitätsergebnisse zu erhalten, ist die Interpretation der Ergebnisse ein weiterer kritischer Aspekt dieses Protokolls. Das CI ist definiert als das Verhältnis zwischen der mutierten Dehnung und der Wild-Typ-Stamm in der Ausgabe geteilt durch das Verhältnis der beiden Stämme in der Eingabe1,19,20. Dieses traditionelle CI, das in Abschnitt 9 dargestellt wird, ist nützlich, wenn die gemischte Infektion nur aus einem Stamm im Vergleich zum Wildtyp besteht. Bei der Verwendung großer Stämmezurt, um Medien oder Tiere zu impfen, konkurrieren die Stämme jedoch nicht nur gegen Wildarten, sondern auch gegen jede andere Belastung, die im Inokulum vorhanden ist. Frühere Studien, die Wettbewerbsexperimente mit mehreren infizierenden Stämmen durchführten, haben dies in ihren Berechnungen nicht berücksichtigt7,13. Um diese Funktion gemischter Infektionen zu berücksichtigen, haben wir eine Formel zur Berechnung von CIs eingeführt, die für gepoolte Infektionen geändert wurde. Es ist unwahrscheinlich, dass alle Stämme das gleiche Wettbewerbsniveau bieten werden, das eine Wildsorte hätte. Da jedoch die meisten bakteriellen Gene nur geringe Auswirkungen auf die Virulenz haben, da die Anzahl der Stämme, die in wettbewerbsorientierten Indexexperimenten verwendet werden, zunimmt, steigt die Wahrscheinlichkeit, dass die allgemeine Virulenz zum Wildstamm tendiert. Dies kann nicht unbedingt der Fall für bestimmte experimentelle Designs mit Pools von vielen Stämmen alle mit bekannten Virulenzdefekten sein. Dies wird jedoch in der geänderten Gleichung berücksichtigt, da weniger reichlich vorhandene Stämme (weniger Passform) im Ergebnis einen geringeren Effekt auf die X-Ausgabe haben werden. Je nach spezifischem Versuchsdesign kann es Fälle geben, in denen die eine oder andere Formel bevorzugt wird. In den meisten Fällen mit gepoolten Infektionen ist es jedoch wichtig zu bedenken, dass bei einer gemischten Infektion alle Stämme gegeneinander antreten, nicht nur gegen Wildtyp. Bei der Analyse der Ergebnisse ist es entscheidend, dass die Gründe hinter jeder Formel gut verstanden werden, um die genauesten Interpretationen der Dehnungstauglichkeit zu machen. Bei der Berichterstattung über Die Ergebnisse ist es ebenso wichtig, genau anzugeben, wie Daten analysiert wurden.

Abschnitt 9 des Protokolls enthält auch Formeln zur Bestimmung von Geninteraktionen mit einem COI. Mit dieser Analyse können Vorhersagen getroffen werden, um festzustellen, ob zwei Virulenzgene unabhängig oder zusammen arbeiten. COI ist definiert als das Verhältnis der doppelmutierten zu einzelnen mutierten Dehnung in der Ausgabe geteilt durch das Verhältnis der beiden Stämme im Eingang1. Die Formel wurde entwickelt, um die phänotypische Additivität von Genstörungen zu erkennen. Wenn Gene unabhängig funktionieren, um die Virulenz zu verbessern, sollte eine Störung beider Gene eine größere Abnahme der Fitness im Vergleich zu einer einzigen Störung eines der beiden Gene allein verursachen. Wenn Gene zusammen funktionieren, um die Virulenz zu verbessern (z. B. Gene, die zwei Enzyme in einem Signalweg kodieren), sollte eine Störung beider Gene die gleiche Wirkung auf die Virulenz haben, wie beide Gene zu stören. Die Erkennung der phätotypischen Additivität kann schwierig sein, wenn der Durcheindringungsgrad eines einzelnen Gens entweder sehr hoch oder sehr niedrig ist. Dennoch bietet der direkte Vergleich von Stämmen innerhalb desselben Tiersystems weniger Variabilität und eine zuverlässigere Darstellung der funktionellen Beziehung zwischen Genen, und diese Berechnung kann von zwei Stämmen innerhalb einer größeren gemischten Population durchgeführt werden.

Ein letzter kritischer Aspekt für die Interpretation der Ergebnisse besteht darin, die Auswirkungen der Bevölkerungsdynamik zu berücksichtigen. Bei einigen gemischten Infektionen, die mehrere Stämme haben, kann eine einzelne Sorte entweder dominanter oder weniger fit aufgrund von zufälliger Bevölkerungsdrift auftreten. Dieses Phänomen kann verstärkt werden, wenn Engpassereignisse auftreten. Dies kann durch die Verwendung einer sehr großen Anzahl von Eingangsstämmen, einer sehr geringen Anzahl von Gesamtbakterien im Inokulum oder einer Kombination aus beidem verursacht werden. Ein weiterer störender Aspekt, der durch gemischte Infektionen entsteht, ist die Möglichkeit der Transkomplementierung. Dies tritt auf, wenn eine Passform, wie z. B. der Wildtyp, die Virulenz einer weniger fitten Sorte künstlich verstärkt. Ein hypothetisches Beispiel dafür wäre, die Tauglichkeit eines S. zu vergleichen. Typhimurium Pathogenicity Island 2 (SPI2)-Knockout-Stamm ko-infiziert mit einem Wild-Typ-Stamm. SPI2 aktiviert S. Typhimurium, um intrazellulär zu überleben, indem effektore in den Wirt Cytosol sezernieren, die das Phagosoin innerhalb eines Makrophagens verändern. Störung dieses Systems macht S. Typhimurium anfällig für intrazelluläre Tötung. Da Makrophagen jedoch in der Lage sind, zwei oder mehr Bakterien gleichzeitig zu verschlingen, könnte der SPI2-Knockout eine erhebliche Steigerung der Fitness erhalten, wenn er sich im selben Makrophagen wie ein Wildtyp Sbefindet.  Typhimurium, das Effektoren in den Wirt Cytosol sezerniert. Die zufällige Populationsdynamik und die Möglichkeit der Transkomplementierung sind eine Einschränkung jedes Wettbewerbsexperiments. Wenn bei der Transkomplementierung vermutet wird, sollten Phänotypen mit anderen ergänzenden Methoden zur Beurteilung der Eignung bestätigt werden. Um die zufällige Populationsdynamik zu überwinden, erhöht die Erhöhung der Anzahl der Replikationsexperimente die Wahrscheinlichkeit, Ausreißer in Ergebnissen zu identifizieren. Glücklicherweise erleichtert das oben beschriebene Protokoll eine größere Anzahl identischer Replikationsexperimente, da die Anzahl der experimentellen Bedingungen drastisch reduziert wird.

Ein Schlüsselelement der oben beschriebenen CI-Technik ist ihre Fähigkeit, an fast jeden Organismus und jedes experimentelle Design angepasst zu werden, das eine genaue Quantifizierung von Mikroorganismen erfordert. Es erfordert jedoch die genetische Manipulation eines Organismus, um eine einzigartige DNA-Sequenz auf dem Chromosom zu integrieren. Die Anpassungsfähigkeit der Technik erfordert, dass die Art genetisch verformbar ist und sich auf die Generierung alternativer Protokolle zur Veränderung des Genoms stützt (Schritte 1 und 2). Die in den Tabellen 2 und S1 aufgeführten DNA-Barcodes sollten für die meisten Bakterien ausreichen; Wie bei allen quantitativen PCR-Experimenten ist es jedoch relevant, das bakterielle Genom zu analysieren, um durch eine einfache BLAST-Analyse ein minimales Potenzial für die Off-Target-Bindung von Primern und Sonden zu gewährleisten. Die in dieser Studie verwendeten DNA-Barcodesequenzen unterscheiden sich in einigen Fällen nur durch 3-4 Basen, was die exquisite Spezifität der Sonden hervorhebt, die das Potenzial für unspezifische Bindung minimiert. Unabhängig von der Spezifität von Fluoreszenzsonden müssen alle neuen Barcodesequenzen entsprechend auf Empfindlichkeit und Spezifität validiert werden, wie in Schritt 6 beschrieben. Nach der Erstellung von Barcode-Stämmen ist es möglich, dieses Protokoll an viele Arten von Experimenten anzupassen, abgesehen von In-vitro-Wettbewerbstests wie oben beschrieben. Die Stämme eignen sich für In-vivo-Wettbewerbstests bei Mäusen oder anderen Tiermodellsystemen. Nur minimale Modifikationen sind erforderlich, um gDNA aus tierischen Organen und Geweben zu extrahieren, und diese Modifikationen sind von herstellern Kits für solche Zwecke gut beschrieben. Darüber hinaus wurden große Pools gemischter Infektionen für den In-vivo-Wettbewerb zuvor erfolgreich genutzt7, was das Potenzial bietet, die Anzahl der Tiere zu reduzieren, die für ein einziges Experiment erforderlich sind, was nicht nur die Kosten dieser Experimente senkt. verringert aber auch das Potenzial für die Variabilität von Tier zu Tier. In ähnlicher Weise könnten Barcode-Stämme in anderen In-vitro-Assays verwendet werden, die die Anfälligkeit von Stämmen für verschiedene Behandlungsbedingungen untersuchen (z. B. Antibiotika, Säureanfälligkeit, Tötung durch reaktive Sauerstoff- oder Stickstoffarten usw.). Bei diesen Experimenten könnte die Beurteilung der Wachstumshemmung erreicht werden, indem dem Wachstumsmedium in Schritt 3.4 die gewünschte Chemikalie hinzugefügt und wie beschrieben vorgeht. Um den bakteriellen Tod zu beurteilen, könnte ein großer Pool von Stämmen gemischt werden, und der Input quantifiziert, wie oben beschrieben. Nach der Exposition gegenüber der gewünschten Behandlung konnten lebende Zellen selektiv quantifiziert werden, indem das digitale PCR-Quantifizierungsverfahren mit Viability PCR gekoppelt wurde, um zwischen lebenden und abgestorbenen Zellen zu unterscheiden21,22,23 , 24 , 25 , 26. Der Durchsatz für solche Experimente würde drastisch erhöht, da Verdünnungen und Replikplatten für jeden Stamm durch schlankere molekulare Techniken ersetzt werden. Schließlich ist die Analyse der Evolutionsbiologie und der Populationsgenetik zwar außerhalb des Rahmens dieses Papiers, aber Barcode-Organismen sind für solche Studien sehr anpassungsfähig.  Letztlich war der Zweck dieses Protokolls, eine leistungsfähige Technik zur Quantifizierung von Bakterien zu entwickeln, die für ihren Einsatz in vielen verschiedenen Arten und in vielen Arten von Experimenten sehr anpassungsfähig ist.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom George F. Haddix President es Faculty Research Fund und dem National Institute of General Medical Science der National Institutes of Health (NIH) unter der Nummer GM103427 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 22600028 Procure from any manufacturer
16 mL culture tubes MidSci 8599 Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tips RAININ 30389241 Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipette RAININ 17013804 Use alternative multichannel pipettes with caution
Agarose ThermoFisher Scientific BP160-500 Procure from any manufacturer
BLAST Analysis NCBI N/A https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module Bio Rad 1851197 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5α Invitrogen 18258012 Procure from any manufacturer or prepare yourself
Chloramphenicol ThermoFisher Scientific BP904-100 Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate reader BioTek CYT5MF Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) Bio Rad N/A Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well Plates Bio Rad 12001925 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader Oil Bio Rad 1863004 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Bio Rad 1863024 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1864008 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1863009 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for Probes Bio Rad 1863005 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Kanamycin ThermoFisher Scientific BP906-5 Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agar ThermoFisher Scientific BP1425-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani broth ThermoFisher Scientific BP1426-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio Rad 1814040 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR Tubes Eppendorf 951010022 Procure from any manufacturer
Petri dishes ThermoFisher Scientific FB0875712 Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+ Stratagene/Agilent 211192 No longer available commercially
Primer/Probe Design IDT N/A https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_Barcodes Addgene Plasmid numbers 122702-122726 www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer Bio Rad 1814000 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Generator Bio Rad 1864002 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Reader Bio Rad 1864003 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s ATCC ATCC 14028s www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate BioTek TAKE3 Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHI ThermoFisher Scientific FERFD0054 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnI ThermoFisher Scientific FERFD1704 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIII ThermoFisher Scientific FERFD0504 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit ThermoFisher Scientific FERK0832 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit ThermoFisher Scientific FERK0503 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F534L Procure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific FEREL0011 Procure from any manufacturer
Thermocycler Bio Rad 1861096 Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue Transilluminator ThermoFisher Scientific UV95043301 Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology Grade ThermoFisher Scientific BP28191 Procure from any manufacturer

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References

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Genetik Ausgabe 147 Wettbewerbsindex Virulenzfaktoren Fitness bakterielle Quantifizierung ddPCR digitale PCR Aush. Wettbewerbsindex Salmonellen,DNA-Barcode molekulare Quantifizierung Geninteraktionen
Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei <em>Salmonellen</em>
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Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella. J. Vis. Exp. (147), e59630, doi:10.3791/59630 (2019).

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