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Genetics

Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59630
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

Summary

Esta aproximação molecular-baseada para determinar a aptidão bacteriana facilita a deteção exata e exata dos micro-organismos usando os códigos de barras genomic originais do ADN que são quantificados através do PCR digital. O protocolo descreve o cálculo do índice competitivo para cepas de Salmonella ; Entretanto, a tecnologia é prontamente adaptável aos protocolos que exigem a quantificação absoluta de todo o organismo genetically-maleável.

Abstract

Um índice competitivo é um método comum usado para avaliar a aptidão bacteriana e/ou virulência. A utilidade desta aproximação é exemplificada por sua facilidade executar e sua habilidade de padronizar a aptidão de muitas tensões a um selvagem-tipo organismo. A técnica é limitada, no entanto, por marcadores fenotípicos disponíveis e o número de cepas que podem ser avaliados simultaneamente, criando a necessidade de um grande número de experimentos replicantes. Em simultâneo com um grande número de experimentos, os custos laborais e materiais para quantificar as bactérias com base em marcadores fenotípicos não são insignificantes. Para superar esses aspectos negativos, mantendo os aspectos positivos, desenvolvemos uma abordagem molecular para quantificar diretamente os microrganismos após marcadores genéticos de engenharia em cromossomas bacterianos. Únicos, 25 códigos de barras do ADN do par baixo foram introduzidos em um locus inócuo no cromossoma de estirpes do selvagem-tipo e do mutante das salmonelas. Experimentos de competição in vitro foram realizados usando inóculos consistindo de cepas agrupadas. Após a competição, os números absolutos de cada cepa foram quantificados por meio de PCR digital e os índices competitivos para cada cepa foram calculados a partir desses valores. Nossos dados indicam que essa abordagem para quantificar a Salmonella é extremamente sensível, precisa e precisa para detectar microrganismos altamente abundantes (de alta aptidão) e raros (baixa aptidão). Adicionalmente, esta técnica é facilmente adaptável a quase todo o organismo com os cromossomas capazes da modificação, assim como aos vários projetos experimentais que exigem a quantificação absoluta dos micro-organismos.

Introduction

Avaliar a aptidão e a virulência de organismos patogénicos é um aspecto fundamental da pesquisa em microbiologia. Permite comparações entre cepas ou entre organismos mutantes, o que permite que os pesquisadores determinem a importância de determinados genes em condições específicas. Tradicionalmente, a avaliação de virulência utiliza um modelo animal de infecção usando diferentes cepas bacterianas e observando o resultado do animal infectado (por exemplo, dose infecciosa50, dose letal50, tempo até a morte, gravidade dos sintomas, falta de sintomas, etc.). Este procedimento fornece descrições valiosas da virulência, mas exige que as tensões causem diferenças consideráveis nos resultados a fim detectar variações do selvagem-tipo. Além disso, os resultados são semiquantitativos, pois enquanto a progressão da doença e a gravidade dos sintomas podem ser quantificadas subjetivamente ao longo do tempo, a interpretação da virulência comparada ao tipo selvagem é mais qualitativa (ou seja, mais, menos ou igualmente virulenta). Uma alternativa comum à realização de ensaios de infectividade animal é gerar índices competitivos (CIs), valores que comparam diretamente a aptidão ou a virulência de uma cepa a uma contraparte de tipo selvagem em uma infecção mista1. Esta técnica tem inúmeras vantagens sobre um modelo animal tradicional de infecção, padronando a virulência para uma estirpe de tipo selvagem e determinando um valor quantificável para refletir o grau de atenuação. Esta técnica também pode ser adaptada para analisar as interações genéticas em bactérias, determinando um índice competitivo cancelado (COI)2. O cálculo de um COI para um grupo de organismos mutados permite que os pesquisadores determinem se dois genes contribuem de forma independente para a patogênese ou se estão envolvidos na mesma via de virulência e dependem uns dos outros. Adicionalmente, calcular um CI exige a enumeração das bactérias que podem fornecer introspecções valiosas na patogénese dos organismos. CIs e COIs também permitem que os pesquisadores para jumentos avirulent cepas que não causam doença clínica, mas ainda têm diferenças na aptidão. Esta técnica é limitada pelo uso de marcadores tradicionais de resistência a antibióticos para identificar cepas, limitando assim o número de cepas de entrada para apenas um ou dois de cada vez. Devido a essa limitação, é necessário um grande número de grupos experimentais e repetições, o que, além de acrescentar aos custos trabalhistas e materiais, também aumenta as oportunidades de variabilidade em condições experimentais e resultados imprecisos. (Para uma revisão minuciosa dos benefícios e aplicações do uso de infecções mistas para estudar a virulência, a aptidão e as interações genéticas, ver C.R. Beuzón e DW Holden 1)

As tentativas foram feitas para superar esta limitação, tal como o uso de pilhas fluorescently-etiquetadas quantificadas através da citometria de fluxo3,4,5. Esta técnica quantifica as células usando 1) anticorpos rotulados para marcadores fenotípicos ou 2) proteínas fluorescentes produzidas endogenamente. O uso de anticorpos rotulados tem um limite de detecção de 1.000 células/mL e, portanto, requer um elevado número de células para analisar3. As células que expressam proteínas fluorescentes têm uma fisiologia alterada e são suscetíveis a alterações de aptidão resultantes da alta expressão protéica6. Ambos os métodos são limitados pelo número de marcadores fluorescentes detectável usando a citometria de fluxo. Um avanço na quantificação molecular foi conseguido com o desenvolvimento de uma técnica do microarray que detectaram a atenuação em 120 tensões de uma infecção misturada inicial sobre de 1.000 tensões em um modelo murino7. Esta técnica utilizou uma análise do microarray do RNA das tensões mutado, que conduzem à variabilidade considerável no resultado.  Não obstante, estabeleceu que as grandes associações de infecções misturadas podem ser uma ferramenta útil e que utilizando técnicas sensíveis da deteção, as diferenças na virulência bacteriana podem ser identificadas. Com o desenvolvimento do sequenciamento da próxima geração, TN-Seq expandiu a utilidade das mutações de transposon, possibilitando um método potente para quantificar as bactérias que foram aleatoriamente mutadas8,9,10, o 11. Um protocolo alternativo foi desenvolvido recentemente que elimina a necessidade para transposons e usa preferivelmente códigos de barras do ADN para identificar mais facilmente e controlar mudanças genomic e seu impacto na aptidão12. Esta tecnologia é um avanço importante, mas a inserção dos códigos de barras genômicos ainda é um processo aleatório. Para superar a aleatoriedade de experimentos anteriores, Yoon et al. desenvolveram um método para calcular os CIs de cepas de Salmonella usando códigos de barras de DNA únicos inseridos em locais precisos sobre os cromossomas das bactérias13. Cepas com código de barras exclusivas foram detectadas usando um método baseado em qPCR com verde SYBR e primers específicos para cada código de barras exclusivo. A técnica foi limitada por restrições impostas pela qPCR, incluindo diferenças na eficiência da cartilha e baixa sensibilidade, evidenciadas pela necessidade de Nested-PCR antes da qPCR. Não obstante, esta aproximação demonstrou que as modificações genomic alvejadas poderiam ser exploradas para detectar e potencialmente quantificar associações de tensões bacterianas múltiplas.

No seguinte protocolo, nós descrevemos uma metodologia nova para executar experimentos bacterianos da competição com as grandes associações do inóculos misturado seguidas pela quantificação exata usando uma técnica digital altamente sensível do PCR. O protocolo envolve cepas bacterianas geneticamente rotuladoras com um código de barras de DNA único inserido em uma região inócuo do cromossomo. Esta modificação permite que as tensões sejam rapidamente e precisamente quantificadas usando a tecnologia molecular moderna em vez das diluições seriais tradicionais, do chapeamento da réplica, e da contagem de unidades formando da colônia que dependem dos marcadores fenotípicos (isto é resistência antibiótica ). As modificações permitem a avaliação simultânea de muitas cepas em um único inoculto agrupada, reduzindo substancialmente a possibilidade de variabilidade experimental, pois todas as cepas são expostas às mesmas condições exatas. Além disso, enquanto esta técnica foi desenvolvida em Salmonella enterica sorovar typhimurium, é altamente adaptável a qualquer organismo geneticamente maleável e quase qualquer experimento experimental onde são necessárias contagens bacterianas precisas, proporcionando uma nova ferramenta para aumentar a exatidão e a taxa de transferência em laboratórios da microbiologia sem as limitações impostas por métodos precedentes.

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Protocol

1. incorpore códigos de barras originais do ADN em um Plasmid que contem os componentes necessários para a troca allelic

Nota: Um plasmídeo novo, nomeado pskap, com um número elevado da cópia e uma eficiência aumentada da transformação comparado ao plasmídeo alélicas pKD13 existente da troca foi criado. Isso é descrito nas etapas 1.1-1.12 (Figura 1). Os plasmídeo finalizados contendo códigos de barras de DNA e componentes exclusivos para a troca alélica estão disponíveis através de um repositório de plasmílicos (tabela de materiais).

  1. Usando um kit de protocolo de plasmídeo comercial, purificar pKD1314 e PPCR script Cam SK+ de culturas bacterianas durante a noite cultivadas em caldo de Luria-Bertani (lb) suplementado com 50 μg/ml de canamicina ou 25 μg/ml de cloranfenicol (para pKD13 e PPCR script Cam SK +, respectivamente) (tabela 1).
  2. Realizar digestões de restrição em ambos os plasmís usando enzimas de restrição comercial HindIII e BamHI de acordo com as especificações do fabricante.
  3. Remova as enzimas de restrição e o DNA extirpado do pPCR script Cam SK+ reação e purifique a espinha dorsal do plasmídeo do par 3.370-base (BP) usando um kit de limpeza de DNA disponível comercialmente de acordo com as especificações do fabricante.
  4. Separe os fragmentos da digestão da limitação de pKD13 em um gel de agarose de 1% usando uma câmara da electroforese.
  5. Visualize bandas usando um transiluminador de luz azul e extirpar o fragmento 1.333 BP do gel (Figura 1C).
    Nota: Este fragmento contem o gene FRT-ladeado da resistência do canamicina exigido para a recolocação alélicas cromossomática.
  6. Purify o ADN extirpado da etapa 1,5 usando um jogo comercial da extração do gel.
  7. Para criar o pskap, ligadura o fragmento purificado de pKD13 (da etapa 1,6) em PPCR script Cam SK+ (da etapa 1,3) usando uma ligase de DNA T4 comercial de acordo com as especificações do fabricante.
  8. Transforme células DH5α quimicamente competentes com o plasmídeo ligado pskap seguindo o protocolo do fabricante (tabela 1).
  9. Espalhe transformantes em placas de agar LB suplementados com 50 μg/mL de canamicina e incubar a 37 ° c durante a noite.
  10. Escolha uma colônia da placa e raia-lo em uma nova placa de agar LB suplementado com 50 μg/mL de canamicina e incubar a 37 ° c durante a noite. Escolha uma colônia desta placa e use para inocular o caldo LB suplementado com 50 μg/mL de canamicina. Incubar a cultura durante a noite a 37 ° c com agitação constante.
  11. Use um kit de protocolo de plasmídeo comercial para purificar o pskap da cultura bacteriana durante a noite.
  12. Realize uma digestão de restrição diagnóstica do plasmídeo da etapa 1,11 usando Hind III e Bam HI de acordo com as especificações do fabricante. Visualize fragmentos em um gel de agarose a 1% como nos passos 1.4-1.5.
    Nota: O tamanho total do pSKAP deve ser 4.703 BP. fragmentos após a etapa 1,12 devem ser 3.370 e 1.333 BP.
  13. Projete primers do PCR para o mutagênese local-dirigido insertional (SDM) (tabela 2 e S1) de tal maneira a introduzir uma seqüência original do ADN de 25 basepair na posição 725 de pskap (Figura 2).
    Nota: O ADN do código de barras é introduzido no plasmídeo apenas fora do gene FRT-ladeado da resistência do canamicina, assim que o código de barras não é perdido durante a remoção subseqüente da gaveta da resistência do canamicina. Se gerar novas sequências de código de barras, use ferramentas on-line para garantir que as sondas de PCR específicas do alvo com rótulo fluorescentamente (doravante referidas simplesmente como "sondas") se vincularão eficientemente à nova sequência. As sequências de inserção projetadas até a data, juntamente com os primers necessários para criá-las, são fornecidas nas tabelas 2 e S1.
  14. Prepare as reações SDM usando uma polimerase de DNA de alta fidelidade comercial, os pares de primer desejados (tabela 2) e o modelo pSKAP. Definir o termocicer para executar o seguinte: 1) 98 ° c para 30 s, 2) 98 ° c para 10 s, 56 ° c para 15 s, 72 ° c para 2 min, 3) Repita os passos 2, 24 vezes, 4) 72 ° c por 5 min, 5) Segure a 4 ° c.
  15. Após a conclusão do PCR, esgote o molde de pSKAP adicionando a enzima da limitação DPN I à reação. Incubar a 37 ° c durante 20 min.
    Nota: Os produtos da PCR devem ser visualizados em gel de agarose para verificar o tamanho e a pureza do produto. Um controle DPN I digestão consistindo do modelo pSKAP não modificado pode ser realizado e usado em etapas subsequentes para garantir o modelo de DNA é completamente digerido.
  16. Use 5 μL do produto da etapa 1,15 para transformar 100 μL de células DH5α comerciais quimicamente competentes de acordo com as recomendações do fabricante.
  17. Transformantes da propagação em placas do agar da libra suplementado com o cloranfenicol de 25 μg/ml e incubar em 37 ° c durante a noite.
  18. Selecione uma colônia (ou colônias) de placas de noite e raia em placas de agar LB individuais suplementadas com cloranfenicol de 25 μg/mL e incubar a 37 ° c durante a noite. Selecione uma colônia de placas overnight e use para inocular 5 mL de caldo LB suplementado com 25 μg/mL de cloranfenicol. Incubar cultura (s) durante a noite a 37 ° c com agitação constante.
  19. Use um kit de protocolo de plasmídeo comercial para purificar os plasmídeos da (s) cultura (ões) durante a noite.
  20. A seqüência de Sanger purificou os plasmíos usando o iniciador de sequenciamento do M13 Forward (tabela 2). Compare a região mutada com o plasmídeo original e avalie a precisão da insertional SDM.
  21. Depois de confirmar a inserção e precisão do código de barras, atribua um nome a cada código de barras e plasmídeo.
    Nota: Os códigos de barras gerados até à data foram atribuídos a uma designação de duas letras: AA, AB, AC,..., BA, BB, BC, etc. Os plasmís codificados são indicados como pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC,..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC, etc.
  22. Repita as etapas 1.14-1.21 para gerar o número desejado de códigos de barras de DNA.

2. introduzir DNA Barcode no cromossomo de S. Typhimurium

Nota: Inserção de códigos de barras de DNA no S. O cromossoma de typhimurium é conseguido usando um método alélicas da troca descrito por datsenko e por Wanner14 que foi modificado para o uso em S. Typhimurium.

  1. Determine o locus no S. Genoma de typhimurium no qual inserir o código de barras de DNA (Figura 3).
    Nota: Selecione uma grande região intergênica do cromossomo. Evite regiões que produzem RNA não codificante. Este estudo utilizou um locus a jusante de colocar P entre os resíduos 1.213.840 e 1.213.861 (determinado a partir do conjunto do genoma GCA_ 000022165.1). Esta região tem sido previamente manipulada geneticamente para a complementação trans dos genes15. Alternativamente, um código de barras do ADN podia ser introduzido ao simultaneamente interromper um gene do interesse. Isso exigiria alterações mínimas neste protocolo e simplificaria a criação de mutantes.
  2. Projete primers do PCR para amplificar o código de barras original e o gene FRT-ladeado da resistência do canamicina do plasmídeo de código de barras pskap desejado da etapa 1,21 (tabela 2). Adicionar 40-nucleotídeo extensões que são homólogo para a região selecionada na etapa 2,1 para o 5 ' fim de cada Primer (tabela 2).
  3. Realize a amplificação usando uma polimerase de alta fidelidade comercial, os primers da etapa 2,2 e o plasmídeo contendo código de barras pSKAP desejado como modelo. Defina o termocicer para executar o seguinte: 1) 98 ° c para 30 s, 2) 98 ° c para 10 s, 3) 56 ° c para 15 s, 4) 72 ° c para 60 s, repita os passos 2-4 29 vezes, 5) 72 ° c por 5 min, 6) Segure a 4 ° c.
  4. Após a conclusão do PCR, esgote o ADN do molde usando o DpnI como descrito em etapa 1,15. Purificar e concentrar o DNA usando um kit de limpeza de DNA comercial de acordo com as especificações do fabricante.
  5. Refira o protocolo previamente publicado para gerar mutantes em S. Tensão 14028s de typhimurium dos produtos14,16,17,18do PCR.
    Nota: Não é essencial que o gene da resistência do canamicina esteja extirpado do cromossoma. Entretanto, a excisão do gene é minimamente disruptiva ao cromossoma bacteriano porque conduz a uma cicatriz de 129 BP que deixaria os genes a jusante potenciais em-quadro. Recomenda-se que a cepa que contém o gene da resistência à canamicina seja mantida, pois pode ser usada para mover códigos de barras entre cepas via transdução mediada por P22.
  6. Repita as etapas 2,3 – 2,5 para criar as cepas desejadas com os códigos de barras apropriados.
    Nota: Os códigos de barras podem ser introduzidos no Wild-Type S. Typhimurium que pode então ser submetido a mais manipulação genética, ou códigos de barras podem ser introduzidos em cepas que têm sido previamente alteradas geneticamente.

3. condições de crescimento bacteriano e ensaios de competição in vitro

  1. Do estoque de bactérias, raia desejada S. Cepas de typhimurium que cada porto um código de barras de DNA exclusivo para placas de agar LB. Incubar placas durante a noite a 37 ° c.
  2. Selecione uma única colônia de cada cepa e inocular 5 mL de caldo LB. Incubar por 20 h a 37 ° c com agitação constante.
    Nota: Usando a cultura overnight, prossiga para o passo 3,5 para coletar o DNA genómico puro (gDNA) de cada cepa com código de barras. Isso é necessário para experimentos subseqüentes de validação e controle na seção 6.
  3. Para cada ensaio da competição, transfira um volume igual de cada cultura overnight em um tubo estéril apropriadamente feito medida. Misture completamente as estirpes juntas por vortexing vigorosamente por pelo menos 5 s.
    Nota: O volume de cada cultura durante a noite para transferência deve ser suficiente para cada condição e replicar, bem como para isolar gDNA para quantificar a entrada. Embora não seja inteiramente necessário medir densidades ópticas de culturas porque o número absoluto de microrganismos de entrada será quantificado usando PCR digital, o número de bactérias de entrada para cada cepa deve ser aproximadamente igual para evitar gargalos ou concorrência desigual no início do experimento. Os ensaios representativos da competição neste protocolo compararam taxas de crescimento de 8 tensões simultaneamente. Cepas adicionais ou menos podem ser necessárias para projetos experimentais individuais.
  4. Transferir 100 μL do inônio misto para 4,9 mL de caldo LB estéril. Incubar a 37 ° c para o tempo desejado ou para uma densidade óptica desejada.
  5. Colher 500 μL do iníbulo por centrifugação a > 12000 x g durante 1 min. remover e descartar o sobrenadante. Prossiga imediatamente para a seção 4 com as células.
  6. Nos pontos de tempo desejados, remova 500 μL de alíquotas de cultura e células de colheita por centrifugação a > 12000 x g por 1 min. Retire e descarte o sobrenadante.
    Nota: Se coletar alíquotas em vários pontos de tempo, congele Pelotas a-20 ° c ou prossiga imediatamente para a etapa 4,1 após cada coleção.

4. coletando e quantificando gDNA de S. Typhimurium (das etapas 3,5 e 3,6)

  1. Colher gDNA de células usando um kit de purificação de gDNA comercial. Se disponível, execute a etapa opcional da depleção de RNA.
    Nota: A depleção de RNA não é necessária; no entanto, a presença de RNA aumentará artificialmente a concentração de DNA, levando a cálculos aberrantes em etapas subsequentes. Se estiver usando um kit de purificação de gDNA comercial, siga as recomendações do fabricante para garantir que a coluna não esteja sobrecarregada com o DNA. Não há nenhuma concentração mínima de DNA necessária se a amostra for quantificável em etapas subsequentes.
  2. Use um espectrofotômetro para quantificar o DNA em cada amostra.
    Nota: O DNA pode ser quantificado usando qualquer método confiável.
  3. Calcule o número de cópia do gDNA com base no tamanho do genoma bacteriano usando a seguinte equação, onde: X é a quantidade de DNA em ng e N é o comprimento de uma molécula de DNA de duas cordas (o tamanho do genoma).
    Equation 1
    Nota: 660 g/mole é usado como a massa média de 1 DNA BP. pequenas variações podem existir dependendo da composição do nucleotídeo do organismo. Inúmeras calculadoras estão disponíveis on-line para realizar o cálculo.

5. Projete primers e pontas de prova para a deteção quantitativa de códigos de barras do ADN através do PCR de dDigital

  1. Projete primers para amplificar a região de código de barras do S. Cromossoma de typhimurium downstream de Putp (Figura 3C e tabela 2).
    Nota: Os projetos da primeira demão e da ponta de prova podem ser facilitados por programas em linha numerosos (tabela dos materiais). Se os códigos de barras são todos inseridos no mesmo loci, um único conjunto de primers de amplificação é universal para todos os códigos de barras.
  2. Projetar sondas com base em 6-carboxifluoresceina (FAM) e/ou hexaclorofluoresceina (HEX) específicas para cada código de barras (tabela 2 e S1).
    Nota: O leitor de gotas utilizado neste experimento é capaz de detectar simultaneamente as sondas FAM-e HEX-based em uma reação multiplex. Design 1/2 das sondas para utilizar FAM e 1/2 para utilizar HEX. Este não é um passo necessário, mas reduzirá o uso de reagentes e os custos experimentais, se implementado.
  3. Faça misturas mestras de primer-sonda de 20x contendo 1) 20 mM de cada primer de amplificação para frente e verso, 2) 10 mM de uma única sonda FAM e 3) 10 mM de uma única sonda HEX (se multiplexação).

6. valide a sensibilidade e a especificidade de cada Pprimer-jogo da ponta de prova para cada código de barras genomic usando o PCR de Digitas

Nota: Este protocolo usa Validando oito códigos de barras originais com oito pontas de prova originais como um exemplo. O número de códigos de barras utilizados pode ser aumentado ou diminuído para acomodar vários designs experimentais.

  1. Crie um pool de gDNA que contenha todos os códigos de barras, exceto um. Use este pool como o diluente para executar uma série de diluição com gDNA contendo o único código de barras restante (o esquema de diluição da amostra é fornecido na Figura 4).
    Nota: Usar gDNA agrupada como um diluente assegura um fundo consistente ao verificar a sensibilidade. Usando os números de cópia determinados na etapa 4,3, diluir gDNA a um número da cópia dentro da escala digital recomendada do PCR (1-100000 cópias por uma reação de 20 μL). Tenha em mente que o intervalo é definido para cada destino exclusivo (código de barras), não o gDNA total.
  2. Prepare reações para o PCR digital na duplicata de acordo com as recomendações do fabricante para usar um Supermix digital do PCR projetado para a química sonda-baseada. Use as misturas da etapa 6,1 como o ADN do molde. Use a mistura mestra de primer-Probe 20x da etapa 5,3 que contém a sonda para o código de barras diluído na etapa 6,1.
  3. Prepare reações de controle replicadas para PCR digital de acordo com as recomendações do fabricante para usar uma supermistura de PCR digital projetada para química baseada em sonda. As reações de controle para cada mistura de sonda devem consistir em 1) controles negativos sem controles de modelo (NTCs), 2) e 3) controles positivos.
    Nota: O número mínimo de reações de controle de repetição é dois. Este protocolo de exemplo usa quatro NTCs, seis controles negativos e seis controles positivos para cada código de barras. Os controles negativos devem conter gDNA com cada código de barras, exceto para o código de barras correspondente à sonda que está sendo testada. Isso validará a especificidade de cada sonda.
  4. Repita os passos 6.1-6.3 para criar reações de PCR digital para cada amostra de gDNA codificado. Um arranjo da placa da amostra é apresentado na Figura 5.
    Nota: Isto e as etapas subseqüentes são descritas baseadas em uma plataforma digital específica do PCR que utilize gotas e tecnologia fluir-baseada. As plataformas digitais alternativas do PCR que utilizam a tecnologia chip-based podem facilmente ser substituídas com modificações ligeiras a este protocolo. Etapa 6,4 pode exigir mais de 1 96-bem placa para validar todos os conjuntos de primer. Em contraste com a qPCR, as placas separadas analisadas por PCR digital podem ser prontamente comparadas sem a necessidade de poços de referência padronizados entre as placas.
  5. Gerar gotículas para cada condição de reação usando um gerador de gotas de acordo com as instruções do fabricante.
  6. Transfira gotículas recém-criadas para a placa 96-well apropriada. Use 200 μL de ponteiras de pipeta em uma pipeta multicanal de 5-50 μL.
    Nota: Quando as gotas de pipetagem, pipeta lentamente e suavemente! O fabricante digital do equipamento do PCR recomenda usar somente pipetas e pontas da pipeta de um fabricante particular (por exemplo, Ranin). Estas pontas da pipeta têm uma abertura Lisa sem os fragmentos plásticos microscópicos que podem destruir gotículas ou danificar o microfluídica do leitor da gota. Inúmeras marcas de dicas foram examinadas e observadas para ter um espectro de qualidade de fabricação. Resultados equivalentes foram alcançados usando alternativas de ponteira de pipeta; Entretanto, o cuidado deve ser usado ao desviar-se das recomendações do fabricante.
  7. Depois que todas as gotas foram geradas e transferidas, sele a placa com um aferidor da placa da folha.
  8. Use o termociclador recomendado pelo fabricante para realizar as seguintes condições de ciclismo: 1) 94 ° c por 10 min; 2) 94 ° c por 1 minuto, taxa da rampa ajustada em 1 ° c/s; 3) 55 ° c por 2 minutos, taxa da rampa ajustada em 1 ° c/s; 4) Repita os passos 2 e 3 49 vezes; 5) 98 ° c por 10 min; 6) Segure a 4 ° c até 24 h.
    Nota: A transferência térmica em uma reação da gota não é a mesma que o PCR padrão. As condições de reacção podem necessitar de modificação.
  9. Enquanto o termociclismo está sendo realizado, Programe o software de análise de dados com as informações de configuração da placa, como nome da amostra, tipo de experimento (quantificação absoluta), Supermix usado, nome de destino 1 (nome de código de barras FAM), tipo de alvo 1 (NTC, controle positivo, controle negativo, ou desconhecido), nome do alvo 2 (nome do código de barras HEX), tipo do alvo 2 (espaço em branco, controle positivo, controle negativo, ou desconhecido). A informação final da configuração da placa é mostrada na Figura 5.
  10. Depois que o termociclagem é completo, transfira as reações terminadas ao leitor da gota e comece o processo de leitura de acordo com as instruções do fabricante.

7. quantificar o número de bactérias em um experimento de índice competitivo

  1. Diluir o gDNA isolado e quantificado da secção 4 para uma concentração adequada, tal como descrito acima.
  2. Prepare reações para o PCR digital de acordo com as recomendações do fabricante para usar o Supermix apropriado. Use o DNA da etapa 7,1 como o modelo. Use uma mistura mestra de primer-Probe 20x que contenha a sonda (ou sondas se detectando FAM e HEX) para possíveis códigos de barras presentes no experimento.
  3. Prepare reações digitais adicionais do PCR como na etapa 7,2 usando misturas mestras diferentes da primer-ponta de prova 20x até que todos os códigos de barras utilizados no projeto experimental possam ser detectados.
  4. Inclua controles para cada condição conforme descrito em 6,3. Isso inclui 1) sem controles de modelo (NTCs), 2) controles negativos e 3) controles positivos.
  5. Continue com o protocolo conforme descrito nas etapas 6.5-6.10.

8. analise dados do PCR de Digitas e calcule números absolutos da cópia

  1. Quando todos os poços tiverem sido lidos e a execução estiver concluída, abra o arquivo de dados. QLP usando o software de análise de dados.
    Nota: Os tipos de arquivo e os procedimentos de análise de dados descritos aqui são específicos a um fabricante digital do PCR. Se utilizar plataformas de PCR digitais alternativas, os tipos de ficheiro e os procedimentos de análise de dados serão específicos da plataforma utilizada e devem ser efectuados de acordo com as especificações recomendadas pelo fabricante.
  2. Selecione todos os poços que utilizam o mesmo primer-Probe Master Mix.
  3. Na guia gotículas , examine o número de gotas analisadas em cada poço (gotas positivas e negativas). Exclua da análise qualquer poço que tenha menos de 10.000 gotículas totais.
  4. Mova para a guia amplitude 1D e examine as amplitudes de gotas positivas e negativas. Assegure-se de que compreendem duas populações distintas.
  5. Dentro do software, use o recurso de limiarização para fazer um corte entre gotas positivas e negativas para cada sonda que foi utilizada (Figura 6).
    Nota: Todos os poços que usam o mesmo primer-Probe Master Mix da etapa 5,3 devem ter os mesmos limiares.
  6. Uma vez que os limiares apropriados foram aplicados a todos os poços, o software calculará o número de cópias do ADN em cada reação. Exporte dados para uma planilha para facilitar a análise.
    Nota: O software de análise de dados usa o número de gotas positivas e negativas que são adequados para uma distribuição de Poisson para determinar o número de cópia.
  7. Usando os valores da etapa 8,6, calcule o número de cópia inicial de cada código de barras genômica exclusivo na amostra. Determine a taxa média de falso-positivo das reações de controle negativo e subtraia esse valor dos valores obtidos em reações experimentais. Multiplicar os valores conforme necessário com base nas diluições que foram executadas ao configurar cada experimento (tabela 3).

9. Determine a aptidão relativa de um organismo calculando o CI ou o COI da quantificação PCR-baseada de Digitas de estirpes de código de barras

  1. Calcule o CI de uma estirpe de código de barras utilizando as seguintes fórmulas em que: umasaída é a quantificação absoluta da cepa codificada em um determinado ponto de tempo, asaída de WT é a quantificação absoluta de bactérias do tipo selvagem com código de barras ao mesmo timepoint, aentrada é a quantificação absoluta do ininoculto de entrada da estirpe de código de barras, aentrada de WT é a quantificação absoluta do inônio de entrada de bactérias do tipo selvagem com código de barras, asaída X é a somatória de todas as cepas em o mesmo ponto de tempo, XInput é a soma do inum total de entrada de todas as cepas com código de barras.

Equation 2
Equation 3
Nota: Veja a discussão de vantagens, desvantagens e o uso mais adequado de cada fórmula.

  1. Repita a etapa 9,1 para cada tensão codificada em todos os pontos de tempo.
  2. Se aplicável, calcule o COI usando as seguintes fórmulas onde: umasaída é a quantificação absoluta de uma cepa com código de barras com um gene mutado a em um determinado ponto de tempo, asaída AB é a quantificação absoluta de uma cepa de código de barras com genes mutados a e B no mesmo ponto de tempo, umaentrada é a quantificação absoluta do inóculo de entrada da cepa com código de barras com Gene mutado a, aentrada AB é a quantificação absoluta do inóculo de entrada de estirpe com código de barras com genes mutados a e b, b asaída é a quantificação absoluta de uma cepa com código de barras com gene mutado b em um determinado ponto temporal, e aentrada b é a quantificação absoluta da entrada inônio da cepa codificada com Gene Bmutado.

Equation 4
E/OU
Equation 5

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Representative Results

O uso dessa metodologia requer que sejam realizadas reações de controle apropriadas para validar a sensibilidade e a especificidade de cada sonda utilizada para identificar o DNA alvo. Neste experimento representativo, validamos oito códigos de barras de DNA únicos com as oito sondas correspondentes para identificação. Todas as oito sondas apresentaram baixa taxa de falsos positivos em ambas as NTC e reações de controle negativo (tabela 3), destacando sua especificidade mesmo entre seqüências de DNA altamente similares. Para avaliar a sensibilidade de cada condição, o gDNA contendo um código de barras único foi diluído em série em um fundo constante de gDNA contendo cada uma das sete sequências de códigos de barras remanescentes. Com a aproximação esboçada acima, o PCR digital podia distinguir tão poucos quanto 2 cópias de gDNA em um fundo de quase 2 milhões seqüências similares do ADN (tabela 3).

Além de determinar a sensibilidade e a especificidade de cada sonda e sequência de código de barras de DNA, as diluições realizadas no estudo de validação permitiram calcular um índice competitivo simulado a partir dos dados resultantes. Embora não houvesse entrada ou saída verdadeiras para este experimento, os dados podem ser analisados como se um experimento de competição tenha sido realizado. Para isso, consideramos cada mistura na diluição serial como uma saída (aoutput) para o código de barras diluído, enquanto a saída total (xoutput), entrada (aInput), e a entrada total (xInput) de cada cepa é calculada a partir do quantificação nos controles positivos onde todos os códigos de barras são incluídos. Utilizando-se o fator de diluição para cada mistura, determinou-se o IC teórico e é relatado na tabela 3. Em cada uma das séries de diluição que foi executada para cada código de barras, o IC simulado médio é relatado junto com os desvios padrão para cada série duplicada da diluição. Em todos os casos, o IC simulado que foi calculado é semelhante ao IC teórico. A maioria dos CIs calculados desviam-se dos CIs teóricos em menos de 25%. Nos casos de CIs teóricos inferiores, o desvio do valor calculado foi acima de 2 vezes. Por exemplo, isso representou uma alteração de um IC teórico de 0, 625 para um IC calculado de 0, 1220. Esses dados destacam que o método descrito é altamente preciso e altamente preciso. A combinação de alta sensibilidade, especificidade, precisão e precisão permitem que este sistema detecte de forma confiável as diferenças de aptidão que podem passar despercebidas.

Após validar que os códigos de barras genômica poderiam ser detectados e quantificados com precisão, realizamos experimentos de competição in vitro (tabela 4). O primeiro experimento de competição utilizou oito Wild-Type S. Cepas de typhimurium que cada um continha um código de barras DNA único. Cada cepa foi cultivada durante a noite, e as oito culturas foram misturadas em quantidades iguais. 100 μL deste inoculante misto foi utilizado para inocular 4,9 mL de caldo LB estéril e a cultura resultante foi incubada a 37 ° c com agitação constante. a gDNA foi colhida do ininoculador para calcular a entrada exata de cada cepa. O crescimento da cultura foi monitorado medindo-se a absorbância a 600 nm (OD600). No OD600 = 0,5 (fase logarítmica), uma amostra foi coletada de cada cultura e a gDNA foi colhida. A cultura remanescente foi devolvida a 37 ° c com agitação constante até 8 horas após a inoculação quando uma amostra final foi coletada e a gDNA foi colhida (estacionária). Os resultados foram calculados utilizando a fórmula de IC modificada para infecções agrupadas. Como esperado, todas as cepas de tipo selvagem apresentaram valores de IC quase iguais a 1 (tabela 4). Um experimento de competição semelhante foi realizado com oito mutantes S. Estirpes de typhimurium que cada um teve códigos de barras originais além do que uma única, dobro-, ou deficiência da triplo-transketolase18. Como mostrado anteriormente, todas as cepas cresceram similarmente no caldo LB, com apenas um ligeiro atraso observado na cepa tripla-transketolase deficiente. Entretanto, quando o crescimento de cada cepa foi avaliado por meio da análise do IC, observou-se um defeito muito mais profundo para a cepa deficiente transketolase (a CI foi comparada com as curvas de crescimento em Shaw et al.18). Além disso, este experimento permitiu-nos atribuir um valor quantificável às características de crescimento de cada cepa em vez de meramente descrever qualitativamente os padrões de crescimento. Os CIs para cada cepa foram calculados utilizando-se a fórmula tradicional, onde cada cepa foi comparada apenas ao tipo selvagem e à fórmula modificada, onde todas as cepas de entrada foram consideradas. Quando as mudanças eram pequenas, o CI da tensão Triple-transketolase-deficiente era artificialmente baixo na fórmula tradicional porque não conta para as outras seis tensões competindo que toda exibiu próximo-selvagem-tipo aptidão.

Cepas Genótipo Fonte ou referência
S. typhimurium ATCC 14028s selvagem-tipo Atcc
TT22236 LT2 Salmonella transportando pTP2223 27
DH5α F– φ 80Laczδm15 Δ (Laczya-ARGF) U169 RECa1 enda1 HSDR17 (rk–, mk+) PhoA supE44 λ– Thi-1 GyrA96 rela1 28
JAS18077 Putp::AA:: FRT Este estudo
JAS18080 Putp::ad:: FRT Este estudo
JAS18083 Putp::AG:: FRT Este estudo
JAS18088 Putp::Al:: FRT Este estudo
JAS18091 Putp::ao:: FRT Este estudo
JAS18096 Putp::at:: FRT Este estudo
JAS18099 Putp::aw:: FRT Este estudo
JAS18100 Putp::AX:: FRT Este estudo
JAS18122 ΔTkta:: FRT Putp::ad:: FRT Este estudo
JAS18130 ΔTktb:: FRT Putp::Al:: FRT Este estudo
JAS18138 Δtktc:: FRT Putp::at:: FRT Este estudo
JAS18125 ΔTkta:: FRT δtktb:: FRT putp::AG:: FRT Este estudo
JAS18133 ΔTkta:: FRT δtktc:: FRT putp::ao:: FRT Este estudo
JAS18141 ΔTktb:: FRT δtktc:: FRT putp::aw:: FRT Este estudo
JAS18142 ΔTkta:: FRT δtktb:: FRT δtktc:: FRT Putp::AX:: FRT Este estudo
Plasmídeo
pKD13 bla FRT AHP FRT ps1 PS4 oriR6K 14
pPCR script Cam SK + ColE1 Ori; CmR Stratagene/Aligent
pTP2223 Plac Lam Bet EXO TetR 16
pCP20 bla Cat cI857 PRFLP pSC101 orits 29
o pSKAP ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT Este estudo
pSKAP_AA ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; AA Este estudo
pSKAP_AD ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; Anúncio Este estudo
pSKAP_AG ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; AG Este estudo
pSKAP_AL ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; Al Este estudo
pSKAP_AO ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; Ao Este estudo
pSKAP_AT ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; No momento Este estudo
pSKAP_AW ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; Aw Este estudo
pSKAP_AX ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; AX Este estudo

Tabela 1: cepas e plasmíos utilizados neste estudo.

Nome Sequência (5 '-3 ')1, 2, 3
pSKAP SDM AA-F Agaagtctcctgctggtgcttgagt CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AA-R O Actcaagcaccagcaggagacttct O CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AD-F Aagagcacggtgaggtgatagtagg CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AD-R Cctactatcacctcaccgtgctctt O CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AG-F Agtagtgtcctggaggagcatgtga CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AG-R Tcacatgctcctccaggacactact O CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AL-F Accacacatcgaaggcactagctct O CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AL-R Agagctagtgccttcgatgtgtggt CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AO-F Gtccacaaccacactcagtgatact O CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AO-R Agtatcactgagtgtggttgtggac CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AT-F Accagtgtccgtgacatggctagac CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AT-R Gtctagccatgtcacggacactggt O CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AW-F Acgactgagtgatgtggacogtgacg CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AW-R Cgtcacatccacatcactcagtcgt O CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AX-F Actatcgtggtgtaacgacaggctg CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AX-R Cagcctgtcgttacaccacgatagt O CTCAAGACGTGTAATGCTG
M13-F GTAAAACGACGGCCAG
Putp Recombinação-F TAGCGATGGGAGAGAGGACACGTTAATTATTCCATTTTAA
TGCAGCATTACACGTC
Putp Recombinação-R TACTGCGGGTATTAATGCTGAAAACATCCATAACCCATTG
CCTGCAGTTCGAAGTTCC
qPCR região de código de barras Amplify-F1 TGCAGCATTACACGTCTTG
qPCR região de código de barras Amplify-R2 TAGGAACTTCGAAGCAGC
Barcode AA sonda-FAM 6-FAM/AGAAGTCTC/ZEN/CTGCTGGTGCTTGAGTC/IBFQ
Sonda AD de código de barras-FAM 6-FAM/AAGAGCACG/ZEN/GTGAGGTGATAGTAGGC/IBFQ
Barcode AG sonda-FAM 6-FAM/AGTAGTGTC/ZEN/CTGGAGGAGCATGTGAC/IBFQ
Barcode sonda AL-FAM 6-FAM/AGAGCTAGT/ZEN/GCCTTCGATGTGTGGTC/IBFQ
Barcode AO sonda-HEX HEX/AGTATCACT/ZEN/GAGTGTGGTTGTGGACC/IBFQ
Barcode AT sonda-HEX HEX/ACCAGTGTC/ZEN/CGTGACATGGCTAGACC/IBFQ
Sonda AW de código de barras-HEX HEX/ACGACTGAG/ZEN/TGATGTGGATGTGACGC/IBFQ
Sonda AX de código de barras-HEX HEX/ACTATCGTG/ZEN/GTGTAACGACAGGCTGC/IBFQ
1. º Nucleotídeos sublinhados indicam sequências complementares para cada código de barras DNA que é inserido no pSKAP após SDM.
2. º Os nucleotídeos sublinhados dobro indicam uma região complementar no S. Cromossoma de typhimurium usado para a recolocação alélicas.
3. º As pontas de prova do PrimeTime qPCR são oligos da hibridação etiquetadas com um 5 ' tintura fluorescente, o 6-carboxyfluorescein (6-FAM) ou o hexachlorofluorescein (HEX), um quencher interno (ZEN), e o 3 ' quencer Iowa preto® FQ (IBFQ).

Tabela 2: primers e sondas utilizados neste estudo.

Quantificação (reação das cópias/20μL)
Descrição Aa Anúncio Ag Al AO Em AW Machado
Ntc N/A 0, 0 0, 0 3,510 N/A 0, 0 0, 0 0, 0
Ntc 3,600 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0
Ntc 3,510 0, 0 1,280 1,180 2,340 0, 0 0, 0 0, 0
Ntc 2,290 0, 0 0, 0 1,200 1,150 1,160 0, 0 0, 0
Significa 3,133 0, 0 0,320 1,473 1,163 0,290 0, 0 0, 0
Negativo 5,130 1,156 0, 0 1,124 3,745 1,281 7,354 7,142
Negativo 5,270 0, 0 0, 0 1, 87 1,666 1,643 7,746 2,269
Negativo 2,660 0, 0 1,361 1,451 8,974 0, 0 N/A 0, 0
Negativo 6, 90 0, 0 0, 0 2,251 0, 0 2,531 8,700 3,495
Negativo 1,740 0, 0 1, 86 2,130 4,171 0, 0 7,113 5,522
Negativo 6,220 3,581 0, 0 4, 22 1,175 1,341 N/A 5,950
Significa 4,518 0,789 0,408 2, 11 3,288 1,133 7,728 4, 63
Positivo 22281,540 42673, 39 46442,242 45359,180 47885,625 15708, 27 45325,906 20810,559
Positivo 23989,676 44625,523 47356,438 45790,660 47456,973 15096,601 47929,840 22455,234
Positivo 17846,824 38980,133 45633,809 44174,820 33875, 39 15156, 63 42536,270 21467,840
Positivo 21047,588 40140,848 41672,648 46028,496 47426,527 16718, 0 46978,664 19876,473
Positivo 20218,238 44660,602 41718,707 45799,375 46495,602 14590,264 54741, 23 22011,938
Positivo 18531,740 41620,801 N/A 48082,313 35645,199 15341,382 48950,992 21117,559
Significa 20652,601 42116,824 44564,769 45872,474 43130,827 15435, 56 47743,783 21289,934
Subtração em branco 20648, 83 42116, 35 44564,361 45870,463 43127,539 15433,923 47736, 54 21285,871
A não diluído 23024,961 44448,875 58897,510 51120,948 55450,191 18155,305 62844, 68 27567,828
B não diluído 18278,174 35252,586 54409,510 66022,396 43101,148 15732,609 60761,328 26581,979
1/50 A 521,670 755, 35 1066,898 1287,187 1053,339 181,324 1278,336 580,961
1/50 B 435,326 634,215 1168, 87 1383,537 991, 40 165,443 1180,445 596,461
1/100 A 228, 28 598,848 603,911 631,116 507,956 258,405 665,647 331,590
1/100 B 256,330 585,834 583,325 670,875 459,325 289,207 638,916 307,948
1/200 A 121,283 305,293 258,247 346,965 234,774 114,163 169, 55 172,553
1/200 B 114,638 313, 40 253,685 297,216 191,637 179,895 280,989 147,297
1/400 A 42,829 141,343 127,337 163,605 N/A 71,241 157,697 85,976
1/400 B 59,544 180,543 162, 80 162,108 115,508 104,682 151,141 87,804
1/800 A 34,304 67,934 65,939 83,857 66,134 31,784 82,722 45,616
1/800 B 20,390 80,222 81,453 85,325 53,102 38, 34 55,460 29,660
1/1600 A 15,405 44,505 47,672 39,613 33, 27 18, 6 37,655 20,988
1/1600 B 22, 91 48,828 46,781 37,388 30,245 30,138 34,553 19,795
1/3200 A 12,333 22,104 16,850 18,403 11,460 10,535 21,245 9,218
1/3200 B 6,796 32,555 15,742 26,249 15,111 9,908 23,393 10,175
Subtração em branco
A não diluído 23020,443 44448, 86 58897,103 51118,937 55446,903 18154,172 62836,339 27563,765
B não diluído 18273,655 35251,797 54409,103 66020,385 43097,860 15731,477 60753,600 26577,916
1/50 A 517,152 754,246 1066,490 1285,176 1050, 51 180,192 1270,607 576,898
1/50 B 430,808 633,426 1167,679 1381,526 987,751 164,311 1172,717 592,398
1/100 A 223,509 598, 59 603,503 629,105 504,668 257,272 657,918 327,527
1/100 B 251,812 585, 44 582,918 668,864 456, 36 288, 74 631,187 303,885
1/200 A 116,765 304,503 257,840 344,954 231,486 113, 30 161,327 168,490
1/200 B 110,120 312,251 253,277 295,205 188,348 178,762 273,261 143,234
1/400 A 38,310 140,554 126,929 161,594 N/A 70,108 149,968 81,913
1/400 B 55, 26 179,753 161,672 160, 97 112,219 103,549 143,413 83,741
1/800 A 29,786 67,145 65,531 81,847 62,846 30,651 74,994 41,553
1/800 B 15,872 79,433 81, 45 83,314 49,813 36,901 47,732 25,596
1/1600 A 10,886 43,716 47,264 37,602 29,739 16,874 29,927 16,925
1/1600 B 17,573 48, 39 46,373 35,377 26,957 29, 5 26,825 15,732
1/3200 A 7,815 21,314 16,442 16,392 8,172 9,402 13,517 5,155
1/3200 B 2,278 31,765 15,334 24,238 11,822 8,776 15,664 6,112
CI simulado
A não diluído 1,114895 1, 55372 1,321619 1,114419 1,285650 1,176251 1,316329 1,294932
B não diluído 0,885005 0,837016 1,220911 1,439279 0,999312 1, 19279 1,272698 1,248618
1/50 A 0, 25046 0, 17909 0, 23931 0, 28018 0, 24348 0, 11675 0, 26617 0, 27102
1/50 B 0, 20864 0, 15040 0, 26202 0, 30118 0, 22903 0, 10646 0, 24567 0, 27831
1/100 A 0, 10825 0, 14200 0, 13542 0, 13715 0, 11702 0, 16669 0, 13782 0, 15387
1/100 B 0, 12195 0, 13891 0, 13080 0, 14582 0, 10574 0, 18665 0, 13222 0, 14276
1/200 A 0, 5655 0, 7230 0, 5786 0, 7520 0, 5367 0, 7323 0, 3380 0, 7916
1/200 B 0, 5333 0, 7414 0, 5683 0, 6436 0, 4367 0, 11582 0, 5724 0, 6729
1/400 A 0, 1855 0, 3337 0, 2848 0, 3523 N/A 0, 4542 0, 3142 0, 3848
1/400 B 0, 2665 0, 4268 0, 3628 0, 3490 0, 2602 0, 6709 0, 3004 0, 3934
1/800 A 0, 1443 0, 1594 0, 1470 0, 1784 0, 1457 0, 1986 0, 1571 0, 1952
1/800 B 0, 769 0, 1886 0, 1819 0, 1816 0, 1155 0, 2391 0, 1000 0, 1203
1/1600 A 0, 527 0, 1038 0, 1061 0, 820 0, 690 0, 1093 0, 627 0, 795
1/1600 B 0, 851 0, 1141 0, 1041 0, 771 0, 625 0, 1879 0, 562 0, 739
1/3200 A 0, 378 0, 506 0, 369 0, 357 0, 189 0, 609 0, 283 0, 242
1/3200 B 0, 110 0, 754 0, 344 0, 528 0, 274 0, 569 0, 328 0, 287
IC médio (teórico)
Não diluído (1) 0,999950 0,946194 1,271265 1,276849 1,142481 1, 97765 1,294514 1,271775
1/50 (0, 2) 0, 22955 0, 16474 0, 25067 0, 29068 0, 23625 0, 11161 0, 25592 0, 27466
1/100 (0, 1) 0, 11510 0, 14046 0, 13311 0, 14148 0, 11138 0, 17667 0, 13502 0, 14832
1/200 (0, 5) 0, 5494 0, 7322 0, 5735 0, 6978 0, 4867 0, 9453 0, 4552 0, 7322
1/400 (0, 25) 0, 2260 0, 3803 0, 3238 0, 3507 0, 260 * 0, 5626 0, 3073 0, 3891
1/800 (0, 125) 0, 1106 0, 1740 0, 1645 0, 1800 0, 1306 0, 2188 0, 1285 0, 1577
1/1600 (0, 625) 0, 689 0, 1089 0, 1051 0, 795 0, 657 0, 1486 0, 594 0, 767
1/3200 (0, 313) 0, 244 0, 630 0, 357 0, 443 0, 232 0, 589 0, 306 0, 265
Desvio padrão
Diluído 0,11494 0,10918 0, 5035 0,16243 0,14317 0, 7849 0, 2182 0, 2316
1/50 0, 209 0, 143 0, 114 0, 105 0, 72 0, 51 0, 103 0, 36
1/100 0, 69 0, 15 0, 23 0, 43 0, 56 0, 100 0, 28 0, 56
1/200 0, 16 0, 9 0, 5 0, 54 0, 50 0, 213 0, 117 0, 59
1/400 0, 40 0, 47 0, 39 0, 2 0 0, 108 0, 7 0, 4
1/800 0, 34 0, 15 0, 17 0, 2 0, 15 0, 20 0, 29 0, 37
1/1600 0, 16 0, 5 0, 1 0, 2 0, 3 0, 39 0, 3 0, 3
1/3200 0, 13 0, 12 0, 1 0, 9 0, 4 0, 2 0, 2 0, 2
* Representa os resultados de uma única experiência.

Tabela 3: quantificação absoluta e cálculo do IC simulado.

Condição Índice competitivo1
Experiência 1
PESOAA ad WT WTAG WTAl WTao WTna WTaw WTAX
Logarítmica 0,927 ± 0, 33 0,992 ± 0, 31 1, 68 ± 0, 25 0,921 ± 0, 2 1, 44 ± 0, 3 1, 51 ± 0, 57 1, 94 ± 0, 27 0,929 ± 0, 5
Estacionária 1,1 ± 0, 21 1, 71 ± 0, 53 1, 79 ± 0, 65 0,948 ± 0, 2 0,98 ± 0, 2 0,873 ± 0, 44 0,97 ± 0, 56 1, 21 ± 0, 7
Experiência 2
CI (tradicional) PESOAA ΔAad ΔBAl ΔCna a.AG ΔACao ΔBCaw ΔABCAX
Logarítmica 1 ± 0 0,802 ± 0, 84 0,957 ± 0, 2 0,989 ± 0, 73 0,581 ± 0,153 0,86 ± 0, 53 0,995 ± 0, 11 0,695 ± 0, 61
Estacionária 1 ± 0 0,97 ± 0, 63 1, 43 ± 0, 58 0,99 ± 0, 36 1,625 ± 0,589 0,835 ± 0, 51 0,912 ± 0, 47 0,477 ± 0, 49
CI (inoculum agrupada)
Logarítmica 1,114 ± 0, 39 0,864 ± 0, 74 1, 73 ± 0, 32 1,1 ± 0, 68 0,633 ± 0,152 0,938 ± 0, 56 1,111 ± 0, 43 0,746 ± 0, 6
Estacionária 1, 78 ± 0, 39 1, 39 ± 0, 49 1,166 ± 0, 93 1, 66 ± 0, 1 1,735 ± 0,613 0,876 ± 0, 35 0,97 ± 0, 45 0,49 ± 0, 47
1. º Os valores representam a média de IC ± desvio padrão para três ou quatro experimentos replicantes.

Quadro 4: resultados representativos da concorrência in vitro entre S. Cepas de typhimurium .

Tabela S1. Iniciadores opcionais para a criação de sequências de código de barras adicionais e sondas fluorescentes correspondentes para sua detecção. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figure 1
Figura 1. Geração de pSKAP. (A) a pKD13 purificada foi submetida à digestão por restrição com HindIII e BamHI. (B, C) O fragmento de 1.333 BP do interesse que contem um gene FRT-ladeado da resistência do canamicina foi purified. (D) o PPCR script Cam SK + também foi digerido com HindIII e BamHI e o fragmento de PKD13 (B) foi ligado para gerar (e) pskap. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: mutagenese direcionada ao site insercional para pSKAP. (A) ainserção de códigos de barras de DNA de 25 BP na posição 725 foi realizada utilizando-se PCR. Iniciador e reverso primers específicos para esse local foram projetados com complementar 25-nucleotídeo 5 ' extensões (denotado na cartilha como minúsculas "a"). (B) um plasmídeo genérico pSKAP_Barcode resultante de SDM é mostrado com a localização do código de barras de DNA inserido laranja destacado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: rearranjo cromossômico a jusante de Putp. (A) após a recombinação de λ-Red mediada, o gene selecionável da resistência do canamicina (roxo escuro) flanqueado por locais de FRT (cinzento) é introduzido no cromossoma entre o loci indicado (local cromossomático do recombination, vermelho). O código de barras de DNA exclusivo (laranja) é inserido fora do site da FRT. (B) o gene da resistência de canamicina é removido pela excisão FRT-negociada, deixando um remanescente do ADN introduzido no cromossoma (ADN introduzido total, azul) que consiste no código de barras do ADN e em uma cicatriz de FRT. (C) a seqüência de DNA cromossômico modificada em torno do DNA inserido é mostrada, juntamente com os locais de priming de amplificação (roxo claro) usados para PCR digital. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: esquema de diluição para validar a sensibilidade e a especificidade da sonda fluorescente. (A) o gDNA purificado de sete cepas com código de barras é misturado em quantidades iguais para criar o diluente para diluição do gDNA com código de barras OMITIDO (AX no exemplo acima). (B) executar uma diluição serial do gDNA codificado OMITIDO (AX no exemplo acima) usando o diluente preparado descrito anteriormente. Misture completamente o conteúdo de cada tubo antes de transferir para o próximo tubo. A Figura 4 foi criada com o BioRender. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: layout da placa para análise da sensibilidade e especificidade dos conjuntos de sonda-primer 1 e 2. O experimento de PCR digital inclui NTCs, controles positivos, controles negativos e os esquemas de diluição para cada um dos códigos de barras testados. A placa para validar os conjuntos de sonda-primer 3 e 4 é colocada no mesmo padrão usando o gDNA com código de barras apropriado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: resultados representativos da PCR digital de gDNA diluído em AA-Barcoded. gDNA contendo o código de barras AA foi diluído em um fundo de todos os outros gDNA codificado como descrito na Figura 4. O canal 1 representa a sonda FAM para o código de barras AA (painéis superiores) enquanto o canal 2 representa a sonda HEX para o código de barras AO (painéis inferiores). Os resultados de cada sonda são apresentados como amplitude fluorescente de gota individual (painéis esquerdos) e um histograma representando a frequência da intensidade fluorescente de todas as gotas nos poços selecionados (painéis direito). Para cada condição, as gotas positivas (fluorescência alta) e negativa (baixa fluorescência) devem formar duas populações distintas. No caso de AA que foi diluído, e a maioria das gotas foram negativas, o histograma (painel superior direito) parece apenas representar uma única população. Isso porque as gotas positivas são substancialmente superadas por gotículas negativas; Entretanto, duas populações distintas são ainda visíveis examinando a amplitude fluorescente da gota nos painéis esquerdos.  As populações devem ser separadas usando o recurso de limiar para definir gotículas positivas e negativas (visualizadas pela linha rosa). Os valores de limite variarão dependendo das sondas que foram usadas, mas todos os poços que utilizam a mesma mistura de sonda devem ter limiares idênticos. Como o gDNA do AA-Barcoded foi diluído, há uma diminuição em gotas positivas (fluorescentes elevadas) quando o número de gotas positivas do AO permanecer constante no fundo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A capacidade de quantificar com precisão os microrganismos é de suma importância para a pesquisa de microbiologia, e a capacidade de enumerar cepas únicas de uma população mista inicial provou ser uma ferramenta inestimável para avaliar os traços de aptidão e virulência em Bactérias. No entanto, as técnicas para realizar isso não progrediram em ritmo com os desenvolvimentos modernos em biologia molecular. A tecnologia para modificar facilmente os cromossomas de muitas bactérias, incluindo S. Typhimurium, estêve disponível por quase duas décadas14, contudo esta habilidade foi utilizada raramente para cepas molecularmente da etiquetagem com seqüências originais do ADN. Explorando a capacidade de criar cepas prontamente identificáveis com base em códigos de barras de DNA únicos e minimamente disruptivos inseridos no cromossomo bacteriano, juntamente com a tecnologia mais avançada para detectar e quantificar esses identificadores moleculares ( Isto é PCR digital), nós criamos um sistema que forneça a sensibilidade, a especificidade, a exatidão, e a precisão requintados para facilmente quantificar tensões individuais dentro de uma população diversa das bactérias.

Calcular CIs e COIs como descrito acima confia na habilidade de fazer exatamente as modificações apropriadas aos cromossomas bacterianos. Todas as modificações devem ser verificadas pelo sequenciamento de Sanger para garantir que não ocorreram mutações aleatórias. O uso de uma polimerase de alta fidelidade minimizará esses erros, mas quaisquer mutações que ocorram prejudicarão a capacidade de detectar a cepa, que é outro aspecto crítico deste protocolo. Embora tenhamos demonstrado que o PCR digital pode detectar tão poucos como duas cópias de gDNA em um fundo de quase 2 milhões, as tensões fora desta escala podem exigir diluições adicionais para sua quantificação exata. Além disso, as sequências de código de barras de DNA devem ser projetadas para facilitar o uso de sequências de sonda de alta qualidade. As sequências de sonda devem ser analisadas para tendências de autodimerizar, formar grampos de cabelo ou vincular de forma ineficaz seus alvos. A importância do uso de sequências de qualidade e sondas não pode ser minimalizada, fato que é evidenciado pelos experimentos de validação cuidadosos que devem ser realizados com cada sonda. Os esforços para criar códigos de barras de DNA ideais criarão resultados de quantificação de PCR digital ideais.

Embora as tags moleculares cuidadosamente projetadas sejam importantes para a obtenção de resultados de qualidade, interpretar os resultados é outro aspecto crítico deste protocolo. O IC é definido como a razão entre a cepa mutante e a cepa do tipo Wild na saída dividida pela razão das duas cepas na entrada1,19,20. Este CI tradicional apresentado na seção 9 é útil quando a infecção misturada consiste em somente uma tensão contra o selvagem-tipo. No entanto, ao usar grandes piscinas de cepas para inocular meios de comunicação ou animais, as cepas não são apenas concorrentes contra o tipo selvagem, mas também contra todas as outras estirpes presentes no iníbulo. Estudos prévios que realizaram experimentos de competição usando múltiplas cepas infectante não conseguiram levar isso em conta em seus cálculos7,13. Para dar conta deste recurso de infecções mistas, introduzimos uma fórmula para calcular CIs que foi modificada para infecções agrupadas. É improvável que todas as estirpes proporcionem o mesmo nível de concorrência que uma estirpe do tipo selvagem. No entanto, como a maioria dos genes bacterianos tem pouco impacto na virulência, como o número de cepas usadas no experimento de índice competitivo aumenta, a probabilidade de que a virulência geral tende para o tipo selvagem aumenta a tensão. Isto não pode necessariamente ser o caso para determinados projetos experimentais usando associações de muitas tensões todas com defeitos conhecidos da virulência. No entanto, isso é contabilizado na equação modificada porque as cepas menos abundantes (menos ajuste) no resultado terão um efeito menor nasaídaX. Dependendo do experimento experimental específico, pode haver casos em que uma ou outra fórmula é preferida. Na maioria dos casos envolvendo infecções agrupadas, no entanto, é importante considerar que, em uma infecção mista, todas as cepas competem uns contra os outros, não apenas contra o tipo selvagem. Ao analisar os resultados, é fundamental que a lógica por trás de cada fórmula seja bem compreendida para fazer as interpretações mais precisas da aptidão de deformação. Ao relatar os resultados, é igualmente importante divulgar com precisão como os dados foram analisados.

A seção 9 do protocolo também inclui fórmulas para ajudar a determinar as interações genéticas usando um COI. Com esta análise, as previsões podem ser feitas para determinar se dois genes de virulência operam de forma independente ou em conjunto. O COI é definido como a razão entre o mutante duplo e a cepa mutante única na saída dividida pela razão entre as duas cepas na entrada1. A fórmula é projetada detectar o aditividade fenotípico de rupturas do gene. Se os genes funcionam de forma independente para aumentar a virulência, uma ruptura de ambos os genes deve causar uma maior diminuição na aptidão em comparação com uma única perturbação de um ou outro gene sozinho. Se os genes funcionam em conjunto para aumentar a virulência (como genes codificando duas enzimas em um caminho), uma ruptura de um ou outro gene deve ter o mesmo efeito na virulência como interromper ambos os genes. Detectar o aditividade fenotípico pode ser difícil nos casos onde o nível de atenuação causado por um único gene é muito elevado ou muito baixo. No entanto, a comparação direta de cepas dentro do mesmo sistema animal proporciona menor variabilidade e uma conta mais confiável da relação funcional entre os genes, e esse cálculo pode ser realizado a partir de duas cepas dentro de uma população mista maior.

Um aspecto crítico final para interpretar os resultados é considerar os efeitos da dinâmica populacional. Em algumas infecções mistas que têm múltiplas cepas, uma única cepa pode emergir como mais dominante ou menos apto por causa da deriva da população aleatória. Este fenômeno pode ser amplificado quando ocorrem eventos de gargalo. Isso pode ser causado pelo uso de um número muito grande de cepas de entrada, um número muito pequeno de bactérias totais no inuso, ou uma combinação de ambos. Outro aspecto interferente que surge a partir de infecções mistas é a possibilidade de complementação trans. Isso ocorre quando uma cepa de ajuste, como o tipo selvagem, aumenta artificialmente a virulência de uma cepa menos adequada. Um exemplo hipotético disso seria comparar a aptidão de um S. Typhimurium pathogenicity Island 2 (SPI2)-estirpe eliminatória coinfectada com uma estirpe de tipo selvagem. SPI2 permite S. Typhimurium para sobreviver intracelularmente secretoras efetores no citosol do anfitrião que modificam o fagossoma dentro de um macrófago. O rompimento deste sistema faz S. Typhimurium suscetível à matança intracelular. No entanto, porque os macrófagos são capazes de engolir duas ou mais bactérias ao mesmo tempo, o SPI2-Knockout poderia receber um aumento considerável na aptidão se estiver residindo no mesmo macrófago como um selvagem-tipo S.  Typhimurium que está secretando efetores no citosol hospedeiro. A dinâmica populacional aleatória e a possibilidade de complementação trans é uma limitação de qualquer experimento de competição. Se houver suspeita de complementação Trans , os fenótipos devem ser confirmados usando outros métodos complementares para avaliar a aptidão. Para superar a dinâmica populacional aleatória, aumentar o número de experimentos replicados aumenta a probabilidade de identificar valores atípicos nos resultados. Felizmente, o protocolo descrito acima torna mais fácil ter um maior número de experimentos replicadas idênticas porque o número de condições experimentais é drasticamente reduzido.

Um elemento-chave para a técnica de IC descrita acima é a sua capacidade de ser adaptado a quase qualquer organismo e qualquer projeto experimental que exija a quantificação exata de microrganismos. Faz, entretanto, exige a manipulação genética de um organismo incorporar uma seqüência original do ADN no cromossoma. A adaptabilidade da técnica requer que a espécie seja geneticamente maleável e confie na geração de protocolos alternativos para modificação do genoma (etapas 1 e 2). Os códigos de barras de DNA listados nas tabelas 2 e S1 devem ser suficientes para a maioria das bactérias; Entretanto, como em todas as experiências quantitativas do PCR, é pertinente analisar o genoma bacteriano para assegurar o potencial mínimo para o emperramento do fora-alvo dos primers e das pontas de prova por uma análise simples da explosão. As sequências de código de barras DNA utilizadas neste estudo diferem por apenas 3-4 bases em alguns casos, destacando a especificidade requintada das sondas que minimizam o potencial de vinculação não específica. Independentemente da especificidade das sondas fluorescentes, todas as novas sequências de códigos de barras devem ser devidamente validadas para sensibilidade e especificidade, conforme descrito na etapa 6. Após a criação de cepas com código de barras, é possível adaptar este protocolo a muitos tipos de experimentos, além de ensaios de competição in vitro, como descrito acima. As cepas são adequadas para ensaios de competição in vivo em camundongos ou outros sistemas de modelos animais. Somente as modificações mínimas são exigidas para extrair gDNA dos órgãos e dos tecidos animais, e estas modificações são descritas bem por fabricantes dos jogos para tais finalidades. Além disso, grandes pools de infecções mistas para a competição in vivo têm sido utilizados com sucesso anteriormente7, oferecendo o potencial para reduzir o número de animais necessários para um único experimento, que não só diminui os custos dessas experiências Mas também diminui o potencial de variabilidade animal-animal. Da mesma forma, cepas com código de barras podem ser usadas em outros ensaios in vitro que examinam a suscetibilidade de cepas a várias condições de tratamento (por exemplo, antibióticos, susceptibilidade ácida, mortes por espécies reativas de oxigênio ou nitrogênio, etc.). Para esses experimentos, a avaliação da inibição do crescimento pode ser alcançada adicionando-se o produto químico desejado ao meio de crescimento na etapa 3,4 e procedendo conforme descrito. Para avaliar a morte bacteriana, uma grande piscina de cepas pode ser misturada, e a entrada quantificada como descrito acima. Após a exposição ao tratamento desejado, as células ao vivo podem ser seletivamente quantificadas acoplando o procedimento de quantificação de PCR digital com PCR de viabilidade para diferenciar entre células mortas e vivos21,22,23 , 24 de cada , 25 anos de , 26. throughput para tais experiências seria aumentado dramàtica porque as diluições e as placas da réplica para cada tensão são substituídas por umas técnicas moleculars mais aerodinâmicas. Por fim, embora a análise da biologia evolutiva e da genética populacional esteja além do escopo deste trabalho, os organismos com código de barras são altamente adaptáveis para esses estudos.  Em última análise, o objetivo deste protocolo foi desenvolver uma técnica poderosa para quantificar as bactérias que são altamente adaptáveis para seu uso em muitas espécies diversas e em muitos tipos de experimentos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

As pesquisas relatadas nesta publicação foram apoiadas pelo fundo de pesquisa do corpo docente do Presidente George F. Haddix e pelo Instituto Nacional de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde (NIH) o prêmio número GM103427. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 22600028 Procure from any manufacturer
16 mL culture tubes MidSci 8599 Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tips RAININ 30389241 Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipette RAININ 17013804 Use alternative multichannel pipettes with caution
Agarose ThermoFisher Scientific BP160-500 Procure from any manufacturer
BLAST Analysis NCBI N/A https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module Bio Rad 1851197 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5α Invitrogen 18258012 Procure from any manufacturer or prepare yourself
Chloramphenicol ThermoFisher Scientific BP904-100 Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate reader BioTek CYT5MF Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) Bio Rad N/A Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well Plates Bio Rad 12001925 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader Oil Bio Rad 1863004 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Bio Rad 1863024 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1864008 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1863009 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for Probes Bio Rad 1863005 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Kanamycin ThermoFisher Scientific BP906-5 Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agar ThermoFisher Scientific BP1425-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani broth ThermoFisher Scientific BP1426-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio Rad 1814040 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR Tubes Eppendorf 951010022 Procure from any manufacturer
Petri dishes ThermoFisher Scientific FB0875712 Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+ Stratagene/Agilent 211192 No longer available commercially
Primer/Probe Design IDT N/A https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_Barcodes Addgene Plasmid numbers 122702-122726 www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer Bio Rad 1814000 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Generator Bio Rad 1864002 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Reader Bio Rad 1864003 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s ATCC ATCC 14028s www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate BioTek TAKE3 Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHI ThermoFisher Scientific FERFD0054 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnI ThermoFisher Scientific FERFD1704 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIII ThermoFisher Scientific FERFD0504 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit ThermoFisher Scientific FERK0832 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit ThermoFisher Scientific FERK0503 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F534L Procure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific FEREL0011 Procure from any manufacturer
Thermocycler Bio Rad 1861096 Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue Transilluminator ThermoFisher Scientific UV95043301 Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology Grade ThermoFisher Scientific BP28191 Procure from any manufacturer

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References

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Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em <em>Salmonella</em>
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Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella. J. Vis. Exp. (147), e59630, doi:10.3791/59630 (2019).

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