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Genetics

Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59630
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

Summary

Este enfoque molecular para determinar la aptitud bacteriana facilita la detección precisa y precisa de microorganismos utilizando códigos de barras de ADN genómicos únicos que se cuantifican a través de PCR digital. El protocolo describe el cálculo del índice competitivo para las cepas de Salmonella; sin embargo, la tecnología es fácilmente adaptable a los protocolos que requieren la cuantificación absoluta de cualquier organismo genéticamente maleable.

Abstract

Un índice competitivo es un método común utilizado para evaluar la aptitud bacteriana y/o la virulencia. La utilidad de este enfoque se ejemplifica por su facilidad de ejecución y su capacidad para estandarizar la aptitud de muchas cepas a un organismo de tipo salvaje. La técnica está limitada, sin embargo, por los marcadores fenotípicos disponibles y el número de cepas que se pueden evaluar simultáneamente, creando la necesidad de un gran número de experimentos de réplica. Simultáneamente con un gran número de experimentos, los costos de mano de obra y materiales para cuantificar bacterias basadas en marcadores fenotípicos no son insignificantes. Para superar estos aspectos negativos conservando los aspectos positivos, hemos desarrollado un enfoque molecular para cuantificar directamente los microorganismos después de diseñar marcadores genéticos en cromosomas bacterianos. Se insertaron códigos de barras de ADN únicos de 25 pares base en un locus inocuo en el cromosoma de cepas mutantes y de tipo salvaje de Salmonella. Los experimentos de competencia in vitro se realizaron utilizando inocula consistente en cepas agrupadas. Tras la competición, los números absolutos de cada cepa se cuantificaron utilizando PCR digital y los índices competitivos para cada cepa se calcularon a partir de esos valores. Nuestros datos indican que este enfoque para cuantificar la Salmonella es extremadamente sensible, preciso y preciso para detectar microorganismos altamente abundantes (alta aptitud) y raros (baja aptitud). Además, esta técnica es fácilmente adaptable a casi cualquier organismo con cromosomas capaces de modificar, así como a diversos diseños experimentales que requieren la cuantificación absoluta de microorganismos.

Introduction

Evaluar la aptitud y la virulencia de los organismos patógenos es un aspecto fundamental de la investigación en microbiología. Permite realizar comparaciones entre cepas o entre organismos mutados, lo que permite a los investigadores determinar la importancia de ciertos genes en condiciones específicas. Tradicionalmente, la evaluación de la virulencia utiliza un modelo animal de infección utilizando diferentes cepas bacterianas y observando el resultado del animal infectado (por ejemplo, Dosis Infecciosa50, Dosis letal50,tiempo hasta la muerte, gravedad de los síntomas, falta de síntomas, etc.). Este procedimiento proporciona descripciones valiosas de la virulencia, pero requiere que las cepas causen diferencias considerables en los resultados para detectar variaciones de tipo salvaje. Además, los resultados son semicuantitativos porque mientras que la progresión de la enfermedad y la gravedad de los síntomas se pueden cuantificar subjetivamente con el tiempo, la interpretación de la virulencia en comparación con el tipo salvaje es más cualitativa (es decir, más, menos o igualmente virulenta). Una alternativa común a la realización de ensayos de infectividad animal es generar índices competitivos (CIs), valores que comparan directamente la aptitud o virulencia de una cepa con una contraparte de tipo salvaje en una infección mixta1. Esta técnica tiene numerosas ventajas sobre un modelo animal tradicional de infección al estandarizar la virulencia a una cepa de tipo salvaje y determinar un valor cuantificable para reflejar el grado de atenuación. Esta técnica también se puede adaptar para analizar las interacciones genéticas en las bacterias mediante la determinación de un índice competitivo cancelado (COI)2. El cálculo de un COI para un grupo de organismos mutados permite a los investigadores determinar si dos genes contribuyen de forma independiente a la patogénesis o si están implicados en la misma vía de virulencia y dependen entre sí. Además, el cálculo de un CI requiere la enumeración de bacterias que pueden proporcionar información valiosa sobre la patogénesis de los organismos. Los COI y los COI también permiten a los investigadores assimilar a cepas avirulentas que no causan enfermedades clínicas pero que todavía tienen diferencias en la aptitud física. Esta técnica está limitada por el uso de marcadores tradicionales de resistencia a antibióticos para identificar cepas, limitando así el número de cepas de entrada a sólo una o dos a la vez. Debido a esta limitación, se requiere un gran número de grupos experimentales y réplicas, que además de aumentar los costos de mano de obra y materiales, también aumenta las oportunidades de variabilidad en condiciones experimentales y resultados inexactos. (Para una revisión exhaustiva de los beneficios y aplicaciones del uso de infecciones mixtas para estudiar la virulencia, la aptitud y las interacciones genéticas, véase C.R. Beuzón y D.W. Holden 1)

Se ha intentado superar esta limitación, como el uso de células etiquetadas fluorescentes cuantificadas a través de la citometría de flujo3,4,5. Esta técnica cuantifica las células utilizando 1) anticuerpos etiquetados para marcadores fenotípicos o 2) proteínas fluorescentes producidas endógenamente. El uso de anticuerpos etiquetados tiene un límite de detección de 1.000 células/ml, y por lo tanto requiere un alto número de células para analizar3. Las células que expresan proteínas fluorescentes tienen una fisiología alterada y son susceptibles a cambios de aptitud resultantes de la alta expresión proteica6. Ambos métodos están limitados por el número de marcadores fluorescentes detectables mediante citometría de flujo. Se logró un avance en la cuantificación molecular mediante el desarrollo de una técnica de microarray que detectó la atenuación en 120 cepas a partir de una infección mixta inicial de más de 1.000 cepas en un modelo murino7. Esta técnica utilizó un análisis de microarray de ARN a partir de cepas mutadas, lo que condujo a una considerable variabilidad en el resultado.  Sin embargo, estableció que grandes grupos de infecciones mixtas pueden ser una herramienta útil y que mediante la utilización de técnicas de detección sensibles, se pueden identificar diferencias en la virulencia bacteriana. Con el desarrollo de la secuenciación de próxima generación, Tn-seq amplió la utilidad de las mutaciones transposon, permitiendo un poderoso método para cuantificar bacterias que fueron mutadas aleatoriamente8,9,10, 11. Recientemente se desarrolló un protocolo alternativo que elimina la necesidad de transposones y en su lugar utiliza códigos de barras de ADN para identificar y realizar un seguimiento más fácil de los cambios genómicos y su impacto en la aptitud12. Esta tecnología es un avance importante, pero la inserción de los códigos de barras genómicos sigue siendo un proceso aleatorio. Para superar la aleatoriedad de experimentos anteriores, Yoon y otros desarrollaron un método para calcular los CI de las cepas de Salmonella utilizando códigos de barras de ADN únicos insertados en ubicaciones precisas en los cromosomas de la bacteria13. Se detectaron cepas únicas de códigos de barras utilizando un método basado en qPCR con verde SYBR y imprimaciones específicas para cada código de barras único. La técnica se vio limitada por las restricciones impuestas por qPCR, incluidas las diferencias en la eficiencia de imprimación y la baja sensibilidad, evidenciadas por la necesidad de PCR anidado antes de qPCR. Sin embargo, este enfoque demostró que las modificaciones genómicas específicas podían ser explotadas para detectar y potencialmente cuantificar los grupos de múltiples cepas bacterianas.

En el siguiente protocolo, describimos una metodología novedosa para realizar experimentos de competencia bacteriana con grandes piscinas de inóculas mixtas seguidas de una cuantificación precisa utilizando una técnica de PCR digital altamente sensible. El protocolo implica cepas bacterianas de etiquetado genética con un código de barras de ADN único insertado en una región inocua del cromosoma. Esta modificación permite cuantificar las cepas de forma rápida y precisa utilizando tecnología molecular moderna en lugar de diluciones seriales tradicionales, replicación y conteo de unidades formadoras de colonias que se basan en marcadores fenotípicos (es decir, resistencia a los antibióticos ). Las modificaciones permiten la evaluación simultánea de muchas cepas en un solo inóculo agrupado, reduciendo sustancialmente la posibilidad de variabilidad experimental porque todas las cepas están expuestas a las mismas condiciones exactas. Además, si bien esta técnica fue desarrollada en Salmonella enterica serovar Typhimurium, es altamente adaptable a cualquier organismo genéticamente maleable y casi cualquier diseño experimental donde se requieran recuentos bacterianos precisos, proporcionando un nuevo para aumentar la precisión y el rendimiento en los laboratorios de microbiología sin las restricciones impuestas por métodos anteriores.

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Protocol

1. Incorporar códigos de barras de ADN únicos en un plásmido que contiene los componentes necesarios para el intercambio alélico

NOTA: Se creó un nuevo plásmido, denominado pSKAP, con un alto número de copia y una mayor eficiencia de transformación en comparación con el plásmido de intercambio alómico pKD13 existente. Esto se describe en los pasos 1.1-1.12 (Figura1). Los plásmidos finalizados que contienen códigos de barras de ADN únicos y componentes para el intercambio alélico están disponibles a través de un repositorio de plásmidos (Tabla de materiales).

  1. Usando un kit de miniprep de plásmido comercial, purificar pKD1314 y pPCR Script Cam SK+ de cultivos bacterianos nocturnos cultivados en caldo Luria-Bertani (LB) complementado con 50 g/ml de kanamicina o 25 g/mL de cloranfenicol (para pKD13 y pPCR Script Cam SK+, respectivamente) (Tabla 1).
  2. Realizar digestiones de restricción en ambos plásmidos utilizando enzimas de restricción comercial HindIII y BamHI de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
  3. Elimine las enzimas de restricción y el ADN extirpado de la pPCR Script Cam SK+ reacción y purifique la columna vertebral de plásmido de par de 3.370 bases (bp) utilizando un kit de limpieza de ADN disponible comercialmente de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
  4. Separe los fragmentos de la digestión de restricción pKD13 en un gel de agarosa del 1% utilizando una cámara de electroforesis.
  5. Visualice las bandas utilizando un transiluminador de luz azul e exboce el fragmento de 1.333 bp del gel (Figura1C).
    NOTA: Este fragmento contiene el gen de resistencia a la kanamicina flanqueado por FRT necesario para el reemplazo alélico cromosómico.
  6. Purificar el ADN extirpado del paso 1.5 utilizando un kit de extracción de gel comercial.
  7. Para crear pSKAP, ligar el fragmento purificado de pKD13 (del paso 1.6) a pPCR Script Cam SK+ (del paso 1.3) utilizando una ligadura de ADN T4 comercial de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
  8. Transforme las células DH5 , químicamente competentes, con el plásmido pSKAP ligado siguiendo el protocolo del fabricante (Tabla 1).
  9. Esparza los transformadores en placas de agar LB suplementadas con kanamicina de 50 g/ml e incubar a 37oC durante la noche.
  10. Escoge una colonia de la placa y arrehazla en una nueva placa de agar LB suplementada con kanamicina de 50 g/ml e incuba a 37oC durante la noche. Escoge una colonia de este plato y úsalo para inocular el caldo LB complementado con kanamicina de 50 g/ml. Incubar el cultivo durante la noche a 37oC con agitación constante.
  11. Utilice un kit de minipreparación de plásmido comercial para purificar el pSKAP del cultivo bacteriano nocturno.
  12. Realizar una digestión de restricción diagnóstica del plásmido del paso 1.11 utilizando Hind III y Bam HI de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Visualice fragmentos en un gel de agarosa del 1% como en los pasos 1.4-1.5.
    NOTA: El tamaño total de pSKAP debe ser de 4.703 bp. Los fragmentos después del paso 1.12 deben ser 3.370 y 1.333 bp.
  13. Diseñar imprimadores PCR para mutagénesis insercional dirigida por el sitio (SDM) (Tabla2 y S1) de manera que se inserte una secuencia de ADN única de 25 bases en la posición 725 de pSKAP (Figura2).
    NOTA: El ADN del código de barras se inserta en el plásmido justo fuera del gen de resistencia a la kanamicina flanqueada por FRT, por lo que el código de barras no se pierde durante la eliminación posterior del casete de resistencia a la kanamicina. Si genera nuevas secuencias de códigos de barras, utilice herramientas en línea para asegurarse de que las sondas PCR específicas de destino etiquetadas fluorescentmente (en lo sucesivo, simplemente denominadas "sondas") se enlazarán eficientemente a la nueva secuencia. Las secuencias de inserción diseñadas hasta la fecha, junto con los cebantes necesarios para crearlas, se proporcionan en las Tablas 2 y S1.
  14. Prepare las reacciones SDM utilizando una polimerasa deADN de alta fidelidad comercial, los pares de imprimación deseados (Tabla 2) y la plantilla pSKAP. Ajuste el termociclador para que realice lo siguiente: 1) 98 oC para 30 s, 2) 98 oC para 10 s, 56 oC durante 15 s, 72 oC durante 2 min, 3) repita los pasos 2, 24 veces, 4) 72 oC durante 5 min, 5) mantenga a 4 oC.
  15. Después de completar la PCR, agote la plantilla pSKAP añadiendo la enzima de restricción Dpn I a la reacción. Incubar a 37oC durante 20 min.
    NOTA: Los productos de PCR deben visualizarse en un gel de agarosa para verificar el tamaño y la pureza del producto. Se puede realizar y utilizar una digestión Dpn I de control que consiste en la plantilla pSKAP sin modificar en pasos posteriores para garantizar que el ADN de la plantilla esté completamente digerido.
  16. Utilice 5 l del producto a partir del paso 1.15 para transformar 100 l de células DH5TM químicamente competentes comercialmente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
  17. Esparza los transformadores en placas de agar LB suplementadas con 25 g/ml de cloramphenicol e incuban a 37oC durante la noche.
  18. Seleccione una colonia (o colonias) a partir de placas de pernoctación y fíjese sobre placas de agar LB individuales complementadas con 25 g/ml de cloramphenicol e incubar a 37 oC durante la noche. Seleccione una colonia a partir de placas durante la noche y úsela para inocular 5 ml de caldo LB complementado con 25 g/ml de cloramphenicol. Incubar cultivos durante la noche a 37oC con agitación constante.
  19. Utilice un kit de minipreparación de plásmido comercial para purificar los plásmidos de los cultivos nocturnos.
  20. Plásmidos purificados de secuencia de sanger utilizando la imprimación de secuenciación directa M13 (Tabla 2). Compare la región mutada con el plásmido original y evalúe la precisión de inserción del SDM.
  21. Después de confirmar la inserción y precisión del código de barras, asigne un nombre a cada código de barras y plásmido.
    NOTA: A los códigos de barras generados hasta la fecha se les ha asignado una designación de dos letras: AA, AB, AC, ..., BA, BB, BC, etc. Los plásmidos con código de barras se indican como pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC, ..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC, etc.
  22. Repita los pasos 1.14-1.21 para generar el número deseado de códigos de barras de ADN.

2. Introducir código de barras de ADN en el cromosoma de S. Typhimurium

NOTA: Inserción de códigos de barras de ADN en la S. El cromosoma Typhimurium se logra mediante el uso de un método de intercambio alélico descrito por Datsenko y Wanner14 que ha sido modificado para su uso en S. Typhimurium.

  1. Determinar el locus en la S. Genoma de Typhimurium en el que insertar el código de barras de ADN (Figura 3).
    NOTA: Seleccione una región grande e intergénica del cromosoma. Evite las regiones que producen ARN que no son codificantes. Este estudio utilizó un locus aguas abajo de la colocación P entre los residuos 1.213.840 y 1.213.861 (determinado a partir del ensamblaje del genoma GCA_000022165.1). Esta región ha sido previamente manipulada genéticamente para la complementación trans de genes15. Alternativamente, se podría introducir un código de barras de ADN al mismo tiempo que se interrumpe un gen de interés. Hacerlo requeriría alteraciones mínimas en este protocolo y agilizaría la creación de mutantes.
  2. Diseñe imprimadores PCR para amplificar el código de barras único y el gen de resistencia a la kanamicina flanqueado por FRT del plásmido pSKAP que contiene código de barras deseado del paso 1.21 (Tabla 2). Agregue extensiones de 40 nucleótidos que sean homólogas a la región seleccionada en el paso 2.1 hasta el extremo 5 de cada imprimación (Tabla 2).
  3. Realice la amplificación utilizando una polimerasa comercial de alta fidelidad, las imprimaciones del paso 2.2 y el plásmido que contiene código de barras pSKAP deseado como plantilla. Ajuste el termociclador para que realice lo siguiente: 1) 98 oC para 30 s, 2) 98 oC para 10 s, 3) 56 oC para 15 s, 4) 72 oC para 60 s, repita los pasos 2-4 29 veces, 5) 72 oC durante 5 min, 6) mantener a 4 oC.
  4. Después de completar la PCR, agote el ADN de la plantilla usando DpnI como se describe en el paso 1.15. Purificar y concentrar el ADN utilizando un kit comercial de limpieza de ADN de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
  5. Consulte el protocolo publicado anteriormente para generar mutantes en S. Variedad Typhimurium 14028s de productos PCR14,16,17,18.
    NOTA: No es esencial que el gen de resistencia a la kanamicina se exhala del cromosoma. Sin embargo, la escisión del gen es mínimamente perjudicial para el cromosoma bacteriano, ya que resulta en una cicatriz de 129 bp que dejaría los genes potenciales aguas abajo en el marco. Se recomienda que la cepa que contiene el gen de resistencia a la kanamicina se conserve, ya que se puede utilizar para mover códigos de barras entre cepas a través de la transducción mediada por P22.
  6. Repita los pasos 2.3 – 2.5 para crear las cepas deseadas con los códigos de barras adecuados.
    NOTA: Los códigos de barras se pueden introducir en el tipo salvaje S. Typhimurium que puede ser sometido a una mayor manipulación genética, o códigos de barras pueden ser introducidos en cepas que han sido alteradas genéticamente previamente.

3. Condiciones de crecimiento bacteriano y ensayos de competencia in vitro

  1. De las bacterias, la raya deseada S. Typhimurium tensa que cada uno alberga un código de barras de ADN único en las placas de agar LB. Incubar placas durante la noche a 37oC.
  2. Seleccione una sola colonia de cada cepa e inocular 5 ml de caldo LB. Incubar durante 20 h a 37oC con agitación constante.
    NOTA: Usando el cultivo nocturno, proceda al paso 3.5 para recoger ADN genómico puro (GDNA) de cada cepa con código de barras. Esto es necesario para los experimentos de validación y control posteriores en la sección 6.
  3. Para cada ensayo de competición, transfiera un volumen igual de cada cultivo nocturno a un tubo estéril de tamaño adecuado. Mezcle bien las cepas vórtinas vigorosamente durante al menos 5 s.
    NOTA: El volumen de cada cultivo nocturno que se va a transferir debe ser suficiente para cada condición y réplica, así como para aislar el ADNr para cuantificar la entrada. Si bien no es totalmente necesario medir las densidades ópticas de los cultivos porque el número absoluto de microorganismos de entrada se cuantificará utilizando PCR digital, el número de bacterias de entrada para cada cepa debe ser aproximadamente igual para evitar cuellos de botella o competencia desigual al principio del experimento. Los ensayos representativos de competencia en este protocolo compararon simultáneamente las tasas de crecimiento de 8 cepas. Pueden ser necesarias o menos cepas adicionales para diseños experimentales individuales.
  4. Transfiera 100 l del inóculo mezclado a un caldo LB estéril de 4,9 ml. Incubar a 37oC durante el tiempo deseado o a una densidad óptica deseada.
  5. Cosecha 500 l del inóculo por centrifugación a >12.000 x g durante 1 min. Retire y deseche el sobrenadante. Proceda inmediatamente a la sección 4 con las células.
  6. En los puntos de tiempo deseados, retire las alícuotas de 500 ol de las células de cultivo y cosecha por centrifugación a >12.000 x g durante 1 min. Retire y deseche el sobrenadante.
    NOTA: Si recoge alícuotas en múltiples puntos de tiempo, congele los pellets a -20 oC o proceda inmediatamente al paso 4.1 después de cada recolección.

4. Recogida y cuantificación de gDNA de S. Typhimurium (de los pasos 3.5 y 3.6)

  1. Cosecha el ADN gde de las células usando un kit comercial de purificación de ADNa. Si está disponible, realice el paso de agotamiento de ARN opcional.
    NOTA: El agotamiento del ARN no es necesario; sin embargo, la presencia de ARN aumentará artificialmente la concentración de ADN, lo que dará lugar a cálculos aberrantes en pasos posteriores. Si utiliza un kit comercial de purificación de ADNc, siga las recomendaciones del fabricante para asegurarse de que la columna no está sobrecargada con ADN. No se requiere una concentración mínima de ADN si la muestra es cuantificable en pasos posteriores.
  2. Utilice un espectrofotómetro para cuantificar el ADN en cada muestra.
    NOTA: El ADN se puede cuantificar utilizando cualquier método confiable.
  3. Calcular el número de copia de ADNg basado en el tamaño del genoma bacteriano utilizando la siguiente ecuación donde: X es la cantidad de ADN en ng y N es la longitud de una molécula de ADN de doble cadena (el tamaño del genoma).
    Equation 1
    NOTA: 660 g/mole se utiliza como la masa media de 1 ADN bp. Pueden existir pequeñas variaciones dependiendo de la composición de nucleótidos del organismo. Numerosas calculadoras están disponibles en línea para realizar el cálculo.

5. Imprima imprimadores y sondas para la detección cuantitativa de códigos de barras de ADN a través de dDigital PCR

  1. Diseñar imprimaciones para amplificar la región de códigos de barras de la S. Cromosoma Typhimurium aguas abajo de putP (Figura3C y Tabla 2).
    NOTA: Los diseños de imprimación y sonda pueden ser facilitados por numerosos programas en línea (Tablade Materiales). Si todos los códigos de barras se insertan en el mismo loci, un solo conjunto de imprimaciones de amplificación es universal para todos los códigos de barras.
  2. Diseñar sondas basadas en 6 carboxifluoresceínas (FAM) y/o hexaclorofluoresceína (HEX) específicas para cada código de barras (Tabla2 y S1).
    NOTA: El lector de gotas utilizado en este experimento es capaz de detectar sondas basadas en FAM y HEX simultáneamente en una reacción multiplex. Diseño 1/2 de las sondas para utilizar FAM y 1/2 para utilizar HEX. Este no es un paso necesario, pero reducirá el uso de reactivos y los costos experimentales si se implementa.
  3. Hacer mezclas maestras de imprimación-sonda 20x que contengan 1) 20 mM de cada imprimación de amplificación hacia adelante y hacia atrás, 2) 10 mM de una sola sonda FAM y 3) 10 mM de una sola sonda HEX (si se multiplexa).

6. Validar la sensibilidad y especificidad de cada conjunto de pprimer-sonda para cada código de barras genómico utilizando PCR digital

NOTA: Este protocolo utiliza la validación de ocho códigos de barras únicos con ocho sondas únicas como ejemplo. El número de códigos de barras utilizados se puede aumentar o disminuir para adaptarse a varios diseños experimentales.

  1. Cree un grupo de gDNA que contenga todos los códigos de barras excepto uno. Utilice esta piscina como diluyente para realizar una serie de dilución con adNM gDNA que contenga el único código de barras restante (el esquema de dilución de muestrase se proporciona en la Figura 4).
    NOTA: El uso de gDNA agrupado como diluyente garantiza un fondo consistente mientras se determina la sensibilidad. Usando los números de copia determinados en el paso 4.3, diluya el ADNr a un número de copia dentro del rango de PCR digital recomendado (1-100.000 copias por reacción de 20 l). Tenga en cuenta que el rango está establecido para cada objetivo único (código de barras), no el adNM total.
  2. Preparar las reacciones para pcR digital por duplicado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para el uso de una supermezcla digital de PCR diseñada para la química basada en sondas. Utilice las mezclas del paso 6.1 como ADN de plantilla. Utilice la mezcla maestra de imprimación-sonda 20x del paso 5.3 que contiene la sonda para el código de barras diluido en el paso 6.1.
  3. Preparar reacciones de control de réplica para PCR digital de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para el uso de una supermezcla pcR digital diseñada para la química basada en sondas. Las reacciones de control para cada mezcla de sonda deben consistir en 1) sin controles de plantilla (NT), 2) controles negativos y 3) controles positivos.
    NOTA: El número mínimo de reacciones de control de réplica es de dos. Este protocolo de ejemplo utiliza cuatro NTTM, seis controles negativos y seis controles positivos para cada código de barras. Los controles negativos deben contener gDNA con cada código de barras, excepto el código de barras correspondiente a la sonda que se está probando. Esto validará la especificidad de cada sonda.
  4. Repita los pasos 6.1-6.3 para crear reacciones de PCR digitales para cada muestra de ADNes gDNA con código. En la Figura 5se presenta una disposición de placa de muestra.
    NOTA: Este y los pasos subsiguientes se describen en función de una plataforma de PCR digital específica que utiliza gotas y tecnología basada en flujo. Las plataformas PCR digitales alternativas que utilizan tecnología basada en chips se pueden sustituir fácilmente con ligeras modificaciones a este protocolo. El paso 6.4 puede requerir más de una placa de 96 pocillos para validar todos los conjuntos de imprimación. A diferencia de qPCR, las placas separadas analizadas por la PCR digital se pueden comparar fácilmente sin necesidad de pozos de referencia estandarizados entre placas.
  5. Genere gotas para cada condición de reacción utilizando un generador de gotas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  6. Transfiera las gotas recién creadas a la placa de 96 pocillos apropiada. Utilice puntas de pipeta de 200 ml en una pipeta multicanal de 5-50 l.
    NOTA: Al pipetear gotas, pipetear lentamente y suavemente! El fabricante de equipos PCR digitales recomienda utilizar únicamente pipetas y puntas de pipeta de un fabricante en particular (por ejemplo, Ranin). Estas puntas de pipeta tienen una abertura suave sin fragmentos de plástico microscópicos que pueden destruir gotas o dañar los microfluidos del lector de gotas. Numerosas marcas de consejos fueron examinados y observados para tener un espectro de calidad de fabricación. Se han logrado resultados equivalentes utilizando alternativas de punta de pipeta; sin embargo, se debe tener precaución al desviarse de las recomendaciones del fabricante.
  7. Después de que todas las gotas se han generado y transferido, sellar la placa con un sellador de placa de papel de aluminio.
  8. Utilice el termociclador recomendado por el fabricante para realizar las siguientes condiciones de ciclo: 1) 94 oC durante 10 min; 2) 94 oC durante 1 min, velocidad de rampa establecida en 1 oC/s; 3) 55 oC durante 2 min, velocidad de rampa establecida en 1 oC/s; 4) repita los pasos 2 y 3 49 veces; 5) 98 oC durante 10 min; 6) sostener a 4oC hasta 24 h.
    NOTA: La transferencia térmica en una reacción de gotas no es lo mismo que la PCR estándar. Las condiciones de reacción pueden requerir modificaciones.
  9. Mientras se realiza el termocycling, programe el software de análisis de datos con la información de configuración de la placa, como el nombre de la muestra, el tipo de experimento (cuantificación absoluta), la supermezcla utilizada, el nombre de la meta 1 (nombre del código de barras FAM), el tipo de objetivo 1 (NTC, control positivo, control negativo, o desconocido), nombre de destino 2 (nombre del código de barras HEX), tipo de destino 2 (en blanco, control positivo, control negativo o desconocido). La información final de configuración de la placa se muestra en la Figura5.
  10. Una vez completado el termocycling, transfiera las reacciones completadas al lector de gotas e inicie el proceso de lectura de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

7. Cuantificar el número de bacterias en un experimento de índice competitivo

  1. Diluir el ADNr aislado y cuantificado de la sección 4 a una concentración adecuada como se ha descrito anteriormente.
  2. Preparar reacciones para PCR digital de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para el uso de la supermezcla adecuada. Utilice el ADN del paso 7.1 como plantilla. Utilice una mezcla maestra de imprimación-sonda 20x que contenga la sonda (o sondas si detecta FAM y HEX) para posibles códigos de barras presentes en el experimento.
  3. Prepare reacciones de PCR digitales adicionales como en el paso 7.2 utilizando diferentes mezclas maestras de imprimación-sonda 20x hasta que se puedan detectar todos los códigos de barras utilizados en el diseño experimental.
  4. Incluya controles para cada condición como se describe en 6.3. Esto incluye 1) sin controles de plantilla (NTC), 2) controles negativos y 3) controles positivos.
  5. Continúe con el protocolo como se describe en los pasos 6.5-6.10.

8. Analizar datos de PCR digitaly calcular números de copia absoluta

  1. Cuando todos los pozos se hayan leído y la ejecución se haya completado, abra el archivo de datos .qlp utilizando el software de análisis de datos.
    NOTA: Los tipos de archivos y los procedimientos de análisis de datos descritos aquí son específicos de un fabricante de PCR digital. Si se utilizan plataformas de PCR digitales alternativas, los tipos de archivos y los procedimientos de análisis de datos serán específicos de la plataforma utilizada y se realizarán de acuerdo con las especificaciones recomendadas por el fabricante.
  2. Seleccione todos los pozos que utilizan la misma mezcla maestra de imprimación-sonda.
  3. En la pestaña Droplets, examine el número de gotas analizadas en cada pozo (gotas positivas y negativas). Excluir del análisis cualquier pozo que tenga menos de 10.000 gotas totales.
  4. Vaya a la pestaña Amplitud 1D y examine las amplitudes de gotas positivas y negativas. Asegúrese de que comprenden dos poblaciones distintas.
  5. Dentro del software, utilice la característica de umbral para hacer un corte entre lasgotas positivas y negativas para cada sonda que se utilizó (Figura 6).
    NOTA: Todos los pozos que utilizan la misma mezcla maestra de imprimación-sonda del paso 5.3 deben tener los mismos umbrales.
  6. Una vez que se han aplicado los umbrales apropiados a todos los pozos, el software calculará el número de copias de ADN en cada reacción. Exporte datos a una hoja de cálculo para facilitar el análisis posterior.
    NOTA: El software de análisis de datos utiliza el número de gotas positivas y negativas que se ajustan a una distribución de Poisson para determinar el número de copia.
  7. Utilizando los valores del paso 8.6, calcule el número de copia inicial de cada código de barras genómico único en la muestra. Determinar la tasa media de falsopositivo de las reacciones de control negativas y restar este valor de los valores obtenidos en las reacciones experimentales. Multiplique los valores según sea necesario en función de las diluciones que se realizaron al configurar cada experimento (Tabla 3).

9. Determinar la aptitud relativa de un organismo calculando el CI o COI a partir de la cuantificación digital basada en PCR de las cepas de código de barras

  1. Calcular el CI de una cepa de código sin barras utilizando las siguientes fórmulas donde: Unasalida es la cuantificación absoluta de la cepa de código sin código en un momento dado, WTOutput es la cuantificación absoluta de bacterias de tipo salvaje con código de barras al mismo tiempo punto de tiempo, unaentrada es la cuantificación absoluta del inóculo de entrada de la cepa de código de barras, WTInput es la cuantificación absoluta del inóculo de entrada de bacterias de tipo salvaje con código de barras, XOutput es la suma de todas las cepas en el mismo punto de tiempo, XInput es la suma del inóculo de entrada total de todas las cepas con códigodeo.

Equation 2
Equation 3
NOTA: Consulte la discusión para conocer las ventajas, desventajas y el uso más adecuado de cada fórmula.

  1. Repita el paso 9.1 para cada cepa con códigos de barras en todos los puntos de tiempo.
  2. Si procede, calcule el COI utilizando las siguientes fórmulas donde: Unasalida es la cuantificación absoluta de una cepa de código de barras con gen mutado A en un momento dado, ABOutput es la cuantificación absoluta de una cepa de código de barras con genes mutados A y B al mismo punto de tiempo, AInput es la cuantificación absoluta del inóculo de entrada de la cepa de código de barras con el gen mutado A,ABInput es la cuantificación absoluta del inóculo de entrada de cepa de códigos de barras con genes mutados A y B, lasalida B es la cuantificación absoluta de una cepa de código de barras con gen mutado B en un momento dado, y laentrada B es la cuantificación absoluta de la entrada inóculo de la cepa de códigos de barras con el gen mutado B.

Equation 4
Y/O
Equation 5

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Representative Results

El uso de esta metodología requiere que se realicen las reacciones de control adecuadas para validar la sensibilidad y especificidad de cada sonda utilizada para identificar el ADN objetivo. En este experimento representativo, validamos ocho códigos de barras de ADN únicos con las ocho sondas correspondientes para su identificación. Las ocho sondas tenían una baja tasa de falsos positivos tanto en NTC como en reacciones de control negativas (Tabla3),destacando su especificidad incluso entre secuencias de ADN muy similares. Para evaluar la sensibilidad de cada condición, gDNA que contiene un código de barras único se diluyó en serie en un fondo constante de gDNA que contiene cada una de las siete secuencias de código de barras restantes. Con el enfoque descrito anteriormente, la PCR digital podría distinguir tan solo 2 copias de GDNA en un fondo de casi 2.000.000 de secuencias de ADN similares (Tabla3).

Además de determinar la sensibilidad y especificidad de cada sonda y secuencia de código de barras de ADN, las diluciones realizadas en el estudio de validación nos permitieron calcular un índice competitivo simulado a partir de los datos resultantes. Aunque no hubo una entrada o salida verdadera para este experimento, los datos se pueden analizar como si se hubiera realizado un experimento de competencia. Para ello, consideramos cada mezcla en la diluciónen serie como una salida (Salida A) para el código de barras diluido, mientras que la salida total (salida X ), entrada (entrada A ), y la entrada total (entrada X ) de cada cepa se calcula a partir de la cuantificación en los controles positivos donde se incluyen todos los códigos de barras. Utilizando el factor de dilución para cada mezcla, se determinó el CI teórico y se indica en el Cuadro3. En cada una de las series de dilución que se realizaron para cada código de barras, el CI simulado promedio se notifica junto con las desviaciones estándar para cada serie de dilución duplicada. En todos los casos, el CI simulado que se calculó es similar al CI teórico. La mayoría de los IC calculados se desvían de los SI teóricos en menos del 25%. En los casos de IF teóricos inferiores, la desviación del valor calculado fue superior a 2 veces. Por ejemplo, esto representó un cambio de un CI teórico de 0.000625 a un CI calculado de 0.001220. Estos datos destacan que el método descrito es a la vez altamente preciso y altamente preciso. La combinación de alta sensibilidad, especificidad, precisión y precisión permite que este sistema detecte de forma fiable diferencias en la aptitud que de otro modo podrían pasar desapercibidas.

Después de validar que los códigos de barras genómicos podrían ser detectados y cuantificados con precisión, realizamos experimentos de competencia in vitro (Tabla4). El primer experimento de competición utilizó ocho Sde tipo salvaje. Strains Typhimurium que contenían cada una un código de barras de ADN único. Cada cepa se cultiva durante la noche, y los ocho cultivos se mezclaron en cantidades iguales. Se utilizaron 100 ml de este inóculo mixto para inocular 4,9 ml de caldo lb estéril y el cultivo resultante se incubaba a 37 oC con agitación constante. gDNA se extraió del inóculo para calcular el insumo exacto de cada cepa. El crecimiento del cultivo se monitorizó midiendo la absorbancia a 600 nm (OD600). En OD600 a 0,5 (fase logarítmica), se recogió una muestra de cada cultivo y se extraía el ADNado g. El cultivo restante se devolvió a 37 oC con agitación constante hasta 8 horas después de la inoculación cuando se recogió una muestra final y se recolectó ADN g (estacionario). Los resultados se calcularon utilizando la fórmula de CI modificada para las infecciones agrupadas. Como era de esperar, todas las cepas de tipo salvaje tenían valores de CI casi iguales a 1 (Tabla 4). Un experimento de competencia similar se realizó usando ocho mutantes S. Cepas de Typhimurium que tenían códigos de barras únicos además de una deficiencia de una sola, doble o triple transketolasa18. Como se muestra anteriormente, todas las cepas crecieron de manera similar en caldo LB, con sólo un ligero retraso observado en la cepa con deficiencia de triple transketolasa. Sin embargo, cuando el crecimiento de cada cepa se evaluó mediante el análisis del CI, se observó un defecto mucho más profundo para la cepa con deficiencia de transketolasa (CI se comparó con las curvas de crecimiento en Shaw et al.18). Además, este experimento nos permitió asignar un valor cuantificable a las características de crecimiento de cada cepa en lugar de simplemente describir cualitativamente los patrones de crecimiento. Los C para cada cepa se calcularon utilizando tanto la fórmula tradicional donde cada cepa se comparó sólo con el tipo salvaje como la fórmula modificada donde se consideraron todas las cepas de entrada. Si bien los cambios fueron pequeños, el IC de la cepa con deficiencia de triple transketolasa fue artificialmente bajo en la fórmula tradicional porque no tiene en cuenta las otras seis cepas competidoras que todas exhibieron una aptitud casi salvaje.

Cepas Genotipo Fuente o referencia
S. Typhimurium ATCC 14028s tipo salvaje Atcc
TT22236 LT2 Salmonella que transporta pTP2223 (27)
DH5 F– 80lacZ-M15 (lacZYA-argF)U169 recA1 extremoA1 hsdR17(rK–, mK+) phoA supE44 o– thi-1 gyrA96 relA1 (28)
JAS18077 putP::AA::FRT Este estudio
JAS18080 putP::AD::FRT Este estudio
JAS18083 putP::AG::FRT Este estudio
JAS18088 putP::AL::FRT Este estudio
JAS18091 putP::AO::FRT Este estudio
JAS18096 putP::AT::FRT Este estudio
JAS18099 putP::AW::FRT Este estudio
JAS18100 putP::AX::FRT Este estudio
JAS18122 •tktA::FRT putP::AD::FRT Este estudio
JAS18130 •tktB::FRT putP::AL::FRT Este estudio
JAS18138 •tktC::FRT putP::AT::FRT Este estudio
JAS18125 •tktA::FRT átktB::FRT putP::AG::FRT Este estudio
JAS18133 •tktA::FRT átktC::FRT putP::AO::FRT Este estudio
JAS18141 •tktB::FRT átktC::FRT putP::AW::FRT Este estudio
JAS18142 •tktA::FRT átktB::FRT átktC::FRT putP::AX::FRT Este estudio
Plásmidos
pKD13 bla FRT ahp FRT PS1 PS4 oriR6K (14)
pPCR Script Cam SK+ ColE1 ori; CmR Stratagene/Aligent
pTP2223 Plac lam apuesta exo tetR (16)
pCP20 bla cat cI857 PRflp pSC101 oriTS (29)
pSKAP ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT Este estudio
pSKAP_AA ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AA Este estudio
pSKAP_AD ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AD Este estudio
pSKAP_AG ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AG Este estudio
pSKAP_AL ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AL Este estudio
pSKAP_AO ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AO Este estudio
pSKAP_AT ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; EN Este estudio
pSKAP_AW ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AW Este estudio
pSKAP_AX ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AX Este estudio

Tabla 1: Cepas y plásmidos utilizados en este estudio.

Nombre Secuencia (5' - 3')1,2,3
pSKAP SDM AA - F AGAAGTCTCCTGCTGGTGCTTGAGT CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AA - R ACTCAAGCACCAGCAGGAGACTTCT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AD - F AAGAGCACGGTGAGGTGATAGTAGG CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AD - R CCTACTATCACCTCACCGTGCTCTT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AG - F AGTAGTGTCCTGGAGGAGCATGTGA CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AG - R TCACATGCTCCTCCAGGACACTACT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AL - F ACCACACATCGAAGGCACCT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AL - R AGAGCTAGTGCCTTCGATGTGGT CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AO - F GTCCACAACCACACTCAGTGATACT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AO - R AGTATCACTGAGTGTGGTTGTGGAC CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AT - F ACCAGTGTCCGTAGACATGGCTAGAC CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AT - R GTCTAGCCATGTCACGGACACTGGTG CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AW - F ACGACTGAGTGATGTATGTGACGACG CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AW - R CGTCACATCCACATCACTCAGTCGT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AX - F ACTATCGTGGTAACGACAGGCTG CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AX - R CAGCCTGTCGTTACACCACGATAGT CTCAAGACGTGTAATGCTG
M13 - F GTAAAACGACGGCCAG
putP Recombinación - F TAGCGATGGGAGAGAGACGACGTTAATTCCATTTTAA
TGCAGCATTACACGTC
putP Recombinación - R TACTGCGGGTATTAATGCTGAAAACatCCATAACCCATTGG
CCTGCAGTTCGAAGTTCC
qPCR Código de barras Región Amplificar - F1 TGCAGCATTACACGTCTTG
qPCR Código de barras Región Amplificar - R2 TAGGAACTTCGAAGCAGC
Sonda AA de código de barras - FAM 6-FAM/AGAAGTCTC/ZEN/CTGCTGGTGCTTGAGTC/IBFQ
Sonda de código de barras AD - FAM 6-FAM/AAGAGCACG/ZEN/GTGAGGTGATAGTAGGC/IBFQ
Sonda Dered- FAM 6-FAM/AGTAGTGTC/ZEN/CTGGAGGAGCATGTGAC/IBFQ
Sonda de código de barras AL - FAM 6-FAM/AGAGCTAGT/ZEN/GCCTTCGATGTAGGG/IBFQ
Sonda AO de código de barras - HEX HEX/AGTATCACT/ZEN/GAGTGTGGTTGTGGACC/IBFQ
Sonda de código de barras en - HEX HEX/ACCAGTGTC/ZEN/CGTGACATGGCTAGACC/IBFQ
Sonda de código de barras AW - HEX HEX/ACGACTGAG/ZEN/TGATGTGGATGTGACGC/IBFQ
Sonda AX de código de barras - HEX HEX/ACTATCGTG/ZEN/GTGTAACGACAGGCTGC/IBFQ
1 Los nucleótidos subrayados indican secuencias complementarias para cada código de barras de ADN que se inserta en pSKAP después de SDM.
2 Los nucleótidos subrayados dobles indican una región complementaria en la S. Cromosoma Typhimurium utilizado para el reemplazo alélico.
3 Las sondas qPCR PrimeTime son oligos de hibridación etiquetados con un tinte fluorescente de 5', ya sea 6-carboxifluoresceína (6-FAM) o hexaclorofluoresceína (HEX), un quencher interno (ZEN), y el quencer de 3' Iowa Black® FQ (IBFQ).

Tabla 2: Imprimaciones y sondas utilizadas en este estudio.

Cuantificación (copias/reacción de 20 L)
Descripción AA Anuncio Ag AL Ao En Aw Ax
Ntc N/A 0.000 0.000 3.510 N/A 0.000 0.000 0.000
Ntc 3.600 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Ntc 3.510 0.000 1.280 1.180 2.340 0.000 0.000 0.000
Ntc 2.290 0.000 0.000 1.200 1.150 1.160 0.000 0.000
Decir 3.133 0.000 0.320 1.473 1.163 0.290 0.000 0.000
Negativo 5.130 1.156 0.000 1.124 3.745 1.281 7.354 7.142
Negativo 5.270 0.000 0.000 1.087 1.666 1.643 7.746 2.269
Negativo 2.660 0.000 1.361 1.451 8.974 0.000 N/A 0.000
Negativo 6.090 0.000 0.000 2.251 0.000 2.531 8.700 3.495
Negativo 1.740 0.000 1.086 2.130 4.171 0.000 7.113 5.522
Negativo 6.220 3.581 0.000 4.022 1.175 1.341 N/A 5.950
Decir 4.518 0.789 0.408 2.011 3.288 1.133 7.728 4.063
Positivo 22281.540 42673.039 46442.242 45359.180 47885.625 15708.027 45325.906 20810.559
Positivo 23989.676 44625.523 47356.438 45790.660 47456.973 15096.601 47929.840 22455.234
Positivo 17846.824 38980.133 45633.809 44174.820 33875.039 15156.063 42536.270 21467.840
Positivo 21047.588 40140.848 41672.648 46028.496 47426.527 16718.000 46978.664 19876.473
Positivo 20218.238 44660.602 41718.707 45799.375 46495.602 14590.264 54741.023 22011.938
Positivo 18531.740 41620.801 N/A 48082.313 35645.199 15341.382 48950.992 21117.559
Decir 20652.601 42116.824 44564.769 45872.474 43130.827 15435.056 47743.783 21289.934
Resta en blanco 20648.083 42116.035 44564.361 45870.463 43127.539 15433.923 47736.054 21285.871
A sin diluir 23024.961 44448.875 58897.510 51120.948 55450.191 18155.305 62844.068 27567.828
B sin diluir 18278.174 35252.586 54409.510 66022.396 43101.148 15732.609 60761.328 26581.979
1/50 A 521.670 755.035 1066.898 1287.187 1053.339 181.324 1278.336 580.961
1/50 B 435.326 634.215 1168.087 1383.537 991.040 165.443 1180.445 596.461
1/100 A 228.028 598.848 603.911 631.116 507.956 258.405 665.647 331.590
1/100 B 256.330 585.834 583.325 670.875 459.325 289.207 638.916 307.948
1/200 A 121.283 305.293 258.247 346.965 234.774 114.163 169.055 172.553
1/200 B 114.638 313.040 253.685 297.216 191.637 179.895 280.989 147.297
1/400 A 42.829 141.343 127.337 163.605 N/A 71.241 157.697 85.976
1/400 B 59.544 180.543 162.080 162.108 115.508 104.682 151.141 87.804
1/800 A 34.304 67.934 65.939 83.857 66.134 31.784 82.722 45.616
1/800 B 20.390 80.222 81.453 85.325 53.102 38.034 55.460 29.660
1/1600 A 15.405 44.505 47.672 39.613 33.027 18.006 37.655 20.988
1/1600 B 22.091 48.828 46.781 37.388 30.245 30.138 34.553 19.795
1/3200 A 12.333 22.104 16.850 18.403 11.460 10.535 21.245 9.218
1/3200 B 6.796 32.555 15.742 26.249 15.111 9.908 23.393 10.175
Resta en blanco
A sin diluir 23020.443 44448.086 58897.103 51118.937 55446.903 18154.172 62836.339 27563.765
B sin diluir 18273.655 35251.797 54409.103 66020.385 43097.860 15731.477 60753.600 26577.916
1/50 A 517.152 754.246 1066.490 1285.176 1050.051 180.192 1270.607 576.898
1/50 B 430.808 633.426 1167.679 1381.526 987.751 164.311 1172.717 592.398
1/100 A 223.509 598.059 603.503 629.105 504.668 257.272 657.918 327.527
1/100 B 251.812 585.044 582.918 668.864 456.036 288.074 631.187 303.885
1/200 A 116.765 304.503 257.840 344.954 231.486 113.030 161.327 168.490
1/200 B 110.120 312.251 253.277 295.205 188.348 178.762 273.261 143.234
1/400 A 38.310 140.554 126.929 161.594 N/A 70.108 149.968 81.913
1/400 B 55.026 179.753 161.672 160.097 112.219 103.549 143.413 83.741
1/800 A 29.786 67.145 65.531 81.847 62.846 30.651 74.994 41.553
1/800 B 15.872 79.433 81.045 83.314 49.813 36.901 47.732 25.596
1/1600 A 10.886 43.716 47.264 37.602 29.739 16.874 29.927 16.925
1/1600 B 17.573 48.039 46.373 35.377 26.957 29.005 26.825 15.732
1/3200 A 7.815 21.314 16.442 16.392 8.172 9.402 13.517 5.155
1/3200 B 2.278 31.765 15.334 24.238 11.822 8.776 15.664 6.112
CI simulado
A sin diluir 1.114895 1.055372 1.321619 1.114419 1.285650 1.176251 1.316329 1.294932
B sin diluir 0.885005 0.837016 1.220911 1.439279 0.999312 1.019279 1.272698 1.248618
1/50 A 0.025046 0.017909 0.023931 0.028018 0.024348 0.011675 0.026617 0.027102
1/50 B 0.020864 0.015040 0.026202 0.030118 0.022903 0.010646 0.024567 0.027831
1/100 A 0.010825 0.014200 0.013542 0.013715 0.011702 0.016669 0.013782 0.015387
1/100 B 0.012195 0.013891 0.013080 0.014582 0.010574 0.018665 0.013222 0.014276
1/200 A 0.005655 0.007230 0.005786 0.007520 0.005367 0.007323 0.003380 0.007916
1/200 B 0.005333 0.007414 0.005683 0.006436 0.004367 0.011582 0.005724 0.006729
1/400 A 0.001855 0.003337 0.002848 0.003523 N/A 0.004542 0.003142 0.003848
1/400 B 0.002665 0.004268 0.003628 0.003490 0.002602 0.006709 0.003004 0.003934
1/800 A 0.001443 0.001594 0.001470 0.001784 0.001457 0.001986 0.001571 0.001952
1/800 B 0.000769 0.001886 0.001819 0.001816 0.001155 0.002391 0.001000 0.001203
1/1.600 A 0.000527 0.001038 0.001061 0.000820 0.000690 0.001093 0.000627 0.000795
1/1.600 B 0.000851 0.001141 0.001041 0.000771 0.000625 0.001879 0.000562 0.000739
1/3,200 A 0.000378 0.000506 0.000369 0.000357 0.000189 0.000609 0.000283 0.000242
1/3,200 B 0.000110 0.000754 0.000344 0.000528 0.000274 0.000569 0.000328 0.000287
CI promedio (teórico)
Sin diluir (1) 0.999950 0.946194 1.271265 1.276849 1.142481 1.097765 1.294514 1.271775
1/50 (0,02) 0.022955 0.016474 0.025067 0.029068 0.023625 0.011161 0.025592 0.027466
1/100 (0.01) 0.011510 0.014046 0.013311 0.014148 0.011138 0.017667 0.013502 0.014832
1/200 (0.005) 0.005494 0.007322 0.005735 0.006978 0.004867 0.009453 0.004552 0.007322
1/400 (0.0025) 0.002260 0.003803 0.003238 0.003507 0.00260* 0.005626 0.003073 0.003891
1/800 (0.00125) 0.001106 0.001740 0.001645 0.001800 0.001306 0.002188 0.001285 0.001577
1/1.600 (0.000625) 0.000689 0.001089 0.001051 0.000795 0.000657 0.001486 0.000594 0.000767
1/3,200 (0.000313) 0.000244 0.000630 0.000357 0.000443 0.000232 0.000589 0.000306 0.000265
Desviación estándar
Sin diluir 0.11494 0.10918 0.05035 0.16243 0.14317 0.07849 0.02182 0.02316
1/50 0.00209 0.00143 0.00114 0.00105 0.00072 0.00051 0.00103 0.00036
1/100 0.00069 0.00015 0.00023 0.00043 0.00056 0.00100 0.00028 0.00056
1/200 0.00016 0.00009 0.00005 0.00054 0.00050 0.00213 0.00117 0.00059
1/400 0.00040 0.00047 0.00039 0.00002 0* 0.00108 0.00007 0.00004
1/800 0.00034 0.00015 0.00017 0.00002 0.00015 0.00020 0.00029 0.00037
1/1.600 0.00016 0.00005 0.00001 0.00002 0.00003 0.00039 0.00003 0.00003
1/3,200 0.00013 0.00012 0.00001 0.00009 0.00004 0.00002 0.00002 0.00002
*Representa los resultados de un solo experimento.

Tabla 3: Cuantificación absoluta y cálculo de CI simulado.

Condición Indice Competitivo1
Experimento 1
WTAA ANUNCIO WT WTAG WTAL WTAO WTAT WTAW WTAX
Logarítmica 0.927 a 0,033 0,992 a 0,031 1.068 a 0,025 0,921 a 0,02 1.044 a 0,03 1.051 a 0,057 1.094 a 0.027 0.929 a 0,005
Estacionario 1,1 a 0,021 1.071 a 0,053 1.079 a 0,065 0,948 a 0,02 0,98 a 0,02 0,873 a 0,044 0,97 a 0,056 1.021 a 0,007
Experimento 2
CI (tradicional) WTAA AAD •BAL • CAT ABAG • ACAO AW de BC ABCAX
Logarítmica 1 a 0 0,802 a 0,084 0,957 a 0,02 0,989 a 0,073 0,581 a 0,153 0,86 a 0,053 0,995 a 0,011 0,695 a 0,061
Estacionario 1 a 0 0,97 a 0,063 1.043 a 0,058 0,99 a 0,036 1.625 a 0,589 0,835 a 0,051 0,912 a 0,047 0,477 a 0,049
CI (Inóculo ensallado)
Logarítmica 1.114 a 0,039 0,864 a 0,074 1.073 a 0,032 1,1 a 0,068 0,633 a 0,152 0,938 a 0,056 1.111 a 0,043 0,746 a 0,06
Estacionario 1.078 a 0,039 1.039 a 0,049 1.166 a 0,093 1.066 a 0,01 1.735 a 0,613 0,876 a 0,035 0,97 a 0,045 0,49 a 0,047
1 Los valores representan la media de CI: desviación estándar para tres o cuatro experimentos de réplica.

Cuadro 4: Resultados representativos de la competencia in vitro entre S. Strains Typhimurium.

Cuadro S1. Imprimaciones opcionales para crear secuencias de códigos de barras adicionales y las sondas fluorescentes correspondientes para su detección. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figure 1
Figura 1. Generación de pSKAP. (A) PKD13 purificado fue sometido a digestión de restricción con HindIII y BamHI. (B, C) Se purificó el fragmento de 1.333 bp de interés que contiene un gen de resistencia a la kanamicina flanqueado por FRT. (D) pPCR Script Cam SK+ también se digiere con HindIII y BamHI y el fragmento de pKD13 (B) se bloqueó para generar (E) pSKAP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Mutagénesis dirigida por el sitio de inserción a pSKAP. (A) La inserción de códigos de barras de ADN de 25 bp en la posición 725 se realizó utilizando PCR. Las imprimaciones delanteras y inversas específicas para esa ubicación fueron diseñadas con extensiones complementarias de 25 nucleótidos 5' (denotadas en la imprimación como "a" minúsculas). (B) Se muestra un plásmido genérico pSKAP_Barcode resultante de SDM con la ubicación del código de barras de ADN insertado resaltado en naranja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Reorganización cromosómica aguas abajo de putP. (A) Después de la recombinación mediada por el rojo, el gen de resistencia a la kanamicina seleccionable (púrpura oscuro) flanqueado por sitios FRT (gris) se inserta en el cromosoma entre los loci indicados (Sitio de Recombinación Cromosómica, rojo). El código de barras de ADN único (naranja) se inserta justo fuera del sitio de FRT. (B) El gen de resistencia a la kanamicina se elimina mediante escisión mediada por FRT, dejando un remanente de ADN insertado en el cromosoma (ADN insertado total, azul) que consiste en el código de barras de ADN y una cicatriz FRT. (C) Se muestra la secuencia de ADN cromosómico modificada que rodea el ADN insertado, junto con los sitios de cebado de amplificación (púrpura claro) utilizados para la PCR digital. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Esquema de dilución para validar la sensibilidad y especificidad de la sonda fluorescente. (A) El ADN g purificado de siete cepas con códigos de barras se mezcla en cantidades iguales para crear el diluyente para diluir el gDNA con código omitido (AX en el ejemplo anterior). (B) Realice una dilución en serie del gDNA con código de barras omitido (AX en el ejemplo anterior) utilizando el diluyente preparado descrito anteriormente. Mezcle a fondo el contenido de cada tubo antes de transferirlo al siguiente tubo. La Figura 4 se creó con BioRender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Diseño de placas para analizar la sensibilidad y especificidad de los conjuntos de imprimación-sonda 1 y 2. El experimento de PCR digital incluye NTPC, controles positivos, controles negativos y los esquemas de dilución para cada uno de los códigos de barras probados. La placa para validar los conjuntos de imprimación 3 y 4 se presenta en el mismo patrón utilizando el gDNA con código de barras adecuado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Resultados representativos de PCR digitales de gDNA con código sin código AA diluido. gDNA que contiene el código de barras AA se diluyó en un fondo de todos los demás gDNA con código de barras como se describe en la Figura4. El canal 1 representa la sonda FAM para el código de barras AA (paneles superiores) mientras que el canal 2 representa la sonda HEX para el código de barras AO (paneles inferiores). Los resultados de cada sonda se presentan como una amplitud fluorescente de gotas individuales (paneles izquierdos) y un histograma que representa la frecuencia de intensidad fluorescente de todas las gotas en los pozos seleccionados (paneles derecho). Para cada condición, las gotas positivas (alta fluorescencia) y negativas (baja fluorescencia) deben formar dos poblaciones distintas. En el caso de AA que se diluyó, y la mayoría de las gotas fueron negativas, el histograma (panel superior derecho) parece representar sólo una sola población. Esto se debe a que las gotas positivas son sustancialmente superadas por gotas negativas; sin embargo, dos poblaciones distintas todavía son visibles examinando la amplitud fluorescente de las gotas en los paneles izquierdos.  Las poblaciones deben separarse utilizando la función de umbral para definir gotas positivas y negativas (visualizadas por la línea rosa). Los valores de umbral variarán dependiendo de los sondeos que se utilizaron, pero todos los pozos que utilizan la misma mezcla de sondeos deben tener umbrales idénticos. A medida que el ADNa con código de barras AA se diluyó, hay una disminución en las gotas positivas (alta fluorescente), mientras que el número de gotas AO positivas permanece constante en el fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La capacidad de cuantificar con precisión los microorganismos es de suma importancia para la investigación de microbiología, y la capacidad de enumerar cepas únicas de una población mixta inicial ha demostrado ser una herramienta invaluable para evaluar los rasgos de aptitud y virulencia en gérmenes. Sin embargo, las técnicas para lograrlo no han progresado en el ritmo de los desarrollos modernos en biología molecular. La tecnología para modificar fácilmente los cromosomas de muchas bacterias, incluyendo S. Typhimurium, ha estado disponible durante casi dos décadas14, sin embargo, esta capacidad rara vez se ha utilizado para cepas de etiquetado molecular con secuencias de ADN únicas. Al explotar la capacidad de crear cepas fácilmente identificables basadas en códigos de barras de ADN únicos y mínimamente disruptivos insertados en el cromosoma bacteriano, junto con la tecnología más avanzada para detectar y cuantificar estos identificadores moleculares ( es decir, PCR digital), hemos creado un sistema que proporciona exquisita sensibilidad, especificidad, precisión y precisión para cuantificar fácilmente las cepas individuales dentro de una población diversa de bacterias.

El cálculo de los CI y los COI como se describió anteriormente se basa en la capacidad de realizar con precisión las modificaciones adecuadas a los cromosomas bacterianos. Todas las modificaciones deben ser verificadas por la secuenciación de Sanger para asegurarse de que no se produjeron mutaciones aleatorias. El uso de una polimerasa de alta fidelidad minimizará estos errores, pero cualquier mutación que ocurra perjudicará la capacidad de detectar la tensión, que es otro aspecto crítico de este protocolo. Aunque hemos demostrado que la PCR digital puede detectar tan solo dos copias de ADN g en un fondo de casi 2 millones, las cepas fuera de este rango pueden requerir diluciones adicionales para su cuantificación precisa. Además, las secuencias de códigos de barras de ADN deben diseñarse para facilitar el uso de secuencias de sonda de alta calidad. Las secuencias de sondas deben ser analizadas para las tendencias a la autodimeriza, formar horquillas o unir ineficazmente sus objetivos. La importancia de utilizar secuencias de calidad y sondeos no se puede minimalizar, un hecho que se evidencia en los experimentos de validación cuidadosos que se deben realizar con cada sonda. Los esfuerzos para crear códigos de barras de ADN óptimos crearán resultados óptimos de cuantificación de PCR digital.

Si bien las etiquetas moleculares cuidadosamente diseñadas son importantes para obtener resultados de calidad, la interpretación de los resultados es otro aspecto crítico de este protocolo. El CI se define como la relación entre la cepa mutante y la cepa detipo salvaje en la salida dividida por la relación de las dos cepas en la entrada 1,19,20. Este CI tradicional presentado en la sección 9 es útil cuando la infección mixta consiste en una sola cepa frente a tipo salvaje. Sin embargo, cuando se utilizan grandes piscinas de cepas para inocular medios o animales, las cepas no sólo compiten contra el tipo salvaje, sino también contra cualquier otra cepa presente en el inóculo. Estudios previos que realizaron experimentos de competencia utilizando múltiples cepas infectantes no han tenido esto en cuenta en sus cálculos7,13. Para tener en cuenta esta característica de las infecciones mixtas, hemos introducido una fórmula para calcular los iC que se ha modificado para las infecciones agrupadas. Es poco probable que todas las cepas proporcionen el mismo nivel de competencia que una cepa de tipo salvaje. Sin embargo, debido a que la mayoría de los genes bacterianos tienen poco impacto en la virulencia, a medida que aumenta el número de cepas utilizadas en el experimento de índice competitivo, aumenta la probabilidad de que la virulencia general tienda hacia la tensión de tipo salvaje. Esto puede no ser necesariamente el caso para ciertos diseños experimentales utilizando piscinas de muchas cepas, todas con defectos de virulencia conocidos. Sin embargo, esto se tiene en cuenta en la ecuación modificada porque las cepas menos abundantes (menos ajuste) en el resultado tendrán un efecto menor en lasalidaX. Dependiendo del diseño experimental específico, puede haber casos en los que se prefiera una u otra fórmula. En la mayoría de los casos que implican infecciones agrupadas, sin embargo, es importante tener en cuenta que en una infección mixta, todas las cepas compiten entre sí, no sólo contra el tipo salvaje. Al analizar los resultados, es fundamental que la razón detrás de cada fórmula sea bien entendida para hacer las interpretaciones más precisas de la aptitud de la cepa. Al notificar los resultados, es igualmente importante revelar con precisión cómo se analizaron los datos.

La sección 9 del protocolo también incluye fórmulas para ayudar a determinar las interacciones genéticas mediante un COI. Con este análisis, se pueden hacer predicciones para determinar si dos genes de virulencia funcionan de forma independiente o conjunta. COI se define como la relación entre la cepa mutante doble y la cepa mutante única en la salida dividida por la relación de las dos cepas en la entrada1. La fórmula está diseñada para detectar la aditividad fenotípica de las alteraciones genéticas. Si los genes funcionan de forma independiente para mejorar la virulencia, una interrupción de ambos genes debería causar una mayor disminución de la aptitud en comparación con una sola interrupción de cualquiera de los genes. Si los genes funcionan juntos para mejorar la virulencia (como los genes que codifican dos enzimas en una vía), una interrupción de cualquiera de los genes debe tener el mismo efecto sobre la virulencia que la alteración de ambos genes. Detectar la aditividad fenotípica puede ser difícil en casos en los que el nivel de atenuación causada por un solo gen es muy alto o muy bajo. Sin embargo, la comparación directa de cepas dentro del mismo sistema animal proporciona menos variabilidad y una cuenta más confiable de la relación funcional entre genes, y este cálculo se puede realizar a partir de dos cepas dentro de una población mixta más grande.

Un aspecto crítico final para interpretar los resultados es considerar los efectos de la dinámica de la población. En algunas infecciones mixtas que tienen múltiples cepas, una sola cepa puede surgir como más dominante o menos en forma debido a la deriva de la población aleatoria. Este fenómeno se puede amplificar cuando se producen eventos de cuello de botella. Esto puede ser causado por el uso de un gran número de cepas de entrada, un número muy pequeño de bacterias totales en el inóculo, o una combinación de ambos. Otro aspecto interferente que surge de las infecciones mixtas es la posibilidad de en la complementación trans. Esto ocurre cuando una cepa de ajuste, como el tipo salvaje, mejora artificialmente la virulencia de una cepa menos adecuada. Un ejemplo hipotético de esto sería comparar la aptitud de una S. Typhimurium Pathogenicity Island 2 (SPI2)-knockout cepa co-infectada con una cepa de tipo salvaje. SPI2 habilita S. Typhimurium para sobrevivir intracelularmente mediante la secretación de efectos en el citosol del huésped que modifican el fagosoma dentro de un macrófago. La interrupción de este sistema hace S. Typhimurium susceptible a la matanza intracelular. Sin embargo, debido a que los macrófagos son capaces de envolver dos o más bacterias a la vez, el SPI2-knockout podría recibir un aumento considerable en la aptitud si reside en el mismo macrófago que un tiposalvaje S.  Typhimurium que está secretando a los efectos en el citosol anfitrión. La dinámica aleatoria de la población y la posibilidad de complementar se trata de una limitación de cualquier experimento de competencia. Si se sospecha de complementación trans, los fenotipos deben confirmarse utilizando otros métodos complementarios para evaluar la aptitud. Para superar la dinámica de población aleatoria, aumentar el número de experimentos de réplica aumenta la probabilidad de identificar valores atípicos en los resultados. Afortunadamente, el protocolo descrito anteriormente facilita la realización de un mayor número de experimentos de réplica idénticos porque el número de condiciones experimentales se reduce drásticamente.

Un elemento clave de la técnica de CI descrita anteriormente es su capacidad para adaptarse a casi cualquier organismo y a cualquier diseño experimental que requiera una cuantificación precisa de los microorganismos. Sin embargo, requiere la manipulación genética de un organismo para incorporar una secuencia de ADN única en el cromosoma. La adaptabilidad de la técnica requiere que la especie sea genéticamente maleable y se basará en la generación de protocolos alternativos para modificar el genoma (pasos 1 y 2). Los códigos de barras de ADN enumerados en las Tablas 2 y S1 deben ser suficientes para la mayoría de las bacterias; sin embargo, como en todos los experimentos cuantitativos de PCR, es pertinente analizar el genoma bacteriano para garantizar un potencial mínimo de unión fuera del objetivo de imprimaciones y sondas mediante un simple análisis BLAST. Las secuencias de códigos de barras de ADN utilizadas en este estudio difieren en sólo 3-4 bases en algunos casos, destacando la exquisita especificidad de las sondas que minimiza el potencial de unión inespecífica. Independientemente de la especificidad de las sondas fluorescentes, todas las nuevas secuencias de códigos de barras deben validarse adecuadamente para la sensibilidad y especificidad como se describe en el paso 6. Después de crear cepas con códigos de barras, es posible adaptar este protocolo a muchos tipos de experimentos además de ensayos de competencia in vitro como se describió anteriormente. Las cepas son adecuadas para ensayos de competición in vivo en ratones u otros sistemas de modelos animales. Sólo se requieren modificaciones mínimas para extraer el ADN de los órganos y tejidos animales, y estas modificaciones son bien descritas por los fabricantes de kits para tales fines. Además, grandes grupos de infecciones mixtas parala competencia in vivo se han utilizado con éxito anteriormente 7, ofreciendo el potencial de reducir el número de animales necesarios para un solo experimento, que no sólo disminuye los costos de esos experimentos pero también disminuye el potencial de variabilidad de animales a animales. Del mismo modo, las cepas con código de barras podrían utilizarse en otros ensayos in vitro que examinan la susceptibilidad de cepas a diversas condiciones de tratamiento (por ejemplo, antibióticos, susceptibilidad ácida, matanza por especies reactivas de oxígeno o nitrógeno, etc.). Para estos experimentos, la evaluación de la inhibición del crecimiento podría lograrse añadiendo el producto químico deseado al medio de crecimiento en el paso 3.4 y procediendo como se describe. Para evaluar la muerte bacteriana, se podría mezclar un gran grupo de cepas y cuantificar la entrada como se describió anteriormente. Después de la exposición al tratamiento deseado, las células vivas podrían cuantificarse selectivamente acoplando el procedimiento de cuantificación digital de PCR con Viability PCR para diferenciar entre células vivas y muertas21,22,23 , 24 , 25 , 26. El rendimiento de estos experimentos aumentaría drásticamente porque las diluciones y las placas de réplica para cada cepa se sustituyen por técnicas moleculares más optimizadas. Por último, aunque el análisis de la biología evolutiva y la genética de la población está fuera del alcance de este documento, los organismos con códigos de barras son altamente adaptables para tales estudios.  En última instancia, el propósito de este protocolo era desarrollar una técnica poderosa para cuantificar bacterias que es altamente adaptable para su uso en muchas especies diversas y en muchos tipos de experimentos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Fondo de Investigación de la Facultad del Presidente George F. Haddix y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número de premio GM103427. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 22600028 Procure from any manufacturer
16 mL culture tubes MidSci 8599 Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tips RAININ 30389241 Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipette RAININ 17013804 Use alternative multichannel pipettes with caution
Agarose ThermoFisher Scientific BP160-500 Procure from any manufacturer
BLAST Analysis NCBI N/A https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module Bio Rad 1851197 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5α Invitrogen 18258012 Procure from any manufacturer or prepare yourself
Chloramphenicol ThermoFisher Scientific BP904-100 Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate reader BioTek CYT5MF Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) Bio Rad N/A Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well Plates Bio Rad 12001925 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader Oil Bio Rad 1863004 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Bio Rad 1863024 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1864008 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1863009 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for Probes Bio Rad 1863005 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Kanamycin ThermoFisher Scientific BP906-5 Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agar ThermoFisher Scientific BP1425-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani broth ThermoFisher Scientific BP1426-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio Rad 1814040 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR Tubes Eppendorf 951010022 Procure from any manufacturer
Petri dishes ThermoFisher Scientific FB0875712 Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+ Stratagene/Agilent 211192 No longer available commercially
Primer/Probe Design IDT N/A https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_Barcodes Addgene Plasmid numbers 122702-122726 www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer Bio Rad 1814000 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Generator Bio Rad 1864002 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Reader Bio Rad 1864003 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s ATCC ATCC 14028s www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate BioTek TAKE3 Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHI ThermoFisher Scientific FERFD0054 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnI ThermoFisher Scientific FERFD1704 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIII ThermoFisher Scientific FERFD0504 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit ThermoFisher Scientific FERK0832 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit ThermoFisher Scientific FERK0503 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F534L Procure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific FEREL0011 Procure from any manufacturer
Thermocycler Bio Rad 1861096 Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue Transilluminator ThermoFisher Scientific UV95043301 Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology Grade ThermoFisher Scientific BP28191 Procure from any manufacturer

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References

  1. Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
  2. Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
  3. Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
  4. Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
  5. Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
  6. Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
  7. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
  8. Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
  9. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  10. Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
  11. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
  12. Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
  13. Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
  16. Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
  17. McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
  18. Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
  19. Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
  20. Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
  21. Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
  22. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
  23. Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
  24. Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
  25. Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
  26. Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
  27. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
  28. Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
  29. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).

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Genética Número 147 Índice competitivo factores de virulencia aptitud cuantificación bacteriana ddPCR PCR digital índice competitivo cancelado Salmonella,código de barras de ADN cuantificación molecular interacciones genéticas
Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en <em>Salmonella</em>
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Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella. J. Vis. Exp. (147), e59630, doi:10.3791/59630 (2019).

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