Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59630
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

Summary

Bakteriyel Fitness belirlenmesi için bu moleküler tabanlı yaklaşım dijital PCR üzerinden nicelik benzersiz genomik DNA barkodları kullanarak mikroorganizmaların kesin ve doğru algılanmasını kolaylaştırır. Protokol, Salmonella suşları için rekabetçi dizinin hesaplanmasında açıklanmaktadır; Ancak, teknoloji, herhangi bir genetiği değiştirilmiş organizmanın mutlak ölçümlerini gerektiren protokollere kolayca adapte olmaktadır.

Abstract

Rekabetçi bir endeks, bakteriyel Fitness ve/veya virulence değerlendirmek için kullanılan ortak bir yöntemdir. Bu yaklaşımın yarar gerçekleştirmek için kolaylığı ve bir vahşi tip organizmaya birçok suşların Fitness standartlaştırmak yeteneği tarafından örneklenmiştir. Teknik, ancak, mevcut fenotipi belirteçler ve aynı anda değerlendirilebilir suşların sayısı tarafından, çoğaltır deneyler çok sayıda ihtiyacı oluşturarak sınırlıdır. Çok sayıda deney ile eşzamanlı olarak, fenotipik işaretçileri dayalı bakterilerin ölçülmesini için işçilik ve malzeme maliyetleri önemsiz değildir. Olumlu yönlerini koruyarak bu olumsuz yönlerini aşmak için, bakteri kromozomları üzerine genetik belirteçleri mühendislik sonra doğrudan mikroorganizmalar ölçmek için moleküler tabanlı bir yaklaşım geliştirdik. Benzersiz, 25 baz çifti DNA barkodları, yaban tipi ve Salmonellamutant suşlarının kromozom üzerinde bir zararsız Locus yerleştirilir. In vitro rekabet denemeleri, havuzlanmış suşlardan oluşan inocula kullanılarak yapılmıştır. Rekabetin ardından, her bir gerilimin mutlak sayısı dijital PCR kullanılarak ölçülebilir ve her bir gerinim için rekabetçi endeksleri bu değerlerden hesaplanır. Verilerimiz, Salmonella 'yı ölçmek için bu yaklaşımın, hem son derece bol (yüksek Fitness) hem de nadir (düşük Fitness) mikroorganizmaları tespit etmek için son derece hassas, doğru ve hassas olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, bu teknik, neredeyse herhangi bir organizmaya modifikasyon yapabilen kromozomlar ve mikroorganizmaların mutlak ölçülmesini gerektiren çeşitli Deneysel tasarımlar için kolayca uyarlanabilir.

Introduction

Patojen organizmaların Fitness ve virulinin değerlendirilmesi Mikrobiyoloji araştırmalarının temel bir özelliğidir. Bu karşılaştırmalar suşları veya mutasyona uğramış organizmalar arasında yapılması için, hangi araştırmacılar belirli koşullarda belirli genlerin önemini belirlemek için izin verir. Geleneksel olarak, virülans değerlendirmesi farklı bakteriyel suşları kullanarak enfeksiyon bir hayvan modeli kullanır ve enfekte hayvanın sonucunu gözlemlemek (örneğin bulaşıcı doz50, ölümcül doz50, ölüm zamanı, belirti şiddeti, eksikliği Belirtiler, vb.). Bu prosedür, virulence değerli açıklamaları sağlar, ancak vahşi türde varyasyonları algılamak için sonuçlar önemli farklılıklar neden suşları gerektirir. Ayrıca, sonuçlar yarı niceliksel çünkü hastalık ilerlemesi ve semptom şiddeti zaman içinde subjektif olarak niceleyilebilir, vahşi türe kıyasla virülans yorumu daha niteliksel (yani daha fazla, daha az veya eşit derecede virlan). Hayvan infeksiyonunun gerçekleştirilmesi için ortak bir alternatif, rekabetçi Endeksleri (BDT), doğrudan Fitness ya da bir gerinlik virülans karma bir enfeksiyon bir vahşi tip mevkidaşı karşılaştırmak değerleri oluşturmak için1. Bu teknik, vahşi tip bir gerinim için virülans standardizasyon ve zayıflatma derecesini yansıtacak şekilde ölçülebilir bir değer belirleme tarafından enfeksiyon geleneksel hayvan modeli üzerinde sayısız avantajları vardır. Bu teknik, iptal edilmiş bir rekabetçi Endeks (COı)2belirlenerek bakterilerde gen etkileşimlerini analiz etmek için de adapte edilebilir. Bir COI 'nin bir grup mutasyona uğramış organizmalar için hesaplanması, araştırmacılar iki genin bağımsız olarak patogeneze katkıda bulunup bulunmadığını ya da aynı virülans yoluna katılıp birbirlerine bağımlı olup olmadığını belirlemesine olanak tanır. Ayrıca, bir CI hesaplanması, organizmaların patogenezine değerli Öngörüler sağlayan bakterilerin numaralandırılmasını gerektirir. BDT ve COIs de araştırmacılar klinik hastalığa neden olmayan ama hala Fitness farklılıkları var avirlan suşları asses izin. Bu teknik, suşları tanımlamak için geleneksel antibiyotik direnci belirteçlerinin kullanımı ile sınırlıdır, böylece giriş suşlarının sayısını aynı anda sadece bir ya da iki kez sınırlandırır. Bu sınırlama nedeniyle, çok sayıda deneysel grup ve çoğaltır gereklidir, bu da işçilik ve malzeme maliyetlerine ilaveye ek olarak, deneysel koşullarda değişkenlik ve hatalı sonuçlar için fırsatları da arttırır. (Virulence, Fitness ve gen etkileşimlerini incelemek için karışık enfeksiyonlar kullanmanın faydaları ve uygulamalarının kapsamlı bir gözden geçirilmesi için, bkz: CR Beuzón ve D.W. Holden 1)

Akış cytometri3,4,5ile niceli floresan etiketli hücrelerin kullanımı gibi bu sınırlamanın üstesinden gelmek için girişimleri yapılmıştır. Bu teknik, 1 ' i kullanarak hücreleri ölçülebilir) fenotipik işaretçileri veya 2) endojenously üretilen floresan proteinleri etiketli antikorlar. Etiketli antikorların kullanımı 1.000 hücre/mL algılama sınırı vardır ve bu nedenle3analiz etmek için hücre yüksek sayıda gerektirir. Floresan proteinlerini ifade eden hücreler değiştirilmiş bir fizyolojisine sahiptir ve yüksek protein ifadesi6' dan kaynaklanan Fitness değişikliklerine duyarlıdır. Her iki yöntem de Akış sitometrisi kullanılarak algılanabilir floresan belirteçleri sayısı ile sınırlıdır. Bir duvar modeli7' de 1.000 suşlarının ilk karma enfeksiyonundan 120 suşlarında zayıflama tespit eden bir Mikroarray tekniğinin gelişimi ile moleküler ölçüte bir gelişme elde edildi. Bu teknik, sonuç olarak önemli değişkenlik sağlayan mutasyona uğramış suşlarından RNA 'nın Mikroarray analizini kullandı.  Yine de, karışık enfeksiyonların büyük havuzları yararlı bir araç olabilir ve hassas algılama teknikleri kullanarak, bakteriyel virülans farklılıkları tespit edilebilir kuruldu. Yeni nesil sıralamanın geliştirilmesi ile, TN-Seq transpozon mutasyonların yardımcı programını genişletti ve rasgele mutasyona uğramış bakteri ölçümü için güçlü bir yöntem sağlayan8,9,10, 11' den itibaren. Alternatif bir protokol son zamanlarda Transpozonlar ihtiyacını ortadan kaldırır ve bunun yerine daha kolay tanımlamak ve genomik değişiklikleri ve fitness üzerindeki etkilerini izlemek için DNA barkodları kullanır geliştirilmiştir12. Bu teknoloji büyük bir ilerlemedir, ancak genomik barkodların eklenmesi hala rasgele bir süreçtir. Önceki deneylerin rastgele üstesinden gelmek için, Yoon et al. bakterilerin kromozomları üzerinde kesin yerlere yerleştirilen benzersiz DNA barkodları kullanarak Salmonella suşlarının BDT 'sını hesaplamak için bir yöntem geliştirdi13. Benzersiz barkodlu suşlar, SYBR yeşil ve her benzersiz barkodan spesifik astar içeren qPCR tabanlı bir yöntem kullanılarak saptandı. Bu teknik, qPCR 'den önceki iç içe-PCR ihtiyacının kanıtlandığı primer verimlilikler ve düşük hassasiyette farklılıklar da dahil olmak üzere KSC tarafından uygulanan kısıtlamalarla sınırlıdır. Yine de bu yaklaşım, hedeflenen genomik değişikliklerin, birden fazla bakteriyel suşların havuzlarını tespit etmek ve potansiyel olarak ölçmek için yararlanabileceğini göstermiştir.

Aşağıdaki protokolde, son derece hassas bir dijital PCR tekniği kullanarak büyük karışık inokula havuzları ve ardından doğru ölçüte sahip bakteriyel rekabet denemeleri yapmak için yeni bir metodoloji tarif ediyoruz. Protokol, kromozom bir zararsız bölgeye yerleştirilen benzersiz bir DNA barkod ile genetik etiketleme bakteriyel suşları içerir. Bu değişiklik suşları hızlı ve doğru geleneksel seri seyreltme yerine modern moleküler teknoloji kullanarak nicelik sağlar, yineleme kaplama, ve fenotipik belirteçler (yani antibiyotik direnci güveniyor koloninin şekillendirme birimleri sayma ). Değişiklikler, tek bir havuza alınan inokulum içinde birçok suşların eşzamanlı değerlendirilmesi için izin, önemli ölçüde tüm suşları tam aynı koşullara maruz çünkü deneysel değişkenlik olasılığını azaltır. Ayrıca bu teknik Salmonella enterica serovar typhimurium 'da geliştirilirken, herhangi bir genetik olarak kötü hale gelebilen organizmaya ve doğru bakteriyel sayılarının gerekli olduğu neredeyse her deneysel tasarıma son derece uyarlanabilir, yeni bir önceki yöntemlerle uygulanan kısıtlamalar olmadan Mikrobiyoloji laboratuvarlarında doğruluğu ve verimi artırmak için bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Allelic Exchange için gerekli bileşenleri Içeren bir Plasmid üzerine benzersiz DNA barkodları dahil

Not: Yeni bir Plasmid, pskap adlı, yüksek kopya numarası ve artan dönüşüm verimliliği ile karşılaştırıldığında mevcut pKD13 allelik değişim plazmid oluşturuldu. Bu, 1.1-1.12 adımlarda açıklanmıştır (Şekil 1). Benzersiz DNA barkodları ve allelik değişimi için bileşenler içeren sonuçlandırılmış plazmids bir Plasmid deposu (malzeme tablosu) aracılığıyla mevcuttur.

  1. Ticari bir Plasmid Sage kiti kullanarak, pKD1314 ve ppcr Script cam SK+ , Luria-Bertani (lb) suyu ile yetiştirilen gece bakteriyel kültürlerden 50 μg/ml kanamisin veya 25 μg/ml kloramfenikol ile tamamlayıcı (pKD13 ve ppcr Script cam için) SK +, sırasıyla) (Tablo 1).
  2. Üreticinin özelliklerine göre ticari kısıtlama enzimleri HindIII ve BamHI kullanarak hem plazmids üzerinde kısıtlama sindirimler gerçekleştirin.
  3. PPCR Script cam SK+ reaksiyonunun kısıtlama enzimlerini ve EKSIZ DNA 'sını çıkarın ve 3.370-baz çifti (BP) Plasmid omurgasını üreticinin özelliklerine göre ticari olarak KULLANILABILIR bir DNA Temizleme Kiti kullanarak arındırın.
  4. PKD13 kısıtlama sindirimi parçaları bir elektroforez odası kullanarak% 1 agaroz jel ayırın.
  5. Mavi ışık transaydınlatıcıyı kullanarak bantları görselleştirin ve 1.333 BP parçasını jelden (Şekil 1C) çıkarın.
    Not: Bu parça, kromozomal allelik değiştirme için gerekli frt-flanked kanamisin direnç geni içerir.
  6. Ticari bir jel ekstraksiyon kiti kullanılarak adım 1,5 ' ten itibaren eksiz DNA 'Yı arındırın.
  7. PSKAP oluşturmak için, pKD13 'den (adım 1,6) gelen temizleşmiş parçayı pPCR Script cam SK+ ' a (adım 1,3), üreticinin özelliklerine göre ticari BIR T4 DNA ligaz kullanarak yerleştirin.
  8. Üreticinin protokolünün ardından birleştirilmiş pSKAP Plasmid ile kimyasal olarak yetkili DH5α hücrelerini dönüştürün (Tablo 1).
  9. 50 μg/ml kanamisin ile tamamlayıcı lb agar plakaları üzerine Spread transformanlar ve bir gecede 37 °c ' de inkük.
  10. Plaka bir koloni seçin ve yeni lb agar plaka üzerinde çizgi 50 μg/ml kanamisin ile tamamlayıcı ve 37 °c gece içinde inkük. Bu plakaya bir koloni seçin ve 50 μg/ml kanamycin ile tamamlayıcı lb suyu aşılamak kullanın. Her gece 37 °C ' de sürekli ajitasyon ile kültürü kulyın.
  11. Pskap 'i gecede bakteriyel kültürden arındırmak için ticari bir Plasmid Sage kiti kullanın.
  12. Üretici özelliklerine göre Hind III ve bam HI kullanarak adım 1,11 Plasmid bir tanı kısıtlama sindirimi gerçekleştirin. 1.4-1.5 adımlarında olduğu gibi% 1 agaroz jel üzerinde parçaları görselleştirin.
    Not: PSKAP toplam boyutu 4.703 BP olmalıdır. Adım 1,12 sonra parçaları 3.370 ve 1.333 BP olmalıdır.
  13. Pskap (Şekil 2) 725 pozisyonunda benzersiz bir 25-basepair DNA dizisi eklemek gibi bir şekilde eklemsel site yönlendirilmiş mutagenez (SDM) (Tablo 2 ve S1) için PCR astar tasarımı.
    Not: Barkod DNA, FRT-flanked kanamisin direnç geni dışında Plasmid içine yerleştirilir, bu nedenle barkod kanamyisin direnç kaseti sonraki kaldırılması sırasında kaybolmaz. Yeni barkod dizileri oluştururken, floresan etiketli hedefe özel PCR problarının (bundan böyle "prob" olarak anılacaktır) verimli bir şekilde yeni sırasına bağlandığından emin olmak için çevrimiçi araçlar kullanın. Oluşturmak için gerekli astar ile birlikte tarih için tasarlanmış ekleme dizileri, Tablolar 2 ve S1sağlanır.
  14. Hazırlamak SDM ticari yüksek doğruluk DNA polimeraz kullanarak reaksiyonlar, istenen astar çiftleri (Tablo 2), ve pSKAP şablonu. Aşağıdaki işlemleri yapmak için termocycler ayarlayın: 1) 98 °C 30 s, 2) 98 °C için 10 s, 56 °C için 15 s, 72 °C 2 dakika, 3) 2, 24 kez, 4) 72 °C 5 dakika, 5), 4 °C ' de tutun.
  15. PCR tamamlandıktan sonra, reaksiyona kısıtlama enzim DPN I ekleyerek pskap şablonu tüketmek. 37 °C ' de 20 dakika boyunca inkübe
    Not: Ürünün boyutunu ve saflığını doğrulamak için, bir agaroz jeli üzerinde PCR 'den ürünler görselleştirilmelidir. Modifiye edilmemiş pSKAP şablonundan oluşan bir kontrol DPN ı sindirimi yapılabilir ve sonraki adımlarında DNA şablonu tamamen sindirilmesi sağlamak için kullanılır.
  16. Üreticinin tavsiyelerine göre ticari kimyasal olarak yetkili DH5α hücrelerin 100 μL dönüştürmek için adım 1,15 ürün 5 μL kullanın.
  17. 25 μg/ml kloramfenikol ile tamamlayıcı lb agar plakaları üzerine Spread transformanlar ve 37 ° c 'de bir gecede inkük.
  18. Gecelik plakalardan bir koloni (veya koloniler) seçin ve 25 μg/ml kloramfenikol ile desteklenen ve 37 °c ' de geceleyin bireysel lb agar plakalarına yerleştirin. Gece plakaları bir koloni seçin ve 25 μg/ml chloramphenicol ile tamamlayıcı lb suyu 5 ml aşılamak için kullanın. Her gece 37 °C ' de sürekli ajitasyon ile kültürü (ler) kulyatın.
  19. Bir ticari Plasmid Sage kiti gece kültürü (ler) plazmids arındırmak için kullanın.
  20. Sanger dizisi M13 ileri sıralı astar kullanarak plazmidler saflaştırılmış (Tablo 2). Mutasyona uğramış bölgeyi orijinal Plasmid ile karşılaştırın ve SDM insertional doğruluk için değerlendir.
  21. Barkod ekleme ve doğruluğu onayladıktan sonra, her barkod ve Plasmid bir isim atayın.
    Not: Tarih için oluşturulan barkodlar iki harfli bir atama atanmıştır: AA, AB, AC,..., BA, BB, BC, vb. Barcoded plazmids pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC,..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC, vb olarak belirtilir.
  22. İstenen sayıda DNA barkodları oluşturmak için 1.14-1.21 arasındaki adımları yineleyin.

2. DNA barkod S kromozom üzerine tanıtmak. Typhimurium

Not: DNA barkodlarının S üzerine yerleştirilmesi . Typhimurium kromozom, S 'de kullanılmak üzere değiştirilmiş olan Datsenko ve Wanner14 tarafından tanımlanan bir allelik değişim yöntemi kullanılarak elde edilir . Typhimurium.

  1. S üzerinde Locus belirleyin . DNA barkodu eklemek için typhimurium genom (Şekil 3).
    Not: Kromozom büyük, interjenik bir bölge seçin. Kodlama içermeyen RNA üreten bölgelerden kaçının. Bu çalışmada, artıklar 1.213.840 ve 1.213.861 (genom montajından GCA_ 000022165.1) arasında belirlenen P koymak için bir Locus aşağı aşağı kullanılmıştır. Bu bölge daha önce genlerin Trans tamamında genetik olarak manipüle edilmiştir15. Alternatif olarak, bir DNA barkod aynı anda ilgi bir geni bozarken tanıtılabilir. Bunu yapmak, bu protokole en az değişiklikler gerektirir ve mutant yaratılmasını kolaylaştırır.
  2. Özel barkod ve frt-flanked kanamisin direnç geni, istenen pskap barkod içeren Plasmid dan adım 1,21 (Tablo 2) yükseltmek için PCR astar tasarımı. 2,1 adımda seçilen bölge için homolog olan 40-nükl uzantıları ekleyin (Tablo 2) her astar 5 ' sonuna.
  3. Bir ticari yüksek sadakat polimeraz, adım 2,2 astar ve istenen pSKAP barkod içeren Plasmid şablon olarak kullanarak amplifikasyon gerçekleştirin. Aşağıdaki işlemleri yapmak için termocycler ayarlayın: 1) 98 °C 30 s, 2) 98 °C için 10 s, 3) 56 °C için 15 s, 4) 72 °C için 60 s, adımları yineleyin 2-4 29 kez, 5) 72 °C 5 dakika, 6) 4 °C ' de tutun.
  4. PCR tamamlandıktan sonra, 1,15 adımda açıklandığı gibi dpni kullanarak şablon DNA 'sı tüketmek. Üreticinin özelliklerine göre ticari bir DNA Temizleme Kiti kullanarak DNA 'Yı arındırın ve konsantre olun.
  5. S'de mutantlar oluşturmak için önceden yayımlanan protokole bakın. Typhimurium strain 14028s PCR ürünleri14,16,17,18.
    Not: Kanamyisin direnç geni kromozom 'dan eksiz olması gerekli değildir. Ancak, genin eksizyonu, bakteri kromozom için minimal şekilde bozulur, böylece potansiyel aşağı genleri çerçeve içinde bırakacak bir 129 BP yara izi oluşur. Kanamyisin direnç geni içeren gerinim, P22 aracılı dönüştürücü ile suşları arasındaki barkodları taşımak için kullanılabilmesi önerilir.
  6. Uygun barkodlarla istenen suşları oluşturmak için 2,3 – 2,5 arasındaki adımları yineleyin.
    Not: Barkodlar vahşi tip S içine tanıtılabilir . Daha sonra daha fazla genetik manipülasyon, veya barkodlar daha önce genetik olarak değiştirilmiş suşları içine tanıtılabilir olabilir typhimurium.

3. bakteriyel büyüme koşulları ve In vitro yarışma Assays

  1. Bakteri stokları, çizgi istenen S. Her liman LB agar plakaları üzerine benzersiz bir DNA barkod typhimurium suşları. 37 ° c 'de bir gecede plakaları kulküat.
  2. Her gerinim tek bir koloni seçin ve lb suyu 5 ml aşılamak. Sabit ajitasyon ile 37 °C ' de 20 h için inkübe.
    Not: Gece kültürünü kullanarak, her bir barkoddan saf genomik DNA (gDNA) toplamak için 3,5 adıma geçin. Bu, Bölüm 6 ' da sonraki doğrulama ve denetim denemeleri için gereklidir.
  3. Her yarışma tahlil için, uygun büyüklükte bir steril tüp içine her gece kültürünün eşit hacimli transfer. İyice en az 5 s için güçlü vortekslenir tarafından birlikte suşları karıştırın.
    Not: Transfer için her gece kültürünün hacmi her koşul ve çoğalmak için yeterli olmalıdır, yanı sıra giriş ölçmek için gDNA yalıtılması için. Mutlak giriş mikroorganizmaları dijital PCR kullanarak nicelleşmiş olacak çünkü kültürlerin optik yoğunlukları ölçmek için tamamen gerekli değildir, her gerinim için giriş bakteri sayısı yaklaşık darboğazları önlemek için eşit olmalıdır veya Deney erken eşit olmayan rekabet. Bu protokolde temsilcilik rekabeti, 8 suşların büyüme oranlarını aynı anda karşılaştırır. Bireysel Deneysel tasarımlar için ek veya daha az suşlar gerekli olabilir.
  4. 4,9 ml steril lb suyu içine karışık inokulumunu 100 μL transfer. İstenilen süre veya istenilen optik yoğunluğa göre 37 °C ' de inküye yapın.
  5. 500 1 dakika boyunca > 12000 x g 'de santrifüjleme ile inokulumunu μL 'yi topla. supernatant çıkarmak ve atmak. Hücrelerle Bölüm 4 ' e hemen geçin.
  6. İstenilen zaman noktalarında, > 12000 x g 'de santrifüjleme ile kültür ve hasat hücrelerinin 500 μL plakaya kaldırmak 1 dakika. supernatant kaldırmak ve atmak.
    Not: Birden fazla zaman noktalarında plakaya toplama,-20 °c ' de Pelet dondurmak ya da hemen her koleksiyondan sonra 4,1 adıma geçin.

4. gDNA 'Yı S. ' den toplama ve ölçme Typhimurium (adım 3,5 ve 3,6)

  1. Bir ticari gDNA arıtma kiti kullanarak hücrelerden gDNA hasat. Varsa, isteğe bağlı RNA tükenmesi adımını gerçekleştirin.
    Not: RNA tükenmesi gerekli değildir; Ancak RNA 'nın varlığı DNA konsantrasyonunu yapay olarak artıracak ve sonraki adımlarda anormal hesaplamalara yol açacaktır. Ticari bir gDNA arıtma kiti kullanıyorsanız, sütunun DNA ile aşırı yüklendiğinden emin olmak için üreticinin önerilerini izleyin. Numunenin sonraki adımlarla ölçülebilir olması durumunda minimum DNA konsantrasyonu gerekmez.
  2. Her örnekteki DNA 'Yı ölçmek için spektrofotometre kullanın.
    Not: DNA herhangi bir güvenilir yöntem kullanılarak nicelik olabilir.
  3. Aşağıdaki denklemin kullanıldığı bakteriyel genom boyutuna göre gDNA kopya numarasını hesaplayın: X ng 'de DNA miktarı ve N bir çift telli DNA molekül (genom boyutu) uzunluğudur.
    Equation 1
    Not: 660 g/mol, 1 DNA BP ortalama kitle olarak kullanılır. organizmanın nüklesotit bileşimine bağlı olarak küçük varyasyonlar bulunabilir. Hesaplama yapmak için birçok hesap online mevcuttur.

5. dDigital PCR üzerinden DNA barkodlarının nicel tespiti için tasarım astar ve problar

  1. Sbarkodlu bölgesini yükseltmek için tasarım astar. Putp , typhimurium kromozom aşağı (Şekil 3c ve Tablo 2).
    Not: Primer ve prob tasarımları çok sayıda çevrimiçi program (malzeme tablosu) tarafından kolaylaştırılabilir. Barkodlar tüm aynı loci takılı ise, amplifikasyon astar tek bir dizi tüm barkodları için evrensel.
  2. Tasarım 6-karboksfloresan (FAM) tabanlı ve/veya hexachlorofluorescein (HEX)-tabanlı problar her barkoddan (Tablo 2 ve S1) özeldir.
    Not: Bu denemede kullanılan damlacık okuyucusu, hem FAM hem de HEX tabanlı probları aynı anda Multiplex bir reaksiyon içinde algılamaya yeteneğine sahiptir. Tasarım 1/2, HEX kullanmak için FAM ve 1/2 kullanmak için problar. Bu gerekli bir adım değildir ancak uygulanırsa reaktif kullanımını ve deneysel maliyetleri azaltacaktır.
  3. 1) 20 mM her ileri ve ters amplifikasyon astar, 2) 10 mM tek bir FAM prob ve 3) 10 mm tek bir HEX prob (Eğer Multiplexing) içeren 20X primer-prob ana karışımları olun.

6. dijital PCR kullanarak her genomik barkod için her Pprimer-prob seti duyarlılık ve özgüllüğü doğrulayın

Not: Bu protokol, sekiz benzersiz barkodları örnek olarak sekiz benzersiz prob ile doğrulama kullanır. Kullanılan barkodların sayısı artan veya çeşitli Deneysel tasarımlar karşılamak için azaltılabilir.

  1. Biri dışında her barkod içeren bir gDNA havuzu oluşturun. Bu havuzu, tek kalan barkodu içeren gDNA ile bir seyreltme serisi gerçekleştirmek için seyreltici olarak kullanın ( Şekil 4' te örnek seyreltme şeması sağlanır).
    Not: Bir seyreltilme olarak havuzlanmış gDNA kullanımı hassasiyet ascertaining sırasında tutarlı bir arka plan sağlar. 4,3 adımda belirlenen kopya numaralarını kullanarak, gDNA 'yı önerilen dijital PCR aralığında bir kopya numarasına seyreltin (20 μL reaksiyon başına 1-100000 kopya). Aralığın, toplam gDNA değil, her benzersiz hedef (barkod) için ayarlanmış olduğunu aklınızda bulundurun.
  2. Prob bazlı Kimya için tasarlanan dijital PCR supermix kullanarak üreticinin tavsiyelerine göre yinelenen dijital PCR için reaksiyonları hazırlayın. 6,1 adım karışımları şablon DNA olarak kullanın. Adım 6,1 yılında seyreltilmiş barkod için prob içeren adım 5,3 20X primer-prob ana karışımı kullanın.
  3. Prob bazlı Kimya için tasarlanan dijital PCR supermix kullanarak üreticinin tavsiyelerine göre dijital PCR için çoğaltır kontrol reaksiyonları hazırlayın. Her prob karışımı için kontrol reaksiyonları 1) şablon kontrolleri (NTCs), 2) negatif kontroller ve 3) pozitif kontroller oluşmalıdır.
    Not: En az sayıda çoğaltma denetimi reaksiyonları iki ' dir. Bu örnek protokol dört NTCs, altı negatif denetim ve her barkod için altı pozitif denetim kullanır. Negatif kontroller, test edilen sondaya karşılık gelen barkod dışında her barkodla gDNA içermelidir. Bu, her yoklama özgüllüğü doğrular.
  4. Her barkodlu gdna örneği için dijital PCR reaksiyonları oluşturmak için 6.1-6.3 arasındaki adımları yineleyin. Şekil 5' te örnek bir plaka düzenlemesi sunulmaktadır.
    Not: Bu ve sonraki adımlar, damlacıkları ve akış tabanlı teknolojiyi kullanan belirli bir dijital PCR platformuna dayanarak açıklanmıştır. Çip tabanlı teknolojiyi kullanan alternatif dijital PCR platformları, bu protokoldeki hafif değişikliklerle kolayca yerine konulabilir. Adım 6,4 tüm astar setleri doğrulamak için 1 96-Well plaka daha fazla gerekebilir. QPCR aksine, dijital PCR tarafından analiz ayrı plakalar kolayca plakalar arasında standardize referans kuyuları gerek kalmadan karşılaştırılabilir.
  5. Üreticinin talimatlarına göre bir damlacık jeneratör kullanarak her reaksiyon durumu için damlacıklar oluşturun.
  6. Yeni oluşturulan damlacıkları uygun 96-Well plakasına aktarın. 5-50 μL çok kanallı pipet üzerinde 200 μL pipet uçları kullanın.
    Not: Damlacıklar pipetleme yaparken, yavaşça ve düzgün pipet! Dijital PCR ekipman üreticisi, belirli bir üreticiden (örneğin, Ranin) sadece Pipetler ve Pipet uçları kullanmanızı önerir. Bu pipet uçları, damlacıkları yok edebilir veya damlacık okuyucusunun mikrofluidiklarına zarar verebilecek mikroskobik plastik parçaları olmayan pürüzsüz bir açılım vardır. Birçok marka ipuçları incelendi ve üretim kalitesi bir spektrumuna sahip gözlenen. Pipet Ucu alternatifleri kullanılarak eşdeğer sonuçlar elde edilmiştir; Ancak, dikkat üreticinin önerileri saparak kullanılmalıdır.
  7. Tüm damlacıklar oluşturulan ve transfer edildikten sonra, bir folyo plaka mühürleyici ile plaka mühür.
  8. Aşağıdaki Bisiklet koşullarını gerçekleştirmek için üretici tarafından önerilen termocycler kullanın: 1) 94 °C 10 dk; 2) 94 °C 1 dk, rampa hızı 1 °C/s olarak ayarlanır; 3) 55 °C 2 dakika, rampa hızı 1 °C/s 'de ayarlanır; 4) adımları yineleyin 2 ve 3 49 kez; 5) 98 °C 10 dk; 6) 4 °C ' ye kadar 24 saate tutun.
    Not: Damlacık reaksiyonunda termal transfer standart PCR ile aynı değildir. Reaksiyon koşulları değiştirilmesi gerekebilir.
  9. Termobisiklet gerçekleştirilirken, örnek adı, deney tipi (mutlak miktarma), kullanılan supermix, hedef 1 adı (FAM barkod adı), hedef 1 tipi (NTC, pozitif kontrol, gibi plaka kurulum bilgileri ile veri analizi yazılımı programı, negatif kontrol veya bilinmeyen), hedef 2 adı (HEX barkod adı), hedef 2 türü (boş, pozitif kontrol, negatif kontrol veya bilinmeyen). Son plaka kurulum bilgileri Şekil 5' te gösterilir.
  10. Termobisiklet tamamlandıktan sonra, tamamlanan reaksiyonları damlacık okuyucusuna aktarın ve okuma sürecini üreticinin talimatlarına göre başlatın.

7. rekabetçi endeks deneyinde bakteri sayısını ölçmek

  1. Seyreltilmiş gDNA, yukarıda açıklandığı gibi, Bölüm 4 ' ten uygun bir konsantrasyona kadar yalıtılmış ve ölçülebilir.
  2. Uygun supermix kullanarak üreticinin tavsiyelerine göre dijital PCR için reaksiyonları hazırlayın. Şablon olarak adım 7,1 DNA kullanın. Denemede bulunan olası barkodlar için prob (ya da FAM ve HEX algılıyorsanız probları) içeren bir 20X primer prob ana karışımı kullanın.
  3. Deneysel tasarımında kullanılan tüm barkodlar tespit edilebilir kadar farklı 20X primer-prob Master karışımları kullanarak adım 7,2 olarak ek dijital PCR reaksiyonlar hazırlayın.
  4. 6,3 'de açıklandığı gibi her koşul için denetimler içerir. Bu 1) şablon denetimleri (NTCs), 2) negatif denetimler ve 3) pozitif denetimler içerir.
  5. 6.5-6.10 adımlarında açıklandığı gibi protokole devam edin.

8. dijital PCR verilerini analiz edin ve mutlak kopya numaralarını hesaplayın

  1. Tüm kuyular okunduğunda ve çalıştırma tamamlandığında, veri analiz yazılımını kullanarak. QLP veri dosyasını açın.
    Not: Burada açıklanan dosya türleri ve veri çözümleme yordamları, bir dijital PCR üreticisine özeldir. Alternatif dijital PCR platformları kullanıyorsanız, dosya türleri ve veri analizi prosedürleri kullanılan platforma özel olacaktır ve üreticinin önerilen özelliklerine göre yapılmalıdır.
  2. Aynı primer-prob ana karışımını kullanan tüm kuyuları seçin.
  3. Damlacıklar sekmesinde, her bir kuyunda (hem pozitif hem de negatif damlacıklar) analiz edilen damlacıklar sayısını inceleyin. Analiz dışında 10.000 toplam damlacıkları daha az olan herhangi bir iyi hariç.
  4. 1D genlik sekmesine gidin ve pozitif ve negatif damlacıklar genlikleri inceleyin. İki farklı nüfus oluşturduğundan emin olun.
  5. Yazılım içinde, kullanılan her prob için pozitif ve negatif damlacıklar arasında bir kesme yapmak için eşik özelliğini kullanın (Şekil 6).
    Not: Adım 5,3 aynı primer-prob ana karışımını kullanan tüm kuyular aynı eşiklere sahip olmalıdır.
  6. Tüm kuyulara uygun eşikler uygulandıktan sonra, yazılım her reaksiyonda DNA kopyası sayısını hesaplayacak. Daha fazla analiz kolaylaştırmak için bir elektronik tabloya veri verme.
    Not: Veri çözümleme yazılımı, kopya numarasını belirlemek için Poisson dağılımına uygun pozitif ve negatif damlacıklar sayısını kullanır.
  7. 8,6 adımından değerleri kullanarak, örnekteki her benzersiz genomik barkodın ilk kopya numarasını hesaplayın. Negatif kontrol reaksiyonları ortalama yanlış pozitif oranı belirlemek ve deneysel reaksiyonlar elde edilen değerlerden bu değeri çıkarın. Her denemeyi (Tablo 3) ayarlarken gerçekleştirilen dilüsyonları temel alarak değerleri gerektiği gibi çarpın.

9. Barcoded suşların dijital PCR tabanlı miktarından CI veya COı hesaplayarak bir organizmanın göreli Fitness belirlemek

  1. Aşağıdaki formülleri kullanarak barkodlu bir gerinim CI hesaplayın: birÇıkış belirli bir timepoint barkodlu gerinim mutlak kantifikasyon, WTÇıkış aynı anda barkodlu vahşi tip bakterilerin mutlak miktarın olduğunu timepoint, birgiriş barkodlu gerinim giriş inokulumunu mutlak kantifikasyon, WTgiriş barkodlu vahşi tip bakterilerin giriş inokulumunu mutlak kantifikasyon olduğunu, XÇıkış tüm suşları toplamı aynı timepoint, Xgiriş tüm barkodlu suşların toplam giriş inokulumunu toplamını olduğunu.

Equation 2
Equation 3
Not: Avantajları, dezavantajları ve her formül en uygun kullanımı için tartışma bakın.

  1. Tüm zaman noktalarında Barkodlu her gerinim için adım 9,1 yineleyin.
  2. Varsa, aşağıdaki formülleri kullanarak COI hesaplayın nerede: birÇıkış mutasyona uğramış gen ile bir barkodlu gerinim mutlak kantifikasyon a verilen timepoint, ABçıkışı bir barkodlu gerinim mutlak kantifikasyon olduğunu aynı timepoint içinde a ve B mutasyona uğramış genler ile, birgiriş mutasyona uğramış gen aile barkodlu gerinim giriş inokulumunu mutlak kantifikasyon, ABgirişi giriş inokulumunu mutlak kantifikasyon olduğunu mutasyona uğramış genler ile barkodlu gerinim a ve b, bçıkışı , belirli bir timepoint 'te mutasyona uğramış gen B ile bir barkodlu gerilimin mutlak ölçüsüdir ve bgirişi , girişin mutlak ölçümlerini oluşturmaktadır. mutasyona uğramış gen Bile barkodlu gerinim inokulumunu.

Equation 4
Veya
Equation 5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu metodolojinin kullanımı, hedef DNA 'yı tanımlamak için kullanılan her prob hassasiyeti ve özgüllüğü doğrulamak için uygun kontrol reaksiyonları gerçekleştirilmesini gerektirir. Bu temsilci denemede, sekiz benzersiz DNA barkodları ile kimlik tespiti için sekiz probla onaylandı. Tüm sekiz probların hem NTC hem de negatif kontrol reaksiyonları (Tablo 3) yanlış pozitifi düşük bir oranı vardı, oldukça benzer DNA dizileri arasında bile kendi özgülüğü vurgulayarak. Her koşulun hassasiyetini değerlendirmek için, benzersiz bir barkod içeren gDNA, kalan yedi barkod dizisini içeren gDNA 'nın sürekli bir arka planında seri olarak seyreltildi. Yukarıda özetlenen yaklaşım ile, dijital PCR yaklaşık 2.000.000 benzer DNA dizileri bir arka planda gDNA 2 kopya olarak az ayırt edebilir (Tablo 3).

Her prob ve DNA barkod dizisinin hassasiyetini ve özgüllüğünü belirlemenin yanı sıra, doğrulama çalışmasında gerçekleştirilen seyreltme, ortaya çıkan verilerden simüle edilmiş bir rekabetçi dizini hesaplamamıza izin verdi. Bu deney için gerçek bir giriş veya çıkış olmasa da, veri bir yarışma deneyi gerçekleştirildiği gibi analiz edilebilir. Bunu yapmak için, seri seyreltme içindeki her karışımı seyreltilmiş barkod için bir çıkış (Açıkışı) olarak göz önünde bulundururken, toplam çıkış (xçıkışı), giriş (agirişi) ve her bir gerilimin toplam girişi (xgirişi) Tüm barkodların içerdiği pozitif kontrollerde ölçülme. Her karışım için seyreltme faktörü kullanılarak teorik CI belirlendi ve Tablo 3' te bildirilmiştir. Her barkodu için yapılan seyreltme serisinin her biri, ortalama simüle CI her yinelenen seyreltme serisi için standart sapmaları ile birlikte bildirilir. Her durumda, hesaplandı simüle CI teorik CI benzer. Hesaplanan BDT 'nin çoğunluğu teorik BDT 'den% 25 ' den az bir sapma oluşturmaktadır. Daha düşük teorik BDT durumlarında, hesaplanan değerin sapması 2 katla yukarı doğru idi. Örneğin, bu bir değişim teorik CI 0,000625 bir hesaplanan CI 0,001220 için temsil etti. Bu veriler, açıklanan yöntemin hem son derece doğru hem de son derece hassas olduğunu vurgulamaktadır. Yüksek hassasiyet, özgüllük, doğruluk ve hassasiyet kombinasyonu, bu sistemin, aksi takdirde fark edilmeyebilir Fitness farklılıkları güvenilir bir şekilde algılamak için etkinleştirin.

Genomik barkodların doğru algılanabileceğini ve ölçülebilir olduğunu doğruladıktan sonra, in vitro rekabet deneyleri (Tablo 4) gerçekleştirdik. İlk yarışma deneyi sekiz vahşi tip Skullandı. Her biri benzersiz bir DNA barkodu içerdiği typhimurium suşları. Her gerginlik bir gecede büyüdü ve sekiz kültürler eşit miktarlarda birlikte karıştırıldı. 100 Bu karışık inokulumunu μL 4,9 ml steril lb suyu aşılamak için kullanıldı ve ortaya çıkan kültür sürekli ajitasyon ile 37 °c ' de kulkarlanmış. gdna, her bir gerilimin tam girişini hesaplamak için inokulumunu 'dan hasat edildi. Kültür büyüme 600 Nm (OD600) içinde emici ölçme tarafından izleniyor. At OD600 = 0,5 (Logaritmik faz), her kültürden bir örnek toplandı ve gdna hasat edildi. Kalan kültür 37 °C ' ye geri döndü ve son numune toplanırken gDNA (Sabit) toplama işleminden sonra 8 saate kadar sürekli ajitasyon yapıldı. Sonuçlar, havuzlanmış enfeksiyonlar için değiştirilmiş CI formülü kullanılarak hesaplanmıştır. Beklendiği gibi tüm vahşi tip suşları CI değerleri neredeyse 1 (Tablo 4) eşittir. Benzer bir yarışma deneyi sekiz mutant Skullanılarak yapılmıştır. Her biri tek, Çift veya üçlü-transketolaz eksikliği18ek olarak benzersiz barkodlar vardı typhimurium suşları. Daha önce gösterildiği gibi, suşları tüm benzer LB suyu, sadece hafif bir gecikme ile üçlü-transketolaz eksikliği gözlenen büyüdü. Ancak, her bir gerilimin büyümesi CI analizinde değerlendirildiğinde, transketolaz yetersizliği için çok daha derin bir kusur gözlenmiştir (CI, Shaw ve ark.18' deki büyüme eğrilerine kıyasla). Ayrıca, bu deney, sadece niteliksel olarak büyüme desenlerini tanımlamak yerine her bir gerilimin büyüme özelliklerine ölçülebilir bir değer atamamıza izin verdi. Her bir gerinim için BDT, her bir gerilimin sadece vahşi türe ve tüm giriş suşlarının kabul edildiği değiştirilmiş formüle kıyasla her iki geleneksel formülü kullanılarak hesaplanmıştır. Değişiklikler küçük iken, Üçlü-transketolaz-eksikliği gerinim CI yapay olarak düşük geleneksel formül çünkü diğer altı rakip suşları için hesap değil tüm yakın-Wild-tipi Fitness sergiledi.

Suş Genotip Kaynak veya referans
S. typhimurium ATCC 14028s vahşi tip ATCC
TT22236 LT2 Salmonella pTP2223 taşıma 27
DH5α F– φ 80Laczδm15 Δ (Laczya-argf) U169 RECa1 Enda1 HSDR17 (rk–, mk+) PhoA SUPE44 λ– Thi-1 GyrA96 rela1 28
JAS18077 Putp::AA:: frt Bu çalışma
JAS18080 Putp::ad:: frt Bu çalışma
JAS18083 Putp::AG:: frt Bu çalışma
JAS18088 Putp::Al:: frt Bu çalışma
JAS18091 Putp::Ao:: frt Bu çalışma
JAS18096 Putp::at:: frt Bu çalışma
JAS18099 Putp::AW:: frt Bu çalışma
JAS18100 Putp::AX:: frt Bu çalışma
JAS18122 ΔTKTA:: frt Putp::ad:: frt Bu çalışma
JAS18130 ΔTktb:: frt Putp::Al:: frt Bu çalışma
JAS18138 ΔTktc:: frt Putp::at:: frt Bu çalışma
JAS18125 ΔTKTA:: frt ΔTktb:: frt putp::AG:: frt Bu çalışma
JAS18133 ΔTKTA:: frt ΔTktc:: frt putp::Ao:: frt Bu çalışma
JAS18141 ΔTktb:: frt ΔTktc:: frt putp::AW:: frt Bu çalışma
JAS18142 ΔTKTA:: frt δTktb:: frt δTktc:: frt Putp::AX:: frt Bu çalışma
Plazmid
pKD13 bla FRT Ahp frt ps1 PS4 oriR6K 14
pPCR Script cam SK + ColE1 Ori; Ramazan R Stratagene/Aligent
pTP2223 Bu 16
pCP20 bla Cat cı857 PRFLP pSC101 orits 29
pSKAP ColE1 Ori; CmR; bla Tamer Ahp frt Bu çalışma
pSKAP_AA ColE1 Ori; CmR; bla FRT Ahp frt; AA Bu çalışma
pSKAP_AD ColE1 Ori; CmR; bla FRT Ahp frt; Reklam Bu çalışma
pSKAP_AG ColE1 Ori; CmR; bla FRT Ahp frt; AG Bu çalışma
pSKAP_AL ColE1 Ori; CmR; bla FRT Ahp frt; Al Bu çalışma
pSKAP_AO ColE1 Ori; CmR; bla FRT Ahp frt; Ao Bu çalışma
pSKAP_AT ColE1 Ori; CmR; bla FRT Ahp frt; At Bu çalışma
pSKAP_AW ColE1 Ori; CmR; bla FRT Ahp frt; AW Bu çalışma
pSKAP_AX ColE1 Ori; CmR; bla FRT Ahp frt; AX Bu çalışma

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan suşlar ve plazmitler.

Adı Sıra (5 '-3 ')1, 2, 3
pSKAP SDM AA-F Bir daha olmaz. CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AA-R Akcaagcaccagcaggagacttct ÖZGÜL
pSKAP SDM reklam-F Araagagacggtagarahtlık CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM reklam-R Bir daha yok ÖZGÜL
pSKAP SDM AG-F Agtagtgtcctggaggagcatgtga CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AG-R Tcacatgctcctccaggacactact ÖZGÜL
pSKAP SDM AL-F Akım Atcgaaggcactagctct ÖZGÜL
pSKAP SDM AL-R Agagctagtgccttcgatgtgtggt CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AO-F ( Gccacaaccacactcagtgatact ) ÖZGÜL
pSKAP SDM AO-R Agtatcactgagtgtggttgtggac CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AT-F Bir daha yok. CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AT-R Gctagccatgtcacggacactggt ÖZGÜL
pSKAP SDM AW-F (Asam) CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AW-R Cgtcacatccacatcactcagtcgt ÖZGÜL
pSKAP SDM AX-F ( Actatcgtggtgtaacgacaggctg ) CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AX-R Oktay Cağmaz ÖZGÜL
M13-F Mustafa akgül
Putp Yeniden kombinasyon-F TAGCGATGGGAGAGAGGACACGTTAATTATTCCATTTTAA
ÇASGC
Putp Yeniden kombinasyon-R TAKıKATTAATTGAAAACATCCATAACCCATTG
Bu BILGI
qPCR barkod bölgesi amplifikasyon-F1 Oktay k
qPCR barkod bölgesi amplifikasyon-R2 TANER k
Barkod AA prob-FAM 6-FAM/AGAAGTCTC/ZEN/CTGCTGGTGCTTGAGTC/ıBFQ
Barkod AD Probe-FAM 6-FAM/AAGAGCACG/ZEN/GTGAGGTGATAGTAGGC/ıBFQ
Barkod AG prob-FAM 6-FAM/AGTAGTGTC/ZEN/CTGGAGGAGCATGTGAC/ıBFQ
Barkod AL Probe-FAM 6-FAM/AGAGCTAGT/ZEN/GCCTTCGATGTGTGGTC/ıBFQ
Barkod AO prob-HEX HEX/AGTATCACT/ZEN/GAGTGTGGTTGTGGACC/ıBFQ
Prob AT barkod-HEX HEX/ACCAGTGTC/ZEN/CGTGACATGGCTAGACC/ıBFQ
Barkod AW prob-HEX HEX/ACGACTGAG/ZEN/TGATGTGGATGTGACGC/ıBFQ
Barkod AX prob-HEX HEX/ACTATCGTG/ZEN/GTGTAACGACAGGCTGC/ıBFQ
1 Altı çizili nükleotidler pSKAP sonra SDM yerleştirilen her DNA barkod için tamamlayıcı dizileri gösterir.
2 Çift altı çizili nükleotidler Süzerinde tamamlayıcı bir bölge gösterir. Allelik değiştirme için kullanılan typhimurium kromozom.
3 ' ü Primetime qPCR probları 5 ' floresan boya ile etiketlenmiş hibridizasyon oligos, ya 6-karbokflucein (6-FAM) veya hexachlorofluorescein (hex), bir iç giderici (Zen) ve 3 ' quencer Iowa siyah® FQ (ıbfq) ' dir.

Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan astar ve problar.

Miktar (kopya/20μL reaksiyon)
Açıklama Acar Reklam Ag AL Ao TESISINDE AW Ax
Ntc Yok 0,000 0,000 3,510 Yok 0,000 0,000 0,000
Ntc 3,600 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
Ntc 3,510 0,000 1,280 1,180 2,340 0,000 0,000 0,000
Ntc 2,290 0,000 0,000 1,200 1,150 1,160 0,000 0,000
Demek 3,133 0,000 0,320 1,473 1,163 0,290 0,000 0,000
Negatif 5,130 1,156 0,000 1,124 3,745 1,281 7,354 7,142
Negatif 5,270 0,000 0,000 1,087 1,666 1,643 7,746 2,269
Negatif 2,660 0,000 1,361 1,451 8,974 0,000 Yok 0,000
Negatif 6,090 0,000 0,000 2,251 0,000 2,531 8,700 3,495
Negatif 1,740 0,000 1,086 2,130 4,171 0,000 7,113 5,522
Negatif 6,220 3,581 0,000 4,022 1,175 1,341 Yok 5,950
Demek 4,518 0,789 0,408 2,011 3,288 1,133 7,728 4,063
Pozitif 22281,540 42673,039 46442,242 45359,180 47885,625 15708,027 45325,906 20810,559
Pozitif 23989,676 44625,523 47356,438 45790,660 47456,973 15096,601 47929,840 22455,234
Pozitif 17846,824 38980,133 45633,809 44174,820 33875,039 15156,063 42536,270 21467,840
Pozitif 21047,588 40140,848 41672,648 46028,496 47426,527 16718,000 46978,664 19876,473
Pozitif 20218,238 44660,602 41718,707 45799,375 46495,602 14590,264 54741,023 22011,938
Pozitif 18531,740 41620,801 Yok 48082,313 35645,199 15341,382 48950,992 21117,559
Demek 20652,601 42116,824 44564,769 45872,474 43130,827 15435,056 47743,783 21289,934
Boş çıkarma 20648,083 42116,035 44564,361 45870,463 43127,539 15433,923 47736,054 21285,871
Seyreltilmiş A 23024,961 44448,875 58897,510 51120,948 55450,191 18155,305 62844,068 27567,828
Seyreltilmiş B 18278,174 35252,586 54409,510 66022,396 43101,148 15732,609 60761,328 26581,979
1/50 A 521,670 755,035 1066,898 1287,187 1053,339 181,324 1278,336 580,961
1/50 B 435,326 634,215 1168,087 1383,537 991,040 165,443 1180,445 596,461
1/100 A 228,028 598,848 603,911 631,116 507,956 258,405 665,647 331,590
1/100 B 256,330 585,834 583,325 670,875 459,325 289,207 638,916 307,948
1/200 A 121,283 305,293 258,247 346,965 234,774 114,163 169,055 172,553
1/200 B 114,638 313,040 253,685 297,216 191,637 179,895 280,989 147,297
1/400 A 42,829 141,343 127,337 163,605 Yok 71,241 157,697 85,976
1/400 B 59,544 180,543 162,080 162,108 115,508 104,682 151,141 87,804
1/800 A 34,304 67,934 65,939 83,857 66,134 31,784 82,722 45,616
1/800 B 20,390 80,222 81,453 85,325 53,102 38,034 55,460 29,660
1/1600 A 15,405 44,505 47,672 39,613 33,027 18,006 37,655 20,988
1/1600 B 22,091 48,828 46,781 37,388 30,245 30,138 34,553 19,795
1/3200 A 12,333 22,104 16,850 18,403 11,460 10,535 21,245 9,218
1/3200 B 6,796 32,555 15,742 26,249 15,111 9,908 23,393 10,175
Boş çıkarma
Seyreltilmiş A 23020,443 44448,086 58897,103 51118,937 55446,903 18154,172 62836,339 27563,765
Seyreltilmiş B 18273,655 35251,797 54409,103 66020,385 43097,860 15731,477 60753,600 26577,916
1/50 A 517,152 754,246 1066,490 1285,176 1050,051 180,192 1270,607 576,898
1/50 B 430,808 633,426 1167,679 1381,526 987,751 164,311 1172,717 592,398
1/100 A 223,509 598,059 603,503 629,105 504,668 257,272 657,918 327,527
1/100 B 251,812 585,044 582,918 668,864 456,036 288,074 631,187 303,885
1/200 A 116,765 304,503 257,840 344,954 231,486 113,030 161,327 168,490
1/200 B 110,120 312,251 253,277 295,205 188,348 178,762 273,261 143,234
1/400 A 38,310 140,554 126,929 161,594 Yok 70,108 149,968 81,913
1/400 B 55,026 179,753 161,672 160,097 112,219 103,549 143,413 83,741
1/800 A 29,786 67,145 65,531 81,847 62,846 30,651 74,994 41,553
1/800 B 15,872 79,433 81,045 83,314 49,813 36,901 47,732 25,596
1/1600 A 10,886 43,716 47,264 37,602 29,739 16,874 29,927 16,925
1/1600 B 17,573 48,039 46,373 35,377 26,957 29,005 26,825 15,732
1/3200 A 7,815 21,314 16,442 16,392 8,172 9,402 13,517 5,155
1/3200 B 2,278 31,765 15,334 24,238 11,822 8,776 15,664 6,112
Simüle CI
Seyreltilmiş A 1,114895 1,055372 1,321619 1,114419 1,285650 1,176251 1,316329 1,294932
Seyreltilmiş B 0,885005 0,837016 1,220911 1,439279 0,999312 1,019279 1,272698 1,248618
1/50 A 0,025046 0,017909 0,023931 0,028018 0,024348 0,011675 0,026617 0,027102
1/50 B 0,020864 0,015040 0,026202 0,030118 0,022903 0,010646 0,024567 0,027831
1/100 A 0,010825 0,014200 0,013542 0,013715 0,011702 0,016669 0,013782 0,015387
1/100 B 0,012195 0,013891 0,013080 0,014582 0,010574 0,018665 0,013222 0,014276
1/200 A 0,005655 0,007230 0,005786 0,007520 0,005367 0,007323 0,003380 0,007916
1/200 B 0,005333 0,007414 0,005683 0,006436 0,004367 0,011582 0,005724 0,006729
1/400 A 0,001855 0,003337 0,002848 0,003523 Yok 0,004542 0,003142 0,003848
1/400 B 0,002665 0,004268 0,003628 0,003490 0,002602 0,006709 0,003004 0,003934
1/800 A 0,001443 0,001594 0,001470 0,001784 0,001457 0,001986 0,001571 0,001952
1/800 B 0,000769 0,001886 0,001819 0,001816 0,001155 0,002391 0,001000 0,001203
1/1600 A 0,000527 0,001038 0,001061 0,000820 0,000690 0,001093 0,000627 0,000795
1/1600 B 0,000851 0,001141 0,001041 0,000771 0,000625 0,001879 0,000562 0,000739
1/3200 A 0,000378 0,000506 0,000369 0,000357 0,000189 0,000609 0,000283 0,000242
1/3200 B 0,000110 0,000754 0,000344 0,000528 0,000274 0,000569 0,000328 0,000287
Ortalama CI (teorik)
Seyreltilmemiş (1) 0,999950 0,946194 1,271265 1,276849 1,142481 1,097765 1,294514 1,271775
1/50 (0,02) 0,022955 0,016474 0,025067 0,029068 0,023625 0,011161 0,025592 0,027466
1/100 (0,01) 0,011510 0,014046 0,013311 0,014148 0,011138 0,017667 0,013502 0,014832
1/200 (0,005) 0,005494 0,007322 0,005735 0,006978 0,004867 0,009453 0,004552 0,007322
1/400 (0,0025) 0,002260 0,003803 0,003238 0,003507 0,00260 * 0,005626 0,003073 0,003891
1/800 (0,00125) 0,001106 0,001740 0,001645 0,001800 0,001306 0,002188 0,001285 0,001577
1/1600 (0,000625) 0,000689 0,001089 0,001051 0,000795 0,000657 0,001486 0,000594 0,000767
1/3200 (0,000313) 0,000244 0,000630 0,000357 0,000443 0,000232 0,000589 0,000306 0,000265
Standart sapma
Sulandırılmamış 0,11494 0,10918 0,05035 0,16243 0,14317 0,07849 0,02182 0,02316
1/50 0,00209 0,00143 0,00114 0,00105 0,00072 0,00051 0,00103 0,00036
1/100 0,00069 0,00015 0,00023 0,00043 0,00056 0,00100 0,00028 0,00056
1/200 0,00016 0,00009 0,00005 0,00054 0,00050 0,00213 0,00117 0,00059
1/400 0,00040 0,00047 0,00039 0,00002 0 0,00108 0,00007 0,00004
1/800 0,00034 0,00015 0,00017 0,00002 0,00015 0,00020 0,00029 0,00037
1/1600 0,00016 0,00005 0,00001 0,00002 0,00003 0,00039 0,00003 0,00003
1/3200 0,00013 0,00012 0,00001 0,00009 0,00004 0,00002 0,00002 0,00002
* Tek bir deneyden sonuçları temsil eder.

Tablo 3: mutlak kantifikasyon ve simüle CI hesaplama.

Durum Rekabetçi endeks1
Deney 1
mehmetacar WTreklam WTAG aslan al ( yok) WT cinsinden aykut gür WTAX
Logaritmik 0,927 ± 0,033 0,992 ± 0,031 1,068 ± 0,025 0,921 ± 0,02 1,044 ± 0,03 1,051 ± 0,057 1,094 ± 0,027 0,929 ± 0,005
Sabit 1,1 ± 0,021 1,071 ± 0,053 1,079 ± 0,065 0,948 ± 0,02 0,98 ± 0,02 0,873 ± 0,044 0,97 ± 0,056 1,021 ± 0,007
Deney 2
CI (Geleneksel) mehmetacar akın ad BAHADıRAl ΔCat burakAG (Uluslararası ) aykut gür ΔABCAX
Logaritmik 1 ± 0 0,802 ± 0,084 0,957 ± 0,02 0,989 ± 0,073 0,581 ± 0,153 0,86 ± 0,053 0,995 ± 0,011 0,695 ± 0,061
Sabit 1 ± 0 0,97 ± 0,063 1,043 ± 0,058 0,99 ± 0,036 1,625 ± 0,589 0,835 ± 0,051 0,912 ± 0,047 0,477 ± 0,049
CI (havuzlanmış Inoculum)
Logaritmik 1,114 ± 0,039 0,864 ± 0,074 1,073 ± 0,032 1,1 ± 0,068 0,633 ± 0,152 0,938 ± 0,056 1,111 ± 0,043 0,746 ± 0,06
Sabit 1,078 ± 0,039 1,039 ± 0,049 1,166 ± 0,093 1,066 ± 0,01 1,735 ± 0,613 0,876 ± 0,035 0,97 ± 0,045 0,49 ± 0,047
1 Değerler üç veya dört çoğaltma denemeleri için Ortalama CI ± standart sapmayı temsil eder.

Tablo 4: S. arasında in vitro rekabetten temsilci sonuçları. Typhimurium suşları.

Tablo S1. Ek barkod dizileri ve algılama için ilgili floresan problar oluşturmak için opsiyonel astar. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Figure 1
Şekil 1. PSKAP üretimi. (A) Purified PKD13 HindIII ve bamhi ile kısıtlama sindirime maruz kalmıştır. (B, C) 1.333, FRT-Flanşlı kanamyisin direnç geni içeren BP 'nin faiz parçası saflaştırıldı. (D) Ppcr SCRIPT cam SK + da HindIII ve bamhi ile sindirilmiş ve PKD13 (B) gelen parça (E) pskap oluşturmak için bağlandı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: pskap 'e eklemsel site yönlendirilmiş mutagenez. (A) 725 pozisyonunda 25 BP DNA barkodunun YERLEŞTIRILMESI PCR kullanılarak yapılmıştır. Bu konuma özgü ileri ve ters astarlar, tamamlayıcı 25-nükle 5 ' uzantılarıyla tasarlanmıştır (astar içinde küçük harf "a" olarak belirtilir). (B) bir genel pSKAP_Barcode PLASMID kaynaklanan SDM eklenen DNA barkod turuncu vurgulanan konumu ile gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Putp'Nin kromozomal yeniden düzenlenmesi. (A) λ-Red aracılı yeniden kombinasyonundan sonra, FRT siteleri (gri) ile çevrili seçilebilir kanamisin direnç geni (koyu mor), belirtilen loci arasındaki kromozom üzerine yerleştirilir (kromozom rekombinasyon sitesi, kırmızı). Benzersiz DNA Barkod (turuncu) FRT sitenin hemen dışında yerleştirilir. (B) kanamyin direnç geni frt-aracılı eksizyon tarafından KALDıRıLıR, DNA barkod ve frt yara oluşan kromozom (Toplam eklenmiş DNA, mavi) ÜZERINE eklenmiş DNA kalıntıları bırakarak. (C) eklenmiş DNA 'yı çevreleyen değiştirilmiş kromozomal DNA dizisi, dijital PCR için kullanılan amplifikasyon astar siteleri (açık mor) ile birlikte gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: floresan prob hassasiyetini ve özgüllüğü doğrulamak Için seyreltme şeması. (A) yedi barkodlu suşlardan arındırılmış gdna, belirtilen barkodlu gdna 'yı (Yukarıdaki örnekte AX) seyreltilmesi için seyreltici oluşturmak üzere eşit miktarlarda birlikte karıştırılır. (B) daha önce açıklanan hazırlanmış seyreltici kullanarak, atlanmamış barkodlu gdna (Yukarıdaki örnekte AX) bir seri seyreltme gerçekleştirin. Bir sonraki tüpe aktarmadan önce her tüpün içeriğini iyice karıştırın. Şekil 4 BioRender ile oluşturuldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: astar-prob setleri 1 ve 2 hassasiyeti ve özgüllüğü analiz etmek Için plaka düzeni. Dijital PCR deneyi NTCs, pozitif kontroller, negatif kontroller ve test edilmiş barkodların her biri için seyreltme düzenleri içerir. Primer-prob setleri 3 ve 4 doğrulama için plaka uygun barkodlu gdna kullanarak aynı desen dışarı yerleştirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: seyreltilmiş AA-Barcoded gDNA 'Nın temsili dijital PCR sonuçları. AA barkodu içeren gdna, Şekil 4' te açıklandığı gibi diğer tüm barkodlu gdna 'nın arka planında seyreltildi. Kanal 1, AA Barkod (üst paneller) için FAM araştırmasını temsil ederken, Kanal 2, AO Barkod (alt paneller) için HEX prob temsil eder. Her prob sonuçları bireysel damlacık floresan amplitül (sol paneller) ve seçilen kuyularda (sağ paneller) tüm damlacıklar floresan yoğunluğu sıklığını temsil eden bir histogram olarak sunulur. Her koşul için pozitif (yüksek floresans) ve negatif (düşük floresan) damlacıklar iki farklı nüfus oluşturmalıdır. AA durumunda seyreltilmiş ve çoğu damlacıklar negatifti, histogram (sağ üst panel) sadece tek bir nüfus tasvir görünüyor. Bunun nedeni pozitif damlacıklar negatif damlacıklar tarafından önemli ölçüde sayıca; Ancak, iki farklı nüfus sol panellerde damlacık floresan amplitül inceleyerek hala görülebilir.  Nüfus, pozitif ve negatif damlacıklar (pembe çizgi tarafından görselleştirilen) tanımlamak için eşik özelliği kullanılarak ayrılmalıdır. Eşik değerleri, kullanılan problara bağlı olarak değişir, ancak aynı prob karışımını kullanan tüm kuyular aynı eşiklere sahip olmalıdır. AA-Barcoded gDNA seyreltilmiş olarak, pozitif AO damlacıkları sayısı arka planda sabit kalır iken pozitif (yüksek floresan) damlacıkları bir azalma vardır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroorganizmaların doğru şekilde ölçülmesine yönelik yetenek, mikrobiyoloji araştırmaları için önemli bir öneme sahiptir ve ilk karma nüfusun benzersiz suşları numaralandırılması, Fitness ve virülans özelliklerini değerlendirmek için paha biçilmez bir araç olduğunu kanıtladı Bakteri. Ancak, bunu gerçekleştirmek için teknikler moleküler biyoloji modern gelişmeler ile ilerlemedi değil. Birçok bakterinin kromozomları kolayca değiştirmek için teknoloji, S dahil . Typhimurium, yaklaşık iki yıl için kullanılabilir olmuştur14, henüz bu yetenek NADIREN benzersiz DNA dizileri ile moleküler etiketleme suşları için kullanılmıştır. Bakteriyel kromozom üzerine yerleştirilen benzersiz, Minimally-bozucu DNA barkodları dayalı kolayca tanımlanabilir suşları oluşturmak için yeteneğini sömürüyor, algılamak ve bu moleküler tanımlayıcılar ölçmek için en State-of-the-art teknoloji ile birlikte ( Yani dijital PCR), farklı bir bakteri nüfusu içinde bireysel suşları kolayca ölçmek için zarif hassasiyet, özgüllük, doğruluk ve hassasiyet sağlayan bir sistem oluşturduk.

Yukarıda açıklandığı gibi BDT ve COI hesaplamaları, bakteri kromozomları için uygun değişiklikleri doğru şekilde yapma yeteneğine dayanır. Tüm değişiklikler herhangi bir rasgele mutasyon oluştuğunu sağlamak için Sanger sıralaması tarafından doğrulanmalıdır. Yüksek sadakat polimeraz kullanımı bu hataları en aza indirir, ancak bu tür mutasyonlar meydana gelen bu protokolün başka bir kritik yönü olan gerinim algılamak için yeteneği zarar verecektir. Biz dijital PCR yaklaşık 2.000.000 bir arka planda iki gDNA kopya olarak az algılayabilir rağmen, bu aralığın dışında suşları doğru quantification için ek seyreltme gerekebilir göstermiştir. Ayrıca, DNA barkod dizileri yüksek kaliteli prob dizileri kullanımını kolaylaştırmak için tasarlanmalıdır. Prob dizileri kendi kendine dimerize, form saç iğneler, ya da etkili bir şekilde hedef bağlamak eğilimleri için analiz edilmelidir. Kalite dizileri ve problar kullanarak önemini minimalized, her prob ile gerçekleştirilmesi gereken dikkatli doğrulama denemeleri tarafından kanıtlandığı bir gerçektir. Optimum DNA barkodları oluşturma çabaları, optimum dijital PCR ölçme sonuçları oluşturur.

Özenle tasarlanmış moleküler Etiketler kalite sonuçları elde etmek için önemli olmakla beraber, sonuçları yorumlama bu protokolün başka bir kritik yönüdür. CI, giriş1,19,20' deki iki suşların oranıyla bölünmüş olarak mutant gerinim ve çıktıda vahşi tip gerinim arasındaki oran olarak tanımlanır. Bu geleneksel CI Bölüm 9 sunulan karmaşık enfeksiyon vahşi tip karşı sadece bir gerinim oluşur yararlıdır. Ancak, medya veya hayvanlar aşılamak suşların büyük havuzları kullanırken, suşları sadece vahşi tip karşı rekabet değil, aynı zamanda inoculum diğer her türlü gerilme karşı. Birden fazla enfekte suşları kullanarak rekabet deneylerini gerçekleştiren önceki çalışmalar, bu hesaplamaları7,13' te dikkate alamadı. Karma enfeksiyonlar Bu özellik için hesap için, biz havuzlanmış enfeksiyonlar için değiştirilmiş BDT hesaplamak için bir formül tanıttı. Tüm suşların bir vahşi tip gerilme aynı seviyede rekabet sağlayacaktır olası değildir. Ancak, çoğu bakteriyel genlerin virülans üzerinde az etkisi olduğu için, rekabetçi endeks deneyinde kullanılan suşların sayısı arttıkça, genel virülans vahşi tip gerinim artar doğru eğilmek olasılığı. Bu mutlaka bilinen virülans kusurları ile birçok suşların havuzları kullanarak bazı deneysel tasarımlar için durum olmayabilir. Ancak, bu değiştirilmiş denklemde hesaplaşır, çünkü daha az bol suşlar (daha az uygun) sonuç Xçıktısındadaha küçük bir etkiye sahip olacaktır. Belirli deneysel tasarıma bağlı olarak, bir veya diğer formülün tercih edildiği durumlarda olabilir. Çoğu durumda havuzlanmış enfeksiyonlar içeren, ancak, bu karışık bir enfeksiyon dikkate almak önemlidir, tüm suşları sadece vahşi tip karşı, birbirlerine karşı rekabet. Sonuçları analiz ederken, her formülün arkasındaki mantık, gerinim Fitness en doğru yorumlarını yapmak için iyi anlaşılır olduğu önemlidir. Sonuçları raporlarken, verilerin nasıl çözümlendiğinden doğru şekilde ifşa edilmesi aynı derecede önemlidir.

Bölüm 9 protokolünün de bir COı kullanarak gen etkileşimlerini belirlemenize yardımcı olmak için formüller içerir. Bu analiz ile, iki virülans genlerin bağımsız veya birlikte çalışıp çalışmayacağını belirlemek için tahminler yapılabilir. COI, giriş1' deki iki suşların oranıyla bölünmüş olarak çift mutant 'ın çıktıda tek mutant gerilime oranı olarak tanımlanır. Formül, gen kesintinin fenokotifik additivity algılamak için tasarlanmıştır. Eğer genler bağımsız olarak virulence geliştirmek için işlev, her iki genlerin bir bozulma iki gen tek bir bozulma ile karşılaştırıldığında Fitness daha büyük bir azalma neden olmalıdır. Genlerin (örneğin, bir yol içinde iki enzim kodlama genler gibi) virülans geliştirmek için birlikte işlev, her iki geni bozulma olarak virülans aynı etkiye sahip olmalıdır. Tek bir geni neden olan zayıflama seviyesinin çok yüksek ya da çok düşük olduğu durumlarda fenokotifik additivity tespit etmek zor olabilir. Yine de, aynı hayvan sistemi içindeki suşların doğrudan karşılaştırılması daha az değişkenlik ve genler arasında işlevsel ilişkinin daha güvenilir bir hesap sağlar ve bu hesaplama daha büyük bir karma nüfus içinde iki suşlardan gerçekleştirilebilir.

Sonuçları yorumlama için son kritik bir yönü nüfus dinamiklerinin etkilerini dikkate etmektir. Birden fazla suşları olan bazı karışık enfeksiyonlara, tek bir gerinim rastgele nüfus sürüklenme nedeniyle ya daha baskın ya da daha az uygun olarak ortaya çıkabilir. Bu fenomen, darboğaz olayları oluştuğunda amplifikatörleşmiş olabilir. Bu giriş suşları çok sayıda kullanarak neden olabilir, inoculum içinde toplam bakteri çok az sayıda, ya da her ikisinin bir kombinasyonu. Karışık enfeksiyonlardan kaynaklanan başka bir müdahale yönü Trans tamamlayıcı olasılığıdır. Bu, vahşi tip gibi uygun bir gerinim, daha az uygun bir gerilimin virülliğini yapay olarak geliştirdiğinde gerçekleşir. Bunun bir varsayımsal örnek bir S Fitness karşılaştırmak olacaktır . Typhimurium Patisite Island 2 (SPI2)-Knockout gerinim bir vahşi tip gerilme ile birlikte enfekte. SPI2 sağlar S. Typhimurium bir makrophage içinde phagosome değiştirmek ev sahibi sitosol içine salıtarak Efektörler tarafından hücre içi hayatta kalmak için. Bu sistemin Bozulması S. yapar. Hücre içi öldürme duyarlı typhimurium. Ancak, macrofajlar bir kerede iki veya daha fazla bakteri yutmaya yeteneğine sahip olduğundan, SPI2-Knockout bir vahşi tip Saynı makrophage ikamet ederse Fitness önemli bir artış alabilirsiniz.  Ana sitsol içine Efektörler salgımakta olan typhimurium. Rasgele nüfus dinamikleri ve Trans tamamlayıcı olarak olasılığı herhangi bir rekabet deneyi bir sınırlamasıdır. Eğer Trans uluslara şüphelenildiğinde, fenotipleri Fitness değerlendirmek için diğer tamamlayıcı yöntemler kullanılarak teyit edilmelidir. Rasgele nüfus dinamiklerini aşmak için, çoğalan deneylerin sayısını artırmak, sonuçlarda aykırı değerleri belirleme olasılığını artırır. Neyse ki, yukarıda açıklanan protokol, deneysel koşulların sayısı büyük ölçüde azaldığından, aynı çoğaltır deneylerinin daha fazla sayıda olmasını kolaylaştırır.

Yukarıda açıklanan CI tekniğine önemli bir unsur, neredeyse her organizmaya ve mikroorganizmaların doğru ölçülmesini gerektiren herhangi bir deneysel tasarıma adapte olma yeteneğidir. Ancak, bir organizmanın genetik olarak manipülasyon yapması, kromozom üzerinde benzersiz bir DNA dizisi içermesi gerekir. Tekniğin uyum türlerin genetik-malleable ve genom (Steps 1 ve 2) değiştirmek için alternatif protokoller nesil güvenmek gerekir gerektirir. Tablolar 2 ve S1 'de listelenen DNA barkodları çoğu bakteri için yeterli olmalıdır; Ancak, tüm nicel PCR deneylerinde olduğu gibi, basit bir BLAST analizi ile astar ve probların off-Target bağlayıcı için minimal potansiyeli sağlamak için bakteriyel genomu analiz etmek için uygun olduğunu. Bu çalışmada kullanılan DNA barkod dizileri, bazı durumlarda sadece 3-4 üsleri ile farklılık gösterirken, spesifik olmayan bağlama potansiyelini en aza indiren problerin zarif özgüllüğü vurgulanır. Floresan problarının özgüllüğü ne olursa olsun, tüm yeni barkod dizileri, 6. adımda açıklandığı gibi hassasiyet ve özgüllük için uygun şekilde doğrulanmalıdır. Barkodlu suşları oluşturduktan sonra, bu protokolün, yukarıda açıklandığı gibi in vitro rekabetin yanı sıra birçok deney türüne adapte edilmesi mümkündür. Suşlar farelerde veya diğer hayvan modeli sistemlerinde in vivo rekabete uygundur. Sadece minimal değişiklikler hayvan organları ve dokulardan gDNA ayıklamak için gerekli olan, ve bu değişiklikler de bu tür amaçlar için kitleri üreticileri tarafından tanımlanır. Ayrıca, in vivo rekabet için karışık enfeksiyonlar büyük havuzları başarıyla daha önce7kullanılmıştır, tek bir deneme için gerekli hayvanların sayısını azaltmak için potansiyel sunan, hangi sadece bu deneylerin maliyetlerini düşürür Ama aynı zamanda hayvan-to-Hayvan değişkenlik potansiyelini azaltır. Benzer şekilde, barkodlu suşları çeşitli tedavi koşullarına suşların duyarlılık incelemek diğer in vitro asder kullanılabilir (örneğin, antibiyotik, asit duyarlılık, reaktif oksijen veya azot türleri tarafından öldürme, vb.). Bu deneyler için, büyüme inhibisyonu değerlendirmek adım 3,4 büyüme ortamına istenilen kimyasal ekleyerek elde edilebilir ve açıklandığı gibi devam. Bakteri ölümü değerlendirmek için, suşların büyük bir havuz karışık olabilir, ve giriş yukarıda açıklandığı gibi nicelik. İstenilen tedaviye maruz kaldıktan sonra, canlı hücreler, canlı ve ölü hücreler arasında ayrım yapmak için dijital PCR ölçme prosedürünü viability PCR ile bağlayarak seçici olarak ölçülmüş olabilir21,22,23 , 24 , 25 , 26. her gerinim için seyreltme ve çoğaltma plakaları daha aerodinamik moleküler teknikleri ile değiştirilir, çünkü bu tür deneyler için verim önemli ölçüde artırılır. Son olarak, Evrimsel biyoloji ve nüfus genetik analizleri bu kağıdın kapsamının ötesinde olsa da, barkodlu organizmalar bu tür çalışmalar için oldukça adapte olmaktadır.  Sonuçta, bu protokolün amacı çok çeşitli türler ve deneylerin birçok türde kullanımı için son derece uyarlanabilir bakterilerin ölçülmesi için güçlü bir teknik geliştirmek oldu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu yayında rapor edilen araştırma, George F. Haddix Cumhurbaşkanı fakülte Araştırma Fonu ve Ulusal Sağlık Enstitüsü Genel tıp bilimi (NıH) tarafından GM103427 ödül numarası uyarınca desteklenmektedir. İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 22600028 Procure from any manufacturer
16 mL culture tubes MidSci 8599 Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tips RAININ 30389241 Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipette RAININ 17013804 Use alternative multichannel pipettes with caution
Agarose ThermoFisher Scientific BP160-500 Procure from any manufacturer
BLAST Analysis NCBI N/A https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module Bio Rad 1851197 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5α Invitrogen 18258012 Procure from any manufacturer or prepare yourself
Chloramphenicol ThermoFisher Scientific BP904-100 Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate reader BioTek CYT5MF Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) Bio Rad N/A Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well Plates Bio Rad 12001925 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader Oil Bio Rad 1863004 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Bio Rad 1863024 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1864008 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1863009 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for Probes Bio Rad 1863005 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Kanamycin ThermoFisher Scientific BP906-5 Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agar ThermoFisher Scientific BP1425-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani broth ThermoFisher Scientific BP1426-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio Rad 1814040 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR Tubes Eppendorf 951010022 Procure from any manufacturer
Petri dishes ThermoFisher Scientific FB0875712 Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+ Stratagene/Agilent 211192 No longer available commercially
Primer/Probe Design IDT N/A https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_Barcodes Addgene Plasmid numbers 122702-122726 www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer Bio Rad 1814000 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Generator Bio Rad 1864002 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Reader Bio Rad 1864003 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s ATCC ATCC 14028s www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate BioTek TAKE3 Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHI ThermoFisher Scientific FERFD0054 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnI ThermoFisher Scientific FERFD1704 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIII ThermoFisher Scientific FERFD0504 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit ThermoFisher Scientific FERK0832 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit ThermoFisher Scientific FERK0503 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F534L Procure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific FEREL0011 Procure from any manufacturer
Thermocycler Bio Rad 1861096 Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue Transilluminator ThermoFisher Scientific UV95043301 Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology Grade ThermoFisher Scientific BP28191 Procure from any manufacturer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
  2. Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
  3. Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
  4. Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
  5. Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
  6. Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
  7. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
  8. Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
  9. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  10. Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
  11. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
  12. Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
  13. Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
  16. Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
  17. McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
  18. Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
  19. Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
  20. Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
  21. Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
  22. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
  23. Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
  24. Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
  25. Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
  26. Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
  27. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
  28. Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
  29. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).

Tags

Genetik sayı 147 rekabetçi Endeks virülans faktörleri Fitness bakteriyel ölçüme ddpcr dijital PCR rekabetçi endeksi iptal Salmonella DNA barkod molekül ölçümü gen etkileşimleri
<em>Salmonella</em> Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital… More

Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella. J. Vis. Exp. (147), e59630, doi:10.3791/59630 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter